器官功能的增强的制作方法

专利名称：器官功能的增强的制作方法
对相关申请的引用本申请要求申请日为2001年11月16日的美国临时申请流水号60/331500的优先权。本申请还是申请日为1999年12月29日的美国专利申请流水号09/474525的继续部分申请。以上两份相关申请的内容被专门收作本文参考。
背景技术：
本发明的技术领域是通过移植培养的细胞群增强器官功能。通常，在患者出现彻底的器官衰竭之前，任何器官功能的大部分可能已经丧失。例如，在表现肾脏衰竭之前，高达90-95％的肾脏功能可能已经丧失。这证实了快速自我更新的巨大能力(Cuppage等，(1969)Lab.Invest.21449-459；Humes等，(1989)J Clin.Invest.841757-1761；andWitzgall等(1994)J.Clin.Invest.932175-2188)。这种再生能力，使得肾脏能够在数天或数周内恢复正常功能。
正常肾脏功能和能力的破坏可能是由于多种机制而引起的，如感染，循环衰竭(休克)，血管堵塞，肾小球肾炎，尿路堵塞，与创伤、败血症，手术后并发症，或药物，特别是抗生素相关的肾衰竭。上述原因中的大部分，导致了肾功能降低。
上述某些疾病的治疗通常包括透析，它能从血液系统或移植中去除废物和化学物质。透析对大多数患者来说是很不方便的。通常的治疗方案包括很长的时间，在此期间，患者与透析装置连接，并且，在一周之内还要重复所述透析过程多次。在很多场合下，很多患者会经历副作用，如肌肉痉挛和与患者体液快速改变相关的低血压。
对于肾脏移植来说，主要危险是肾脏排异，即使具有良好的组织相容性匹配也是如此。通常给患者使用诸如环孢菌素和FK506的免疫抑制药物，以便抑制排异。不过，所述免疫抑制药物，在适当的免疫抑制和毒性之间具有窄的治疗窗。长时间的免疫抑制可能削弱免疫系统，这有可能导致出现感染的威胁。在某些场合下，即使是免疫抑制，也不足以阻止肾脏排异。
为了避免上述问题，业已报导了多种方法，其中，业已在体外培养了患者自身的肾脏细胞。例如，授予Humes的美国专利号5,429,938披露了一种使用培养的肾细胞重建肾小管的方法。可以将所述重建的肾小管移植到患者体内。
Naughton等披露了一种三维组织培养系统，其中，将基质细胞铺放在聚合物支持系统上(参见U.S.5,863,531)，并且在基质上培养实质细胞。Vacanti等还披露了用于在用可生物降解的聚合物制备的三维基质上培养细胞的方法。上述方法取决于将所述支持结构塑造成整个器官的理想的形状，并且使得这种人工器官可以作为替代物移植到体腔内。不过，有很多场合不需要置换整个器官，因为只是器官的一部分受到损伤。
因此，需要用于增强器官功能的更好的方法和组合物，该方法不需要生长或置换整个器官。需要使用模拟天然器官结构的较小的，较简单的支持结构。
发明概述本发明提供了利用小型基质移植物增强器官功能的方法和组合物，所述移植物是通过将组织特异性或未分化的细胞接种到基质材料(例如晶片，海绵或水凝胶)上而制备的。然后可以在体外培养接种的基质组合物，以便形成三维生物基质，其中，所述细胞业已生长而产生能够发育成新形态(neomorphic)的器官增强结构的组织层。一旦移植之后，所述三维生物基质在所述器官内的一个或多个靶位点发育和增殖，以便增强所述位点的器官功能。
本发明部分基于以下发现接种的小型基质能维持其他细胞群的活性增殖。这可能部分是因为所述基质结构的增加的表面积，使得新的细胞能保持较长时间的活性增殖。长时间的增殖，使得所述细胞能发育成新形态的器官增强结构，该结构本身可以发育成器官增强单位，或能够提供对发育成器官增强结构的其他细胞群的生长和发育的支持。另外，所述基质允许进行模拟体内条件的空间分布，因此使得能够形成能诱导细胞成熟和迁移的微环境。由此提供的正确空间距离，使得细胞-细胞相互作用能够发生。在存在这种基质的条件下的细胞生长，可以通过添加蛋白，糖蛋白，糖胺聚糖，和细胞基质进一步增强。
在本发明的一个方面，披露了用于增强器官功能的人工器官构建体，它包括通过用至少一种培养的细胞群灌注基质材料而形成的三维生物基质，使得所述细胞附着在所述基质材料上，并且产生能够增强器官功能的组织层，例如，增强诸如心脏，肾脏，肝脏，胰腺，脾，膀胱，输尿管或尿道的器官。
所述构建体可以通过将细胞接种在诸如脱细胞组织，水凝胶或合成的或天然聚合物的小型基质材料上而制成的。所述基质优选是“小型基质”，它的最大尺寸小于大约50毫米。在一种优选实施方案中，所述基质基本上是扁平结构，它的最大尺寸与它的厚度之比大于5∶1。
在本发明的另一方面，所述增强器官结构是增强肾脏功能的结构，它包括通过用肾细胞群灌注基质材料而形成的三维生物基质，以便所述肾细胞附着在所述基质上，并且产生分化成肾单位结构或肾单位结构的一部分的组织层，从而增强肾脏功能。
在本发明的另一方面，所述基质最初是用内皮细胞群灌注的，以便所述内皮细胞与所述基质材料附着，产生包括血管系统的内皮细胞层，然后接种第二个细胞群，以便第二个细胞群与包括所述血管系统的内皮组织层附着，并且分化以便增强器官功能。
在一方面，本发明被设计成在不置换整个器官，或重建整个器官的前提下增强器官功能。例如，为了增强肾脏功能，可以从肾脏中采集小的生物活组织，然后在体外扩增肾细胞。对细胞进行分选，以便除去受损的细胞，然后将正常细胞放置在基质(例如，EGA晶片，海绵，水凝胶)上，并且培养。然后培养所述基质，直到所述细胞产生能够分化成新形态的器官结构的肾组织层，从而产生生物基质。然后将所述生物基质重新移植到患者体内，移植到肾脏内的需要的部位，或靠近尿道(例如，靠近输尿管或膀胱)。
所有类型的肾细胞都是可以分离的，即近端小管，肾小球，远端小管和收集管。所述细胞可以分别接种或同时接种。当所述细胞同时接种时，可能需要将不同类型的细胞依次接种在所述基质上，或在其他场合下，同时接种各种类型的细胞。在移植之后，所述细胞混合物将在数周之内再生成肾组织。在本发明的一种实施方案中，将所述肾细胞放置在聚合材料，如乙基乙二醇乙酸酯(EGA)的晶片上或脱细胞的组织。所述晶片能够以任何适合植入的形状放置到定位区，例如，可以是卷曲的，可以是扁平的等。在一种实施方案中，可以将所述晶片放入所述器官，例如，肾脏的一个部位。在另一个实施方案中，可以将多个晶片放置在所述器官的不同部位。在一种优选实施方案中，所述基质是小型化的，以便更有利于移植。在很多场合下，需要小型基质，其最大尺寸在50毫米或更小的数量级上，优选25毫米或更小，最优选10毫米或更小。例如，聚合物晶片的尺寸可以为大约2-5毫米，优选大约2-3毫米。所述晶片优选薄到足以能够在所述晶片上的细胞和它周围的细胞之间发生血管生长。在一种实施方案中，所述基质可以用生长因子，例如，VEGF处理。
在体外生长期间，所述细胞发育并且产生能包被所述基质材料的组织层。所述组织层能够发育成新形态的器官增强结构，并且支持其他培养的细胞群的生长和发育。在一种实施方案中，所述组织层可能来自肾细胞。在另一种实施方案中，所述组织层可能来自内皮细胞，所述细胞发育，以便产生原始血管系统。该原始血管系统可以继续生长和发育，并且进一步支持其他实质细胞的生长。
在一种实施方案中，所述增强目标是选自下组的器官心脏，肾脏，肝脏，胰腺，脾，膀胱，输尿管和尿道。在另一种实施方案中，所述增强目标是选自下组的器官的一部分心脏，肾脏，肝脏，胰腺，脾，膀胱，输尿管和尿道。在一种优选实施方案中，所述靶器官是肾脏。
在另一方面，本发明涉及一种治疗患有器官疾病的受试者的方法，该方法包括移植生物基质，所述生物基质是通过用细胞群接种基质材料而形成的，以便所述细胞与所述基质附着，从而产生能够分化成新形态的器官结构的包括原始血管系统的原生组织(proto-tissue)；以及监测所述受试者对所述器官疾病的调节。
在另一方面，本发明涉及一种人工器官构建体，它包括用细胞群接种基质材料而产生的基质，以便所述细胞与所述基质附着，产生包括能够分化成新形态的器官结构的原始血管系统的组织。
在另一方面，本发明涉及用于重建人工肾脏构建体的方法，该方法包括将组织特异性或未分化细胞接种到基质材料(如晶片，海绵或水凝胶)上，以便细胞与所述基质附着；在所述基质中和基质上培养所述细胞，直到所述细胞产生组织结构；并且将接种的基质移植到靶位点，以便进行体内器官增强。
在另一方面，本发明涉及一种治疗患有肾脏疾病的受试者的方法，该方法包括通过用细胞群接种基质材料而形成的基质，以便所述细胞附着在所述基质上，产生能够分化成新形态的肾脏结构的包括原始血管系统的组织；以及监测所述受试者对所述肾脏疾病的调节。
在另一方面，本发明涉及一种人工肾脏构建体，它包括通过用细胞群接种基质材料而形成的基质，以便所述细胞与所述基质附着，产生能够分化成新形态的器官结构的包括原始血管系统的原生组织。
附图简述

图1是表示利用生物基质增强肾脏的示意图。
详细说明除非另有说明，本发明的实践采用本领域技术人员所公知的常规微生物学方法，分子生物学方法和重组DNA技术。所述技术在文献中有详细说明(参见，例如，Sambrook，等Molecular CloningALaboratory Manual(Current Edition)；DNA CloningA PracticalApproach，Vol.I & II(D.Glover，ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，ed.，Current Edition)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins，eds.，Current Edition)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins，eds.，Current Edition)；CRC Handbook ofParvoviruses，Vol.I & II(P.Tijessen，ed.)；Fundamental Virology，2ndEdition，Vol.I & II(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.))。本发明还采用组织工程文献中所披露的技术(例如，参见Principles of TissueEngineering，Lanza等(Current Edition))。为了能更好地理解本发明，首先对某些术语进行定义在本文中所使用的短语“增强器官功能”或“增强器官的功能”，表示提高、增强、改善在低于最佳能力的条件下工作的器官的功能。该术语被用于表示增加功能，以便所述器官在所述受试者的生理学可接受的能力下工作。例如，来自儿童的诸如肾脏或心脏的器官的生理学可接受的能力，与成年或老年患者的生理学可接受的能力不同。可以增强整个器官，或器官的一部分。所述增强优选会导致与天然器官具有相同生理学反应的器官。在优选实施方案中，当器官以它的天然能力的至少10％行使功能的时候，该器官的能力就得到增强。
在本文所使用的短语“三维生物基质”或“增强构建体”或“新形态的器官增强结构”表示业已用所述细胞灌注过的，并且培养直到所述细胞形成组织层的小型基质。所述组织层可以是单一的单层，或多层。组织特异性细胞表示源于需要增强的特定器官的细胞，例如，来自要进行器官增强的肾脏器官的细胞，和来自要进行心脏器官增强的心脏的细胞。所述三维生物基质中的细胞建立了“组织样”组织学，可以再生组织样结构，并且发育成具有复杂的、多层结构的原始类器官，它最终能发育成实际器官或器官的一部分。所述三维生物基质是人工器官，或器官的一部分是天然器官的“功能等同物”，即以与天然器官相同或类似的方式起作用，例如，人工肾脏与体内的肾脏具有相同的功能特征。例如，肾脏增强结构可以是具有能够发育成肾单位结构或肾单位结构的一部分的一层组织的结构。对于肾脏增强来说，组织特异性细胞可以是选自下组的分离的细胞群远端小管细胞，近端小管细胞，肾小球细胞，Bowman氏囊细胞，和亨利氏袢细胞。另外，所述组织特异性细胞可以是远端小管细胞，近端小管细胞，肾小球细胞，Bowman氏囊细胞，和亨利氏袢细胞等细胞的混合细胞群。可以制备针对特定疾病或病症的各种三维生物基质。例如，所述三维生物基质可以是专门制备的，以便缓解与肾小球相关的病症，包括采用肾小球细胞的均匀群体，灌注所述基质材料。另外，所述三维生物基质可以是用肾细胞的混合细胞群制备的普通构建体。
当所述三维生物基质与所述器官中的靶位点的宿主组织接触时，它能够在所述靶位点内生长和繁殖，并且补充或增强所述器官在该位点的消失了的活性。所述增强构建体可以添加在所述器官内的单一位点。另外，可以制备多个增强构建体，并且添加到所述器官内的多个位点。
本文所使用的短语“肾细胞”表示源于肾脏的任何区域的细胞，如源于远端小管细胞，近端小管，肾小球细胞，Bowman氏囊细胞，或亨利氏袢细胞的细胞。该术语被用于表示包括来自肾脏的所有细胞的细胞混合物。该术语还被用于表示源于肾单位的一个区的分离的细胞亚群体，例如，仅有肾小球细胞的单一群体。可以通过从受试者体内采集生物活组织，获得来自肾脏的细胞。可以利用细胞分选技术，从病变细胞中分离健康细胞。还可以用细胞分选技术分离细胞的亚群。
本文所使用的术语“肾单位结构”，表示肾脏的完整的功能单位，它能够从血液中清除废物和多余的物质，以便产生尿液。在每一个肾脏中数百万个肾单位中的每一个，是长度为1.2-2.2英寸(30-55毫米)的小管。该小管的一端是封闭的，扩张的，并且折叠成双壁杯形结构，称之为“Bowman氏囊”，包绕被称为“肾小球” 的一簇毛细血管。通过肾小球的毛细管壁，强制从血液中流出的流体进入Bowman氏囊，流入相邻的肾小管，在这里，将水和养分选择性地从所述流体中重新吸收到血液中，并且在亨利氏袢细胞和近端小管中平衡诸如钠和钾的电解质。最终的浓缩产物以尿液形式收集在收集管中。
本文所使用的术语“肾单位结构的部分”表示所述肾单位的任何部分。例如，可以分选细胞群，以便产生仅由肾小球细胞组成的分离的细胞群。可以将这种肾小球细胞的分离群用于接种小型基质材料，并且培养，以便产生具有能分化成肾小球的肾小球组织层的三维小型生物基质。可以将相同的方法应用于由源于肾单位的不同区域的特定细胞制备三维小型生物基质，所述细胞分化成肾单位的一部分，如远端小管部分。与肾单位的特定区域相关的其他肾脏疾病，包括与肾小管细胞相关的病理状况。
本文所使用的术语“靶位点”表示所述器官中需要增强的区域。所述靶位点可以是所述器官内的单一区域，或者可以是所述器官内的多个区域。可以增强整个器官，或器官的一部分。所述增强优选能得到具有与正常器官相同的生理学反应的器官。可以通过将多个生物基质以合适的距离放置在整个器官上，例如，沿肾脏的整个纵切面放置，来增强整个器官。另外，可以通过将至少一个生物基质放置在所述器官的一个靶位点，例如肾脏的顶部，来增强该器官的一部分。
本文所使用的术语“附着”，表示直接粘附在所述基质上的细胞或它们本身附着在其他细胞上的细胞。
本文所使用的短语“小型基质材料”表示可以附着细胞的支持性构架。所述“小型基质”的最大尺寸优选具有不足大约50毫米。在一种优选实施方案中，所述基质是基本上扁平的结构，其最大尺寸与它的厚度之比大于5∶1。所述小型基质材料包括任何材料和/或形状，细胞可以附着在它上面或它内部(或可以修饰，以便细胞能附着在它上面或它内部)，并且使得细胞能生长成至少一个单层或至少一个组织层。然后，所培养的细胞群可以在所述基质上或在所述基质内生长。在一种实施方案中，所述基质材料是聚合物基质，它能提供细胞-细胞相互作用所需要的间隙距离。在另一种实施方案中，所述基质材料是由交联的聚合物网组成的水凝胶，它通常是不溶于水的或在水中的溶解度较差，不过，在存在过量水的情况下能够膨胀到平衡尺寸。由于水凝胶的独特性质及其在诸如药物送递的领域的潜在用途，业已合成并且表征了各种类型的水凝胶。
小型基质材料的尺寸还可以根据要增强的器官的面积而改变。所述尺寸通常小于完整的器官。所述基质的体积优选为大约1立方毫米至所述器官的尺寸。所述体积的大小最优选大约0.01立方毫米-大约30立方毫米，更优选大约0.1立方毫米-大约20立方毫米，甚至更优选大约1立方毫米，2立方毫米，3立方毫米，4立方毫米，5立方毫米，6立方毫米，7立方毫米，8立方毫米，9立方毫米，和10立方毫米。在很多场合下，长形或扁平基质都是优选的。所述基质的最大尺寸的长度优选大于0.2毫米，并且小于100毫米，更优选为大约0.50毫米-大约30毫米范围内。在一种优选实施方案中，所述小型基质的形状基本上是扁平的，并且它的最大尺寸与它的厚度之比大于5∶1，更优选大于10∶1。
所述小型基质材料的形状和尺寸，是根据要增强的器官，以及用于制备所述小型生物基质的小型基质材料的类型确定的。例如，如果将聚合物基质用于肾脏增强的话，所述聚合物基质的尺寸可以在所述聚合物基质的宽度和长度方面加以改变，例如，所述尺寸可以为大约1毫米宽×1毫米长×1毫米高-大约10毫米宽×20毫米长×1毫米高。技术人员可以理解的是，所述聚合物基质的大小和尺寸，可以根据要扩增的器官的区域，以及要扩增的实际器官来确定。
另外，如果用于增强肾脏的基质材料是水凝胶，可以根据肾脏中要增强的区域的大小确定水凝胶的体积。例如，可以在大约1立方毫米，2立方毫米，3立方毫米，4立方毫米，5立方毫米，6立方毫米，7立方毫米，8立方毫米，9立方毫米，和10立方毫米的范围内培养细胞群。在一种实施方案中，可以将水凝胶注射到所述器官的一个或多个靶位点。可以根据要增强的器官和器官的区域改变水凝胶的体积。例如，如果所述器官是心脏，并且要增强的是心脏中的梗塞区域的话，所述水凝胶的体积，可以是小于梗塞尺寸的体积至梗塞的实际尺寸。
本文所使用的术语“生物结构”表示业已通过从器官的部分除去完整细胞和组织成分而脱细胞的器官的部分。
本文所使用的术语“脱细胞的”或“脱细胞”表示生物结构(例如器官或器官部分)，业已从它除去了细胞和组织内容，留下了完整的无细胞基础结构。诸如肾脏的器官是由各种特化组织组成的。器官的特化组织结构或实质提供了与所述器官相关的特殊功能。器官的支持性纤维网是基质。大部分器官具有由未特化的结缔组织组成的基质构架，由它支持所述特化组织。所述脱细胞过程，能除去所述特化组织，留下结缔组织的复杂的三维网。结缔组织的基础结构，主要是由胶原组成。脱细胞的结构提供了可以在它上面注入各种细胞群的基质材料。脱细胞生物结构可以是刚性的或半刚性的，具有改变其形状的能力。可用于本发明的脱细胞器官的例子包括，但不局限于心脏，肾脏，肝脏，胰腺，脾，膀胱，输尿管和尿道。
本文所使用的短语“三维支架”，表示在对诸如器官的天然生物结构进行脱细胞之后形成的残余基础结构。这种复杂的三维支架提供了所述支持性构架，细胞可以与它连接并且在它上面生长。培养的细胞群随后可以在所述三维支架上生长，它提供了细胞-细胞相互作用所需要的确切的间隙距离。由此提供了类似于天然的体内器官的重建器官。用培养的内皮细胞群灌注这种三维支架，所述细胞群生长，并且发育，以便提供能够发育成成熟的血管系统的包括原始血管系统的内皮组织层。所述内皮组织层和原始血管系统还能够支持至少一个其他培养细胞群的生长和发育。
本文所使用的术语“原始血管系统”，表示血管系统发育的早期阶段，它包括向所述组织结构送递血液的血管。
本文所使用的术语“受试者”，表示任何能够引起免疫应答的活的生物。术语受试者包括，但不局限于人类，非人灵长类，如黑猩猩和其他猿和猴物种；家畜，如牛，绵羊，猪，山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物，如小鼠，大鼠和豚鼠等。该术语不表示特定年龄或性别。因此，该术语意在包括成年和新生受试者，以及胎儿，无论它们是雄性的或是雌性的。
I.细胞的分离和培养细胞可以从多种来源中分离，例如，从活检组织，或尸检组织，被程序化要分化成需要的器官细胞的干细胞群，业已进行包被以便使它没有免疫原性的异源细胞群，异种细胞，和同种异体细胞中分离。在本发明的范围内，还包括用诸如能改善组织形成的生长因子的因子转染细胞群的方法。
所述分离的细胞，优选是通过活组织检查，从所述受试者体内获得的同种异体细胞，自体细胞。例如，肾细胞还可以源于受试者的机能障碍的肾脏，并且在体外培养。所述活检组织可以通过使用活检针头获得，或使用能够使得这一过程快捷并且简单的快速动作针头获得。可以通过皮下注射少量的利多卡因，以局部麻醉形式处理进行活检区域。然后可以按照披露于以下文献中的方法对诸如肾脏的器官的小的活检核心进行繁殖，并且在体外培养Atala，等，(1992)J.Urol.148，658-62；Atala，等(1993)J.Urol.150608-12。还可以将来自亲属或相同物种的其他供体的细胞用于合适的免疫抑制。
在以下文献中披露了用于细胞分离和培养的方法Fauza等(1998)J.Ped.Surg.33，7-12和Freshney，动物细胞培养，A Manual of BasicTechnique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，1987，Ch.9，pp.107-126，以上文献被收作本文参考。可以用本领域技术人员所公知的技术分离细胞。例如，可以通过机械方法解离组织或器官和/或用消化酶和/或螯合剂处理，以便削弱相邻细胞之间的连接，使它能够将所述组织分散成单细胞的悬浮液，而又不会造成明显的细胞破坏。酶促解离可能伴随着组织的破碎，并且用多种消化酶中的任意一种单独或组合处理破碎的组织。所述消化酶包括，但不局限于胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胶原酶，弹性蛋白酶，和/或透明质酸酶，DNA酶，链霉蛋白酶和分散酶。另外，可以采用机械破碎，并且这一目的可以通过多种方法实现，这些方法包括，但不局限于刮器官表面，使用研磨器，搅拌器，筛子，匀浆器，压力室或超声处理器。有关组织分散技术的综述，可以参见Freshney，(1987)，动物细胞培养，A Manual of Basic Technique，2dEd.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.9，pp.107-126。
优选的细胞类型包括，但不局限于肾细胞，内皮细胞，心脏细胞，肝脏细胞，胰腺细胞，脾细胞，尿道上皮细胞，间充质细胞，平滑肌细胞或骨骼肌细胞，肌细胞(肌干细胞)，成纤维细胞，软骨细胞，脂肪细胞，纤维成肌细胞，和外胚层细胞，包括导管细胞和皮肤细胞，肝细胞，胰岛细胞，存在于肠道中的细胞，和其他实质细胞，成骨细胞和其他形成骨骼或软骨的细胞。在某些场合下，可能还需要包括神经细胞。在优选实施方案中，分离了肾细胞。可以使用来自所有发育阶段的肾细胞，如胎儿，新生儿，少年直到成年人的肾细胞。在另一种优选实施方案中，分离了内皮细胞。
一旦将组织降解成单细胞的悬浮液，可以将所述悬浮液分离成亚群，可以从这些亚群中获得细胞元件。这一目的还可以采用细胞分离的标准技术实现，包括，但不局限于特定细胞类型的克隆和筛选，选择性的破坏不想要的细胞(负选择)，基于混合细胞群中有差异的细胞聚集力进行的分离，冻-融方法，在混合细胞群中细胞的有差异的粘附特性，过滤，常规离心和区带离心，离心淘析(对流离心)，单位重力离心，对流分布，电泳和荧光激活的细胞分选。有关克隆筛选和细胞分离技术的综述，可以参见Freshney，(1987)，动物细胞培养，A Manual ofBasic Techniques，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.11 and 12，pp.137-168。例如，可以通过荧光激活的细胞分选，富集肾脏的肾细胞。另外，可以将肾细胞的不同区域分选成独立的亚群。例如，分离肾小球细胞，Bowman氏囊细胞，远端小管细胞，近端小管细胞，亨利氏袢细胞和收集管细胞的亚群。
为了从病变细胞中分选健康细胞，可能也需要细胞分级分离，例如，当所述供体患有疾病，如癌症或肿瘤转移时。可以分选细胞群，以便从正常非癌变细胞中分离恶性细胞或其他肿瘤细胞。然后可以将通过一种或多种分选技术分离的正常非癌细胞用于器官增强。
分离的细胞可以在体外培养，以便增加可用于对所述基质材料进行包被的细胞的数量。为了避免组织排异，优选使用同种异体细胞，更优选使用自体细胞。不过，如果在移植人工器官之后在受试者体内发生了免疫应答，可以用诸如环孢菌素或FK506的免疫抑制剂处理所述受试者，以便减弱排异的可能性。在某些实施方案中，可以将嵌合细胞，或来自转基因动物的细胞包被在所述基质材料上。另外，可以使用干细胞。
还可以使用干细胞制备本发明的新形态的器官增强结构。干细胞可源于人类供体，例如，多能造血干细胞。胚胎干细胞，成人体干细胞等。所述干细胞可以在存在多肽，重组人类生长因子，和促成熟因子，如细胞因子，淋巴因子，集落刺激因子，促丝裂原，生长因子，和成熟因子的组合的条件下培养，以便分化成想要的细胞类型，例如，肾细胞或心脏细胞。例如，在以下文献中披露了将成人骨髓干细胞(BMSCs)分化成肾脏和肝脏细胞的方法Forbes等(2002)，Gene Ther 9625-30。业已建立了用于将胚胎干细胞体外分化成诸如心肌细胞的方法，所述细胞代表心脏的所有特化的细胞类型，如房样，室样，窦房节样和Purkinje样细胞(例如，参见Boheler等(2002)Circ Res 91189-201)。来自后肾间充质的多能干细胞，可以产生至少三种不同的细胞类型肾小球细胞，近端和远端上皮细胞，即分化成单个肾单位片段(例如，参见Herzlinger等(1992)Development 114565-72)。
在对所述基质材料进行包被之前，可以用特定的基因转染所述器官细胞，例如肾细胞。所述新形态的器官增强结构，可能携带宿主或有要增强的器官长期存活所需要的遗传信息。
分离的细胞可以是正常的或遗传工程改造过的，以便提供额外的或正常的功能。例如，可以用能在所述器官内的靶位点减缓疾病进程的化合物转染细胞。还可以对细胞进行工程改造，以便减弱或消除所述宿主体内的免疫应答。例如，可以抑制诸如I型和II型组织相容性抗原的细胞表面抗原的表达。这可能会使得移植的细胞具有较小的被宿主排斥的可能性。另外，还可将转染用于基因送递。可以使用用逆转录病毒载体，聚乙二醇，或本领域技术人员所公知的其他方法对细胞进行遗传工程改造的方法。其中，包括使用在所述细胞内转运并且表达核酸的核酸载体(参见Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))。
生长在所述基质上的细胞可以进行遗传工程改造，以便产生对移植有利的基因产物，例如抗炎因子，例如，抗-GM-CSF，抗-TNF，抗-IL-1，和抗-IL-2。另外，可以对内皮细胞进行遗传工程改造，以便“剔除”会促进炎症的天然基因产物的表达，例如，GM-CSF，TNF，IL-1，IL-2，或MHC的“剔除”表达，以便降低排异的危险。此外，可以对细胞进行遗传工程改造，用于基因治疗，以便调节患者中的基因活性水平，从而辅助或改进组织移植的结果。
可以使用用逆转录病毒载体，聚乙二醇，或本领域技术人员所公知的其他方法对细胞进行遗传工程改造的方法。其中，包括使用在所述细胞中转运和表达核酸分子的表达载体(参见Geoddel；Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))。
通过常规转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以从以下文献中查阅到Sambrook等Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Edition，Cold SpringHarbor Laboratory press(1989)，和其他实验室教材。可以用含有转化或转染所述细胞的感兴趣的基因的重组DNA构建体，对接种的细胞进行工程改造。所述接种的基质包括能表达活性基因产物的转染过的细胞，可以将所述基质移植到缺少所述产物的个体内。例如，在疾病状况下，能抑制或缓解各种类型的血管，泌尿生殖道，疝，胃肠道疾病，或肾脏疾病的症状。可以通过提高所存在的基因产物水平或通过提高存在于包括基质材料和组织，例如，内皮组织层或肾组织层的生物基质中的活性基因产物的水平，提高所述基因活性的水平。然后，可以将表达所述活性靶基因产物的生物基质培养物移植到缺乏该产物的患者体内。
然后，可以将含有所述遗传工程改造过的细胞的生物基质培养物移植到所述受试者体内，以便缓解所述疾病的症状。所述基因表达可以受非诱导型(即组成型)或诱导型启动子的控制。可以根据随后的、用于各个患者进行治疗的模式，控制基因表达水平和调节的基因的类型。
II.基质材料本发明的方法和组合物是通过使用基质材料作底物制备的，在所述基质材料上沉积细胞，并且让细胞在它上面生长和粘附。对于要增强的特定器官来说，重要的是在培养物中重建体内存在的细胞微环境。保持与体内器官相似或相同的基础结构，产生了进行细胞-细胞相互作用，细胞群的发育和分化的最佳环境。在体内使用之前细胞和组织层生长的程度可能根据要增强的器官的类型而改变。
本发明提供了采用基质材料增强器官功能的方法，所述基质材料支持其他体外培养细胞的成熟，发育和分化，以便形成类似于其体内对应物的成体组织的成分。所述基质允许进行最佳的细胞-细胞的相互作用，从而允许更天然的形成细胞表型和组织微环境。所述基质还可以使细胞继续活跃生长，增殖并且分化，以便产生同样能支持其他培养的细胞群生长，增殖和分化的新形态的器官增强结构。
根据本发明，在所述基质材料上生长的细胞可以长成多层，形成类似于体内存在的生物学条件的细胞结构。所述基质可以支持不同类型细胞的增殖并且形成多种不同的组织。其例子包括，但不局限于肾脏，心脏，皮肤，肝脏，胰腺，肾上腺和神经组织，以及胃肠道和泌尿生殖道组织，和循环系统。
可以将本发明的接种过的基质用于多种用途。例如，可以将所述基质移植到受试者体内。根据本发明，移植物可用于替代或增强现有的组织。例如，通过增强天然肾脏治疗患有肾脏疾病的受试者。可以在移植所述基质移植物之后，监测所述受试者的肾脏病症的缓解。
在本发明的范围内，还包括用具有一个培养细胞群的新形态的器官增强结构进行器官增强的组合物和方法，以便由所述单一细胞群产生组织层。另外，所述新形态的器官增强结构，可以包括源于至少两个不同细胞群，例如，平滑肌细胞群，和尿道上皮细胞群的多层。在优选实施方案中，所述新形态的器官增强结构，包括具有原始血管系统和至少一个其他源于实质细胞的组织层的新形态的器官增强结构。
一旦灌注到所述基质材料上，所述内皮细胞就会在聚合物基质上增殖和发育，以便形成内皮组织层。在体外培养期间，所述内皮细胞发育并且分化，以便产生能够发育成成熟血管系统的原始血管系统，并且还能够进一步发育，并且还能支持灌注到所述基质材料内的实质细胞的生长。重要的是，由于所述聚合物基质具有允许培养基到达内皮组织层和实质细胞的基础结构，不同的细胞群继续生长，分裂，并且保持功能活性。所述实质细胞增殖，并且分化成新形态的器官结构，该结构具有类似于活体结构的形态学。在体内使用之前，内皮细胞和实质细胞生长的程度，可以根据要增强的器官类型而改变。可以增强的器官包括，但不局限于心脏，肾脏，肝脏，胰腺，脾，膀胱，输尿管和尿道。
(i)聚合物基质在优选实施方案中，所述基质材料是聚合物基质。合适的聚合物的例子包括，但不局限于胶原，聚(α酯)，如聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚原酸酯和聚酐以及它们的共聚物，纤维素醚，纤维素，纤维素酯，氟化聚乙烯，酚类，聚-4-甲基戊烯，聚丙烯腈，聚酰胺，聚酰胺酰亚胺，聚丙烯酸酯，聚苯并噁唑，聚碳酸酯，聚氰基芳醚，聚碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亚胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟烯烃，聚酰亚胺，聚烯烃，聚噁二唑，聚苯醚，聚亚苯基，硫化物，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚，聚三唑，聚氨酯，聚偏1，1-二氟乙烯，再生纤维素，尿素-甲醛，或所述材料的共聚物或物理混合物。
诸如聚乙醇酸的聚合物，是适用于生产器官增强结构的生物相容性结构。可以用诸如溶剂浇注，压力成形，拉丝，结网，淋滤，编织和包被的方法，对所述生物相容性聚合物进行成形。
在溶剂浇注中，以分支形式的减压结构，对存在于诸如二氯甲烷的合适溶剂中的一种或多种聚合物的溶液进行浇注。在溶剂蒸发之后，获得了薄膜。
在压力成形中，以每平方英寸最多30000磅的压力，将聚合物压制成合适的形式。拉丝包括由熔融聚合物进行拉伸，而结网包括通过将纤维压缩成毛毡样材料形成筛网。
在淋滤中，将含有两种材料的溶液，分散成接近所述器官最终形式的形状。然后将溶剂用于溶解掉所述成分之一，得到多孔结构(参见Mikos，US 5,514,378，被收作本文参考)。
在成核作用中，让器官形状的薄膜接触放射性裂变产物，它能产生辐射受损材料的轨迹。然后，用酸或碱对聚碳酸酯片材进行蚀刻，将辐射-受损材料的轨迹转化成孔。最后，可以用激光成型，并且穿过很多材料烧制单个的孔，以便形成具有均匀孔径的器官结构。
可以将所述聚合物基质制造成具有受控制的孔结构，它使得养分能够从培养基到达沉积的细胞群，但是，能阻止培养的细胞通过所述孔迁移。在体外细胞附着和细胞存活力，可以通过扫描电子显微镜，组织学进行评估，并且用放射性同位素进行定量评估。
可以将所述聚合物基质塑造成多种理想形状的任意一种，以便满足多种总体系统，几何学或空间限制。可以将所述聚合物基质成形成不同的尺寸，以便适合不同体形患者的器官。还可以对所述聚合物基质进行成形，以便有利于患者的特殊需要，例如，满足残疾患者的需要，所述患者可能具有不同的腹腔空间，可能需要重建的器官或部分器官，以便适合所述空间。
在其他实施方案中，将所述聚合物基质用于治疗体内的分层结构，如尿道，输精管，输卵管，泪腺管。在所述用途中，可以将所述聚合物基质成形为空心管状。
起着增强器官作用的本发明的新形态的器官增强结构可以是扁平的，管状的或具有复杂的几何形状。所述器官的形状是由它的预期用途决定的。可以移植所述人工器官，以便修复，增强或更换所述器官的病变的或受损伤的部分。可以使用扁平的片材或晶片。可以将扁平片材成形为需要的形状和几何形状，以便适合器官的靶位点，例如，卷绕成筒状或管状。例如，可以用管状移植物替代管状器官，如食道，器官，肠道，和输卵管的横切面。所述器官具有基本管状的形状，它具有外表面和腔面。
聚合物基质可以用一种材料渗透，例如，用液化共聚物(聚-DL-丙交酯共-乙交酯50∶50 80mg/ml二氯甲烷)渗透，以便改变它的机械性能。这一目的可以通过涂敷一层或多层，直到获得需要的机械性能而实现。所述聚合物基质的尺寸是根据需要的器官增强程度而确定的。例如，所述基质的尺寸可以为大约1毫米长×1毫米宽×1毫米厚。所述基质的形状和尺寸取决于要增强的器官的部位。
在一种实施方案中，要增强的器官是肾脏，并且所述基质可以是扁平片材，它的尺寸为大约1厘米×1厘米，并且厚度小于大约1毫米。所述基质的最大尺寸的长度大于0.2毫米，并且小于100毫米，更优为大约0.50毫米-大约30毫米。在优选实施方案中，所述小型基质的形状基本上是扁平的，并且，它的最大尺寸与它的厚度之比大于5∶1，更优选大于10∶1。
在另一种实施方案中，可以在接种细胞之后，将所述聚合物基质卷绕成管状，以便提供更大的器官结构体积。所述聚合物基质的尺寸和形状可以是圆片，晶片，卷绕的晶片，方形和矩形等。所述聚合物基质的形状，是根据要增强的区域，要增强的器官而确定的。对所述聚合物基质的大小和形状进行选择，以便所产生的新形态的器官增强结构的最大尺寸与它的厚度之比大于5∶1，更优选大于10∶1。
在一种实施方案中，可以用所述增强器官结构增强包括多层的器官，例如膀胱。这一目的可以通过以下方式实现，通过在所述聚合物基质的一面涂敷诸如肾细胞的第一种均匀细胞群的悬浮液，用所述聚合物基质的一面制备组织层。在培养基中培养所述第一种均匀细胞悬浮液，直到所述细胞发育，并且增殖产生单层，并且所述单层的细胞附着在所述聚合物基质上。一旦形成了所述单层，就将所述第一种均匀的细胞悬浮液沉积在所述第一单层上，并且培养所述细胞，直到它们发育并且增殖，以便在所述第一单层产生第二个细胞单层，从而形成双层。重复以上过程，直到产生包括所述第一均匀细胞群的多个层的多层。培养所述多层，以便产生具有形态学和功能特征的组织层，这些特征使得它能分化成器官增强结构。
在另一种实施方案中，利用所述聚合物基质的两侧产生多层均匀细胞群。这一目的是通过用诸如肾细胞的均匀细胞群的悬浮液涂敷所述聚合物基质的一面，并且培养所述细胞，直到它们发育成单层而实现的。在所述聚合物基质的相反一面重复以上过程。在所述聚合物的两面重复以上过程，直到在该基质的两面产生包括多层均匀细胞群的多层。培养在两面包括所述多层的聚合物基质，以便产生具有使它能分化成器官增强结构的形态学和功能特征的组织层。在另一种实施方案中，可以利用所述聚合物基质的两面制备不同细胞群的多层。这一目的是通过将诸如内皮细胞的第一均匀细胞群的悬浮液涂敷在聚合物基质的一面，并且培养所述细胞直到它们发育成单层而实现的。用诸如肾细胞的不同均匀细胞群在所述聚合物基质的相反一面重复所述过程。
在一种实施方案中，要增强的器官是肾脏。所述器官增强结构是通过接种在基质材料中或基质材料上的肾细胞，或分离的远端小管细胞，近端小管细胞，或肾小球细胞群制备的。可以沿它的纵轴线，通过手术方法切开所述肾脏，并且将所述新形态的器官增强结构放入肾脏内的至少一个靶位点。在另一种实施方案中，可以制备多个新形态的器官增强结构，并且将其添加在肾脏内的多个靶位点。要添加的新形态的器官增强结构的数量，取决于肾脏受损的程度。例如，如果肾脏上半部分的一半受到损伤的话，就可以沿肾脏上半部分等距离地放置大约1-大约10个晶片形式的增强构建体。要植入的增强构建体的数量，还取决于用于生产它们的晶片的尺寸。如果所述晶片具有诸如1厘米×1毫米×1厘米的大的尺寸，就需要较少数量的晶片来增强肾脏的上半部分。另外，如果所述晶片较小，例如，1毫米×1毫米×1毫米的话，就需要很多这样的晶片来增强所述肾脏的上半部分。
(ii)水凝胶在一种实施方案中，所述基质材料是由交联的聚合物网的水凝胶，通常它是不溶于水的或者在水中的溶解度较差，不过，在存在过量水分的情况下，能够膨胀到平衡尺寸。例如，可以将所述细胞放入水凝胶，并且将所述水凝胶注入器官内的所需位置。在一种实施方案中，所述细胞可以用胶原单独注射。在另一种实施方案中，所述细胞可以用胶原和其他水凝胶注射。水凝胶的组合物可以包括，但不局限于，例如，聚(酯)，聚(羟酸)，聚(内酯)，聚(酰胺)，聚(酯-酰胺)，聚(氨基酸)，聚(酐)，聚(原酸酯)，聚(碳酸酯)，聚(膦嗪)，聚(硫酯)，多糖和它们的混合物。另外，所述组合物还可以包括，例如聚(羟)酸，包括聚(α-羟)酸和聚(β-羟基)酸。所述聚(羟)酸包括例如，聚乳酸，聚乙醇酸，聚己酸，聚丁酸，聚戊酸，和它们的共聚物和混合物。由于水凝胶的独特性质，以及它们在作为受控的药物送递的领域的潜在用途，业已合成并且表征了各种类型的水凝胶。大部分此类工作集中在轻度交联的、均匀的均聚物和共聚物方面。
整体聚合，即在没有添加溶剂的条件下，使单体聚合制备均匀的水凝胶，能产生玻璃状、透明的聚合物基质，这种基质是非常坚硬的。当在水中浸泡时，所述玻璃状基质膨胀，成为柔软的和可弯曲的。多孔的水凝胶，通常是通过溶液聚合技术制备的，它能够在合适的溶剂中聚合单体。合成水凝胶(无论它是致密的凝胶或是疏松的聚合物网)的性质，取决于单体的类型，单体混合物中稀释剂的量，以及交联剂的量。随着所述单体混合物中稀释剂(通常是水)的量增加，所述孔径还可以提高到微米范围内。有效孔径为10-100纳米，和100纳米-10微米的水凝胶，分别被称为“微孔”和“大孔”水凝胶。水凝胶的微孔和大孔结构，可以区别于诸如多孔聚氨酯泡末的非水凝胶多孔材料。在塑料泡末领域，微孔和大孔被限定为分别具有小于50微米的孔和100-300微米的孔。造成这种差别的原因之一是，具有大于10微米孔的水凝胶是不常见的，而具有100-300微米的孔的多孔塑料是非常常见的。
微孔和大孔水凝胶，通常被称为聚合物“海绵”。当诸如甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)的单体，以45(w/w)％或更高的起始单体浓度在水中聚合时，产生了一种水凝胶，它的孔隙度大于所述均匀水凝胶的孔隙度。本发明的基质材料包括常规泡末或海绵材料，以及所谓的″水凝胶海绵″。有关水凝胶的进一步说明，可以参见美国专利号5,451,613(授予Smith等)。
(iii)生物结构的脱细胞部分在另一种实施方案中，可以用天然脱细胞器官的部分制备新形态的器官增强结构。可以通过从器官中取出完整的细胞和组织成分，将生物结构，或器官的部分脱细胞。所述脱细胞过程包括一系列顺序提取。这种提取过程的一个关键特征是，可以避免有可能干扰或破坏所述生物结构的复杂基础结构的粗糙的提取。第一个步骤包括消除细胞碎片，并且溶解所述细胞膜。在这一步骤之后，接着进行的是溶解细胞核细胞质成分和细胞核成分。
所述生物结构，例如，器官的部分，优选是通过用柔和的机械破碎方法除去所述部分器官周围的细胞膜和细胞碎片而脱细胞的。所述柔和的机械破碎方法，必须足以破坏细胞膜。不过，所述脱细胞过程，应当避免损伤或干扰所述生物结构的复杂的基础结构。柔和的机械破碎方法，包括刮所述器官部分的表面，搅拌所述器官部分，或者在合适体积的流体，例如，蒸馏水中搅拌所述器官。在一种优选实施方案中，所述柔和的机械破碎方法，包括在合适体积的蒸馏水中搅拌所述器官部分，直到破碎所述细胞膜，并且将细胞碎片从所述器官中去除。
在去除细胞膜之后，去除所述生物结构的细胞核和细胞质成分。这一目的可以通过在不破坏所述基础结构的前提下，溶解所述细胞成分和细胞核成分而实现。为了溶解细胞核成分，可以使用非离子型洗涤剂或表面活性剂。非离子洗涤剂或表面活性剂的例子包括，但不局限于Triton系列，可以从Philadelphia，Pa.的Rohm和Haas公司获得，所述系列包括Triton X-100，TritonN-101，Triton X-114，Triton X-405，Triton X-705，和Triton DF-16，可以从很多销售商那里购买。Tween系列，如单月桂酸酯(Tween 20)，单棕榈酸酯(Tween 40)，单油酸酯(Tween 80)，和聚环氧乙烷-23-十二烷基醚(Brij.35)，聚环氧乙烷醚W-1(Polyox)等，胆酸钠，脱氧胆酸盐，CHAPS，皂苷，n-癸基β-D-葡糖吡喃糖苷，n-辛基β-D-庚基P-D-葡糖吡喃糖苷，n-辛基α-D-吡喃葡糖苷和Nonidet P-40。
本领域技术人员可以理解的是，有关属于上述类型的化合物的说明和销售商可以通过商业渠道获得，并且可以在以下文献中查阅到″Chemical Classification，Emulsifiers and Detergents″，McCutcheon′s，Emulsifiers and Detergents，1986，North American and InternationalEditions，McCutcheon Division，MC Publishing Co.，Glen Rock，N.J.，U.S.A.和Judith Neugebauer，A Guide to the Properties and Usesof Detergents in Biology and Biochemistry，Calbiochem.R.，HoechstCelanese Corp.，1987。在一种优选实施方案中，所述非离子型表面活性剂是Triton.系列，优选TritonX-100。
所述非离子型洗涤剂的浓度，可以根据要脱细胞的生物结构的类型而改变。例如，对于诸如血管的精细组织来说，应当降低所述洗涤剂的浓度。非离子型洗涤剂的优选浓度范围，可以为大约0.001-大约2.0％(w/v)。更优选为大约0.05-大约1.0％(w/v)。更优选大约0.1％(w/v)-大约0.8％(w/v)。优选的浓度范围为大约0.001-大约0.2％(w/v)，特别优选大约0.05-大约0.1％(w/v)。
可以用诸如氢氧化铵的碱溶液溶解细胞骨骼成分，所述成分包括致密的细胞质长丝网，细胞间复合物和顶端纤维细胞结构。还可将由铵盐或它们的衍生物组成的其他碱性溶液，用于溶解细胞骨骼成分。所述其他合适的铵溶液的例子包括硫酸铵，乙酸铵和氢氧化铵。在一种优选实施方案中，使用氢氧化铵。
诸如氢氧化铵的碱性溶液的浓度可以根据要脱细胞的生物结构的类型而改变。例如，对于诸如血管的精细组织来说，所述洗涤剂的浓度应当降低。优选的浓度范围可以为大约0.001-大约2.0％(w/v)，更优选大约0.005-大约0.1％(w/v)。甚至更优选大约0.01％(w/v)-大约0.08％(w/v)。
脱细胞的、冷冻干燥的结构，可以在合适温度下保存，直到需要使用。在使用之前，可以在合适的等渗缓冲液或细胞培养基中平衡所述脱细胞的结构。合适的缓冲液包括，但不局限于磷酸缓冲的盐溶液(PBS)，盐溶液，MOPS，HEPES，和Hank′s平衡盐溶液等。合适的细胞培养基包括，但不局限于RPMI 1640，Fisher′s，Iscove′s，McCoy′s，和Dulbecco′s培养基等。
III.细胞粘附在某些实施方案中，通过用诸如基底膜成分，琼脂，琼脂糖，明胶，阿拉伯树胶，I，II，III，IV，和V型胶原，纤连蛋白，层连蛋白，糖胺聚糖，它们的混合物，以及为细胞培养领域的技术人员所公知的其他亲水性和肽附着材料的化合物涂敷所述基质材料，增强所述细胞与所述基质材料的附着。用于涂敷所述基质材料的优选材料是胶原。
例如，在其他实施方案中，在移植之前，在用培养的细胞涂敷所述基质材料之前或之后，可以用因子或药物处理基质材料，以便促进在移植之后新组织的形成。包括药物的因子可以掺入所述基质材料中，或者与所述基质组合提供。所述因子一般是根据要重建或增强的组织或器官选择的，以便确保在移植器官或组织中形成合适的新组织(例如，用于促进骨骼愈合的添加剂)(例如，参见Kirker-Head，(1995)Vet.Surg.24408-19)。例如，当把基质材料用于增强血管组织时，可以采用血管内皮生长因子(VEGF)促进新血管组织的形成(例如，参见美国专利号5,654,273，该专利被授予Gallo等)。其他有用的添加剂包括诸如抗生素的抗微生物剂。
IV.内皮组织层的建立在一方面，本发明涉及使用灌注在聚合物基质材料上或材料内的培养的内皮细胞群或脱细胞器官的一部分，以便所述内皮细胞生长并且发育，从而产生原始血管系统。所述内皮细胞可源于器官，如皮肤，肝脏，和胰腺，所述细胞可以通过活检(如果合适的话)或通过尸检获得。内皮细胞还可以从任何合适的尸体器官获得。在灌注到所述基质材料中之前，可以通过在体外将它们培养到需要的细胞密度，对所述内皮细胞进行扩增。
可以通过分解要被用作所述细胞来源的合适的器官，或器官或组织的一部分方便地分离内皮细胞。这一目的可以通过使用本领域技术人员所公知的技术而实现。所述组织或器官可以通过机械方法分离和/或用能削弱相邻细胞之间的联系的消化酶和/或螯合剂处理，使得可以将所述组织分散成单细胞的悬浮液，而又不会明显破坏细胞。酶促解离可以通过破碎所述组织，并且用多种消化酶中的任意一种或组合使用这些酶处理破碎的组织而完成。所述酶包括，但不局限于胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胶原酶，弹性蛋白酶，和/或透明质酸酶，DNA酶，链霉蛋白酶和分散酶。另外，可以采用机械破碎，并且这一目的可以通过多种方法实现，这些方法包括，但不局限于刮器官表面，使用研磨器，搅拌器，筛子，匀浆器，压力室或超声处理器。有关组织分散技术的综述，可以参见Freshney，(1987)，动物细胞培养，A Manual of Basic Technique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.9，pp.107-126。
一旦将组织降解成单细胞的悬浮液，可以将所述悬浮液分离成亚群，可以从这些亚群中获得内皮细胞。这一目的还可以采用细胞分离的标准技术实现，包括，但不局限于特定细胞类型的克隆和筛选，选择性的破坏不想要的细胞(负选择)，基于混合细胞群中有差异的细胞聚集力进行的分离，冻-融方法，在混合细胞群中细胞的有差异的粘附特性，过滤，常规离心和区带离心，离心淘析(对流离心)，单位重力离心，对流分布，电泳和荧光激活的细胞分选。(参见例如Freshney，(1987)，动物细胞培养，A Manual of Basic Techniques，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.11 and 12，pp.137-168)。
细胞在诸如聚合物基质中的基质材料中的生长可以通过在所述基质材料上添加或涂敷蛋白(例如，胶原，弹性纤维，网状纤维)糖蛋白糖胺聚糖(例如，硫酸乙酰肝素，软骨素-4-硫酸，软骨素-6-硫酸，硫酸皮肤素，硫酸角质素等)，细胞基质，和/或其他材料。
在灌注所述内皮细胞之后，应当在合适的营养培养基中温育所述基质材料。很多商业化培养基，如RPMI 1640，Fisher′s，Iscove′s，McCoy′s，Dulbecco′s培养基等可能都适合使用。所述培养基还应当定期更换，以便除去使用过的培养基，减少释放的细胞，并且添加新的培养基。重要的是让所述内皮细胞生长到这样一个阶段其中，在用所述实质细胞灌注所述内皮组织层之前，业已形成了包括原始血管系统的内皮组织层。
V.将实质细胞灌注到基质材料内皮细胞层上一旦所述内皮组织层达到了合适的生长程度，并且发育到产生原始血管系统的程度，就可以将诸如实质细胞的其他培养细胞群添加到所述内皮组织层上。可以培养灌注在所述内皮组织上的实质细胞，以便使所述细胞粘附在所述内皮组织层上。所述实质细胞可以在培养基中体外培养，使所述细胞生长并且发育，直到所述细胞产生类似于天然组织的形态学和结构。实质细胞在所述内皮组织层上的生长，导致实质细胞分化成合适的新形态的器官增强结构。
另外，在灌注所述实质细胞之后，所述基质可以在不进行实质细胞的事先体外培养的前提下移植到体内。选择用于灌注的实质细胞取决于要增强的器官。例如，肾脏的增强涉及将培养的内皮细胞灌注到基质材料内或基质材料上，培养所述细胞，直到它们发育成包括原始血管系统的内皮组织层。然后，可以用培养的肾细胞灌注所述内皮组织，并且在体外培养，直到所述肾细胞开始分化，形成肾单位结构。
所述实质细胞可以从细胞悬浮液中获得，所述悬浮液是通过用上述标准技术分离需要的组织而制备的。然后，在体外将所述细胞培养到需要的密度。在达到需要的密度之后，可将所述培养的细胞用于灌注具有所述内皮组织层的基质材料。所述细胞将在所述内皮组织层上增殖，成熟和分化。实质细胞的选择，取决于要增强的器官，例如，在增强肾脏时，所述基质材料，例如，聚合物基质和内皮组织层是用培养的肾细胞灌注的。在增强肝脏时，所述聚合物基质和内皮组织层是用培养的肝细胞灌注的。在增强胰腺时，所述聚合物基质和内皮组织层是用培养的胰腺内分泌细胞灌注的。在增强胰腺时，所述聚合物基质和内皮组织层是用培养的胰腺内分泌细胞灌注的。当增强心脏时，所述聚合物基质和内皮组织层是用培养的心脏细胞灌注的。有关可用于从各种组织获得实质细胞的方法的综述，可以参见Freshney，(1987)动物细胞培养，AManual of Basic Techniq ue，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.20，pp.257-288。培养细胞，直到它们分化到产生类似于天然体内组织形态学的新形态的器官增强结构。
可以将生长因子和调控因子添加到所述培养基中，以便增强，改变或调节所述培养物的增殖和细胞成熟和分化。培养物中的细胞的生长和活性，可以受多种生长因子的影响，如胰岛素，生长激素，生长调节素，集落刺激因子，红细胞生成素，表皮生长因子，肝脏造血因子(红细胞生成素)，和肝细胞生长因子。能调节繁殖和/或分化的其他因子包括前列腺素，白介素，和天然存在的抑素。
VI.三维生物基质的形成在一方面，本发明涉及形成三维生物基质，或器官增强结构/构建体。在一种实施方案中，制备的所述器官增强结构，是用于治疗破坏所述器官功能的特定疾病或失调的。例如，器官增强结构可以是为了增强，以及从而缓解与异常的肾小球功能相关的肾小球病的特定增强结构(例如，肾小球病，如与受损的肾小球滤过相关的原发性肾小球病(例如，急性肾炎综合征，快速进展的肾小球性肾炎(RPGN)，肾小球硬化，肾炎综合症，无症状的尿沉渣异常(hepaturia，蛋白尿)，和慢性肾小球性肾炎)，或与系统性疾病相关的继发肾小球病(例如，糖尿病肾病和免疫介导的多系统疾病)。所述器官增强结构可以用分离的肾小球细胞群制备，让所述细胞生长成组织层，并且随后移植所述构建体，以便治疗肾小球硬化。在另一种例子中，所述器官增强结构可以用分离的小管细胞群制备，以便增强，并从而缓解肾小管疾病，如近端小管机能障碍和肾小管酸中毒。这使得本发明的方法和组合物可用于治疗与肾单位的特定部位相关的特定病症和疾病。近端小管机能异常可能表现无选择性的重吸收缺陷，它可导致低钾血，氨基酸尿，糖尿，磷酸盐尿，尿酸尿，或碳酸氢盐尿。肾小管酸中毒(RTA)是由过滤的HCO3的重吸收缺陷，H的外泌或这两者导致的。肾小管酸中毒以与高氯血症和正常的肾小球功能为特征。RTA可以划分成远端RTA(RTA-1)，近端RTA(RTA-2)和高钾血RTA(RTA-4)。最后一种情况出现在多种高钾血症状态中，并且所述缺陷以所述小管不能外泌足够的NH4为特征，它是增加细胞钾储留的直接后果。
在另一种实施方案中，所述器官增强结构可以是用从要增强的器官中分离的细胞混合物制备的通用增强结构。例如，用肾细胞接种的新形态的器官增强结构，所述细胞包括远端小管细胞，近端小管细胞，亨利氏袢细胞，和肾小球细胞的混合物。
在另一种实施方案中，可以将所述增强构建体用于增强心脏功能。在本例子中，新形态的器官增强结构可以通过用心脏细胞群接种所述基质材料而制备。
在另一种实施方案中，可以将所述增强构建体用于增强膀胱功能。在本例子中，所述增强构建体可以通过用分离的尿道上皮细胞群，或包括平滑肌和尿道上皮细胞的混合物的细胞群接种所述基质材料而制成。
所述生物基质包括业已用至少一个培养细胞群灌注的基质材料，并且温育直到它形成单层，并且继续温育所述培养过的细胞，直到它形成由多个细胞单层组成的多层，并最终形成组织层，例如，肾组织层，或具有原始血管系统的内皮细胞层。
所述组织层的持续的活跃增殖，最终导致了所述组织层类似于体内器官的等同的实质组织。这可能部分是由于通过生产所述多层的方法导致的。通过一次在所述基质材料上首先培养第一个均匀的细胞群，直到每一层细胞被活跃增殖而产生的。温育所述多层，直到所述细胞发育并且繁殖为类似于体内器官的等同实质组织的结构和形态学。
因此，通过本发明方法形成的多层，能产生支持所述均匀的细胞群长期增殖所需要的蛋白，生长因子和调控因子。在形成所述第一个多层之后，由它提供了用于生产第二个多层的表面。第二个多层包括不同于第一个均匀细胞群的第二个均匀的细胞群。所述第二个多层是通过每次一层培养所述第二均匀的细胞群直到每一层细胞活跃增殖以便产生多层细胞，并最终形成组织层而形成的。
通过进一步体外温育或体内温育，所述组织层能够分化成器官增强结构。细胞在所述组织层中的生长可以通过添加诸如养分，生长因子，细胞因子，细胞外基质成分，分化诱导物，分泌产物，免疫调节剂，能够增强或允许细胞网生长的生物活性化合物或神经纤维蛋白，糖蛋白，和糖胺聚糖的因子进一步增强所述细胞在所述组织层中的生长。
在一种实施方案中，用于制备所述生物基质的基质材料是聚合物基质。所述组织层可以在所述聚合物基质的一面形成，或者在所述聚合物基质的两面形成，直到产生具有允许分化成器官增强结构的形态学和组织学的组织层。在另一种实施方案中，所述聚合物基质是业已在它里面混合了培养的细胞群的水凝胶。在所述水凝胶中温育所述细胞，直到它们形成能分化成器官增强结构的组织层。
VII.三维生物基质的移植通过标准手术方法将所述三维生物基质或器官增殖结构移植到需要增强的器官内。所述手术方法可以根据要增强的器官而改变。对于肾脏移植来说，可能需要将一系列三维生物基质移植到沿肾脏的无血管平面形成的切口中，或移植到器官的血管最少的区域。在其他用途中，本发明的构建体可以通过介入性较低的方法导入，例如，导管，针头，套针或插管类型的仪器。
VIII.用途本发明的方法和组合物可用于增强多种器官的器官功能。
(i)肾脏在一种实施方案中，本发明涉及用于增强肾脏功能的方法和组合物。由于实际上所有肾脏疾病都能导致肾衰竭，在大多数场合下，治疗的主要焦点是保留肾脏功能。受试者通常具有超过所需要的肾功能，并且大多数肾脏疾病不会导致明显的问题或症状，直到90％的肾功能丧失。因此，可将本发明的方法和组合物用于增强肾脏的肾功能，其中，至少具有大约2％的功能，优选大约5％的功能，更优选大约10％的功能，更优选大约15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90％的功能。还可将本发明的方法和组合物用于缓解急性和慢性肾衰竭的症状。可以增强的肾脏疾病包括，但不局限于(例如，肾小球病，如与受损的肾小球滤过相关的原发性肾小球病(例如，急性肾炎综合征，快速进展的肾小球性肾炎(RPGN)，肾小球硬化，肾炎综合症，无症状的尿沉渣异常(hepaturia，蛋白尿)，和慢性肾小球性肾炎)，或与系统性疾病相关的继发肾小球病(例如，糖尿病肾病和免疫介导的多系统疾病)。这使得本发明的方法和组合物可用于治疗与肾单位的特定部位相关的特定病症和疾病。近端小管机能异常可能表现无选择性的重吸收缺陷，它可导致低钾血，氨基酸尿，糖尿，磷酸盐尿，尿酸尿，或碳酸氢盐尿。肾小管酸中毒(RTA)是由过滤的HCO3的重吸收缺陷，H的外泌或这两者导致的。肾小管酸中毒以与高氯血症和正常的肾小球功能为特征。RTA可以划分成远端RTA(RTA-1)，近端RTA(RTA-2)和高钾血RTA(RTA-4)。最后一种情况出现在多种高钾血症状态中，并且所述缺陷以所述小管不能外泌足够的NH4为特征，它是增加细胞钾储留的直接后果。
(ii)心脏病在另一种实施方案中，可以将本发明的方法和组合物用于增强患有心脏疾病或病症的受试者的心脏功能。在美国，心力衰竭是导致发病和死亡的主要因素之一。心力衰竭可以由能减弱心脏泵血能力的任何条件所导致。最常见的是，心力衰竭是由心肌收缩力降低而导致的，它是由冠状动脉血流减少所导致的。很多其他因素都可能导致心力衰竭，这些因素包括对心脏瓣膜的损伤，维生素缺乏，以及原发性心肌病(Guyton(1982)Human Physiology and Mechanisms of Disease，ThirdEdition，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，Pa.，p.205)。心力衰竭通常表现为与心肌梗塞相关(Manual of Medical Therapeutics(1989)Twenty-Sixth Edition，Little，Brown & Co.，Boston(W.C.Dunagan andM.L.Ridner，eds.)，pp.106-09)。
人类的心力衰竭以心肌收缩力降低开始，它会导致心脏输出减少。可以将本发明的方法和组合物用于增强心脏功能。例如，通过制备新形态的器官增强结构，可以增强业已受到损伤或梗塞或局部缺血的心脏部位。
心脏病包括，但不局限于心绞痛，心肌梗塞，和慢性缺血性心脏病。
(iii)泌尿生殖道病症在另一种实施方案中，可以将本发明的方法和组合物用于增强患有泌尿生殖道器官疾病或病症的受试者的泌尿生殖道器官功能。泌尿生殖道疾病的例子包括，但不局限于与膀胱，尿道和输尿管相关的疾病。
(iv)脾病症脾是靠近胃的小器官，它是淋巴系统的一部分。脾有助于保护身体免受感染，并且过滤血液。切除了脾的患者，更容易受到某些类型的感染。因此，可以将本发明的方法和组合物用于改善和控制脾病症，例如，通过使用重组修饰过的细胞，它能表达控制所述疾病或病症的试剂。脾病症的例子包括，但不局限于特发性紫癜，Felty′s综合征，Hodgkin′s病，和免疫介导的脾破坏。
通过阅读本文所披露的说明书和实践，本领域技术人员可以理解本发明的其他实施方案和用途。无论出于何种原因在本文中提到的所有美国专利和其他文献都被专门收作参考。
实施例实施例1肾细胞的分离对诸如来自一周龄的C7黑色小鼠的小肾进行被膜剥离，解剖，和研磨，并且悬浮在Dulbecco′s改良的Eagles′s培养基(DMEM；Sigma，St.Louis，MO)中，该培养基含有pH 7.4的15mM Hepes，和0.5μg/ml胰岛素，1.0mg/ml胶原酶，和0.5mg/ml分散酶，来自多粘芽孢杆菌的中性蛋白酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。
在37℃下，用10分钟时间，用不含钙的Eagles基本必需培养基，动脉灌注诸如猪肾的大肾，在提取的3小时内进行。然后，用补充了1.5mM MgCl2和1.5mM CaCl2的相同缓冲液中的0.5mg/ml胶原酶(IV型，Sigma，St.Louis，MO)灌注所述肾脏。然后对所述肾脏进行被膜剥离，解剖，粉碎，并且悬浮在Dulbecco′s改良的Eagles′s培养基(DMEM；Sigma，St.Louis，MO)中，该培养基含有pH 7.4的15mMHepes，和0.5μg/ml胰岛素，1.0mg/ml胶原酶和0.5mg/ml分散酶，源于多粘芽孢杆菌的中性蛋白酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。
在37℃下，在水浴中，将来自大或小肾的肾细胞悬浮液轻柔搅拌30分钟。通过以50g的速度离心5分钟，回收所述细胞和片段。将沉淀物重新悬浮在含有10％胎牛血清(Biowhittaker，Walkersville，Maryland)的DMEM中，以便终止蛋白水解，并且让浑浊的溶液通过无菌的80目尼龙筛，以去除大的片段。通过离心回收细胞，并且，用不含钙的Dulbecco′s改良的Eagles′s培养基洗涤2次。
实施例2肾细胞的体外培养I.大鼠尾胶原的分离从大鼠尾部剥离腱，并且保存在50ml试管中的用去离子水制备的0.12M乙酸溶液中。在16小时后，在4℃下过夜。
对透析袋进行预处理，以便确保具有均匀的孔径并且清除重金属。简单地讲，将透析袋浸泡在2％碳酸氢钠和0.05％EDTA的溶液中，并且煮沸10分钟。通过多次蒸馏水漂洗除去碳酸氢钠和0.05％EDTA。
将包括大鼠腱的0.12M乙酸溶液放入处理过的透析袋中，并且透析2-3天时间，并除去乙酸。每隔3-4小时更换透析溶液。
(ii)对组织培养平板进行包被用含有大约30μg/ml胶原(Vitrogen或大鼠尾胶原)，大约10μg/ml人类纤连蛋白(Sigma，St.Louis，MO)和大约10μg/ml牛血清白蛋白(Sigma，St.Louis，MO)的溶液对75cm2的培养烧瓶进行包被，所述包被是在大约2ml补充培养基的总体积中进行的，在37℃下温育3小时。
(iii)细胞培养将消化过的单悬浮的肾细胞以大约1×106细胞/ml的浓度铺平板到修饰的胶原基质上，并且在大约10％胎牛血清，大约5μg/ml牛胰岛素，大约10μg/ml运铁蛋白，大约10μg/ml硒酸钠，大约0.5μM氢化可地松，大约10ng/ml前列腺素E2，大约100个单位/ml青霉素G，大约100μg/ml链霉素(Sigma，St.Louis，MO)的DMEM中，在5％的CO2培养箱中，在大约37℃下生长。
通过用溶解在不含钙离子的磷酸缓冲的盐溶液(PBS)(大约1.51mM KH2PO4，大约155.17mM NaCl，大约2.8mM Na2HPO4·7H2O)中的大约0.05％胰蛋白酶，大约0.53mM EDTA(Gibco BRL，GrandIsland，NY)处理，对铺满的单层进行继代培养。从第一代开始，可以通过悬浮在含有大约10％DMSO的培养基中将细胞培养任意时间，以便冷冻，并且在液体培养基中保存。
实施例3内皮细胞的分离和培养从解剖的静脉中分离内皮细胞。用静脉周的肝素/罂粟碱溶液(将3mg盐酸罂粟碱稀释在25ml Hanks平衡的盐溶液(HBSS)中，它含有100个单位的肝素(最终浓度4μg/ml))用于改善内皮细胞保存。将近端丝状环放置在静脉血管周围，并且用一个节固定。在靠近所述节的部位进行小的静脉切开手术，并且插入静脉插管的顶端，并且用第二个节固定在原处。在超过所述近端节的部位进行第二次小的静脉切开手术，并且用添加了20％胎牛血清，ECGF(100mg/ml)，L-谷氨酰胺，肝素(Sigma，17.5u/ml)和抗生物素-抗真菌剂的培养基199/肝素溶液培养基199(M-199)轻柔冲洗所述静脉，以便除去血液和血凝块。用大约1ml胶原酶溶液(溶解在98ml M-199中的0.2％Worthington I型胶原酶，1ml的FBS，1ml的FBS，1ml的PSF，在37℃下，15-30分钟，并且无菌过滤)冲洗解剖的静脉。还要用所述胶原酶溶液轻轻地扩张静脉，并且将扩张的静脉放入含有Hank′s平衡盐溶液(HBSS)的50ml试管中。在37℃下将含有胶原酶扩张的静脉血管的试管温育12分钟，以便消化所述静脉内衬。在消化之后，取出含有内皮细胞的静脉的内含物，放入无菌的15ml试管中。以125×g的速度将所述内皮细胞悬浮液离心10分钟。将内皮细胞重新悬浮在2ml含有10％FBS和青霉素/链霉素的Dulbecco.′s改良的Eagle培养基(DMEM/10％FBS)中，并且铺平板到用1％difcogelatin包被的24孔平板中。在37℃下温育所述内皮细胞过夜。
在温育过夜之后，用HBSS漂洗所述细胞，并且放入1ml新的DMEM/10％FBS。每周3次更换所述培养基。当培养物达到铺满时(3-7天之后)，通过用0.05％胰蛋白酶，0.53mM EDTA处理3-5分钟，直到细胞分散，对铺满的单层进行继代培养。将分散的细胞铺平板到用0.1％difcogelatin包被的培养皿上，分割比例为1∶4-1∶6。扩增所述内皮细胞，直到获得足够数量的细胞。对细胞进行胰蛋白酶化，收集，洗涤，并且计数，以便接种。
实施例4尿道上皮细胞和平滑肌细胞的分离和培养按照以前披露的方法培养收获的细胞Atala等，(1993)J.Urol.150608，Cilento等，(1994)J.Urol.152655，Fauza等，(1998)J.Ped.Surg，33，7-12，以上文献都被专门收作本文参考。
a)培养尿道上皮细胞群获得膀胱样品，并且制备用于培养。为了减少细胞损伤，用锋利的刀片切割所述样品，而不是用电烙术切割。用缝合线标记浆膜面，以便确保不会混淆哪一面表示尿道上皮细胞面。
用无菌的仪器在层流细胞培养厨中处理所述样品。制备补充了角质细胞-SFM(GIBCO BRL(Cat.No.17005)，牛脑垂体提取物(Cat.No.13028，25mg/500ml培养基)和重组上皮生长因子(Cat.No.13029，2.5μg/500ml培养基)的培养基。在4℃下，将10ml培养基放入两个10厘米细胞培养皿的每一个中，并且在第三个培养皿中放入3.5ml。通过将所述样品放入第一个培养皿，并且轻轻地将它前后搅动，从样品中除去血液。在第二个培养皿中重复以上过程，并最终将所述样品转移到第三个培养皿中。用10号解剖刀片轻轻地刮所述尿道上皮细胞表面，而不切入所述样品。尿道上皮细胞看上去是分散到所述培养基中的小型的不透明的材料。吸出所述尿道上皮细胞/培养基悬浮液，并且接种到24孔细胞培养平板的6个孔中，在每一个孔中接种大约0.5-1ml培养基，使每个孔的总体积为1-1.5ml。在37℃下5％的CO2中温育所述细胞。
次日(收获后的第一天)，将培养基从所述6个孔中吸出，并且添加新的培养基。以1000rpm的速度对所述细胞进行离心4分钟，并且除去上清液。将所述细胞重新悬浮在3-4.5ml的新鲜培养基中，在24孔平板上加热到37℃。
除去培养基，并且将PBS/EDTA(37℃，pH 7.2，0.53mM EDTA(0.53ml的0.5M EDTA，pH 8.0，分别在500ml PBS中))添加到24孔平板的每一个孔中，或将10ml添加到每一个10cm的培养皿中。然后，让所述细胞在2个10cm的培养皿中传代。然后，当所述细胞达到80-90％的铺满度时，对所述细胞进行传代，而不让所述细胞达到100％的铺满度。
在相差显微镜下观察所述细胞。当对于大部分细胞来说(大约5-15分钟)，分离细胞-细胞结合处，除去PBS/EDTA，向24孔平板的每一个孔中添加300μl或向每一个10cm的培养皿中添加7ml胰蛋白酶/EDTA(37℃，GIBCO BRL，Cat.No.25300-054)。定期搅动所述平板/培养皿。当80-90％的细胞从所述平板上分离并且开始漂浮时(大约3-10分钟)，通过向24孔平板的每一个孔中添加30μl或向每一个10cm的培养皿中添加700μl大豆胰蛋白酶抑制剂(GIBCO BRL，Cat.No.17075-029，在20ml PBS中添加294mg抑制剂)，终止EDTA的作用。向24孔平板的每个孔中添加0.5ml培养基，或者向每一个10cm的培养皿中添加3ml培养基。PBS/EDTA和胰蛋白酶/EDTA温育是在室温下进行的，不过，如果在37℃下温育所述平板将更有效。
通过以1000rpm的速度离心4分钟收获所述细胞，并且除去上清液。将所述细胞重新悬浮在5ml培养基中，并且用血细胞计确定细胞的数量。通过标准台盼兰染色测试确定细胞存活力。对于100mm的培养平板来说，最佳接种密度为大约1×106细胞/平板。将需要量的细胞分装到所述培养皿中，并且添加一定体积的培养基，使总体积达到大约10ml/平板。
b)培养膀胱平滑肌细胞。
在按上述方法从膀胱样品中除去尿道上皮细胞层之后，将其余的肌肉解剖成2-3毫米的肌肉片段。将每一个肌肉片段均匀地分布在100毫米细胞培养皿上。使所述肌肉片段干燥，并且使它粘附在培养皿上(大约10分钟)。将含有10％FCS的20ml Dulbecco′s改良的Eagle培养基添加到干燥的肌肉片段上。在37℃，5％的CO2下不加干扰的将所述肌肉片段温育5天时间。在第6天更换培养基，并且除去任何非粘附片段。将其余的片段一共培养10天时间，然后，除去所有的肌肉片段。培养业已粘附在所述培养皿上的来自所述肌肉片段的细胞，直到出现细胞小岛。对所述细胞进行胰蛋白酶处理，计数，并且接种到T75培养烧瓶中。
根据细胞密度，每3天对所述细胞进行饲养，并且当所述细胞达到80-90％的铺满度时对所述细胞进行传代。
实施例5心脏细胞的分离和培养本实施例披露了一种培养心脏细胞的方法。诸如来自心房组织的心脏细胞可以从哺乳动物获得。心房组织可以从诸如右心耳的组织中获得，所述组织是从正在进行需要心肺旁路手术的心血管手术患者体内获得的。可以取出所述心耳，并且放入冰-盐水半融化物中，以便漂洗。可以用手术刀片除去坚硬心包覆盖层，以便减少细胞收获物中所包含的结缔组织的量。可以将其余的心房肌肉切碎成小的(0.5-1.0立方毫米)的碎片，并且放入不含钙或镁的冷的Hank′s平衡盐溶液(HBSS)中(Whittaker，Walkerville，Mass.)。切碎的心房组织能够以1.43mg/ml的浓度在0.14％胶原酶溶液(Worthington，Freehold，N.J.)中消化。可以将所述碎片放入35ml的这种溶液中，并且在37℃下，以125RPM的速度在摇床上消化1小时。可以从所述心房组织中取出上清液，并且在37℃下，以3500RPM的速度离心10分钟。可以将所述切碎的组织放入另外35ml胶原酶溶液中，同时对上清液进行离心，并且再继续消化作用1小时。取出上清液胶原酶溶液，并且放在一边，以便用于第三次消化。可以将细胞沉淀重新悬浮在2ml含有30％新生牛血清(Whittaker)和0.1％抗生素溶液-10,000单位/cc青霉素G，10,000μg/cc链霉素和25μg/cc两性霉素B(Gibco，Grand Island，N.Y.)的具有Earle′s盐(Whittaker)的Eagle′s最低必需培养基(EMEM)中。这一过程可以持续到再次消化。
可以合并各种消化物，并且用血细胞计检测细胞浓度，并且用EMEM调整到1×105细胞/ml。可以将所述细胞铺平板到35毫米明胶包被的培养皿(Corning，Coming，N.Y.)上，并且在37℃下，在5％CO2的气氛中温育。在生长的前两周，每隔三天更换培养基，然后每隔5-7天更换培养基。当所述培养物分散，并且接近铺满时，用胰蛋白酶对它们进行处理，并且转移到60毫米用明胶包被的培养皿(Corning)中的EMEM中。当所述细胞接近铺满时，可以用胰蛋白酶对它们进行处理，并且转移到T-75烧瓶(Corning)中的MCDB 107(Sigma，Saint Louis，Mo.)中。
可以将在MCDB 107中生长的一部分细胞铺平板到四室明胶包被的载玻片培养平板(Lab Tek，Naperville，III)上。对照细胞可以是人脐带内皮细胞和人皮肤成纤维细胞培养物(Beaumont Research Institute，Royal Oak，Mich.)，它们可以在含有20％胎牛血清，1％L-谷氨酰胺，0.1％的5mg/ml胰岛素，5mg/ml运铁蛋白，5μg/ml硒酸(CollaborativeResearch Inc.)，0.6ml肝素(0.015％，溶解在M199)中，0.1％抗生素-抗真菌溶液(Gibco Laboratories10,000单位/ml青霉素钠G，100,000mcg/ml硫酸链霉素和25mcg/ml两性霉素B)，和300μg/ml购自Biotechnology Research Inst.，Rockville，Md.的内皮细胞生长添加剂(ECGS)的M119中生长。当对照培养物和收获的细胞展开并且接近铺满时，可以用HBSS漂洗，并且用10％的福尔马林固定10分钟。可以取出所述室，并且用免疫过氧化物酶染料对留在平板上的细胞进行染色，所述染料能够对平滑肌α肌动蛋白(Lipshaw，Detroit，Mich.)，横纹肌特异性肌球蛋白(Sigma，St.Louis，Mo.)，肌红蛋白(Dako，Carpinteria，Calif.)，因子VIII(Lipshaw，Detroit，Mich.)，和心房利尿钠因子肽(Research and Diagnostic Antibodies，Berkeley，Calif.)进行染色。然后用光学显微镜检查所述平板。
可以将一部分在MCDB 107中生长的细胞铺平板到96孔明胶包被的平板(Corning)上。当所述细胞展开并且接近铺满时，用HBSS漂洗，并且用2.5％戊二醛，0.2M cacodyiate缓冲液，pH 7.4(Polysciences，Inc.，Warrington，Pa.)固定，用1％四氧化锇(Polysciences，Inc.)进行后固定，包埋在Epon LX-112树脂(Ladd′s Research，Burlington，Va.)中，用0.03％的柠檬酸铅(EastmanKodak，Rochester，N.Y.)和用50％乙醇制备的饱和乙酸脲(Pelco Co.，Tustin，Calif.)染色，然后在透射电子显微镜下检查。
实施例6脱细胞器官或部分器官的制备以下方法披露了用于除去器官或组织的完整的细胞成分，而又不破坏所述器官或组织的复杂的三维基础结构的方法。使用组织取出的标准技术，从C7黑色小鼠体内手术取出肾脏。将所述肾脏放入含有合适体积的蒸馏水以便能覆盖分离的肾脏的烧瓶中。使用磁力搅拌板和磁力搅拌器使分离的肾脏在4℃下，以合适的速度在所述蒸馏水中旋转24-48小时。这一过程能够除去所分离的肾脏周围的细胞碎片和细胞膜。
在上述第一个去除步骤之后，用含有0.5％Triton X-100的0.05％的氢氧化铵溶液更换所述蒸馏水。使用磁力搅拌平板和磁力搅拌器，在4℃下让所述肾脏在该溶液中旋转72小时。这种碱溶液能够溶解分离的肾脏的细胞核和细胞质成分。使用洗涤剂Triton X-100去除肾脏的细胞核成分，而利用氢氧化铵溶液裂解分离的肾脏的细胞膜和细胞质蛋白。
然后在4℃下，使用磁力搅拌平板和磁力搅拌器用蒸馏水洗涤分离的肾脏24-48小时。在该洗涤步骤之后，通过对一小片肾脏进行组织分析，证实从分离的肾脏中除去了细胞成分。如果必要的话，再次用含有Triton X-100的氢氧化铵溶液处理分离的肾脏，直到除去分离的肾脏的所有细胞内含物。在除去溶解的成分之后，制备了呈分离的肾脏形状的胶原性三维构架。
用1倍磷酸缓冲液(PBS)平衡该脱细胞的肾脏，包括使用磁力搅拌平板和磁力搅拌器使脱细胞的肾脏在4℃下旋转过夜。在平衡之后，在真空条件下将脱细胞的肾脏冷冻干燥过夜。用环氧乙烷气体对冷冻干燥的肾脏进行消毒72小时。在消毒之后，马上使用所述脱细胞的肾脏，或者在4℃下或在室温下保存直到使用。在接种培养细胞之前，将保存的器官放在组织培养基中，在4℃下平衡过夜。
实施例7肾增强器官结构的制备本实施例披露了用于移植到诸如肾脏的器官的一个或多个部位的晶片的制备。确定用于放入所述肾实质的肾组织基质(晶片)的大小和形状。例如，大约1毫米厚，即长和宽大约2cm的基质。将单一悬浮的肾细胞以大约10×106细胞cm3的浓度接种到肾组织基质上。在37℃下，用大约2小时让所述细胞附着在所述基质上。然后，将所述基质翻转到相反一面，并且将单一悬浮的肾细胞接种到肾组织基质上。在37℃下，用大约2小时让所述细胞附着在所述基质壁上。在温育结束之后，将培养基缓慢添加到所述烧瓶中，以便覆盖整个肾基质。应当小心不扰动所述基质内的细胞。在提供CO2的37℃的培养箱中温育所述基质。每天更换培养基或者更频繁地更换，这取决于所产生的乳酸水平。在开始接种之后的第4天，将所述细胞-基质系统放入旋转生物反应器系统中，再温育3天时间，以便获得均匀的细胞分布和生长。
实施例8肾增强器官结构的移植将肾增强器官晶片放入诸如肾脏的器官的一个或多个区域。所述受体肾的表面是暴露的。用血管钳临时夹住肾血管，以便减少出血。在肾囊上形成一个切口，以便进入肾实质。将所述囊小心地从所述实质上推开。将大小和形状类似于所述肾组织基质的肾实质组织取出，而在取出期间不破坏收集系统。将接种过细胞的肾组织基质放入所述肾实质，并且将所述肾囊缝合在移植的肾组织基质上。去掉血管钳恢复循环。通过在移植物上轻轻按压而达到止血。止血后，闭合伤口。在移植之后，检查所述细胞在肾增强器官结构中的生长和发育。移植一周之后的肾生物基质的照片显示，所述细胞是活的，并且在100倍的放大倍数下用亲脂性红色荧光示踪剂carbocyanine检测呈阳性(照片未发表)。在移植之后四周，见到了肾小管和肾小球样结构的形成(H & E×200，照片未发表)。所述肾小管结构的发育持续到移植后第8周(照片未发表)。
权利要求
1.一种用于增强器官功能的人工器官构建体，它包括通过用至少一个培养细胞群灌注基质材料而形成的三维生物基质，以便所述细胞附着在所述基质材料上，并且产生能够增强器官功能的组织层。
2.如权利要求1的构建体，其中，所述构建体是通过将细胞灌注在小型基质材料上形成的。
3.如权利要求1的构建体，其中，选择所述构建体，以便增强选自下组的器官心脏，肾脏，肝脏，胰腺，脾，膀胱，输尿管和尿道。
4.如权利要求1的构建体，其中，所述基质材料是脱细胞的组织。
5.如权利要求1的构建体，其中，所述基质材料是水凝胶。
6.如权利要求1的构建体，其中，所述基质材料是聚合物。
7.如权利要求2的构建体，其中，所述基质的最大尺寸小于50毫米。
8.如权利要求1的构建体，其中，所述基质是基本上扁平的结构，它的最大尺寸与它的厚度之比大于5∶1。
9.如权利要求1的构建体，其中，所述构建体是增强肾功能的构建体，它包括通过用肾细胞群灌注基质材料而形成的三维生物基质，以便所述肾细胞附着在所述基质上，并且产生分化成肾单位结构或肾单位结构的一部分的组织层，从而增强肾功能。
10.如权利要求1的构建体，其中，所述基质最初是用内皮细胞群灌注过的，以便所述内皮细胞附着在所述基质上，产生包括血管系统的内皮组织层，然后，接种第二个细胞群，以便所述第二个细胞群附着在所述包括血管系统的内皮组织层上，并且分化，从而增强器官功能。
全文摘要
本发明提供了利用小型基质移植物增强器官功能的方法和组合物，所述移植物是通过将组织特异性或未分化的细胞接种到基质材料(例如，晶片，海绵或水凝胶)上而制备的。然后，可以移植接种的基质组合物，并且在体内发育成器官补充结构。接种的细胞在移植基质上的继续生长和分化，导致了在所述组织中形成原始血管系统。然后，所述原始血管系统可以发育成成熟的血管系统，并且，还能够支持其他培养的细胞群的生长和发育。可以利用所述接种的基质系统在体内导入多种不同的细胞和组织。
文档编号C12M3/00GK1615162SQ02827228
公开日2005年5月11日 申请日期2002年11月12日 优先权日2001年11月16日
发明者A·阿塔拉 申请人:儿童医疗中心有限公司