专利名称：一种新型空气微生物采样液的制作方法
技术领域：
空气微生物对人类健康带来的危害日益严重并逐步引起各方关注。空气微生物中一种或多种组分会对暴露其中对象的健康产生影响。空气微生物与很多疾病有关，它们或作为过敏原引起过敏反应(如真菌孢子)；或作为传染原引起传染病(如结核分枝杆菌)；而且有些较低浓度的空气微生物就可以引起急性或慢性的健康损害。由于当今生活水平和生活质量的提高，人们对空气质量的要求也愈来愈高。所以准确地监测室内外环境空气中的微生物污染，对制定环境标准，消除污染危害和保证人民健康都是十分必要的。
背景技术：
空气微生物分析的第一步是必须将空气中的微生物收集在固体、半固体或液体基质中，然后才能进行后续的生物学、物理学、和化学分析。无论是固体还是液体的采样基质在应用时都会碰到气流撞击的问题，在这种冲击下如何能保证微生物的存活是一个比较棘手的问题，所以研制一种能够保证微生物存活和适应后续检测的新型采样液就有着十分重要的意义。微生物尤其是细菌的生长速度很快，例如大肠杆菌每20分钟就能繁殖一代，如果采样液中含有刺激细菌繁殖的物质，那么细菌数目在采样和递送至分析和检测的几个小时之内会有惊人的增长，这就造成了对采样样品的过高估计。过高估计样品中的细菌数目会造成假阳性结果，这就会导致人们对本来不具危害地区采取措施，造成人力和财力的浪费。所以选取采样液时的一个准则是保持样品完整。既不能刺激生长，也不能对样品造成危害。例如有些报道使用培养基来直接采样，如果是在夏季高温下进行采样而又未能及时进行分析，则采样液中的微生物尤其是细菌就会很快繁殖，造成一个不可信的结果。
目前国际上对于空气微生物采样液的使用还没有一个普遍认可的方案，在使用采样液时基本上是各行其是。随意使用采样液的后果是可能低估或高估空气微生物的含量，这就给实验结果的解释带来了一定困难。例如有人使用的采样液是最单纯的无菌水，而有人使用一些简单的无机盐缓冲液，这些采样液仅起到一个收集作用，对微生物的保护和稳定作用较差，也不能满足我们在某些特殊条件下的需要(比如在冷冻温度下使用)。保证存活对于微生物的分离培养和鉴定是十分必要的，因此研制新型空气微生物采样液具有十分重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种空气微生物采样液。
本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明空气微生物采样液含有如下组合物0.05mol/L PBS〔磷酸盐缓冲液〕150-300体积份〔重量体积比为g/ml〕、肌醇10-30重量份、海藻糖10-30重量份、甜菜碱1.0-5.0体积份、甘油100-350体积份、去离子水300-800体积份；采样液中0.05mol/L PBS 150-300体积份可以用1mol/L Tris-HCl 5-15体积份替代；其中0.05mol/L PBS由40重量份NaCl，1.0重量份KCl，7.2g Na2HPO4，1.2重量份KH2PO4，1体积份(重量体积比为g/L)H2O，pH7.4制成；1mol/L Tris-HCl由121重量份Tris碱，1体积份(重量体积比为g/L)H2O，pH调至7.4制成；上述组合物加入常规溶剂制成采样液。
与常规采样液相比，本发明采样液能够保持样品完整，既不刺激空气微生物的生长，同时具有较好的保护效果。本发明采样液同时具有一定的抗冻、抗蒸发能力，可以在零下10摄氏度使用，在夏季使用可具有一定的抗蒸发性。
采样是空气微生物分析和检验的第一个步骤，而采样液是空气采样得以实现的必要条件和手段，采样液的使用直接关系到样品的处理、分析和检测效果，因此采样液研究对于环境监测、卫生检验、流行病学调查、工程菌污染评估、空气过敏源确定等方面都具有重要的意义。随着人们生活水平的提高，人们对环境卫生愈加重视，对空气质量要求越来越高，能够用于大部分空气微生物检测的新型采样液会有一定的需求量。
实验例1正交实验选取0.05mol/L PBS(40g NaCl，1.0g KCl，7.2g Na2HPO4，1.2g KH2PO4，1L H2O，pH7.4)或1mol/L Tris-HCl(121g Tris碱，pH调至7.4)(为了统计处理方便，这两种成分以下简称(A)，肌醇(B)，海藻糖(C)，甜菜碱(D)和甘油(E)五种成分作为采样液的组成部分，每个成分取三个浓度，利用正交实验设计来测试静态下各种成分对细菌的保护作用。实验基础来自正交表L27(313)，每个成分的三个浓度即为三个不同的实验水平，五种成分即为实验所涉及的因素数，即我们实验中所选用的各种试剂，正交表第一列的1-27代表实验次数，即将要进行27个平行实验(表1，表2)。此外根据试剂性质和工作经验，考虑三个交互作用AB，AC，AE。
表1.27次试验正交安排表试验号1(A)2(B)5(C)8(E) 11(D)1 1 1 1 1 12 1 1 2 2 23 1 1 3 3 34 1 2 1 2 35 1 2 2 3 16 1 2 3 1 27 1 3 1 3 28 1 3 2 1 39 1 3 3 2 110 2 1 1 1 111 2 1 2 2 212 2 1 3 3 313 2 2 1 2 314 2 2 2 3 115 2 2 3 1 216 2 3 1 3 217 2 3 2 1 318 2 3 3 2 119 3 1 1 1 120 3 1 2 2 221 3 1 3 3 322 3 2 1 2 323 3 2 2 3 124 3 2 3 1 225 3 3 1 3 226 3 3 2 1 327 3 3 3 2 1
表2.正交表中的各个因素及其水平因素 A(PBS or B C E DTris)水平10.01mol/L 0.5％0.5％ 5％ 0.1mol/L水平20.02mol/L 1％ 1％ 10％ 0.2mol/L水平30.05mol/L 2％ 2％ 30％ 0.5mol/L此正交设计针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粘质沙雷氏菌均同时开展实验。具体实验步骤为，将9.5ml最终配方液体置于大试管内，加入0.5ml菌液，室温放置30min，然后从每个大试管中取1ml涂布两个营养琼脂平板，37℃倒置培养12小时后计菌落数。实验对照组为10ml无菌去离子水。完毕后用SAS统计软件进行分析，根据分析结果选取保护效果较好的前8种，命名为Samplution PX1，PX2，PD1，PD2，TX1，TX2，TD1和TD2。其中X代表夏用型，D代表冬用型。
表3六次正交实验结果结果(P1/P2/T1/T2/粘沙/金葡) 存活率％ 存活率提高百分点％管号(单位CFU) 计数结果/菌总数×100％ (计数-对照)/菌总数×100％1335/143/157/242/756/24389.8/77.3/53.2/71.8/99.5/10568.9/48.1/44.1/17.5/33.2/31.02350/138/175/229/748/20593.8/74.6/77.6/68.0/98.4/89.1 72.9/45.4/50.2/13.6/32.1/14.53264/108/141/238/648/18470.8/58.4/47.8/70.6/85.3/79.2 49.9/29.2/38.6/16.3/18.9/4.514266/76 /146/238/666/16971.3/41.1/49.5/70.6/87.6/73.5 50.4/11.9/40.3/16.3/21.3/-1.15265/167/160/261/771/22371.0/90.3/54.2/77.4/100 /97.0 50.1/61.1/45.1/23.1/35.1/22.36307/172/163/265/690/23382.3/93.0/55.3/78.6/90.8/10161.4/63.8/46.1/24.3/24.5/26.77364/161/162/247/739/20797.6/86.5/54.9/73.3/97.2/90.0 76.7/57.8/45.8/19.0/30.9/15.48252/108/118/269/693/22367.6/58.4/40.0/79.8/91.2/97.0 46.6/29.2/30.8/25.5/24.9/22.39336/149/152/277/672/17190.1/80.5/51.5/82.2/88.4/74.3 69.2/51.4/42.4/27.9/22.1/0.010314/141/127/252/752/27784.2/76.2/43.1/74.8/98.9/12063.3/47.0/38.6/20.5/32.6/45.811327/150/165/262/672/21887.7/81.0/55.9/77.7/88.4/94.8 66.8/51.9/41.7/23.4/22.1/20.112240/98 /97 /236/618/19964.3/53.0/32.9/70.0/81.3/86.5 43.4/23.8/24.1/15.7/15.0/11.913258/107/117/235/686/19969.2/57.8/39.7/69.7/90.3/86.5 48.3/28.6/27.1/15.4/23.9/11.914331/146/185/211/683/27388.7/78.9/62.7/62.6/89.9/11967.8/49.7/40.3/8.30/23.6/47.115341/147/179/170/645/19591.4/79.5/60.7/50.4/84.9/84.8 70.5/50.2/40.7/-3.9/18.6/10.216319/157/141/195/739/22785.5/84.9/47.8/57.9/97.2/98.7 64.6/55.7/44.1/3.60/30.9/24.117204/87 /104/235/676/20254.7/47.0/35.3/69.7/88.9/87.8 33.8/17.8/20.3/15.4/22.6/13.018342/129/139/340/756/18691.7/69.7/47.1/100 /99.5/80.9 70.8/40.5/34.6/46.6/33.2/6.2519295/133/125/308/745/21479.1/71.9/42.4/91.4/98.0/93.0 58.2/42.7/35.9/37.1/31.7/18.420346/135/151/289/718/20392.8/73.0/51.2/85.8/94.5/88.3 71.8/43.8/36.6/31.5/28.2/13.621216/99 /91 /240/569/19257.9/53.5/30.8/71.2/74.9/83.5 37.0/24.3/24 4/16.9/0.09/8.8622223/80 /123/190/670/20959.8/43.2/41.7/56.4/88.2/90.9 38.9/14.1/18.0/2.00/21.8/16.323292/139/153/285/745/20078.3/75.1/51.8/84.6/98.0/87.0 57.4/45.9/38.0/30.3/31.7/12.324352/135/143/326/741/18494.4/73.0/48.5/96.7/97.5/80.0 73.5/43.7/36.6/42.1/31.2/5.3825324/151/144/279/679/19686.9/81.6/48.8/82.8/89.3/85.2 66.0/52 4/42.0/28.5/23.0/10.626194/99 /93 /220/558/19652.0/53.5/31.5/65.3/73.4/85.2 31.1/24.3/24.4/11.0/0.07/10.627324/141/130/248/662/16286.9/76.2/44.1/73.6/87.1/70.4 66.0/47.0/38.6/19.3/20.8/-4.1
说明大肠杆菌包括P1，P2，T1，T2四次试验，粘质沙雷氏菌(表中简称粘沙)和金黄色葡萄球菌(表中简称金葡)各一次。P1，P2，T1，T2，粘沙和金葡六个对照0min结果依次为；373，185，295，337，7602和302 CFU，60min后对照组结果依次为78，54，27，183，504和172 CFU。
正交试验结果表明采样液与对照组相比，在静态下对三种细菌保护效率平均提高58.2％，40.5％，44.1％，20.5％(大肠杆菌四次实验)，24.7％(粘质沙雷氏菌)和15.4％(金黄色葡萄球菌)。SAS统计结果表明，成分D在整个采样液中所起的显著性作用比较明显。AB、AC和AE之间都没有明显的交互作用(表3)。在几种试剂之间并不存在着交互作用，这意味着几种试剂可以以任意比例混溶，对采样液定型设计有很大的方便。
实验例28种Samplution进行抗冻、抗蒸发和初步应用实验。
将冬用型Samplution 10ml置入-20℃冰箱中放置，30min观察是否结冰。将10ml Samplution置于10ml锥形管中，37℃放置30min记录剩余液体量。使用AGI-10采样器，内装10ml不同配方的采样液，在室温下使用打气机在7L/min恒定流速下打气30min。使用大容量采样器采样，同时使用10mlSamplution、PBS和LB肉汤，观察剩余液体量。
静态下Samplution为无色、无味、透明均一的液体，pH值约为7.4-7.6，密度在1.1-1.2之间(表4)。静态下Samplution在35℃，30min中内基本没有蒸发作用，但在动态下即20℃，30min和35℃，30min时有较大程度的蒸发作用，与无菌水相比基本没有差别(表5)。但在使用大容量采样器时，Samplution抗蒸发效果就显示出来了，它比PBS和肉汤蒸发作用减少了10％。冬用型Samplution在-20℃时全部未结冰，但在-25℃时有微量结冰现象。
表4 Samplution的密度和pH值采样液 PX1 PX2 PD1PD2TX1TX2TD1TD2密度 1.151.151.21 1.21 1.14 1.16 1.21 1.21pH 7.357.277.23 7.27 7.74 7.67 7.67 7.64
表5 Samplution动态下蒸发量(30min后)采样液 PX1PX2PD1PD2TX1TX2TD1TD220℃ 1.71.71.41.82.01.72.01.335℃ 1.91.91.82.01.82.02.02.0在经过综合考虑后，我们淘汰了其中四种采样液，剩下的4种为PD1(A1B3C3D1E3，即0.01mol/L PBS、2％肌醇、2％海藻糖、0.1mol/L甜菜碱和30％甘油)，PX2(A1B3C3D1E1，即0.01mol/L PBS、2％肌醇、2％海藻糖、0.1mol/L甜菜碱和10％甘油)，TD1(A1B3C3D2E3，即0.01mol/L Tris-HCl、2％肌醇、2％海藻糖、0.2mol/L甜菜碱和30％甘油)，和TX2(A1B3C3D2E1，即0.01mol/L Tris-HCl、2％肌醇、2％海藻糖、0.2mol/L甜菜碱和10％甘油)。
实验例3实际应用初步应用的测试在500L气雾室中进行，测试菌株使用大肠杆菌。使用TK-2型气溶胶发生器发生大肠杆菌气溶胶，发生5min后利用AGI-10采样器以7L/min恒定流速采样(此时气溶胶发生器继续发生气溶胶)，内装10mlSamplution，采样时间为5min。然后从每个采样器中取1ml涂布两个营养琼脂平板，37℃倒置培养12小时后计菌落数，实验对照组为10ml无菌PBS。观察Samplution对细菌回收率。采样器中剩余液体取一定量进行核酸扩增实验，观察采样液对核酸分析的影响。
4种采样液在动态条件下对待测微生物具体保护效果(以提高百分比计，括号中的两个数值，前者为Samplution采样液中细菌菌落数，后者为对照组菌落数)为PD1(153/47226％)；PX2(111/17553％)；TD1(120/48150％)；TX2(419/114268％)。采样液对随后的核酸检测有轻微影响，但可以通过氯仿抽提或快速核酸抽提技术消除。甚至在对照样品中微生物回收率为0的情况下，Samplution中仍能够有效回收到较低浓度的微生物。
Samplution对核酸分析的影响。当待测样品占扩增体系的10％时，基本不会影响以后的核酸扩增；当待测样品占扩增体系40％或以上时，会明显影响甚至抑制核酸扩增；两种缓冲体系中，PBS系统比Tris系统的影响因素更大。鉴于核酸扩增所需样品量较少，所以采样液对核酸扩增的影响基本可以忽略。使用酚氯仿抽提或使用快速核酸抽提技术则可以消除以上所有的抑制因素实施例10.05mol/L PBS 200ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜碱1.17g和甘油300ml，全部组合物溶解混匀后定容至1L；置于高压蒸汽灭菌器中110℃ 15min即得采样液。
实施例20.05mol/L PBS 200ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜碱1.17g和甘油100ml，全部组合物溶解混匀后定容至1L；置于高压蒸汽灭菌器中110℃ 15min即得采样液。
实施例31.0mol/L Tris-HCl 10ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜碱2.34g和甘油300ml，全部组合物溶解混匀后定容至1L；置于高压蒸汽灭菌器中110℃15min即得采样液。
实施例41.0mol/L Tris-HCl 10ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜碱2.34g和甘油100ml，全部组合物溶解混匀后定容至1L；置于高压蒸汽灭菌器中110℃15min即得采样液。
权利要求
1.一种空气微生物采样液，其特征在于该采样液中含有如下组合物0.05mol/L PBS 150-300体积份、肌醇10-30重量份、海藻糖10-30重量份、甜菜碱0.5-5重量份、甘油100-350体积份，300-800体积份H2O。
2.如权利要求1所述的空气微生物采样液，其特征在于该采样液中PBS可以用5-15体积份1mol/L Tris-HCl替代。
3.如权利要求1所述的空气微生物采样液，其特征在于该采样液中含有如下组合物0.05mol/L PBS 200体积份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜碱1.17重量份和甘油300体积份，500体积份H2O。
4.如权利要求1所述的空气微生物采样液，其特征在于该采样液中含有如下组合物0.05mol/L PBS 200体积份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜碱1.17重量份和甘油100体积份，700体积份H2O。
5.如权利要求2所述的空气微生物采样液，其特征在于该采样液中含有如下组合物Tris碱1.21重量份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜碱2.34重量份和甘油300体积份，700体积份H2O。
6.如权利要求2所述的空气微生物采样液，其特征在于该采样液中含有如下组合物Tris碱1.21重量份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜碱2.34重量份和甘油100体积份，900体积份H2O。
全文摘要
本发明公开了一种空气微生物采样液，该采样液中含有如下组合物0.05mol/L PBS 150－300体积份(或1.0mol/L Tris－HCl 5－15体积份)、肌醇10－30重量份、海藻糖10－30重量份、甜菜碱1.0－1.5重量份、甘油100－350体积份，H
文档编号C12Q1/24GK1519327SQ0310067
公开日2004年8月11日 申请日期2003年1月21日 优先权日2003年1月21日
发明者翟俊辉, 陈梅玲, 徐秀芝, 孙振海, 车凤翔 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所, 中国人民解放军军事医学科学院微生物