专利名称：一种固定化胆碱酯酶片的制备方法
技术领域：
本发明涉及到一种固定化胆碱酯酶片的制备方法，适用于批量制备用于生物测定的酶试剂，属于生物试剂制备技术领域。
酶的固定化方法主要有吸附法、包埋法、共价键合法和交联法。吸附法和包埋法对酶的失活作用小，但酶固定得不牢，易流失，寿命短。共价键合法反应条件不易控制，固定化酶的重现性差。交联法是采用双功能团试剂(如戊二醛)将酶固定到电极表面或合适的载体上。目前文献报道的酶的固定化方法，大都从实验室研究的角度出发制备酶片，未涉及商品生产，若用于批量制备，酶片的重现性难以保证。
本发明的技术方案是这样实现的这种固定化胆碱酯酶片的制备方法，包括
(1)、载体处理将载体制成直径5-15mm的圆片，置于磷酸盐缓冲溶液中活化，备用；(2)、固定化在冰浴4℃以下将乙酰胆碱酯酶、磷酸盐缓冲溶液、戊二醛溶液、牛血清白蛋白(BSA)混合，加入预处理的载体，于3-5℃保温2-12小时；(3)、洗涤及保存取出固定好的酶片，用含有甘氨酸的磷酸盐缓冲溶液冲洗数次，最后将酶片浸泡在磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCL缓冲溶液中3-5℃保存。
所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法中制作酶片的载体包括尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜。
所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法中步骤(1)用于载体活化的缓冲溶液pH为7-8.5。
所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法步骤(1)中用于载体活化还包括用甲醇、乙二醇、高碘酸钠溶液进行预处理。
所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法步骤(2)中加入乙酰胆碱酯酶与载体的比例为5-10u/片。
所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法步骤(2)中加入戊二醛与载体的比例为0.5-1.0μL/片。
所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法步骤(2)中加入牛血清白蛋白与载体的比例为3-5μL/片。
本发明提供的固定化胆碱酯酶片的批量制备方法制备的酶片活力重现性好，使酶片的商品化生产成为可能，有利于有机磷农药测定的自动化、规范化；本发明制备的酶片由于在冰浴上操作，酶失活少；采用旋涡混匀器混合，酶液混合快速、均匀，因此制备的酶片活性高、寿命长；本发明涉及的酶片保存方法只需浸泡在溶液中，操作简便。
具体实施例方式
实施例1以尼龙膜作载体制备酶片(1)载体预处理将商品尼龙膜裁成直径为5-15mm的圆片，置于无水甲醇中浸泡30分钟活化，取出，用0.1mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗5分钟，晾干备用。(2)固定化用微量移液器准确移取20U乙酰胆碱酯酶于1mL塑料离心管中，离心管置于冰浴中，4℃下操作，加入130uL0.1mol/L pH7.0～8.5的磷酸盐缓冲溶液，在旋涡混匀器上混合10秒，放回冰浴。再加入10uL5％的戊二醛及40uL1％的牛血清白蛋白，在旋涡混匀器上混合20秒，放回冰浴。向上述酶溶液中放入5片预活化的载体。注意各载体间不要叠合，于3℃～5℃下保持2小时。(3)洗涤及保存取出固定好的载体片(酶片)，放入盛有1％甘氨酸的0.1mol/LpH8.0的磷酸盐缓冲溶液中冲洗数次。最后将酶片浸泡在pH7.0～8.5的0.1mol/L的磷酸盐缓中溶液中3℃～5℃保存。实施例2以硝酸纤维素膜作载体制备酶片(1)载体预处理将商品硝酸纤维素薄膜裁成直径为5-15mm的圆片，将载体片置于0.01mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，3℃下浸泡36小时以上。(2)固定化用微量移液器准确移取50U乙酰胆碱酯酶于2mL塑料离心管中，离心管置于冰浴中，4℃下操作，加入390uL0.1mol/L pH7.0～8.5的磷酸盐缓冲溶液，在旋涡混匀器上混合10秒，放回冰浴。再加入10uL5％的戊二醛及50uL1％的牛血清白蛋白，在旋涡混匀器上混合20秒，放回冰浴。向上述酶溶液中放入10片预活化的载体。注意各载体间不要叠合，于3℃下保持12小时。(3)洗涤及保存取出固定好的载体片(酶片)，放入含有1％甘氨酸的0.1mol/LpH8.0的磷酸盐缓冲溶液中冲洗数次。最后将酶片浸泡在pH7.0～8.5的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中3℃～5℃保存。实施例3以醋酸纤维素膜作载体制备酶片(1)载体预处理将商品醋酸纤维素膜裁成直径为5-15mm的圆片，置于0.1mol/LNaIO4溶液中搅拌1小时，再放入0.06mol/L的乙二醇溶液中搅拌1小时。取出，用0.01mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗数次，于该溶液中3℃保存。(2)固定化用微量移液器准确移取10U乙酰胆碱酯酶于1mL塑料离心管中，离心管置于冰浴中，4℃下操作，加入50uL0.1mol/L pH7.0～8.5的磷酸盐缓冲溶液，在旋涡混匀器上混合10秒，放回冰浴。再加入10uL5％的戊二醛及50uL1％的牛血清白蛋白，在旋涡混匀器上混合20秒，放回冰浴。向上述酶溶液中放入2～3片预活化的载体。注意各载体间不要叠合，于室温下保持10小时。(3)洗涤及保存取出固定好的载体片(酶片)，放入盛有1％甘氨酸的0.1mol/LpH8.0的磷酸盐缓冲溶液中冲洗数次。最后将酶片浸泡在pH7.0～8.5的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中3℃～5℃保存。实施例4室温条件固定酶片固定化温度采用室温15～25℃，其他条件同实施例2。实施例5Tris-HCl缓冲溶液4℃保存酶片酶片制备过程同实施例2，最后将酶片浸泡在pH7.0～7.5的0.1mol/L Tris-HCl缓冲溶液中3℃～5℃保存。
权利要求
1.一种固定化胆碱酯酶片的制备方法，包括(1)、载体处理将载体裁成直径5-15mm的圆片，置于磷酸盐缓冲溶液中活化，备用；(2)、固定化在冰浴4℃以下将乙酰胆碱酯酶、磷酸盐缓冲溶液、戊二醛溶液、牛血清白蛋白混合，加入预处理的载体，于3-5℃保温2-12小时；(3)、洗涤及保存取出固定好的酶片，用含有甘氨酸的磷酸盐缓冲溶液冲洗数次，最后将酶片浸泡在磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCL缓冲溶液中3-5℃保存。
2.根据权利要求1所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法，其特征在于制作酶片的载体包括尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜。
3.根据权利要求1或2所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法，其特征在于步骤(1)用于载体活化的缓冲溶液pH为7-8.5。
4.根据权利要求3所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法，其特征在于步骤(1)中用于载体活化还包括用甲醇、乙二醇、高碘酸钠溶液进行预处理。
5.根据权利要求1所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法，其特征在于步骤(2)中加入乙酰胆碱酯酶与载体的比例为5-10u/片。
6.根据权利要求1所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法，其特征在于步骤(2)中加入戊二醛与载体的比例为0.5-1.0μL/片。
7.根据权利要求1所述的固定化胆碱酯酶片的制备方法，其特征在于步骤(2)中加入牛血清白蛋白与载体的比例为3-5μL/片。
全文摘要
本发明提供一种固定化胆碱酯酶片的制备方法，包括(1)、载体处理将载体制成直径5－15mm的圆片，置于磷酸盐缓冲溶液中活化，备用；(2)、固定化在冰浴4℃以下将乙酰胆碱酯酶、磷酸盐缓冲溶液、戊二醛溶液、牛血清白蛋白混合，加入预处理的载体，于3－5℃保温2－12小时；(3)、洗涤及保存取出固定好的酶片，用含有甘氨酸的磷酸盐缓冲溶液冲洗数次，最后将酶片浸泡在磷酸盐缓冲溶液或Tris－HCl缓冲溶液中3－5℃保存。本发明制备的酶片重现性好，活性高、寿命长；酶片保存方法只需浸泡在溶液中，操作简便，使酶片的商品化生产成为可能。
文档编号C12N11/12GK1431302SQ0310537
公开日2003年7月23日 申请日期2003年2月27日 优先权日2003年2月27日
发明者韩菊, 魏福祥, 刘庆洲 申请人:河北科技大学