嗜热酯酶/磷脂酶基因、工程菌、酶及其应用的制作方法

专利名称：嗜热酯酶/磷脂酶基因、工程菌、酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种嗜热酯酶/磷脂酶A2的基因、由该基因重组载体在常温宿主中表达的工程菌、利用该工程菌构建的嗜热酯酶/磷脂酶A2及该酶在工业中的应用。
背景技术：
自1985年第一种嗜热酶即TaqDNA聚合酶被成功地用于聚合酶链式反应(PCR)后，生长在特殊高热环境下的微生物正日益引起人们的重视。许多具有水解酶活性的嗜热酶(thermophilic enzyme， 55-80℃)相继得到了开发，并在许多领域发挥了重要作用。近年来，人们从海底热流的嗜热性古生菌中分离得到超级嗜热酶(hyperthermophilic enzyme，80-113℃)，为现代酶工程技术展现了新的应用前景(王柏婧等，微生物学报，2002，42259-262；Fujiwara S，et al.J.Biosci.Bioeng.2002，94(6)518-525)。嗜热酶不仅具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效率高和底物专一性强，而且酶的稳定性极好。它可以克服中温酶(mesophilic enzyme，20-55℃)及低温酶(psychrophilic enzyme，-2-20℃)在应用过程中常常出现的生物学性质不稳定的现象，从而使很多高温化学反应得以实现，这将极大地促进生物技术产业的发展，带动技术水平和生活质量的提高。
利用嗜热酶作为生物催化剂有如下优点(1)酶制剂的制备成本降低。因为嗜热酶的稳定性高，因而可以在室温下分离提纯和包装运输，并且能长久地保持活性；(2)加快动力学反应。随着反应温度的提高，分子运动速度加快，酶催化能力加强；(3)减少了能耗。因为在高温情况下反应，因此对反应器冷却系统的要求标准降低；(4)提高了产物的纯度。在嗜热酶催化反应条件下(超过70℃)，很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢物对最终产物的污染。由于嗜热酶的高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在食品、医药、制革、石油开采及废物处理等方面都有广泛的应用潜力。
酯酶(Esterases，EC 3.1.1.1)是一类广泛分布于组织与器官的丝氨酸水解酶类，能水解许多含有羧酯键、硫酯键、酰胺键的内源性及外源性物质。其在生物体内的主要功能是参与脂质代谢、信号传导及维持生物膜结构的完整性；在体外主要用于酯水解和在有机相中完成酯化、酯交换等众多反应(Klibanov A M.2001，Nature，409241-246)。利用酯酶的立体专一性，还可以催化不对称性反应，制备许多利用化学法难以合成的手性化合物(如液晶、光学活性药物和农药等)。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，国外对酯酶基因的克隆研究很活跃，已有几种微生物酯酶基因得到控制和表达，为了提高酯酶的热稳定性和底物特异性，应用定点突变和定向进化技术已对酶进行了分子改造(Giver JC，Arnold FH，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998，9512809-13；Henke E，Bornscheuer UT，Biol.Chem.，1999，3801029-33)。由于嗜热菌微生物培养条件苛刻，因此对于嗜热酯酶的研究还很少。
磷脂酶A2(PLA2)，系统名称为磷脂酰2-酯酰水解酶(phosphatidylcholine-2-acylhydrolase)，它能酶促水解甘油磷脂的第二位酯酰键，生成溶血磷脂和脂肪酸，如下式所示 (卵)磷脂溶血(卵)磷脂 脂肪酸PLA2具有很多生物学功能，如作为神经毒素、肌肉毒素和心脏毒素，参与许多生理活动，如脂质消化和代谢、信号传导以及消除炎症过程，从而引起国内外研究学者的广泛关注。目前，国内主要集中于蛇PLA2的研究；国外对蛇毒PLA2的克隆、表达与晶体结构模拟等都已有详细报道，另外对蜂毒PLA2的DNA重组及结构也进行了初步研究，但这些酶大多数属于中温酶。而嗜热PLA2，特别是古生菌嗜热酶PLA2的研究还处于初始阶段，到现在为止，只在Pyrococcus horikoshii中发现了嗜热PLA2的活力(Feng，Y.，et al.American Oil Chemistry Society，2000，771147-1152.)，但是由于其分子结构的复杂性，还没有成功地构建表达嗜热PLA2的工程菌。
PLA2在油脂工业中具有重要的应用价值。在进行高品质油脂生产过程中，需要对油脂进行脱胶化处理，将混于油脂中的脂溶性磷脂分子分解为水溶性的磷脂衍生物，从而除去磷脂，提高油脂的纯度和质量。目前在色拉油等高品质油脂生产中通常采用化学法和物理法脱胶，但是该法不仅工艺复杂、成本高，而且污染严重。近十年来，欧洲等地如德国已尝试使用酶法对此工艺进行改造(K.Dahlke and H.Buchold，Information，1995，6(12)1284-1291)。他们应用猪胰磷脂酶转化磷脂分子取得了很好的效果。不仅生产效率提高，而且生产成本也降低了43％。因为酶制剂生产的安全性和高效性，该方法得到了广泛的注意，国内贸易部西安油脂科学研究设计院及天津正大集团油脂有限公司也组织研究人员对酶法工艺进行了研究(刘智锋，高忠霞，油脂精炼技术的新进展，中国油脂，1998，23(2)3)。但目前还没有达到生产规模，仍停留在研究阶段。主要的问题是所用的猪胰磷脂酶耐热性差(在60℃以内表现最佳催化活力)，而油脂脱胶化过程需要较高的温度(70-80℃)。常规酶由于反应温度的限制，使脱胶过程的生产效率和成本都未达到最佳程度。
所以，为应用于较高温度的反应体系，寻找在高温环境下仍具有较高催化活力的酯酶和磷脂酶A2是非常重要的，而对嗜热古生菌功能蛋白的开发将有利于发现和制备新型高温水解酶。

发明内容
本发明的目的之一是在嗜热性古生菌中提取一种嗜热酯酶/磷脂酶A2基因；本发明的另一个目的是利用上述嗜热酯酶/磷脂酶A2基因通过生物工程技术构建一种嗜热酯酶/磷脂酶A2工程菌；本发明的再一个目的是利用上述嗜热酯酶/磷脂酶A2工程菌制备一种稳定性好、耐热性强、催化效率高的嗜热酯酶/磷脂酶A2。
本发明的最后一个目的是通过对嗜热酯酶/磷脂酶A2的理化性质的研究，提供嗜热酯酶/磷脂酶A2在工业生产中的多种用途。
嗜热古生菌Aeropyrum pernix K1来源于日本深海火山口，最适生长温度为95℃。我们在前期工作中发现该菌所表达的蛋白同时具有嗜热酯酶和磷脂酶A2的活力，因此可将其DNA分子中表达嗜热酯酶/磷脂酶A2活性的基因序列称为嗜热酯酶/磷脂酶A2基因。由于嗜热古生菌(包括来源于日本深海火山口的嗜热古生菌)人工培养困难，生长周期较长，所含嗜热酯酶/磷脂酶A2的量非常低，因此不能直接利用古生菌培养物来生产嗜热酯酶/磷脂酶A2。将嗜热酯酶/磷脂酶A2基因转入可快速繁殖、培养条件简单的常温宿主如大肠杆菌内，能够有效地解决上述问题。
对来源于日本深海火山口的嗜热古生菌Aeropyrum pernix K1通过培养、目的基因钓取，得到本发明所述嗜热蛋白基因，我们委托宝生物工程(大连)有限公司进行基因测序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
我们将嗜热酶基因装载在pET系统载体上，然后转入到大肠杆菌宿主中，得到一株工程菌(命名为JDA1)。该工程菌菌株已于2002年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.0844。分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
工程菌表达产物是细胞可溶性蛋白，通过细胞超声破碎、加热失活大肠杆菌杂蛋白，即可进行分离纯化得到嗜热蛋白。
应用大肠杆菌工程菌(JDA1)表达的嗜热蛋白经活性实验鉴定，不仅具有磷脂酶A2活性，还有酯酶活性；该嗜热蛋白即为本发明所述的嗜热酯酶/磷脂酶A2，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，它具有普通酯酶和磷脂酶A2所不具备的优点，能在高温条件(80-100℃)下催化反应，有很强的抗高温和化学物质变性的能力；运用到生产中，有储运成本低、加快动力学反应、对反应器冷却系统要求标准低等优点。该重组酶能催化酯合成、酯交换和酯水解反应，在生物化工、油脂脱胶、工具酶等领域都具有重要的应用潜力。
将本发明的嗜热酯酶/磷脂酶A2基因与表达载体重组，形成重组表达载体，本发明不限于特定的表达载体，优选的表达载体采用真核或原核表达载体，进一步优选的为pET15b载体。
上述重组表达载体可按常规方法导入适宜的宿主细胞，适宜的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用E.coli BL21(DE3)codon plus菌株。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。
本发明的嗜热酯酶/磷脂酶A2催化反应所利用的底物范围不局限于任何指定的酯类、磷脂类、有机酸、醇等物质，只要能参与水解、合成、转酯反应发生的化学物质都可以。在一优选实施方案中，本发明使用对硝基苯酚脂肪酸酯和NBD-卵磷脂(1-hexadecanoyl-2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)aminohexanoyl]-sn-glycero-3-phosphocholine，NBD-PC)作为底物。
该酶的底物不局限于任何指定的酯、磷脂、有机酸、醇等物质，只要能参与酯水解、酯合成及转酯反应的化学物质都是该酶的适用底物。
取37.4g Bacto marine broth 2216(Difco)(培养基)溶于990ml蒸馏水中，湿热灭菌；取1.0g Na2S2O3·5H2O(营养盐)溶于10ml蒸馏水中，0.45m滤膜过滤除菌后加入到灭菌的培养基中。古生菌Aeropyrum pernix K1的干细胞加入0.5ml培养基，溶解后转移至装有5mL上述培养基的试管中，混匀；从中取0.5ml转移至装有5ml新鲜培养基的试管，90℃静止培养7天。然后转移至装有100ml培养基的锥型瓶中90℃振荡培养3天，-40℃保存菌体备用。
取1.5ml的古生菌培养物收集菌体，用200μL的25mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0，含50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA)重悬沉淀，加入50μl的50mg/ml溶菌酶，4℃消化1小时；加入125μl的SDS溶液(终浓度为2％)反应10分钟；加入等体积的酚氯仿异戊醇，混匀，离心5分钟，将上清液转移到另一支离心管中；向沉淀中加入2倍体积的无水乙醇，沉淀菌体DNA，12000rpm离心5分钟，倒去上清后，用70％的乙醇洗涤DNA；离心后除去上清，用TE溶液重新溶解，所得染色体DNA溶液放4℃冰箱中备用。
(2)引物设计及用PCR法钓取酶的基因制备重组载体古生菌Aeropyrum pernix K1基因组中含有几段可能的脂肪酶基因。通过测序，我们选择其核苷酸序列如表SEQ ID NO.1所示的基因作为研究对象，并称之为嗜热酯酶/磷脂酶A2基因。该酶基因通过已知PCR方法从步骤(1)所得染色体DNA中扩增而得到。两个引物是根据该基因的序列及表达载体的多酶切位点而设计的，委托上海生工生物工程公司合成。
上游引物TTTAGAATTCGCGCATATGGGTGTTAACGAGG，划线部分为Nde I位点；下游引物TTTTGGTACCTTAGGATCCAATTAGTGTTTAGCCTCCG，划线部分为BamH I位点。
两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET15b的NdeI和BamHI相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。
PCR反应在100μl反应体系中含1μl Vent DNA聚合酶，10μl Vent DNA聚合酶缓冲液，1.5μl dNTP混合物(每种核苷酸浓度25nmol/L)，4μl染色体DNA，1μl上游引物，1μl下游引物，81.5μl超纯水。每循环中94℃变性0.5分钟，55℃退火0.5分钟，72℃延伸1分钟，最后一次循环延至10min，共35个循环。用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量与预期的(474bp)一致。使用PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。
将纯化的PCR产物用限制性内切酶BamH I酶切，37℃下保温1小时后，加入1μl 0.5M NaCl，2μl Nde I，再在37℃下保温1小时。酶切完毕，在2.0％的琼脂糖凝胶上电泳，应用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。
应用类似的方法酶切pET15b载体，然后再用碱性磷酸酶(CAP)处理，在0.7％琼脂糖凝胶中检测线性载体并提纯酶切后的载体。在16℃应用T4DNA聚合酶来连接酯酶基因片段和载体。将连接载体转入E.coli BL21(DE3)Codon Plus中，用含氨苄青霉素的琼脂糖平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。从菌落中挑取载体，用限制性内切酶Nde I和BamH I作用载体，得到大小两个片段，其大小分别与酯酶基因和pET15b/NdeI+BamHI的片段大小一致。重组载体的构建过程如图2所示。
(3)重组载体在宿主细菌中的表达重组载体可转化到E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)Codon Plus等宿主细胞中，在E.coli BL21(DE3)Codon Plus中表达的嗜热酶含量较高。大肠杆菌感受态细胞制备及其载体转化方法参照“分子克隆实验指南”一书。挑取阳性转化菌，置5ml含氨苄青霉素的培养液中37℃振荡培养过夜，次日接种到100ml新鲜LB培养基中，37℃继续培养4h。将初步放大的种子液以1％的比例接入2L的培养液中，在空气摇床震荡培养(37℃，120rpm/min)。待菌体生长到A600为0.6～1.0时，加入100mM的异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，降低培养温度至25℃，对菌体进行诱导使其产生大量目的蛋白，培养10-12小时后收获菌体，得到本发明所述工程菌。该工程菌菌株已于2002年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No0844。分类命名大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。
把菌体于-30℃冷冻1小时，融化，加入菌体5-10倍体积的50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，超声破碎10分钟；将破碎液于85℃加热处理30分钟，离心除去变性的大肠杆菌杂蛋白(12000rpm，20min)，收集上清得粗酶液。
因为重组嗜热酶N-末端含有His-Tag，应用镍亲和柱(Ni-Chelating Column)对重组蛋白进行分离，用100mM咪唑洗脱与层析柱结合得到嗜热酶。应用SDS-PAGE(12％)电泳检测重组蛋白的纯度，可见在18000Da附近可见一电泳条带，如图3所示。实施例2重组嗜热酯酶/磷脂酶A2的特性(1)最适反应温度反应温度是影响酶催化活力的重要因素。一般而言，嗜热酯酶/磷脂酶A2在高温下的反应活力远远高于低温。考虑到底物的稳定性，在此酶催化活力检测的最高温度仅为100℃。
以NBD-PC作为反应底物，在50-100℃的温度范围内测定磷脂酶A2活力。由图4(a)可见，其活力在50-90℃温度范围内随温度的升高而提高，在90℃以上，活力下降，最适温度为90℃。
以对硝基苯酚丙酸酯为底物，我们还研究了该重组酶在不同温度下的酯酶活力。结果如图4(b)所示，当温度达到90℃时，该酶表现出最大催化活力。
嗜热酯酶/磷脂酶A2活力测定以带有NBD荧光标记的卵磷酯作为底物，通过观测NBD衍生物产生的荧光，就可以通过薄板扫描仪(WALLAC ARTHUR，England，1442MULTI-WAVELEN GTH FLUOROIMAGER)来检测酶的活力。
取20ul NBD-PC(0.1mg/ml，溶于氯仿)放入2ml玻璃瓶中，吹氮气以使氯仿蒸发。加入1.5ml Tris-HCl缓冲液(pH为8.0，终浓度为50mmol/L)和20ul本发明所述酶液，90℃反应1小时后，置冰浴中终止反应。将3ml乙酸乙酯/丙酮(2∶1，v∶v)加入到上述反应液中，振摇混合物以萃取残余底物和产物NBD-acid。2500rpm离心10分钟，收集上层溶液(2.5ml)，用氮气干燥样品。将残余固体溶于150μl甲醇/氯仿(1∶1，v/v)，取10μl样品点在薄板上，自然干燥，然后用氯仿/甲醇/水(35∶65∶4，v/v/v)作为展层剂，分离NBD卵磷脂-和NBD酸。
酯酶活性的检测以对硝基苯酚丙酸酯作为脂肪酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为50mM Tris-HCl(pH8.0)，对硝基苯酚辛酸酯的终浓度为0.2mM，加入20ul的酶，70℃用日立557型紫外分光光度计测定420nm的光吸收值。1个酶活力单位是1分钟水解底物生成1μmol对硝基苯酚(ε＝0.016μM-1.cm-1)所需要的酶量。
(2)最适pH环境pH值会影响酶分子中带电氨基酸的解离状态和酶的构象，进而影响酶的催化活力。以对硝基苯酚丙酸酯作为底物，在70℃下测定嗜热酶在pH5-11范围内的比活(pH5.0-7.0，磷酸缓冲液；pH7.5-8.8，Tris-HCl缓冲液；pH9.0-11.0，Gly-NaOH缓冲液)，实验结果如图5所示，在pH值7.5至8.5之间能够有效地催化对硝基苯酚丙酸酯的水解，且表明本发明酶的最适pH为8.0。
(3)底物特异性称取各种对硝基苯酚脂肪酸酯，将它们分别溶于乙腈配成10mmol/L的底物溶液，参照上述酯酶测定条件进行酶活力测定。
由表1可知，嗜热酯酶/磷脂酶A2对底物对硝基苯酚软脂酸酯和对硝基苯酚硬酸酯不表现催化活力；以对硝基苯酚辛酸酯、对硝基苯酚月桂酸酯为底物时有部分活力；在对硝基苯酚丙酸酯作为底物时表现有最高活力。因此可见，短链的脂肪酸酯是酶的适宜底物。短链的脂肪酸酯广泛存在于油脂、化工产品中，因此本发明所述酶在生物化工、油脂加工、工具酶等领域中具有广泛的应用。
表1.嗜热酶的底物特异性底物 相对活力(％)
对硝基苯酚丙酸酯 100.0对硝基苯酚辛酸酯 79.5对硝基苯酚月桂酸酯23.7对硝基苯酚软脂酸酯0对硝基苯酚硬脂酸酯0(4)温度及pH稳定性将纯化的酶置于不同温度(50-100℃)下(pH8，Tris-HCl)缓冲液保温一小时后迅速冷却，然后测定其残留的酶活力。结果如图6(a)所示，表明该酶在80℃保温后残余酶活力仍为76.64％；90℃时的残余酶活力为68.23％；95℃的残余酶活力为53.56％，这说明该酶的热稳定性较高。
将本发明所得酶液放置于50mM不同pH的缓冲液(pH5.0-7.0，磷酸缓冲液；pH7.5-8.8，Tris-HCl缓冲液；pH9.0-11.0，Gly-NaOH缓冲液)中，在室温放置24小时，70℃测其残余活力。由图6(b)可以看出，该酶在碱性(pH6-10)范围内稳定性较高，残余酶活力在60％以上。
(5)金属离子对酶活的影响测试了5种无机离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Zn2+)在浓度为1mmol/L时对酶活力的影响(表2)。结果表明各种金属离子均无明显的激活作用。Zn2+对酶有较强的抑制作用外，其余离子也有一定的抑制作用。因此在使用该酶时，应避免高浓度金属离子的存在。
2.金属离子对酶活力的影响金属离子比活(U/mg) 相对活力(％)对照171.89 100.00Na+100.58 58.51K+135.58 78.88Ca2+141.28 82.11Mg2+123.23 71.60Zn2+00本发明所公开的内容，相信本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。本领域研究人员在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
附本发明所涉及嗜热酯酶/磷脂酶A2基因核苷酸序列和嗜热酯酶/磷脂酶A2氨基酸序列(1)SEQ ID NO.1 嗜热酯酶/磷脂酶A2基因核苷酸序列表<110>吉林大学<120>嗜热酯酶/磷脂酶基因、工程菌、酶及其应用<160>2<210>1<211>477<212>DNA<213>古生菌(Aerobic Hyper-thermophilic crenarchaeon，Aeropyrum pernix K1)<220><221>CDS<222>(1)...(477)<400>1GTG GGT GTT AAC GAG GCT TAC GAG GCG CTG CTC CGA GCC TGT GGC GACVal Gly Val Asn Glu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Arg Ala Cys Gly Asp1 5 10 15GGG GAT TTT GAA GAG TGC AGG AGC GGC TAC CAA AGG TTT CTA GAA GAGGly Asp Phe Glu Glu Cys Arg Ser Gly Tyr Gln Arg Phe Leu Glu Glu20 25 30GCG TGC AGG GAG GCT GGC ACG TGT CCT AAG AGG AGG TCC TCG GGC GCTAla Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Pro Lys Arg Arg Ser Ser Gly Ala35 40 45GGC CGG GGG AAA TAC GTG TGG GTG GAG AGC ATA ATC AGG TCT GGA GTGGly Arg Gly Lys Tyr Val Trp Val Glu Ser Ile Ile Arg Ser Gly Val50 55 60CCC GAC GGG CGC TCT AGG CTG ATA CTC TAC GTT ATA AGC AGG TAT CTTPro Asp Gly Arg Ser Arg Leu Ile Leu Tyr Val Ile Ser Arg Tyr Leu65 70 75 80GTC AAC GTT AAG GGT CTA GAG CCC GGT GAG GCT GAG GCT GTC ATA GACVal Asn Val Lys Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ala Glu Ala Val Ile Asp85 90 95GAG TTC CTG AGG GTC TGC TGC GAG AAG CAC GGC AAC TGC AGG AAA ATCGlu Phe Leu Arg Val Cys Cys Glu Lys His Gly Asn Cys Arg Lys Ile100 105 110TAC AAA TCA TGG ATT AGG AAC GTG CTC AGG AGG GTT AGG GAG GGT GGGTyr Lys Ser Trp Ile Arg Asn Val Leu Arg Arg Val Arg Glu Gly Gly105 120 125TGG AGG CCC TGG ACG CTG GAG AGA ATC AGG AGC GAG GAC CCG GAG CTCTrp Arg Pro Trp Thr Leu Glu Arg Ile Arg Ser Glu Asp Pro Glu Leu130 135 140TAC AGG ATT ATA GAG CCT ATA GTG TCC GCC GGC GGA GGC TAA 477Tyr Arg Ile Ile Glu Pro Ile Val Ser Ala Gly Gly Gly(*)145 150 155(2)SEQ ID N0.2 嗜热酯酶/磷脂酶A2氨基酸序列表<210>2<211>157<212>PRT<213>古生菌(Aerobic Hyper-thermophilic crenarchaeon，Aeropyrum pernix K1)<400>2Val Gly Val Asn Glu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Arg Ala Cys Gly Aspl 5 10 15Gly Asp Phe Glu Glu Cys Arg Ser Gly Tyr Gln Arg Phe Leu Glu Glu20 25 30Ala Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Pro Lys Arg Arg Ser Ser Gly Ala35 40 45Gly Arg Gly Lys Tyr Val Trp Val Glu Ser Ile Ile Arg Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Gly Arg Ser Arg Leu Ile Leu Tyr Val Ile Ser Arg Tyr Leu65 70 75 80Val Asn Val Lys Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ala Glu Ala Val Ile Asp85 90 95Glu Phe Leu Arg Val Cys Cys Glu Lys His Gly Asn Cys Arg Lys Ile100 105 110Tyr Lys Ser Trp Ile Arg Asn Val Leu Arg Arg Val Arg Glu Gly Gly105 120 125Trp Arg Pro Trp Thr Leu Glu Arg Ile Arg Ser Glu Asp Pro Glu Leu130 135 140Tyr Arg Ile Ile Glu Pro Ile Val Ser Ala Gly Gly Gly(*)145 150 15权利要求
1.一种嗜热酯酶/磷脂酶A2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种嗜热酯酶/磷脂酶A2工程菌，其于2002年12月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No0844。
3.一种嗜热酯酶/磷脂酶A2工程菌的构建方法，包括古生菌的培养、目的基因钓取、构建表达载体，及将载体转化到宿主细胞中4个步骤
4.根据权利3所述的嗜热酯酶/磷脂酶A2工程菌的构建方法，其特征在于所使用的载体为真核或原核表达载体。
5.根据权利4所述的嗜热酯酶/磷脂酶A2工程菌的构建方法，其特征在于所使用的载体为pET15b。
6.根据权利3所述的嗜热酯酶/磷脂酶A2工程菌的构建方法，其中所使用的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。
7.根据权利6所述的嗜热酯酶/磷脂酶A2工程菌的构建方法，其特征在于所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus。
8.一种嗜热酯酶/磷脂酶A2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.如权利要求8所述的嗜热酯酶/磷脂酶A2，其特征在于(1)在50-100℃表现催化活力，其酶活力最适反应温度为90℃；(2)能够有效地催化对硝基苯酚丙酸酯、对硝基苯酚辛酸酯、对硝基苯酚月桂酸酯或NBD-卵磷脂的水解；(3)酶在pH6-10范围内稳定性较高，残余酶活力在60％以上。
10.权利要求8或9所述的嗜热酯酶/磷脂酶A2，在生物化工、油脂加工、工具酶等领域中的应用。
11.制备权利要求8或9所述嗜热酯酶/磷脂酶A2的方法，包括工程菌发酵离心，收集沉淀，冻融、超声破碎、热处理、亲和层析等步骤纯化获得。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，涉及一种嗜热酯酶/磷脂酶A
文档编号C12N9/16GK1451751SQ03111700
公开日2003年10月29日 申请日期2003年5月16日 优先权日2003年5月16日
发明者冯雁, 曹淑桂, 卢冬梅, 高仁钧, 韩四平, 任晓东 申请人:吉林大学