专利名称：一种超高退火温度聚合酶链式反应方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种聚合酶链式反应的方法及其应用。
背景技术：
聚合酶链式反应是一种高效的扩增特定DNA的方法，在生物医学的各个领域特别是医学临床检测上有广泛的应用。聚合酶链式反应主要由25-35个温度呈周期变化的循环组成，每一个循环包括变性，退火和延伸三个步骤。其中，退火步骤目的是使正、反引物分别与模板的二条单链互补结合，DNA聚合酶则从互补部分的3’端开始按5’至3’的方向扩展延伸，从而完成一个循环的扩增。在合适的温度下使引物与模板充分退火是保证高扩增效率的关键，一般而言退火温度较低有利于引物与模板结合。另一方面，退火又必须保持在一定的温度以上，退火温度偏低使引物与非模板顺序的互补及引物之间的互补显著增强，从而不仅导致非专一扩增产物和引物二聚物的形成，也会因竞争而降低目标产物的扩增效率甚至得不到目标扩增产物。适当的退火温度是要在扩增效率和专一性之间取得平衡，要通过引物设计和针对每一扩增产物的试验来确定，合适的退火温度是整个扩增过程获得成功的最重要一步。
根据教课书、手册、试剂盒说明书和数以万计的研究论文，现行PCR的典型退火温度在55℃左右，通常退火温度范围在45-65℃之间，少数情况下使用更高的温度如68℃，文献报导的最高退火温度为72℃，一些引物设计软件如Oligo也将72℃设定为最高允许退火温度。对PCR过程的分析和我们的实践表明，采用具有高解链温度的引物能在72-82℃高退火温度下完成扩增，这不仅这对各种模板是一种普遍可行的方法，而且产生在通常退火温度下所达不到的良好效果，有广泛的实用价值。
发明内容
所需要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种超高退火温度聚合酶链式反应方法及其应用，以突破现有PCR方法中引物与模板退火温度上限的常规，拓展了利用退火温度的调节来排除非专一性扩增产物、引物二聚体以及排除假阴性结果的能力。
技术方案本发明的超高退火温度的聚合酶链式反应方法，依次包括如下三个步骤模板变性、引物与模板退火和在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链，然后按此三步骤循环进行扩增反应。其中，引物与模板退火温度为72-82℃，优选为75-80℃。
为实现上述超高退火温度的聚合酶链式反应，可采用长度为15-50碱基的正反引物，优选引物长度为30-45碱基。正反引物的解链温度Tm值范围均为74-96℃，优选84-92℃。在引物设计中应遵循严谨性的原则，使引物碱基序列与模板完全互补，但根据检测需要可有个别碱基在引物3’端之外区域出现错配。
由于采用超高退火温度进行聚合酶链式反应，其退火温度范围达72-82℃，故扩增反应中可实现退火温度和延伸温度相同的设计，将PCR循环步骤由变性—退火—延伸三步简化为高温变性和退火延伸两步，在引物与模板退火的同时，即进行DNA聚合酶催化的新DNA链延伸，退火延伸步骤的恒温时间短于常规三步法。
本发明的退火温度为72-82℃的超高退火温度PCR方法适用于标准PCR和反转录PCR，也可用于竞争定量PCR和实时荧光定量PCR，以减少和排除非专一性扩增产物或引物二聚体，还可以应用于多重PCR、嵌套PCR和其他由标准PCR衍生的各种改良性PCR和应用性PCR方法，提高反应特异性和反应灵敏度，排除非专一性扩增产物或引物二聚体的产生。在上述应用中，其扩增产物与正反引物的解链温度之差可以达到22--5℃，优选范围为15-0℃。
本发明的超高退火温度PCR方法在当原始模板与引物有0-5个碱基的错配，特别是错配碱基为1-3个时，可有效的减少和排除各类标准PCR和由标准PCR衍生的各种改良性PCR和应用性PCR方法的假阴性结果。
为理解本发明的技术构思和应用要点，对反应引物的设计及其解链温度测试作如下说明PCR的最适退火温度和最高允许退火温度与引物的解链温度密切相关。一般认为最适退火温度比一对引物中解链温度较低的一个引物的解链温度低5-10℃。
以乙型肝炎病毒基因为例，利用引物设计软件Oligo共搜索到116对长度为20碱基的具有非常高严谨性的优秀引物，扩增产物长度在150-800碱基之间。用引物设计软件分析了这116对引物的解链温度，最适PCR退火温度和最高允许退火温度，其统计结果列于表1表1.116对引物解链温度和退火温度分析统计结果
表1说明当采用的引物长度为20碱基时，相应的最适退火温度范围在53-63℃之间，平均最适退火温度为54.7℃。最适退火温度比引物对中解链温度较低的那个引物的退火温度低7-17℃，平均低12℃。退火的最高允许温度比引物对中解链温度较低的那个引物的退火温度高3℃。但无论引物的解链温度多高，软件分析的最高允许退火温度均为72℃。
进一步用适合短链寡核苷酸的G+C％方法来计算含不同G+C％的长度为18-25碱基寡核苷酸的解链温度，结果示于表2。
表2.用G+C％方法计算的15-25碱基长引物的解链温度
通常认为引物的G+C％适宜范围在45％-55％之间，所以，18-25碱基长引物的解链温度通常在64-80℃之间，应用表1的所得到的分析结果，可推算当引物长度为18-25碱基时最适退火温度范围通常在52-68℃之间。
对较长的寡核苷酸的解链温度用最邻近碱基计算方法比较适宜。这种方法考虑了引物的长短和碱基组成，也考虑了碱基排列对解链温度的影响。以乙型肝炎病毒基因为例，随机取样分析长度为15，18，25，30和40碱基寡核苷酸的解链温度，每一长度测试50个，统计结果示于表3。
表3.用最邻近碱基法计算的解链温度统计结果
表3说明当寡核苷酸长度为30和40碱基时，平均解链温度已分别高达80℃和近90℃，解链温度高于84℃的寡核苷酸分别占统计数的26％和90％。换言之，根据表1的分析结果，分别有26％和90％的30和40碱基长引物的最适退火温度高于72℃。
虽然如表3所示50个随机抽样的15和18碱基寡核苷酸的最高解链温度都低于69℃，而根据表1分析结果，其最高允许退火温度均低于72℃。但是，如以下实施例所显示的，用引物设计软件还是可以搜寻到少数长度在15-18之间的有高解链温度并有高严谨性的引物对，它们能在72℃以上退火。随引物长度增加能在高温下退火的引物的比例就增加。当引物长度扩展到30或40碱基时能在72℃以上退火的引物就相当普遍。
有益效果本发明的PCR方法在72-82℃高温下退火的意义和效果是非常明显的第1，在72℃以上高温下退火，变性与退火步骤的温度差显著缩小，并且可以将PCR由变性，退火和延伸三步简化为变性和退火延伸二步，这些改进显然有利于PCR反应的操作稳定性和结果的重复性。
第2，退火温度越高，引物与非模板顺序退火的可能性就越低，有利于减少和完全克服非专一扩增产物的形成，使PCR反应专一性更有保证。
第3，Taq-DNA聚合酶的最适温度通常在72-78℃之间。在此范围内退火和延伸，不仅使PCR的步骤简化也使反应速度加快。Taq DNA聚合酶非常耐热，在78℃以上退火和延伸，仍显示较强的反应活力，并可能有其他有利于扩增的特性。
第4，能在72℃以上高温下与模板退火的引物，必然具有高解链温度，与扩增产物的解链温度的差距较小甚至高于扩增产物的解链温度。
以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为例，在不同区域随机取9个长度为400碱基的扩增产物，扩增每一个产物的引物长度分别为20，30和40碱基，根据引物软件计算的9个引物和扩增产物的的特性的统计结果列于表4。
表4.引物长度与引物和扩增产物特性的关系
结果表明如引物长度为20碱基，引物解链温度与扩增产物的解链温度平均差22℃，当引物长度为30-40碱基时，引物的解链温度与扩增产物解链温度相接近甚至超过扩增产物解链温度。PCR进行到一定阶段，扩增产物累积到相对较高浓度时，扩增产物能在从变性温度降低至退火温度的过程中迅速完成自身的退火，从而抑制了引物与模板的退火，使PCR扩增效率降低进入平台期。提高引物的解链温度能减少或消除引物与模板退火和扩增产物自身退火之间的时间差，从而推迟PCR平坡的出现，有利于定量PCR的实现。
第5，能在高退火温度下扩增的引物，不仅引物与模板的结合强度大大提高，同时，分析表明引物与模板的假性匹配却反而有所降低，这对提高PCR的专一性和效率有很大的正面作用。
以全长近10,000碱基的人免疫缺失病毒(HIV〕基因为例，随机选取3’端位置相同的长20，30和40碱基的引物各10个，用Oligo分析引物与模板的专一结合强度和假性匹配强度，统计结果示于表5。
表5.引物与模板的专一结合强度和假性匹配强度分析
表5显示，40碱基的引物平均解链温度高达85℃，能在72℃以上退火，比20碱基长引物的平均解链温度高约26℃。与模板结合的平均强度则比20碱基引物高130点以上，而假性结合反而低20％以上。
第6，在72℃以上高温下退火可以适当降低引物设计时对引物发夹结构特性和正反引物自身及相互间3’端互补结合特性的限制。标准PCR的退火温度在45-65℃之间，在引物设计时通常对引物的发夹结构和正反引物自身和相互间的3’互补结构有一定的限制，因为在此温度范围内有相对严重的发夹结构和3’端碱基互补的引物，就不能充分线性化和比较容易形成引物二聚体。在72℃以上高温下引物的发夹结构几乎都被解开，引物二聚体也几乎没有机会形成。
第7，在高退火温度下，引物发夹结构和二聚体不易形成，就为增加反应体系中引物的浓度创造了锲机，而高浓度引物有利于增强引物与模板退火对扩增产物自身退火的竞争，使平坡出现推迟。
第8，具有高解链温度的引物，特别是高解链温度的长引物，仍能在72℃左右与非3’端有1-3个错配的目标顺序退火完成扩增，从而既保持扩增的专一性，又减少了临床检测的假阴性。
第9，具有高解链温度的引物可以在含10-20％甘油的反应液中，仍在72℃左右高退火温度下完成专一扩增，有利于预混试剂的组建。这一特性也有利于在反应液中引入其他变性剂和PCR反应促进剂，而保持扩增的专一性。
具体实施例方式
本发明的实施例中PCR的模板DNA为人组织总RNA，用Poly(dT)为引物，按Clontech公司的反转录试剂盒推荐的操作所合成的cDNA。PCR反应均采用Clomech公司Advantage-2试剂盒。PCR反应液(25μL计)成分如表6所示。PCR首次变性条件均为95.5℃ 1分钟，循环变性条件均为95.5℃30秒。PGR扩增结果以电泳方法检测判别。
表6.25μL PCR反应液组分及含量
实施例1.
超高退火温度PCR的引物设计和反应结果。
以人肌动球蛋白基因序列为目标序列，设计长度为15、20、30、40和50碱基左右的高严谨引物对(表7和8)。
表7.实施例1引物顺序
表8.实施例1引物的特性
实施例1试验的退火温度范围为72-80℃停留时间30秒，延伸步骤均为80℃ 60秒，共25个循环。结果见表10。
表9.实施例1的PCR反应电泳结果
+表示阳性结果；-表示阴性结果实施例2.
进行两步法PCR。
实施例2所用引物和反应条件与实施例1相同，但退火和延伸温度相同。引物对A1退火和延伸为72℃60秒钟，引物对A2退火和延伸为76℃60秒钟，引物对A3退火和延伸为78℃60秒钟，引物对A4和A5退火和延伸为80℃60秒钟。结果A1-A5对引物经PCR和电泳后均检出与目标扩增产物长度一致的电泳条带。
实施例3.
利用超高退火温度排除非专一性产物。
从人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因中选择二对引物，二对引物的3’区域完全相同(下划线表示)。前一对引物长约20碱基称标准长引物，后一对引物称40碱基长引物，引物的顺序和特性列于表10和11。
表10.实施例3引物顺序
表11.实施例3引物特性
实施例3的反应条件与实施例1相同，标准长引物试验退火温度范围为52-68℃，延伸温度均为72℃。40碱基长引物试验退火温度范围为60-80℃，延伸温度均为80℃。试验结果列于表12。
表12.实施例3试验结果
+表示阳性结果；-表示阴性结果结果表明标准长引物能在52-62℃退火温度下完成扩增，但均伴随非专一扩增产物。40碱基长引物能在60-78℃退火温度下完成扩增。当退火温度高于70℃时非专一扩增产物消失。
实施例4.
利用超高退火温度减少引物发夹和二聚体形成。
各种引物设计软件都将弱发夹结构和低3’端碱基互补作为引物严谨性的主要指标，用引物设计软件搜寻到的严谨性引物的发夹解链温度都较低，3’端互补碱基数通常也小于3，在使用热启动PCR情况下和标准PCR的退火温度范围内，发夹和二聚体形成问题实际上并不严重。但是，高退火温度可以使那些具有强发夹结构在标准退火温度下仍不能解开其发夹的引物充分线性化。
实施例4用分子信标测试分析了发夹的解链特性。分子信标顺序为GCGAGAAGATAAGACCCTATGCTCGC，发夹炳含5对碱基，发夹解链温度为67℃。试验表明在55℃时约有一半的分子信标呈发夹状态，而在72℃以上时几乎全部线性化。
实施例5.
利用超高退火温度排除假阴性。
在有相同数量错配碱基的情况下，引物的近似解链温度的下降与引物的长度有关。下表是用OIigo软件计算的从18至50碱基长引物，每一个错配碱基导致的近似解链温度的下降(表13)。
表13.每一个错配碱基导致的近似解链温度的下降
超高退火温度PCR的优选引物长度为40碱基左右，约为标准PCR所用引物的一倍。根据示于表3的统计结果，20碱基长引物的平均解链温度为62℃，而40碱基长引物为89℃。假定引物与某目标基因变种有三个碱基的错配，20碱基长引物与变种模板的近似解链温度为44℃，在常规的退火温度下难以完成扩增，会造成在检测该变种时出现假阴性。40碱基长引物与同样变种模板的近似解链温度约为80℃，仍能在相当高的退火温度下专一地完成扩增，从而减少或消除了假阴性。
实施例5将表10所示的正反标准长引物和正反40碱基长引物的第4和10位碱基作A与T或C与G的置换(用黑体表示〕，经改造的“突变”引物的顺序列于表14。
表14.实施例5引物顺序
用引物设计软件Oligo计算出示于表10的“野生”引物和示于表14的“突变”引物与目标基因的近似解链温度和结合强度，结果列于表15。
表15.“野生”和“突变”引物的特性
实施例5试验了“突变”引物的扩增能力，试验条件与实施例3相同，标准长“突变”引物退火试验温度范围为45-55℃，结果均未得到目标扩增条带。40碱基长“突变”引物退火试验温度范围为55-70℃，结果均得到目标扩增产物。
权利要求
1.一种超高退火温度的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)模板变性；(2)引物与模板退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；其特征在于，引物与模板退火温度为72-82℃。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于引物长度为15-50碱基。
3.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于引物长度为30-45碱基。
4.根据权利要求1、2或3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于扩增反应中退火温度和延伸温度相同。
5.根据权利要求1、2或3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于正反引物的解链温度均为72-96℃，优选84-92℃。
6.权利要求1所述的超高退火温度聚合酶链式反应方法在排除非专一性扩增产物中的应用，其特征在于引物与模板退火温度为72-82℃。
7.根据权利要求6所述的聚合酶链式反应方法的应用，其特征在于扩增产物与正反引物的解链温度之差为22--5℃。
8.权利要求1所述的聚合酶链式反应方法在排除引物二聚体中的应用，其特征在于引物与模板退火的温度为72-82℃。
9.权利要求1所述的超高退火温度聚合酶链式反应方法在排除假阴性结果中的应用，其特征在于原始模板与引物有0-5个碱基的错配且引物与模板退火温度为72-82℃。
10.根据权利要求9所述的聚合酶链式反应方法在排除假阴性结果中的应用，其特征在于原始模板与引物有1-3个碱基的错配且引物与模板退火温度为72-82℃。
全文摘要
本发明涉及一种聚合酶链式反应的方法及其应用。提供了一种在超高退火温度下进行PCR反应的方法，采用具有高解链温度的引物，能在72－82℃高退火温度下完成扩增，大大高于常规的72℃的退火温度上限，突破了PCR反应设计的普遍认知和人为限制，使PCR循环步骤亦随之简化为高温变性和退火延伸两步。实验发现该方法不但同样可以成为一种普遍应用的PCR，而且利用超高温变性来提高反应的专一性，使本发明在排除非专一性扩增产物和排除假阴性结果等方面有着独特的作用，具有广泛的应用前景。
文档编号C12P19/00GK1517441SQ0311491
公开日2004年8月4日 申请日期2003年1月16日 优先权日2003年1月16日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧