专利名称：Prkcbp2基因第一号外显子多态性的制作方法
技术领域：
本发明涉及PRKCBP2基因第一号外显子的单核苷酸多态性。本发明还涉及分析PRKCBP2基因第一号外显子的等位基因突变的方法。
背景技术：
PRKCBP2，即蛋白激酶C结合蛋白2(Protein Kinase C Binding Protein 2)，又名少突细胞系转录因子2(Oligodendrocyte lineage transcription factor 2，Olig2 or Oligo2)，是一种基本的“螺旋-环形-螺旋”(Helix-Loop-Helix，HLH)转录因子。已经有研究者指出，该转录因子在神经上皮中少突细胞前体形成的区域特异性表达，以及在少突细胞前体内也有特异性表达。从而，解决了先前神经胶质细胞肿瘤无法用细胞形态学或者其它传统标记方法标记的问题，这种转录因子可能被用作少突细胞肿瘤的理想标记，用于检测或者诊断脑部肿瘤。(Proc.Nat.Acad.Sci.9810851-10856，2001)。
在本申请之前，还没有PRKCBP2基因第一号外显子多态性的相关报道。
发明内容
本发明的目的就是提供PRKCBP2基因第一号外显子的多态性及其检测方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测人PRKCBP2基因第一号外显子的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤(a)确定在人PRKCBP2基因第一号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第144位的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
在一优选例中，所述的单核苷酸多态性是在第144位存在C。
在本发明的第二方面，提供了一种分离核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第144位为C。
在本发明的第三方面，提供了一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人PRKCBP2基因第一号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第144位单核苷酸多态性的扩增产物。
在本发明的第四方面，提供了一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人PRKCBP2基因第一号外显子的SEQ IDNO1所示序列中第144位单核苷酸多态性。
一种试剂盒包括(1)特异性扩增人PRKCBP2基因第一号外显子的引物对，(2)检测扩增产物与正常的PRKCBP2基因第一号外显子相比是否存在变化所需的试剂，所述的SEQ ID NO1所示序列中第144位单核苷酸多态性。
另一种诊断试剂盒包括本发明上述的引物和/或本发明上述的寡核苷酸探针。
具体实施例方式
本发明人通过广泛而深入的研究，已经发现了PRKCBP2基因第一号外显子所编码的蛋白序列中第23位Thr(T)->Pro(P)多态(即mRNA上144位A->C多态性)，在此基础上完成了本发明。
根据对正常人PRKCBP2基因测序结果，发现了该SNP。经分析发现，该SNP导致第23位氨基酸由Thr(T)->Pro(P)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致PRKCBP2基因第一号外显子所编码的蛋白活性发生改变。
PRKCBP2基因第一号外显子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中开放阅读框为第78-464位，其所编码的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。PRKCBP2基因第一号外显子的基因组序列可以从GenBank中获得。
本领域的技术人员知道，有大量的分析技术可用于检测PRKCBP2基因第一号外显子中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)DNA测序、杂交测序；酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技术、分子信标等，变性高效液相色谱法(DHPLC)。
另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体患PRKCBP2基因第一号外显子相关疾病的易感性。
用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。对于检测PRKCBP2基因第一号外显子活性而言，可以任何含有PRKCBP2基因第一号外显子的样品，如血液等。
用于本发明方法或检测试剂盒的引物和探针，根据PRKCBP2基因第一号外显子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因组序列进行设计，并可用常规的合成技术进行合成即可。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因的抽提和测序用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。引物是有义引物5’-ctcctctcct ggaagttttc g-3’(SEQ ID NO3)反义引物5’-catccatggc gatgttga-3’(SEQ ID NO4)扩增出的465bp的产物，纯化后进行DNA测序。
实施例2SNP的获得对PRKCBP2基因进行直接测序。将测定的各样本序列进行比较，从而得出序列的差异，获得SNP。
实施例3检测试剂盒制备一检测PRKCBP2基因相关疾病易感性的检测试剂盒，其中，含有下列可扩增出144位SNP的引物对有义引物5’-ctcctctcct ggaagttttc g-3’(SEQ ID NO3)反义引物5’-catccatggc gatgttga-3’(SEQ ID NO4)对扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，可轻易地检测出144位的A->C型SNP。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING<110>上海人类基因组研究中心<120>PRKCBP2基因第一号外显子多态性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>465<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(78)..(464)<223>
<400>1ctcctctcct ggaagttttc gggtccgagg gaaggaggac cctgcgaaag ctgcgacgac 60tatcttcccc tggggcc atg gac tcg gac gcc agc ctg gtg tcc agc cac 110Met Asp Ser Asp Ala Ser Leu Val Ser Ser His1 5 10ccg tcg tcg cca gag ccc gat gac ctt ttt ctg acg gcc cgg agt aag 158Pro Ser Ser Pro Glu Pro Asp Asp Leu Phe Leu Thr Ala Arg Ser Lys15 20 25ggc agc agc ggc agc gcc ttc act ggg ggc acc gtg tcc tcg tcc acc 206Gly Ser Ser Gly Ser Ala Phe Thr Gly Gly Thr Val Ser Ser Ser Thr30 35 40tcg agt gac tgc ccg ccg gag ctg agc gcc gag ctg tac ggc gct atg 254Ser Ser Asp Cys Pro Pro Glu Leu Ser Ala Glu Leu Tyr Gly Ala Met45 50 55ggc tct gcg ggc gcg tat cct ggg gac aag cta gga ggc agt ggc ttc 302Gly Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Gly Asp Lys Leu Gly Gly Ser Gly Phe60 65 70 75aag tca tcc tcg tcc agc acc tcg tcg tct acg tcg tcg gcg gct gcg 350Lys Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala80 85 90tcg tcc acc aag aag gac aag aag caa atg aca gag ccg gag ctg cag 398
Ser Ser Thr Lys Lys Asp Lys Lys Gln Met Thr Glu Pro Glu Leu Gln95 100 105cag ctg cgt ctc aag atc aac agc cgc gag cgc aag cgc atg cac gac446Gln Leu Arg Leu Lys Ile Asn Ser Arg Glu Arg Lys Arg Met His Asp110 115 120ctc aac atc gcc atg gat g 465Leu Asn Ile Ala Met Asp125<210>2<211>129<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Asp Ser Asp Ala Ser Leu Val Ser Ser His Pro Ser Ser Pro Glu1 5 10 15Pro Asp Asp Leu Phe Leu Thr Ala Arg Ser Lys Gly Ser Ser Gly Ser20 25 30Ala Phe Thr Gly Gly Thr Val Ser Ser Ser Thr Ser Ser Asp Cys Pro35 40 45Pro Glu Leu Ser Ala Glu Leu Tyr Gly Ala Met Gly Ser Ala Gly Ala50 55 60Tyr Pro Gly Asp Lys Leu Gly Gly Ser Gly Phe Lys Ser Ser Ser Ser65 70 75 80Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Thr Lys Lys85 90 95Asp Lys Lys Gln Met Thr Glu Pro Glu Leu Gln Gln Leu Arg Leu Lys100 105 110Ile Asn Ser Arg Glu Arg Lys Arg Met His Asp Leu Asn Ile Ala Met115 120 125
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<221>misc_feature<223>引物<400>4catccatggc gatgttga 18
权利要求
1.一种检测人PRKCBP2基因第一号外显子的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，它包括步骤(a)确定在人PRKCBP2基因第一号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第144位的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是在第144位存在C。
3.一种分离核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第144位为C。
4.一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人PRKCBP2基因第一号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第144位单核苷酸多态性的扩增产物。
5.一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人PRKCBP2基因第一号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第144位单核苷酸多态性。
6.一种诊断试剂盒，其特征在于，它包括(1)特异性扩增人PRKCBP2基因第一号外显子的引物对，(2)检测扩增产物与正常的PRKCBP2基因第一号外显子相比是否存在变化所需的试剂，所述的SEQ ID NO1所示序列中第144位单核苷酸多态性。
7.一种诊断试剂盒，其特征在于，它包括权利要求4所述的引物和/或权利要求5所述的寡核苷酸探针。
全文摘要
本发明涉及PRKCBP2基因第一号外显子的单核苷酸多态性(SNP)。本发明提供了分析PRKCBP2基因第一号外显子的SNP或其活性的方法。本发明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人PRKCBP2基因第一号外显子的第144位的A－＞C多态性。该SNP导致编码蛋白第23位发生Thr(T)－＞Pro(P)改变，从而改变了蛋白活性。
文档编号C12N15/11GK1519376SQ0311507
公开日2004年8月11日 申请日期2003年1月22日 优先权日2003年1月22日
发明者黄薇, 施锦绣, 奚慧峰, 金力, 薇 黄 申请人:上海人类基因组研究中心