专利名称：发菜细胞培养及其培养产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养技术特别涉及一种发菜细胞培养技术及发菜多糖的生产技术。
背景技术：
发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生性蓝藻，富含多糖、氨基酸和微量元素，长期以来作为一种名贵食品受到人们的喜爱。近年来，发菜的药用价值日益受到重视，发菜中所含多糖物质可增强机体免疫力，发菜热水抽提物经实验证明具有抗肿瘤活性。从发菜中提取出一种多糖Nostoflan，经实验证实对一些具封套的病毒如1型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒和流感病毒等具有抗病毒活性，并可杀死离体培养的肿瘤细胞。国外已开发出以发菜为主要原料的保健品，市场十分畅销。
目前发菜多糖是从发菜藻体中提取。发菜多糖的生产及一些功能性食品、药物的生产和开发均需要大量的发菜作为原料。发菜迄今不能人工种植生产，而发菜有着特殊的生态环境要求和地理分布，主要生长在荒漠——半荒漠草原地带，生长极为缓慢，自然蕴藏量相当有限。对发菜无节制地大量采收已使发菜资源遭受严重破坏，以致濒临枯竭。宁夏是我国发菜主产地之一，据调查，宁夏20世纪60年代发菜生长地面积约360.7万公顷，至80年代中期减少到173.3万公顷，到20世纪90年代未已减至不足100万公顷，发菜的产量则从70年代的每公顷3-7.5公斤下降至目前的每公顷约0.1公斤。对发菜的不合理采收还对发菜生长地的植被造成严重破坏，致使土地沙化，生态环境日益恶化。鉴于这一局面，我国政府从2000年7月起全面禁止发菜的采收、加工和销售，以发菜为原料的生产因此而无法进行，发菜多糖作为一种具有良好应用前景的生物活性物质，其开发和生产因没有原料来源而难以开展。
发明内容
本发明是针对上述问题进行的研究，其目的是改变发菜多糖只能从发菜藻体中提取的现状，利用细胞培养技术，分离得到发菜细胞，对发菜细胞进行培养，从培养物、培养液中提取发菜多糖或直接作为功能性食品、药物生产的原料，从根本上解决了原料问题对发菜多糖应用的制约。
本发明的技术方案是以发菜细胞为培养材料，步骤如下(1)取少许发菜藻体经表面消毒冲洗后，从中进行细胞分离，得到具有旺盛生命力的发菜细胞；(2)将发菜细胞接入培养基中，经培养得到发菜细胞种，细胞种置8-12℃，弱光下保藏，一月转接一次，或采用冷冻干燥保藏法长期保藏；(3)用发菜细胞种扩培，再接入培养基中进行培养，经收集得到细胞培养物。
本发明得到的细胞培养物、培养液可直接提取发菜多糖或直接作为功能性食品、药物生产的原料。
发菜细胞培养具体方法如下(1)分离发菜细胞称取少量发菜于三角瓶中，表面消毒冲洗后，用酶解法或机械分离法进行细胞分离。酶解法无菌条件下加入过滤除菌的离析酶溶液30mL，转速120r/min振荡1-2小时，最后一次更换酶液后加入玻璃珠，使细胞分散，经过滤后，过滤液离心收集发菜细胞；机械分离法加适量生理盐水或培养基，充分研磨，过滤，过滤液离心收集发菜细胞。
(2)培养发菜细胞种将少量发菜细胞接入培养基中，pH8.5-9.0，温度24-32℃，时间为15-18天培养得到发菜细胞种，细胞种置8-12℃，弱光下保藏，一月转接一次，或采用冷冻干燥保藏法长期保藏；(3)扩培——培养——培养物将少量保藏的发菜细胞种扩培后，接入培养基中，pH8.5-9.0，培养温度为24-32℃，光照培养时间为10-15天。培养液离心处理后，弃上清液，得细胞培养物。
从本发明得到的细胞培养物、培养液中提取发菜多糖具体方法如下培养物加水，沸水浴后，离心，或培养液离心，上清液浓缩，加入乙醇，沉淀离心，沉淀物用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到发菜多糖或直接作为食品、保健品或药物生产的原料。
本发明的优点和积极效果是由于采用细胞培养法生产发菜多糖，改变了只能从发菜藻体中提取多糖的现状；发菜细胞种可长期保藏，经扩大培养直接用于生产，不消耗野生发菜资源，不破坏发菜生长地生态环境；通过调整培养基组成及控制培养条件，可改变细胞培养物成分组成，使某些特定细胞产物得到积累；细胞培养物、培养液可提取发菜多糖或直接作为食品、保健品或药物生产的原料。解决了因禁止发菜的采收、加工和销售，而使发菜为原料的生产无法进行，从而限制了发菜多糖作为一种具有良好应用前景的生物活性物质其应用开发研究受到制约的问题等。节省了发菜自然资源，使发菜资源免受破坏，保护了生态环境。
具体实施例方式
实施例1(1)分离发菜细胞称取1g发菜于三角瓶中，表面消毒，无菌水冲洗。无菌条件下加入过滤除菌的离析酶溶液30mL，酶溶液中含果胶酶0.5％，甘露醇0.8％，硫酸葡聚糖钾1％。三角瓶置于摇床上，转速120r/min，冲程4-5cm，温度25℃，时间2小时，其间每30min更换一次酶液，第三次更换酶液后三角瓶中加入直径2mm的玻璃珠。两小时后酶解液用800目金属网过滤，过滤液3000r/min离心15分钟，收集发菜细胞。
(2)培养发菜细胞种发菜细胞用培养基冲洗3次后，接入培养基中，培养基组成碳酸氢钠1.2％，硝酸钠0.12％，硝酸铵0.03％，添加磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、钼酸钠、硼酸、氯化钴，pH8.5，24℃，4000lux光强静置培养10天，光暗比12∶12，得发菜细胞种。细胞种置8℃，500lux弱光下保藏，一月转接一次，或采用冷冻干燥保藏法长期保藏。
(3)扩培——培养——培养物先将发菜细胞种扩培，然后以15％接种量接入15L气升式光反应器中，其培养基的组成是碳酸氢钠1.2％，硝酸钠0.18％，添加磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁，pH8.5，培养温度为28℃，光照培养10天。培养液4000r/min离心30分钟，弃上清液，得发菜细胞培养物。
实施例2称取1g发菜，表面灭菌后置于研钵中，加入约30mL无菌生理盐水或培养基，无菌条件下充分研磨，800目金属网过滤，过滤液离心，收集发菜细胞，培养得发菜细胞种。细胞种置10℃保藏，或扩培后接入培养基中，接种量20％，pH9，培养温度为30℃，光照培养15天，其余同实施例1。
实施例3发菜细胞种置12℃保藏。细胞种扩培后以15％接种量接入反应器中，培养基组成碳酸氢钠1.6％，硝酸钠0.12％，硝酸铵0.03％，添加磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁，pH8.75，32℃，4500lux光强，光暗比16∶8，光照培养12天。其余同实施例1或实施例2。
实施例4发菜细胞种扩培后以15％接种量接入反应器中，培养基组成碳酸氢钠1.6％，添加磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁，硝酸钠，硫酸亚铁。光照培养12天。其余同实施例1或实施例2。
实施例5提取发菜多糖培养物加水，置沸水浴中1小时，3000r/min离心30分钟，上清液80℃浓缩4倍，加入2倍体积的95％乙醇，沉淀8h，4000r/min离心15分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤，55℃，750mmHg真空干燥，得到发菜多糖，其余同实施例1或2、或3、或4。
实施例6培养液3000r/min离心30分钟，取上清液，浓缩4倍，加入2倍体积的95％乙醇，沉淀8小时，4000r/min离心15分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤，55℃，750mmHg真空干燥，提取发菜多糖，其余同实施例1或2、或3、或4。
实施例7培养液膜式蒸发器蒸发浓缩，所得藻泥60℃，750mmHg真空干燥，得发菜藻粉，用于生产保健品或药品。其余同实施例1或2、或3、或4。
权利要求
1.一种发菜细胞培养，其特征是以发菜细胞为培养材料，具体包括如下步骤(1)取少许发菜经表面消毒冲洗后，从中进行细胞分离，得到具有旺盛生命力的发菜细胞；(2)将发菜细胞接入培养基中，经培养得到发菜细胞种，细胞种置8-12℃，弱光下保藏，一月转接一次，或采用冷冻干燥保藏法长期保藏；(3)发菜细胞种经扩培，再接入培养基中进行培养，经收集得到细胞培养物；
2.根据权利要求1所述的发菜细胞培养，其特征是从发菜藻体中进行细胞分离得到的发菜细胞是用酶解法或机械分离法。
3.根据权利要求1或2所述的发菜细胞培养，其特征在于将分离得到的发菜细胞接入培养基中，其培养基以碳酸盐为碳源，以一种或两种硝酸盐或铵盐为氮源，添加磷酸盐、钾盐、硫酸盐、镁盐、铁盐、钼酸钠、硼酸、氯化钙、氯化钴中的部分或全部；培养温度为24-32℃，光照培养时间10-15天。
4.根据权利要求1或2所述的发菜细胞培养，其特征在于将发菜细胞种扩培后，接入培养基中采用光反应器对发菜细胞进行培养；以碳酸盐或二氧化碳为碳源，不加氮源或以一种或两种硝酸盐和铵盐为氮源，添加矿质元素。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所得到的发菜细胞培养产物，其特征是从细胞培养物、培养液中直接提取发菜多糖或直接作为食品、保健品或药物生产的原料。
全文摘要
本发明公开了一种发菜细胞培养及其培养产物。解决了发菜多糖只能从发菜藻体中提取的问题。技术方案是从发菜藻体中进行细胞分离，得到具有旺盛生命力的发菜细胞，将其接入培养基中，经培养得到发菜细胞种，置8－12℃，500lux弱光下保藏，一月转接一次，或用冷冻干燥保藏法长期保藏；细胞种扩培后进行培养，得到发菜细胞培养物；从细胞培养物或培养液中提取发菜多糖。本发明改变了只能从发菜藻体中提取发菜多糖的现状；细胞种可长期保藏，经扩大培养直接用于生产，不消耗野生发菜资源，不破坏发菜生长地生态环境；调整培养基组成及控制培养条件，可改变细胞培养物成分，使某些特定细胞产物得到积累；细胞培养物可直接作为生产功能性食品或药物的原料。
文档编号C12P19/00GK1530439SQ0311910
公开日2004年9月22日 申请日期2003年3月14日 优先权日2003年3月14日
发明者贾士儒, 苏建宁, 乔长晟 申请人:天津科技大学