专利名称：寡核苷酸文库小片段序列的高效快速测定方法
前言本发明涉及生物学领域，发明了寡核苷酸文库小片段序列的测定方法通过将文库小片段序列连接进行序列测定，使1次序列测定反应可以获得10至30条左右文库小片段序列，相当于发明前10至30次序列测定反应功效，其费用约为发明前的三十分之一至十分之一之间。
此方法快速、经济测定生物大分子(蛋白质，mRNA，DNA分子)和寡核苷酸文库结合的结构位点序列。
这些结构位点的阐明有利于研究发现生物大分子(蛋白质，mRNA，DNA分子)的寡核苷酸小分子药物。应用在理论研究、和人类疾病治疗药物的研究发现。
研究背景，本发明解决的关键问题国内外，在体外模拟生物进化过程(SELEXsystematic evolution of ligands by exponentialenrichment，MASTmRNA accessible sites tagging方法等)产生的生物大分子(含蛋白质，mRNA，DNA分子)能结合的单链寡核苷酸分子，为了阐明其序列结构通常需要一一测定序列，该序列测定过程繁杂，消耗大量人力和物力，或需要高级仪器设备；发明的方法能简易而经济地满足此序列测定要求。所谓的简易就是采用常规分子生物学操作步骤，无须复杂或者高级仪器设备(例如国际上最为有效的方法需要Pyrosequence技术设备等)；所谓的经济就是使序列的测定费用降低到原来的十至三十分之一。
本发明申请保护的技术方案此方法用分子生物学克隆、酶切、连接组合方案，主要发明设计思路如下一、申请保护的技术一——DNA寡核苷酸文库设计构建寡核苷酸文库，使文库两端具备固定的核酸内切酶酶切位点。例如可以将两端设计EcoRI和BamHI，也可以设计为EcoRI和EcoRI，或BamHI和BamHI等，以及应用EcoRI和BamHI以外的其他内切酶。
二、申请保护的技术二——寡核苷酸文库小片段序列连接方案(方案一和二)。
生物大分子(含蛋白质，mRNA，DNA分子)和文库分子结合以后，能结合大分子的文库小片段序列通过生物相互作用筛选而获得。下面是连接测序方案。
方案一、用PCR扩增文库小片段序列，然后酶切、连接。
■技术操作流程文库小片段序列通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后直接酶切连接。
1.1PCR反应根据文库两端的序列设计各含20碱基的扩增引物，例如上游引物
5’GCTGTAGCTCCT GT 3’；下游引物5’AGACAACAATAT GA 3’。PCR反应按50μl体积加入5μl文库小序列片段；上游下游引物各0.8μM；四种dNTP共0.2mM，DNA聚合Taq1.5单位；反应在94℃2min，然后在94℃30s，50℃30s，72℃30s条件进行30次循环。
1.2内切酶酶切反应1毫升PCR产物，经过乙醇沉淀(标准操作)，溶解在内切酶缓冲液200微升，50单位的内切酶EcoRI，在37度消化1小时，用16％聚丙烯酰胺凝胶分离获得30bp的小序列片段，切割含有片段的凝胶在0.3M NaAC中浸泡4度过夜，乙醇沉淀后，溶解在10微升连接缓冲液中，在20度15单位连接酶的作用下2小时，连接反应在2％琼脂糖凝胶上电泳分离，纯化600-900bp条带，进行下述技术三的克隆步骤。
方案二、PCR扩增产物克隆到质粒，含有文库小片段序列的阳性克隆质粒在感受态细菌中克隆培养后，多种阳性克隆混合，获得纯化阳性质粒，将质粒进行酶切、连接。
因为方案一中，PCR产物再扩增过程产生的个别非特异分子，以及Taq酶活性不能轻易失活，导致酶切片段连接效率低，因此本方案将PCR扩增产物克隆到质粒，含有文库小片段序列的阳性克隆质粒在感受态细菌中克隆培养后，多种阳性克隆混合，获得纯化阳性质粒，再行片段酶切回收连接。
■技术操作流程1.1PCR反应同方案一中1.1PCR反应。
1.2CR扩增产物克隆，含有文库小片段序列的阳性克隆质粒的制备3微升PCR产物同1微升T载体(Promega公司)在3单位连接酶作用下，4度过夜，5微升连接产物和50微升感受态细菌(JM109，Promega公司)转化，在100毫升含胺苄青霉素的细菌培养液中37度震荡培养16小时。
纯化细菌的质粒，200微升，50单位的内切酶EcoRI，在37度消化1小时，用2％琼脂糖凝胶上电泳分离获得30bp的小序列片段，切割含有片段的凝胶用试剂盒回收片段，溶解在10微升连接缓冲液中，在20度15单位连接酶的作用下2小时，连接反应在2％琼脂糖凝胶上电泳分离，纯化600-900bp条带，进行下述技术三的克隆步骤。
三、申请保护的技术三——连接片段的克隆质粒。
方案使用T-easy载体用EcoRI处理后，用碱性磷酸酶脱磷酸化，或者使用小片段序列阳性克隆酶切后产生的载体经过碱性磷酸酶脱磷酸化。
上述酶切文库小片段连接序列，和构建的含有设计了EcoRI酶切位点的质粒中，3微升文库小片段连接产物同1微升连接片段的克隆质粒在3单位连接酶作用下，4度过夜，5微升连接产物和50微升感受态细菌(JM109，Promega公司)转化，在含胺卞青霉素的细菌培养琼脂板上涂布37度培养16小时。挑取阳性克隆，用聚合酶链式反应(PCR)扩增鉴定后进行序列测定。
本发明实施应用的实例绿色荧光素蛋白(GFP)的mRNA结合位点序列的测定下列结果显示说明书附图5的一个阳性克隆序列GFP的mRNA结合位点序列之一，用小片段序列阳性克隆酶切后产生的线性载体经过碱性磷酸酶脱磷酸化制备的载体，连接了22条小片段序列， 为EcoRI酶切连接的位置。
1225GFPT7-4CCAACCGTTGANTGCACCCTCTCGGCCGCCANGCCGCGGGATTGCTGTAGCTCCT GTACAACTACGATTTAAGTGAC GACACGATGCTACCAAGAAG GCATAGCACCACCATACATC ACGACTACCCCTTGCAACCC ACCACACCACTAGTATAAGT ACACACTCATCTGACTATAA AACCAAAAACCCCAGAGTCA ACACTGCCCTCAAAAAAACT ACACTCCTATAAGACCCTCC AAGCAACCAAACGCCAATAC ATCACAACCAGAAACTCCTG CCTTGCACAACAACAATTAAC ATATCTCCCACTACCTCTGAA AGCCAACACATTATTTTTAC AGTACTTCACCTGAGCACTC ACTCACGCAGAAATAAGTTG TGTACAACCAACATACCGAA ACTGCACCCATATACACTAA ATAAAACAAAAACCCCTCCT CTAGAACACCCACCTACCTA ATCCACTAACCAACAGGACT ATACAACCATTACTATGTACTC ATATTGTTGTCT TCAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGANCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACT(
)图1.构建寡核苷酸文库，使文库两端具备固定的酶切位点，如图中的EcoRl酶切位点(可以设计为其他内切酶位点例如BamHIGGATCC等)。
图2.基因特异结合寡核苷酸文库片段PCR扩增示意图。
图3.基因特异结合寡核苷酸文库小片段序列PCR扩增图。
图4.用于PCR产物克隆的T载体结构示意图。
图5.用PCR鉴定获得的寡核苷酸文库片段扩增产物阳性克隆样品。
图6.将阳性克隆质粒酶切获得文库片段产物示意图。
图7.将阳性克隆质粒酶切获得文库片段产物图。
图8.酶切小片段进行连接示意图。
图9.酶切小片段进行连接获得产物图。
图10.连接产物插入构建的克隆质粒示意图。
图11.PCR鉴定连接产物的阳性克隆图。
权利要求
1.本发明涉及一种寡核苷酸文库小片断序列的高效、快速测序方法，其特征在于利用克隆、酶切、及连接等技术，构建寡核苷酸文库，并将文库中的小片段序列实行连接测定。
2.根据权利要求1所述，构建寡核苷酸文库，使文库两端具备固定的相同或者不相同的任何核酸内切酶酶切位点。
3.根据权利要求1所述，文库小片段序列通过PCR扩增(或扩增产物克隆产生的阳性克隆质粒)，用核酸内切酶将文库小片段序列切下，连接，然后克隆。
4.根据权利要求1所述，构建了将连接片段克隆的质粒，用于序列测定。
全文摘要
本发明涉及生物学领域，发明了寡核苷酸文库小片段序列的连接测定方法通过将文库小片段序列连接进行序列测定，达到1次序列测定反应可以获得10至30条左右文库小片段序列的目的，相当于发明前10至30次序列测定反应功效，其费用约为发明前的三十分之一至十分之一之间。此方法构建寡核苷酸文库，结合生物大分子的文库小片段序列用聚合酶链式反应(PCR)扩增，PCR产物直接用内切酶切下或者克隆到质粒后用内切酶切下小片段序列，再用DNA连接酶进行连接后进行序列测定。此方法快速、经济测定生物大分子(蛋白质，mRNA，DNA分子)和寡核苷酸文库结合的结构位点序列。这些结构位点的阐明有利于研究发现生物大分子(蛋白质，mRNA，DNA分子)的寡核苷酸小分子药物。应用在理论研究、和人类疾病治疗药物的研究发现。
文档编号C12Q1/68GK1532291SQ0312104
公开日2004年9月29日 申请日期2003年3月21日 优先权日2003年3月21日
发明者毛建平, 王利红, 王全会, 柳晓兰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 中国人民解放军军事医学科学院放射医