专利名称：生物芯片检测肿瘤基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测肿瘤基因的方法，具体发明涉及一种cDNA芯片检测非何杰金氏淋巴瘤基因的方法。
非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的诊断多年来一直是病理医师公认的难题。主要原因有两个一方面，由于淋巴组织增生性疾病的形态学变化极其复杂且缺乏有效的辅助指标，使得鉴别诊断比较困难；另一方面，由于不同的国家/地区使用的分类标准不尽相同，也人为增加了NHL诊断的复杂性。世界卫生组织(WHO)2001年版的恶性淋巴瘤新分类，在相当程度上改善了NHL诊断的混乱状态。但由于对许多问题认识不足，该分类中仍然存在不少不尽完美之处。cDNA芯片能够同时检测上千个基因的表达情况，因此被广泛应用于许多研究领域，用来了解与基因表达相关的各种问题。因此，cDNA芯片技术为我们的进一步研究NHL提供了强有力的手段。
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用cDNA芯片检测非何杰金氏淋巴瘤基因的方法。进一步可为临床提供一种非何杰金氏淋巴瘤可靠的诊断指标。
本发明的基本技术方案是采用多次叠加办法，自行设计一种cDNA芯片，用于检测NHL与淋巴组织反应性增生(LRH)之间基因表达的差异，同时采用免疫组化染色的方法、在蛋白水平验证差异基因的表达情况。
首先，用逆转录PCR的方法将从组织中提取的总RNA转录成cDNA；然后将NHL的cDNA分别标记以红色荧光染料Cy5，同时为使对照均一化以便不同NHL标本间相互比较，将LRH的cDNA混合均匀并标记以绿色荧光染料Cy3；将两种不同荧光标记的cDNA混合，与芯片进行杂交，经过清洗与扫描，就可读取信息芯片中每一个点上红色与绿色荧光强度的比值，即与NHL和LRH标本中mRNA相对含量的比值成比例。结果需经过均一化处理，方法如下计算每个内参基因红、绿色荧光强度比值Ri(即Ratio值)的自然对数值Ri’(Ri’＝In(Ri))，算出Ri’的平均值R’，均一化系数ND即为R’的指数函数即ND＝EXP(R’)。将芯片上所有可读取数据项的绿色荧光标记强度Cy3乘以均一化系数ND，得出调整后的Cy3*。算出所有基因调整后的Ratio值(Cy5/Cy3*)。该值＞2.0或＜0.5的基因，方视为其在NHL与LRH间有差异表达，其中Ratio值＞2.0时视为该基因的mRNA在NHL中表达上调，＜0.5时则视为表达下调。
本发明的积极效果在于制作的cDNA芯片筛选出的10个差异表达基因本身或其蛋白产物，有望成为NHL诊断、预后的新的生物学指标。UBE1蛋白表达与否可协助判断淋巴组织增生性疾病的良、恶性，但对于区分NHL中不同的组织学类型则作用不大。表明新方法对有关差异表达基因筛选的研究有很大促进价值。
下面给出本发明的实施例。
收集未经治疗的NHL淋巴结，用GIBCO公司TRIZOL试剂盒进行总RNA的抽提。
自行设计的cDNA芯片共包含512个基因克隆，包括①NHL中异常表达的27个基因如UBE1，TGF-β，CD4等；②出现表达上调或下调的重要基因，如CD10，BCL-6，CyclinD1；③少数基因如IL-2R，BLMH(博莱霉素水解酶)；④原癌/抑癌基因、‘看家基因’及表达序列标签(ESTs)等。为提供一种内参照以保证基因表达定量的重复性，芯片中的部分基因由2-3个不同的cDNA克隆代表。
基因表达情况通过竞争性杂交的机制进行检测。首先，用逆转录PCR的方法将从组织中提取的总RNA转录成cDNA；然后将NHL的cDNA分别标记以红色荧光染料Cy5，同时为使对照均一化以便不同NHL标本间相互比较，将LRH的cDNA混合均匀并标记以绿色荧光染料Cy3；将两种不同荧光标记的cDNA混合，与芯片进行杂交，经过清洗与扫描，就可读取信息芯片中每一个点上红色与绿色荧光强度的比值，即与NHL和LRH标本中mRNA相对含量的比值成比例。结果需经过均一化处理，方法如下计算每个内参基因红、绿色荧光强度比值Ri(即Ratio值)的自然对数值Ri’(Ri’＝In(Ri))，算出Ri’的平均值R’，均一化系数ND即为R’的指数函数即ND＝EXP(R’)。将芯片上所有可读取数据项的绿色荧光标记强度Cy3乘以均一化系数ND，得出调整后的Cy3*。算出所有基因调整后的Ratio值(Cy5/Cy3*)。该值＞2.0或＜0.5的基因，方视为其在NHL与LRH间有差异表达，其中Ratio值＞2.0时视为该基因的mRNA在NHL中表达上调，＜0.5时则视为表达下调。
采用Chi-Sqaure检验，分析UBE1蛋白在NHL与LRH之间，以及在NHL不同组织学类型之间的表达差异。
结果显示，在我们前期研究的NHL中，出现的差异表达基因分别为67、185和126个；而在利用自行设计的cDNA芯片进行的本研究中，我们发现分别有28、106、41和27个基因在NHL中表达上调或下调。为了避免受测标本间的个体差异，同时简化对于芯片所提供的庞大信息量的分析，我们选择那些在两次检测的总共7例NHL中，至少有3例都出现了差异表达(同时上调或/和下调)的基因作为重点分析对象。结果发现有10个基因符合要求，它们是AMFR(autocrine mobilityfactor receptor，自分泌移动因子受体)，TLN2(talin 2)，BLMH(bleomycin hydrolase，博莱霉素水解酶)，MKP1(MAP kinasephosphatase 1，MAP激酶磷酸化酶1)，PAIP-1(polyadenylate-bindingprotein-interact ing protein 1，polyA结合蛋白交互蛋白1)，hnRNPA1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，异质性核糖核苷蛋白A1)，SMAD7(sma-and mad-related protein 7，sma与mad相关蛋白7)，UBE1(ubiquitin-activating enzyme 1，泛有素活化酶1)，CUL5(cullin5)以及ASH2L(ash2-like)。这些基因中，有些已知与细胞移动、耐药、蛋白质合成、细胞周期进展/增殖/凋亡的调节等功能相关，有些则其结构与功能尚不清楚。至于上述基因在NHL中发挥了什么样的作用，迄今为止相关的研究还很少见。
鉴于DLBCL与FL(滤泡性淋巴瘤)均是NHL中最常见的类型，因此我们在以往及本研究中，均将它们作为主要对象，拟从中寻找一些有价值的线索，再推及到其它类型的NHL中予以验证，探讨对于指导NHL的诊断或预后有意义的新指标。
权利要求
1.一种生物芯片检测肿瘤基因的方法，其特征在于采用多次叠加办法，设计cDNA芯片，检测非何杰金氏淋巴瘤与淋巴组织反应性增生之间基因表达的差异，同时采用免疫组化染色的方法、在蛋白水平验证差异基因的表达。
2.根据权利要求1所述的生物芯片检测肿瘤基因的方法，其特征在于先用逆转录PCR的方法将从组织中提取的总RNA转录成cDNA；然后将NHL的cDNA分别标记以红色荧光染料Cy5，同时为使对照均一化以便不同NHL标本间相互比较，将LRH的cDNA混合均匀并标记以绿色荧光染料Cy3；将两种不同荧光标记的cDNA混合，与芯片进行杂交，经过清洗与扫描，读取芯片中每一个点上红色与绿色荧光强度的比值，即NHL和LRH标本中mRNA相对含量的比值；结果经过均一化处理，方法如下计算每个内参基因红、绿色荧光强度比值Ri的自然对数值Ri’(Ri’＝In(Ri))，算出Ri’的平均值R’，均一化系数ND即为R’的指数函数即ND＝EXP(R’)；将芯片上所有可读取数据项的绿色荧光标记强度Cy3乘以均一化系数ND，得出调整后的Cy3*；算出所有基因调整后的Ratio值(Cy5/Cy3*)；该值＞2.0或＜0.5的基因，方视为其在NHL与LRH间有差异表达，其中Ratio值＞2.0时视为该基因的mRNA在NHL中表达上调，＜0.5时则视为表达下调。
全文摘要
本发明为一种生物芯片检测肿瘤基因的方法。采用多次叠加办法，设计cDNA芯片，检测非何杰金氏淋巴瘤与淋巴组织反应性增生之间基因表达的差异，同时采用免疫组化染色的方法、在蛋白水平验证差异基因的表达情况。本发明为临床提供一种非何杰金氏淋巴瘤可靠的诊断指标。
文档编号C12Q1/68GK1468966SQ0312693
公开日2004年1月21日 申请日期2003年6月20日 优先权日2003年6月20日
发明者苏祖兰, 肖畅, 龙捷, 罗东兰, 金亦, 游景玉 申请人:中山大学