专利名称：川贝母类药材聚合酶链反应－限制性酶切图谱鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药材种质的品质鉴定技术领域。
背景技术：
中药川贝母为百合科植物川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母Fritillaria przewalskii Maxim、或梭砂贝母Fritillaria delavayi Franch.的干燥鳞茎，川贝母具有清热润肺，化痰止咳之功效，用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳咳，咯痰带血等症的治疗。由于川贝母的疗效好，毒性低，自然资源有限，人工栽培困难，因此是贝母类药材中最名贵的品种，市场价格很高。市场上可见用贝母属其它种植物的小鳞茎冒充川贝母的现象。然而，用通常的型态及显微等鉴定方法难以将川贝母与其伪品区别开来，因此寻找可靠的用于川贝母鉴定的方法是贝母药材鉴定中的一个重要问题。川贝母主产于我国西南地区，由于其亲缘关系较近，地理分布较为集中，因而具有相似的遗传背景。通过比较各种贝母nrDNAITS区碱基序列，找到了川贝母与其它种类贝母DNA序列的差别，这种差别可通过聚合酶链反应(PCR)与限制性内切酶反应的片段多态性(RFLP)加以区别。但这种鉴别对于不同的物种，其所用的引物、限制性内切酶的种类及鉴别方法都不相同。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确鉴别川贝母的PCR-RFLP分子鉴定方法，包括川贝母的特征DNA碱基序列、一对PCR引物、一种限制性内切酶酶切位点及其鉴定方法。
本发明的技术方案如下首先从各药材中提取总DNA，利用一对引物，用PCR方法扩增一段DNA片段，经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，建立各样品的DNA序列数据库，在比较数据库DNA序列的基础上，得到川贝母的特征DNA碱基序列为5’-TGCCCGCCCT GCCCGGGACC TCGC-3’，针对川贝母与其它种贝母DNA序列的差异，选择合适的DNA限制性内切酶酶切位点，通过分析聚合酶链反应产物的限制性酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别川贝母的目的。对需要鉴定的贝母样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(P1、P2)，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶Sma I或其同切酶对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，川贝母会出现119，188bp的条带，而其它种类的贝母不出现上述两条带。当供试样品经用本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确地鉴定川贝母或非川贝母药材。本发明设计的用于鉴别川贝母PCR-RFLP分子鉴定方法是采用以下步骤1、药材DNA的提取按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μl；2、扩增DNA片段，即进行聚合酶链反应，用于聚合酶链反应的一对引物的DNA序列为P15’-CGTAACAAG GTTTCC GTAGGT GAA-3’P25’-GCTACG TTC TTC ATC GAT-3’3、PCR扩增产物中加入限制性内切酶Sma I或其同切酶进行酶切，限制性内切酶Sma I或其同切酶的酶切位点为CCC^GGG；4、琼脂糖凝胶电泳分析；5、鉴定结果的判断，若出现119，188bp条带则供试品为川贝母。
本发明的效果是可解决川贝母与其它种贝母相区别的鉴定难题，提供鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、川贝母的特征DNA碱基序列、一种限制性内切酶。川贝母较其它种类的贝母所含的有效成分有差别，毒性很小，且不易栽培，因此市场上川贝母的价格显著高于其它种贝母。然而，川贝母与其它种贝母难以通过形态、显微等特征来加以区别，因此，急需找到一种可靠的鉴别方法。本发明利用川贝母与其它种贝母药材DNA序列的差异，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鉴别方法，对于保证川贝母的药材质量，打击假冒川贝母的市场行为具有重要的价值。
具体实施例方式1、DNA的提取按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μl；2、聚合酶链反应(1)聚合酶链反应以30μl为参考，各种物品的用量分别为10×PCR缓冲液 3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(各10mM) 0.6μl引物P1、P2(30pmol/μl) 各0.5μl供试品DNA模板 1～2μlTaqDNA聚合酶 1U(0.2μl)无离子水 补齐至30μl(2)PCR反应条件反应在PCR仪上进行，反应条件为95℃予变性3min，然后按以下条件进行30循环变性95℃20～40秒复性53℃20～40秒延伸72℃20～40秒循环结束后在72℃保持2～4分钟补齐，反应结束后在4℃保存。
(3)PCR产物的电泳检测取上述反应液4μl，与1μl载样缓冲液混合，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μL溴化乙锭，即EB)电泳检测扩增结果，各种DNA样品均能扩增出一条约307bp的DNA条带；3、聚合酶链反应产物的限制性内切酶酶切反应DNA限制性内切酶酶切反应反应液参考体积为20μl，其中各种物品的用量为PCR产物 5～10μL10×R+限制性内切酶缓冲液 2μL限制性内切酶Sma I 5U无离子水补齐至20μL将反应液置37℃保温3～4小时，反应结束后置于65℃水浴10分钟，使酶失活；4、电泳观察酶切结果酶切产物用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μl的溴化乙锭，即EB)，在4V/cm电场强度下电泳30～50分钟，观察电泳结果；
5、测定结果的判断，使用限制性内切酶Sma I或其同切酶对聚合酶链反应扩增产物进行酶切，产生对川贝母与非川贝母具有鉴别性特征的酶切DNA片段长度图谱。若供试品出现119，188bp的两个片段，则为川贝母；若不出现上述两个片段，则不为川贝母。川贝母类药材聚合酶链反应-限制性酶切图谱鉴定方法<110>中国药科大学<120>川贝母类药材聚合酶链反应-限制性酶切图谱鉴定方法<160>3<210>1<211>24<212>DNA<213>川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don，Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia，Fritillaria przewalskii Maxim，Fritillaria delavayi Franch.)<400>1cgtaacaagg tttccgtagg tgaa<210>2<211>18<212>DNA<213>川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don，Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia，Fritillaria przewalskii Maxim，Fritillaria delavayi Franch.)<400>1gctacgttct tcatcgat<210>3<211>24<212>DNA<213>川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don，Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia，Fritillaria przewalskii Maxim，Fritillaria delavayi Franch.)<400>1tgcccgccct gcccgggacc tcgc
权利要求
1一对聚合酶链反应扩增引物的DNA碱基序列，其特征在于DNA序列为P15’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，P25’-GCT ACG TTC TTCATC GAT-3’。
2一种川贝母特有的DNA碱基序列，其特征在于DNA序列为5’-TGCCCGCCCT GCCCGGGACC TCGC-3’。
3一种川贝母聚合酶链反应-限制性酶切图谱，其特征在于能够识别川贝母特有DNA碱基序列的限制性内切酶Sma I及其同切酶对聚合酶链反应产物消化后的琼脂糖凝胶电泳的特征图谱。鉴定方法为(1)、药材DNA的提取按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μl；(2)、扩增DNA片段，用引物P1、P2进行聚合酶链反应(PCR)，得到聚合酶链反应扩增产物(3)、PCR扩增产物中加入限制性内切酶Sma I或其同切酶进行酶切，限制性内切酶Sma I或其同切酶的酶切位点为CCC^GGG；(4)、琼脂糖凝胶电泳分析；(5)、鉴定结果的判断若出现119，188bp的两个片段，则供试品为川贝母，若不出现上述两个片段，则供试品不为川贝母。
全文摘要
本发明属于中药材种质的品质鉴定技术领域，目的是提供一种准确鉴别川贝母与非川贝母类药材的聚合酶链反应－限制性酶切图谱分子鉴定方法(PCR－RFLP)。PCR扩增所用引物序列为P15’－CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGTGAA－3’，P25’－GCT ACG TTC TTC ATC GAT－3’；川贝母的特征DNA碱基序列为5’－TGCCCGCCCTGCCCGGGACC TCGC－3’；限制性内切酶Sma I及其同切酶可识别并切割该序列。鉴定过程如下提取药材DNA；用引物P1、P2进行PCR扩增；用限制性内切酶Sma I或其同切酶消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与川贝母PCR－RFLP特征结果相比较，即可判断供试品是否川贝母药材。
文档编号C12N15/10GK1487091SQ03131798
公开日2004年4月7日 申请日期2003年7月30日 优先权日2003年7月30日
发明者李萍, 王冲之, 李 萍 申请人:中国药科大学