专利名称：表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明利用基因重组技术，构建可以表达传染性喉气管炎病毒gB基因和/或新城疫病毒F基因、传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒作为疫苗，用于预防以上禽病。
背景技术：
鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性接触性呼吸道传染病。该病以呼吸困难、喘气、咳出血样分泌物、受侵害的气管粘膜细胞肿胀和水肿、出血并导致糜烂为特征，该病在急性暴发时发病率为100％，死亡率可高达70％，平均死亡率一般为10％-40％，导致鸡死亡和产蛋量下降，是危害养禽业的重要疫病之一。该病在世界范围内均有流行，我国在二十世纪50年代发现本病，1988-1990年曾在许多省份流行，1992年以后在我国一些地区又呈地方性流行。
1925年，美国的May首先报道在美国洛岛发现本病，当时称为“喉头-气管炎”。该病曾以不同的名称命名，如“传染性支气管炎”、“禽白喉”等。“喉气管炎”这一术语早在1930年就被使用，1931年，鸡传染性喉气管炎这一病名被美国兽医协会禽病专门委员会所采纳。Beaudette首次证明喉气管炎的病原是一种滤过性病原，即鸡传染性喉气管炎病毒，它属于α-疱疹病毒亚科，又称其为禽疱疹病毒I型。
鸡传染性喉气管炎是第一个被有效疫苗控制的禽病毒性疾病。起初，人们用强毒通过泄殖腔接种来使敏感鸡获得免疫，但是免疫鸡还能排毒，而成为传染源。目前国内外主要采用弱毒疫苗来防制本病，尽管该弱毒疫苗具有良好的免疫效力，也比强毒疫苗安全，但尚存在以下几方面的不足(1)现用的ILTV弱毒疫苗的毒力普遍偏强，接种后反应大。因为它的免疫原性与其毒力呈正相关，如果毒力通过体外传代进一步降低，那么其免疫效力也随之下降。(2)与ILTV强毒株一样ILTV弱毒疫苗也能导致潜伏感染，并且ILTV弱毒疫苗株在鸡群的传播过程中，可引起毒力返强，当它与非免疫鸡群接触时成为潜在的传染源，所以该弱毒疫苗仅限于本病流行地区使用，但非免疫鸡群一旦传入本病将导致重大损失。(3)ILTV强弱毒尚无鉴别诊断方法。由于现用ILTV弱毒疫苗存在的问题，使ILT的完全控制仍然是养禽业的一大难题。传统的方法已经不能解决现有鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗存在的问题，所以需要开发研制一种具有与ILT弱毒疫苗同等免疫效力又能克服弱毒疫苗上述不足的新型安全有效的ILT疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种将ILTV的主要免疫原糖蛋白gB基因，新城疫病毒F基因，传染性支气管炎病毒S1基因等分别插入FPV转移载体中，然后再用该质粒转染FPV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)，以获得抗两种或多种禽病毒病的重组鸡痘病毒活载体疫苗。
上述的目的通过以下的技术方案实现
表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，是一种抗传染性喉气管炎和其它禽病毒病的重组鸡痘病毒活载体疫苗，将鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因和/或其它禽病毒主要保护性抗原基因插入鸡痘病毒弱毒基因组中构建重组鸡痘病毒活载体疫苗。
上述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，含有传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因全部编码框(ORF)，该ORF含有2619个碱基，编码873个氨基酸；上述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，插入的传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的上游有鸡痘病毒早晚期启动子(LP2EP2)。
上述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，含有传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因；上述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，插入的传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因的上游分别连有鸡痘病毒早晚期启动子(LP2EP2)；上述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，含有传染性支气管炎病毒S1基因病上述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，插入的传染性支气管炎病毒S1基因的上游连有鸡痘病毒早晚期启动子(LP2EP2)；上述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，将传染性喉气管炎病毒gB基因和/或其它禽病毒主要保护性抗原基因插入到鸡痘病毒基因组一1.7Kb的EcoRI片段中。
一种表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒在预防鸡痘及本发明的效果是1、新生成的重组鸡痘病毒的鉴定为了分离鸡痘病毒的DNA，用0.1PFU/Cell的剂量感染单层鸡胚成纤维细胞，放在37℃温箱中培养4-6天，待CPE达到100％时，刮细胞到培养基中，3000g离心5分钟收集100％病变的鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞培养物，弃上清，将细胞沉淀重悬于1.0ml的PBS中，反复冻融二次，在最后一次融化后用超声波打两次，30秒中间间隔45秒的冰浴冷却，然后3000g离心5分钟，将上清在15000g离心20分钟后，沉淀重悬于10mmol/L Tris(pH7.5)，此即为粗提的鸡痘病毒。在上述粗提的病毒中加入10％SDS至终浓度0.4％，蛋白酶K至终浓度140μg/ml，37℃消化3-4小时，分别用等体积的饱和酚，等体积的饱和酚/氯仿各抽提一次，于水相中加入2倍体积的100％冷乙醇和1/10体积的3mol/LNaAc(pH4.8)，混匀，-20℃冰箱过夜，12000g离心4℃离心20分钟，弃上清，用70％冷乙醇洗涤沉淀，真空干燥，沉淀用灭菌的TE(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA)置于-20℃冰箱中备用。参照前面的PCR步骤，可以检测到2.7kb的目的片段。
2.发明的外源基因(gB)表达的检测将重组FPV(rFPV)和S-FPV-017感染CEF细胞，待细胞出现100％病变后，倒掉培养液，用PBS(pH7.4)洗细胞二次。加入适量的加热到85℃的2×SDS凝胶电泳加样缓冲液裂解细胞，用细胞刮棒把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，将样品置于沸水中加热10分钟，即为被检样品。分别配制10％分离胶，5％的浓缩胶，按分子克隆上所述方法进行灌制。待其聚合后，用微量加样器加样，同时加蛋白分子量作为对照，在BIO-RAD垂直电泳槽上180V电泳，待染料移至底部时停止电泳，将蛋白分子量切下用0.25％考马斯亮蓝中(0.25％R250，40％甲醇，10％冰乙醇)染色2小时，用脱色液(40％甲醇，10％乙酸)脱色，余下的凝胶置于转印装置，用于Western blot印迹。
将6张Whatman滤纸、NC膜剪成与凝胶同样大小，在转移液中浸泡3-5分钟(48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS)。将3块3MM滤纸对齐依次放置纤维素膜、凝胶，再依次放置另三张滤纸，放置每一层时均要除去它们之间的气泡，然后在TRANS-BLOT SD(Semi-dry Transfer Cell，BIO-RID)转印装置中22V电转45分钟(纤维素膜侧靠正极，胶侧靠负极)。转印完毕，取出NC膜用铅笔在膜上作好标记。夹于两层滤纸之间，室温干燥30分钟。将NC膜放在一个平皿中，加封闭液(0.2％叠氮钠，1％(W/V)BSA溶于PBS)，浸过膜即可，室温下轻振2~3小时。然后用PBS洗3次，加ILTV多克隆血清(1∶100稀释)37℃作用2小时，再用PBS洗3次，Buffer I(150mmol/L NaCl，50mmol/L，Tris.HCl pH7.5)洗10分钟，加入碱性磷酸酶标记的兔抗鸡IgG(用含1％BSABuffer I作1∶10000稀释)37℃作用1小时。用Buffer I洗3次，Buffer II(10mmol/L TrisHCl pH7.5，150mmol/L NaCl)洗一次，吸净余液，置于显色液中。显色完毕，加0.5mmol EDTA(pH8.0)终止显色。
3.重组病毒免疫效力将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒(rFPV-ILTV gB)经翅皮下注射接种(5×105PFU/羽)六周龄的SPF鸡，免疫后四周以致死剂量鸡传染性喉气管炎病毒王岗强毒株进行喉内接种攻毒。结果该重组鸡痘病毒免疫的鸡与鸡传染性喉气管炎病毒弱毒疫苗免疫的鸡一样，对于ILTV王岗强毒株的攻击都获得了100％对死亡的保护和70％对发病的保护。ELISA方法检测结果表明，该重组病毒不仅能在机体内稳定繁殖子代病毒，而且也能稳定地表达插入重组病毒中的外源糖蛋白gB基因，从而刺激机体产生针对鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB和鸡痘病毒的抗体。ILTV王岗强毒株攻击后的鸡的ILTV病毒分离和PCR检测结果都表明，该重组病毒不仅能诱导机体产生抗体，而且也能诱导机体产生针对ILTV的细胞介导的保护性免疫应答，从而保护该重组病毒免疫鸡抵抗ILTV强毒的攻击。
用重组病毒(rFPV-ILTV gB)(5×105PFU/羽)经翅皮下注射接种六周龄的商品鸡。接种后4周以致死剂量的鸡传染性喉气管炎病毒王岗强毒株进行喉内接种攻毒。攻毒后的死亡保护率为，重组鸡痘病毒免疫组100％，ILTV弱毒疫苗免疫组85％，鸡痘病毒疫苗S-FPV-017免疫组70％，非免疫对照组40％。本实验结果表明该重组鸡痘病毒疫苗对商品鸡的免疫保护效果比现用的ILTV弱毒疫苗更好。
将重组病毒添加保护剂制备疫苗，进一步检测疫苗的安全性，在最小免疫剂量免疫的疫苗中，在免疫持续期内，可以保护鸡抵抗强毒的攻击。
表达ILTV gB基因重组禽痘病毒的构建，可以直接进行疫苗的开发工作，而且为进一步构建多价载体疫苗提供了重要的实验材料。例如①在此基础上，可以进一步插入新城疫病毒的F基因，或传染性支气管炎病毒的S1基因等制备多价载体疫苗。②根据这些重组病毒的特点均可建立疫苗免疫和病毒自然感染动物的鉴别诊断方法。
ILTVgB基因与单纯疱疹病毒I型(HSV-1)病毒gB基因是同源基因，与HSV-1糖蛋白gB一样，ILTV糖蛋白gB也是一种跨膜糖蛋白，是病毒感染所必需的，在病毒接触和进入宿主细胞时起关键作用。HSV糖蛋白gB已经被证明能够引起体液抗体和细胞介导的免疫应答，使免疫小鼠能够抵抗HSV强毒的致死性攻击；由痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒表达的HSV糖蛋白gB能保护小鼠抵抗HSV病毒的致死性攻击。ILTV糖蛋白gB基因能编码205ku的糖蛋白复合物，由ILTV糖蛋白gB制备的亚单位疫苗能保护鸡100％抵抗临床发病和83％抑制强毒复制。所有这些都表明，ILTVgB糖蛋白是主要保护性抗原，可作为研制亚单位疫苗、病毒活载体疫苗和DNA疫苗的候选抗原，以ILTVgB基因制备的DNA疫苗可以有效的保护SPF鸡抵抗ILTV强毒的攻击。
鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)表达载体系统是继痘苗病毒(VacciniaVirus，VV)以后发展起来的又一种动物病毒载体。FPV作为活病毒载体有如下优势其基因组结构庞大，比VV长约1/3，能容纳较大的外源基因而不丧失其感染性；被表达的外源蛋白能真实的被表达，如糖基化、羧基化等，可诱导机体产生较长时间的细胞免疫和体液免疫；其严格的细胞浆繁殖特性，避免了病毒基因重组导入宿主细胞染色体而导致细胞特性改变之忧，消除了重组病毒应用对人畜的潜在威胁；重组FPV作为疫苗免疫方法简单，生产疫苗的成本低；非常稳定，反复冻融并不引起病毒改变和失活。人们已经研制了表达几种禽病原的重组鸡痘病毒和鸽痘病毒疫苗，它们包括禽流感的HA基因(Beard et al，1991；1992；Boyle et al，1986；Taylor et al，1988；Tripathy et al，1991)、新城疫的F和HN基因(Boursnell et al，1990；Iritani et al，1991；Letellieret al，1991；Ogawa，1990；Taylor et al，1990)、马立克氏病的gB基因(Nazerianet al，1992)、传染性法氏囊的VP2(Bayliss et al，199l；Heine et al，1993)基因等。与痘苗病毒不同，FPV感染范围很窄，仅感染禽类，其宿主特异性使重组FPV(Recombinant FPV，rFPV)接种哺乳动物后仅产生一过性感染(也即流产性感染)(Taylor et al，1988)，但仍然可在较广范围的动物中正确表达外源基因，在细胞膜表面产生构象正确的抗原，从而诱发机体产生保护性免疫，并且安全、有效，尤其是对免疫缺陷和免疫低下的动物更是理想的载体。所以，FPV不仅可以用于研制禽类的活病毒载体疫苗，而且也可以作为非复制型载体，研制哺乳动物的活病毒载体疫苗。
图1，pSY538质粒图谱图2，pSY681质粒图谱图3，pSC11质粒图谱图4.表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因禽痘病毒转移载体构建图谱图5.表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因禽痘病毒转移载体构建图谱图6.表达传染性支气管炎病毒S1基因载体构建示意图本发明的
具体实施例方式实施例1表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒的构建如下1.ILTVgB基因的克隆以ILTV王岗株DNA为模板，利用合成的引物(上游引物5’-GGAGGATCCATGGCTAGCTTGAAA-3’，位于起始密码子之前；下游引物5’-TACTGTGAATTCTAATGTCA TTTTA-3’，位于终止子之后，两引物间包含完整的gB基因阅读框架，在上下游引物的5’端引入EcoRI酶切位点)进行PCR扩增，反应条件为95℃/5分钟，94℃/1分钟，54℃/50秒，72℃/3分钟，35个循环，72℃延伸5分钟。反应体系为50μl反应体系中加5μl 10×buffer、2U TaqDNA聚合酶、2μl引物(10pmol/μl)、4μl dNTPs(200umol/L)、1μlILTV DNA、35μl灭菌去离子水。反应完毕后取5μl扩增产物，以0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增的ILTV gB基因大小为2.7kb。
将扩增的片段用EcoRI酶切后，连接到pUC119质粒载体上，形成重组质粒pUC119gB，测序结果表明ILTV王岗株gB基因的阅读框架长2619bp，编码873个氨基酸。gB基因的编码蛋白在其氨基端含有21个氨基酸的信号肽序列，在羧基端从690到761位氨基酸中有一段为嵌膜序列，其胞外区有8个糖基化位点，而从762位到873位的正电荷区是一个胞内区，因此该蛋白为一跨膜蛋白。2.含gB基因的鸡痘病毒转移载体的构建重组质粒pUC119gB中2.7kb的gB基因通过EcoRI位点亚克隆到pSY538质粒鸡痘病毒早晚期启动子EP2LP2下游处，EcoRI酶切，可切出3.2kb的pSY538载体带和2.7kb的gB基因条带，BglII酶切该重组子，可以切出0.687kb和5.1kb的两条带，将其命名为pSY638；然后，将来自pSC11质粒的痘苗病毒启动子Pl1控制下的大肠杆菌LacZ基因用PstI，XbaI双酶切，Klenow补平，通过平端连接克隆到pSY638质粒的SmaI位点，NotI酶切得到6kb的LacZ+gB片段带和3.2kb的pSY538载体带，将载体命名为pSY738，再将含LP2EP2-gB基因和Pl1-LacZ基因的NotI片段从pSY738质粒中切下，接着我们再将pSY738中含gB基因和LacZ基因的NotI片段克隆到pSY681的NotI位点中，通过用NotI酶切该重组子，可以切成6kb的LacZ+gB片段带和5.8kb pSY681载体带，将所获得的鸡痘病毒转移质粒命名为pSY781。3.鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备取10日龄的SPF鸡胚，先后用碘酒棉和酒精棉消毒气室部位，无菌取出鸡胚，用Hank’s液洗涤胚体，去头、四肢和内脏，剪成2mm大小的组织块，用0.25％胰酶溶液(4ml/胚)在37℃水浴中消化12分钟左右，然后倒掉胰酶，用Hank’s液洗涤2~3次后，再加入适量的营养液(DMEM)，吹打分散细胞，用6层纱布过滤，制成每毫升含活细胞数106-107个的细胞悬液，分装为5ml/60mm平皿，制成CEF单层细胞。4.鸡痘弱毒(S-FPV-017)种毒的制备鸡痘病毒是通过以0.01PFU/Cell的剂量感染鸡胚成纤维细胞。感染前，用Hank’s液洗涤细胞尽量除去培养液中残余的牛血清，然后在37℃温箱中让病毒液在细胞上吸附2小时，并且每半小时摇动病毒液一次让其充分吸附，2小时后倒去感染液，加入含5％胎牛血清的DMEM培养液，放在37℃温箱中培养3-4天。待第4天细胞病变(CPE)达100％时将培养基和细胞一起收获，冻融三次后储存于-70℃，即为鸡痘病毒种毒，其滴度为106PFU/ml。5.转染和重组鸡痘病毒的筛选含ILTV糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pSY781的纯化，参照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification System说明书。将用上述方法制备80％单层的CEF细胞，用Hank’s液洗涤，然后用S-FPV-017疫苗株(3PFU/cell)感染该细胞，在37℃感作2小时，其间每20分钟摇动病毒感作液一次，然后倒掉感染液，洗涤细胞；转染方法按TfxTM-50脂质体转染试剂盒说明书进行，将5μg(1μg/μl)纯化重组转移质粒(pSY781)加入50μl到150mmol/L NaCl溶液中，充分混匀，制成溶液A；同时，取10μl TransfectionReagent加到150mmol/L NaCl溶液中，充分混匀，制成溶液B。立即将溶液A、B充分混合均匀，室温静置10分钟后，加到已经被S-FPV-017疫苗株感染的CEF细胞上，37℃感作1小时，倒掉转染液，加入含5％牛血清的DMEM培养液，37℃培养至72小时出现典型的细胞病变，收取该细胞培养物反复冻融3次作为转染种毒。
将上述转染种毒按10-1、10-2、10-3稀释度接种CEF单层细胞，37℃感作2小时，感染之后倒掉感染液，加入含1％低熔点琼脂糖的DMEM营养琼脂，37℃培养72小时，待出现典型的细胞病变，再用含X-gal(250μg/ml)DMEM营养琼脂进行染色，37℃培养，待出现蓝色蚀斑，挑取该蓝斑，放入1ml DMEM液中，冻融3次进行新一轮的蚀斑纯化，共进行6轮蚀斑纯化。
将ILTV王岗株的gB基因通过PCR方法扩增出来克隆到鸡痘病毒转移载体中，将此载体和鸡痘病毒弱毒疫苗病毒共同感染CEF细胞，通过蓝斑筛选获得含gB基因的重组鸡痘病毒。
将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒(rFPV-ILTV gB)经翅皮下注射接种(5×105PFU/羽)六周龄的SPF鸡，免疫后四周以致死剂量鸡传染性喉气管炎病毒王岗强毒株进行喉内接种攻毒。结果该重组鸡痘病毒免疫的鸡与鸡传染性喉气管炎病毒弱毒疫苗免疫的鸡一样，对于ILTV王岗强毒株的攻击都获得了100％对死亡的保护和70％对发病的保护。ELISA方法检测结果表明，该重组病毒不仅能在机体内稳定繁殖子代病毒，而且也能稳定地表达插入重组病毒中的外源糖蛋白gB基因，从而刺激机体产生针对鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB和鸡痘病毒的抗体。ILTV王岗强毒株攻击后的鸡的ILTV病毒分离和PCR检测结果都表明，该重组病毒不仅能诱导机体产生抗体，而且也能诱导机体产生针对ILTV的细胞介导的保护性免疫应答，从而保护该重组病毒免疫鸡抵抗ILTV强毒的攻击。
用重组病毒(rFPV-ILTV gB)(5×105PFU/羽)经翅皮下注射接种六周龄的商品鸡。接种后4周以致死剂量的鸡传染性喉气管炎病毒王岗强毒株进行喉内接种攻毒。攻毒后的死亡保护率为，重组鸡痘病毒免疫组100％，ILTV弱毒疫苗免疫组85％，鸡痘病毒疫苗S-FPV-017免疫组70％，非免疫对照组40％。本实验结果表明该重组鸡痘病毒疫苗对商品鸡的免疫保护效果比现用的ILTV弱毒疫苗更好。
将重组病毒添加保护剂制备疫苗，进一步检测疫苗的安全性，在最小免疫剂量免疫的疫苗中，在免疫持续期内，可以保护鸡抵抗强毒的攻击。
取纯化病毒液200ul，加Trizol试剂400ul，剧烈震荡，室温静置10min后；加400ul三氯甲烷，震荡摇匀后，室温静置10min 12500rpm离心10min；取上清移入另一EP管加入两倍体积异戊醇混匀后，室温静置20min，12500rpm离心10min沉淀核酸，真空抽干，重溶于25.5ul DEPC水中。
将RT-PCR扩增的1.7kb大小的S1基因片段用BamHI酶切后，连接到pUC19质粒载体上，进行序列测序，IBV S1基因的阅读框架长1700bp，编码510个氨基酸。2.重组病毒的构建将重组质粒pUC119S1中1.7kb的S1基因通过BamHII位点亚克隆到pSY538质粒中的鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2下游处，鉴定方向后将其命名为pSY638；然后，将来自pSC11质粒的痘苗病毒启动子P11控制下的大肠杆菌LacZ基因用PstI，XbaI双酶切，之后用Klenow补平，通过平端连接克隆到pSY638质粒的SmaI位点，将载体命名为pSY738，再将含LP2EP2-S1基因和P11-LacZ基因的NotI片段从pSY738质粒中切下，克隆到pSY681的NotI位点中，所获得的鸡痘病毒转移质粒命名为pSY781。该载体含有痘苗病毒启动子P11控制下的大肠杆菌LacZ基因和LP2EP2控制下的S1基因。
参照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification System说明书对质粒进行纯化。制备鸡胚成纤维细胞，待细胞达到80％单层时进行转染，先用S-FPV-017疫苗株(3PFU/cell)感染该细胞，在37℃感作2小时，其间每20分钟摇动病毒感作液一次，然后倒掉感染液，洗涤细胞；之后加入配制好的转染液，37℃感作1小时，倒掉转染液，加入含5％牛血清的DMEM培养液，37℃培养至72小时出现典型的细胞病变，收取该细胞培养物反复冻融3次作为转染种毒。
将上述转染种毒按10-1、10-2、10-3稀释度接种CEF单层细胞，37℃感作2小时，感染之后倒掉感染液，加入含1％低熔点琼脂糖的DMEM营养琼脂，37℃培养72小时，待出现典型的细胞病变，再用含X-gal(250μg/ml)DMEM营养琼脂进行染色，37℃培养，待出现蓝色蚀斑，挑取该蓝斑，放入1ml DMEM液中，冻融3次进行新一轮的蚀斑纯化，共进行6轮蚀斑纯化。3.重组鸡痘病毒的鉴定为了分离鸡痘病毒的DNA，用0.1PFU/Cell的剂量感染单层鸡胚成纤维细胞，放在37℃温箱中培养4-6天，待CPE达到100％时，刮细胞到培养基中加入PBS后，补充10％SDS至终浓度0.4％，蛋白酶K至终浓度140μg/ml，37℃消化3-4小时，分别用等体积的饱和酚，等体积的饱和酚/氯仿(1∶1)，等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次，于水相中加入2倍体积的100％冷乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH4.8)，混匀，-20℃冰箱过夜，12000g离心4℃离心20分钟，弃上清，用70％冷乙醇洗涤沉淀，真空干燥，沉淀用灭菌的TE(10mmol/LTris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA)置于-20℃冰箱中备用。PCR试验所使用的上游引物为PS1 5’TTT TAT AAT TTA ACA GTT AGC GTA 3’(430-453)；下游引物为PS2 5’TAA CAA CAC GTT GCC TTA CCA CTA 3’(1072-1095)。两引物扩增的DNA片段长度为689bp；反应条件为95℃/5分钟，94℃/30秒，50℃/30秒，72℃/1分钟，30个循环；最后72℃延伸10分。在0.8％的琼脂糖凝胶上检测表达产物。2.2 Western blot检测糖蛋白gB的表达用rFPV-S1和S-FPV-017感染鸡胚成纤维细胞，待产生细胞病变达100％后，倒掉培养液，用PBS(pH7.4)洗细胞二次。加入等体积的2倍SDS凝胶电泳加样缓冲液，将样品置于沸水中煮5min裂解细胞，准备上样。分别配制10％分离胶，5％的浓缩胶，待其聚合后，上样电泳，同时加蛋白Marker作为对照，在BIO-RAD垂直电泳槽上80V电泳，待染料移至底部时停止电泳，用于Westernblot印迹。
将6张滤纸、一张醋酸纤维素膜(NC)剪成与凝胶同样大小，在转移缓冲液(48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS)中浸泡3-5min。将3张3MM滤纸对齐依次放置NC、凝胶，再依次放置另三张滤纸，放置每一层时均要除去它们之间的气泡，然后在TRANS-BLOT SD(Semi-dry Transfer Cell，BIO-RID)转印装置中22V电转印45min(NC膜侧靠正极，胶侧靠负极)。将NC膜蛋白Marker切下用0.25％考马斯亮蓝(0.25％R250，40％甲醇，10％冰乙醇)速染5sec，之后用脱色液(40％甲醇，10％乙酸)脱色，待蛋白Marker显示后，终止脱色。
将NC膜置于平皿内，加入封闭液(5％脱脂乳溶于PBS中，0.02％叠氮钠，0.02％Tween-20)室温下作用2h。将NC膜放入封闭液稀释的一抗中(传染性支气管炎阳性血清，1∶100稀释)作用1h。用PBS洗膜三次，每次10min；再将NC膜转入洗涤液(150mmol/L NaCl，50mmol/LTris-HCl pH7.5)中室温洗10min，将NC膜放入稀释的酶标兔抗鸡IgG(稀释液1％BSA，150mmol/LNaCl，50mmol/LTris-Cl pH7.5)酶标兔抗鸡IgG(1∶10000稀释)室温下轻轻振荡作用1h。取出NC膜于洗涤液中冲洗3次，每次10min，将NC膜浸入10ml碱性磷酸酶缓冲液中避光显色5-15min，待检测的目的片段显示后，可以看到有特异的片段出现后，终止反应。
经过PCR和Western-Blot分析证明重组鸡痘病毒中含有IBV的S1基因，并获得了表达。
ILTV gB基因核苷酸序列ATGGCTAGCTTGAAAATGCTGATCTGCGTGTGCGTGGCAATCCTGATCCCATCTACCCTATCTCAAGATTCACACGGAATTGCTGGAATAATAGACCCTCATGATACAGCCAGCATGGATGTTGGAAAAATCTCTTTCTCCGAAGCCATTGGGTCGGGGGCACCGAAAGAACCCCAGATTAGAAACAGAATTTTTGCGTGCTCATCTCCAACTGGCGCCAGTGTTGCGAGGCTTGCCCAGCCACGACATTGTCACCGACATGCCGATTCGACTAACATGACTGAAGGAATTGCCGTAGTCTTCAAGCAAAACATTGCCCCGTACGTCTTTAATGTGACTCTATACTATAAACATATAACCACAGTTACTACGTGGGCATTATTCTCAAGACCCCAAATAACAAATGAGTACGTGACCAGGGTTCCAATAGACTATCATGAAATTGTCAGGATTGATCGATCGGGAGAATGCTCATCCAAAGCAACGTATCATAAAAATTTCATGTTTTTTGAAGCTTACGACAATGATGAAGCAGAAAAAAAATTGCCCCTGGTTCCATCACTGTTAAGATCAACTGTCTCCAAGGCGTTTCATACAACTAACTTTACTAAGCGACATCAAACCCTGGGATACCGAACGTCTACATCGGTCGACTGTGTTGTGGAATATCTACAGGCTAGATCTGTATACCCGTATGATTACTTTGGAATGGCGACAGGTGATACAGTAGAAATTTCTCCTTTTTATACCAAAAACACGACCGGACCAAGGCGTCACAGTGTCTACAGAGACTATAGATTTCTCGAAATCGCAAATTATCAAGTCAGGGATTTGGAAACCGGACAAATAAGACCCCCTAAAAAAAGAAACTTTCTAACAGATGAACAATTCACTATAGGCTGGGATGCAATGGAAGAAAAGGAATCTGTATGTACTCTCAGTAAATGGATTGAAGTCCCGGAAGCAGTTCGTGTTTCGTACAAAAACAGTTACCACTTTTCACTTAAAGATATGACTATGACGTTCTCGTCCGGAAAACAACCTTTTAACATCAGCAGGCTTCATTTGGCTGAATGCGTTCCTACCATAGCCTCGGAGGCCATAGATGGCATCTTTGCCAGAAAGTATAGTTCGACTCATGTCCGTTCTGGGGACATCGAATACTATCTCGGTAGTGGCGGATTTCTGATCGCATTTCAGAAACTCATGAGCCATGGCTTGGCTGAAATGTACCTAGAAGAGGCACAAAGACAAAATCATCTCCCGAGAGGGAGAGAGCGTCGCCAAGCCGCAGGTCGCCGCACGGCGTCGCTGCAGTCTGGACCTCAGGGTGATAGAATTACTACCCACAGTTCTGCAACATTTGCCATGTTACAATTTGCATACGACAAAATCCAAGCCCATGTTAACGAGCTTATCGGAAATTTGTTGGAAGCGTGGTGTGAGCTTCAGAACCGCCAACTGATTGTATGGCACGAGATGAAGAAACTAAACCCGAACTCACTGATGACATCTTTGTTCGGACAACCTGTAAGCGCCAGGCTATTGGGAGACATCGTAGCGGTATCAAAATGTATAGAAATTCCAATCGAAAATATTAGGATGCAGGATTCCATGCGCGTGCCAGGGGACCCAACCATGTGCTATACCAGACCAGTACTTATTTTCAGGTATTCGTCCTCCCCTGAGTCACAGTTTTCTGCGAACTCAACAGAAAACCACAATCTTGACATATTAGGCCAACTCGGAGAACATAATGAAATTTTACAAGGGCGGAATTTGATAGAACCATGCATGATCAATCACAGACGGTACTTTCTGTTGGGAGAAAACTACCTTCTTTACGAAGACTATACATTTGTTAGACAAGTAAATGCTTCCGAGATCGAAGAAGTGAGCACATTCATCAACTTGAACGCCACTATACTAGAAGATTTGGACTTTGTGCCCGTCGAAGTATACACTCGCGAGGAACTCAGAGATACTGGGACTTTAAACTATGATGATGTGGTCAGATATCAAAATATITATAACAAAAGGTTCAGAGACATTGACACTGTAATACGTGGAGATAGGGGAGATGCAATCTTTAGAGCAATAGCAGATTTTTTTGGCAACACTCTTGGAGAAGTAGGAAAGGCATTGGGAACTGTAGTGATGACAGCCGCGGCAGCAGTAATTTCTACAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTAACCCGTTCGCCGCACTCGGAATTGGGATAGCGGTGGTGGTGAGCATTATTTTAGGACTGCTGGCGTTCAAATATGTAATGAACCTGAAATCAAACCCAGTTCAGGTTCTGTTCCCAGGCGCAGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCCTCTAGACGTTACTACAAGGATGAGGAGGAGGTTGAGGAGGATAGTGATGAGGACGACAGGATACTTGCCACCAGAGTTCTGAAAGGCCTTGAGCTTCTACACAAGGATGAACAGAAAGCTCGAAGACAGAAAGCGCGGTTTTCTGCTTTTGCTAAAAATATGAGAAACCTATTTCGCAGAAAACCCCGAACCAAGGAAGATGACTACCCCCTGCTCGAATACCCTTCGTGGGCAGAAGAAAGCGAAGACGAATAAILTV gB基因编码氨基酸序列MASLKMLICVCVAILIPSTLSQDSHGIAGIIDPHDTASMDVGKISFSEAIGSGAPKEPQIRNRIFACSSPTGASVARLAQPRHCHRHADSTNMTEGIAVVFKQNIAPYVFNVTLYYKHITTVTTWALFSRPQITNEYVTRVPIDYHEIVRIDRSGECSSKATYHKNFMFFEAYDNDEAEKKLPLVPSLLRSTVSKAFHTTNFTKRHQTLGYRTSTSVDCVVEYLQARSVYPYDYFGMATGDTVEISPFYTKNTTGPRRHSVYRDYRFLEIANYQVRDLETGQIRPPKKRNFLTDEQFTIGWDAMEEKESVCTLSKWIEVPEAVRVSYKNSYHFSLKDMTMTFSSGKQPFNISRLHLAECVPTIASEAIDGIFARKYSSTHVRSGDIEYYLGSGGFLIAFQKLMSHGLAEMYLEEAQRQNHLPRGRERRQAAGRRTASLQSGPQGDRITTHSSATFAMLQFAYDKIQAHVNELIGNLLEAWCELQNRQLIVWHEMKKLNPNSLMTSLFGQPVSARLLGDIVAVSKCIEIPIENIRMQDSMRVPGDPTMCYTRPVLIFRYSSSPESQFSANSTENHNLDILGQLGEHNEILQGRNLIEPCMINHRRYFLLGENYLLYEDYTFVRQVNASEIEEVSTFINLNATILEDLDFVPVEVYTREELRDTGTLNYDDVVRYQNIYNKRFRDIDTVIRGDRGDAIFRAIADFFGNTLGEVGKALGTVVMTAAAAVISTVSGIASFLSNPFAALGIGIAVVVSIILGLLAFKYVMNLKSNPVQVLFPGAVPPAGTPPRPSRRYYKDEEEVEEDSDEDDRILATRVLKGLELLHKDEQKARRQKARFSAFAKNMRNLFRRKPRTKEDDYPLLEYPSWAEESEDE新城疫病毒F基因核苷酸序列图CTGGCACTGAGCTGTGTCCGTCTGACAAATTCTCTCGATGGAAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTAGTAACGGGAGACAAAGCAGTCAACATATACACCTCATCTCAGACAGGGTCAATAATAGTCAAGTTACTCCCAAATATGCCTAAGGATAAAGAGGCGTGTGCAAAAGCCCCGTTGGAGGCATACAACAGGACACTGACTGCTTTGCTCACCCCCCTTGGTGATTCTATCCGCAGGATACAAGAGTCTGCGACTACGTCCGGAGGAAGGAGGCAGAGACGCTTTATAGGTGCCATTATCGGCAGTGTAGCTCTTGGGGTTGCCACAGCTGCCCAGATAACAGCAGCCTCAGCTCTGATACAAGCCAACCAGAATGCTGCCAACATCCTCCGGCTTAAAGAGAGCATTGCTGCAACTAATGAAGCTGTACATGAAGTCACTGACGGATTATCGCAACTAGCAGTGGCAGTTGGGAAGATGCAGCAGTTTGTTAATGACCAGTTTAATAACACAGCTCAGGAATTGGACTGTATAAAAATTACACAGCAGGTTGGTGTAGAACTCAACCTGTACCTAACTGAATTGACTACAGTATTCGGGCCACAAATCACTTCCCCTGCCTTAACTCAGCTGACTATCCAGGCGCTTTACAATCTAGCTGGTGGTAAGATGGATTATTTGTTGACTAAGTTAGGTGTTGGGAACAACCAACTCAGCTCATTAATCGGTAGCGGCTTGATCACCGGTAACCCTATTCTGTACGATTCACAGACTCAACTCTTAGGTATACAGGTAACTTTACCCTCAGTCGGTAACCTAAATAATATGCGTGCTACCTACTTGGAGACCTTGTCTGTAAGCACAACCAAGGGATTTGCCTCAGCACTTGTCCCAAAAGTGGTGACACAGGTCGGGTCTGTGATAGAGGAACTTGACACCTCATACTGTGTAGAGACCGATTTGGATTTATATTGTACAAGAATAGTGACATTCCCTATGTCTCCTGGTATTTATTCCTGTCTGAGCGGTAATACATCAGCTTGCATGTATTCAAAGACTGAAGGTGCACTTACTACGCCATATATGACTATCAAGGGCTCAGTTATTGCCAATTGCAAGATAACAACATGCAGATGTGCAGACCCTCCGGGTATCATATCGCAAAATTATGGAGAAGCTGTGTCTCTAATAGATAGGCACTCATGCAATGTCTTATCCTTAGACGGGATAACTTTGAGGCTCAGTGGAGAATTTGACGTAACTTATCAAAAGAATATCTCAATATTAGATTCTCAGGTAATAGTGACAGGCAATCTCAATATCTCAACTGAACTTGGGAATGTCAACAACTCGATAAGTAATGCTTTGGATAAGTTAGAGGAAAGCAATAGCAAACTTGACAAAGTCAATGTCAAGCTGACCGGCACGTCTGCTCTCATTACCTATATAGTTTTAACTATCATATCTCTTGTTTGTGGTATACTTAGCCTGGTTCTAGCATGCTATCTGATGTATAAGCAAAAGGCGCAACAAAAGACCTTATTATGGCTTGGGAATAATACCCTAAATCAGATGAGGGCCACTACAAGAATCTGA根据新城疫病毒F基因核苷酸序列推导的氨基酸序列图LALSCVRLTNSLDGRPLAAAGIVVTGDKAVNIYTSSQTGSIIVKLLPNMPKDKEACAKAPLEAYNRTLTALLTPLGDSIRRIQESATTSGGRRQRRFIGAIIGSVALGVATAAQITAASALIQANQNAANILRLKESIAATNEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVNDQFNNTAQELDCIKITQQVGVELNLYLTELTTVFGPQITSPALTQLTIQALYNLAGGKMDYLLTKLGVGNNQLSSLIGSGLITGNPILYDSQTQLLGIQVTLPSVGNLNNMRATYLETLSVSTTKGFASALVPKVVTQVGSVIEELDTSYCVETDLDLYCTRIVTFPMSPGIYSCLSGNTSACMYSKTEGALTTPYMTIKGSVIANCKITTCRCADPPGIISQNYGEAVSLIDRHSCNVLSLDGITLRLSGEFDVTYQKNISILDSQVIVTGNLNISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTGTSALITYIVLTIISLVCGILSLVLACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLNQMRATTRI.传染性支气管炎病毒S1基因核苷酸序列图ATGTTGGGGAAGTCACTGTTTTTAGTGACCATTTTGTGTGCACTATGTAGTGCAAATTTGTTCGATCCTGCCAATTATGTGTACTACTACCAAAGTGCCTTTAGGCCTTCAAATGGGTGGCATTTGCAAGGGGGTGCTTATGCAGTAGTGAATTCTTCTAATTATGCTAATAATGCAGGTTCTGCATCTGAGTGCACTGTTGGTGTTATTAAGGATGTCTATAATCAAAGTGCGGCTTCCATAGCTATGACAGCACCTCTTCAGGGTATGGCTTGGTCTAAGTCACAATTTTGTAGTGCACACTGTGACTTTTCTGAAATTACAGTTTTTGTCACACATTGTTATAGTAGTGGATCAGGGTCTTGTCCTATAACAGGCATGATTGCACGTGGTCATATTCGTATTTCTGCAATGAAAAATGGTTCTTTATTTTATAATTTAACAGTTAGCGTATCTAAATACCCTAATTTTAAATCTTTTCAATGTGTTAACAACTTCACATCTGTTTATTTAAATGGTGATCTTGTTTTTACTTCCAACAAAACTACTGATGTTACGTCAGCAGGTGTCTATTTTAAAGCAGGTGGACCTGTAAATTATAGTATTATGAAAGAATTTAAGGTTCTTGCTTACTTTGTTAATGGTACAGCACAAGATGTAATTTTGTGTGATAACTCCCCCAAGGGTTTGCTAGCTTGTCAATATAACACTGGCAATTTTTCAGATGGCTTTTATCCTTTTACTAATAGTACTTTAGTTAGGGAAAAGTTCATTGTCTATCGTGAAAGTAGTGTTAATACTACTTTGGCGTTAACTAATTTCACTTTTACTAATGTAAGTAATGCACAGCCTAATAGTGGCGGTGTTCATACTTTTCATTTATATCAAACACAAACAGCTCAGAGTGGTTATTATAATTTTAATTTGTCATTTCTGAGTCAGTTTGTGTATAAGGCAAGTGATTATATGTATGGGTCTTACCACCCTATTTGTGCTTTTAGACCAGAAACCATTAATAGTGGTTTGTGGTTTAATTCCTTGTCAGTTTCTCTTACTTATGGACCCCTACAGGGAGGGTATAAGCAATCTGTTTTTAGTGGTAAGGCAACGTGTTGTTATGCCTACTCTTATAATGGCCCAAGGGCATGTAAAGGTGTTTATTCAGGTGAATTAAGCAGGGATTTTGAATGTGGATTGCTGGTTTATGTTACTAAGAGTGATGGCTCTCGTATACAGACTAGAACGGAGCCCTTAGTATTAACGCAACACAATTATAATAATATTACTTTAGATAAGTGTGTTGCCTATAATATATATGGCAGAGTAGGCCAAGGTTTTATTACTAATGTGACTGATTCTGTTGCTAATTTTAGTTATTTAGCAGATGGTGGGTTAGCTATTTTAGATACGTCGGGTGCCATAGATGTTTTTGTTGTACAGGGCAGCTATGGTCTTAATTATTACAAGGTTAATCCTTGTGAAGATGTTAACCAACAGTTTGTAGTGTCTGGTGGCAATATAGTTGGCATT传染性支气管炎病毒S1蛋白氨基酸序列图MLGKSLFLVTILCALCSANLFDPANYVYYYQSAFRPSNGWHLQGGAYAVVNSSNYANNAGSASECTVGVIKDVYNQSAASIAMTAPLQGMAWSKSQFCSAHCDFSEITVFVTHCYSSGSGSCPITGMIARGHIRISAMKNGSLFYNLTVSVSKYPNFKSFQCVNNFTSVYLNGDLVFTSNKTTDVTSAGVYFKAGGPVNYSIMKEFKVLAYFVNGTAQDVILCDNSPKGLLACQYNTGNFSDGFYPFTNSTLVREKFIVYRESSVNTTLALTNFTFTNVSNAQPNSGGVHTFHLYQTQTAQSGYYNFNLSFLSQFVYKASDYMYGSYHPICAFRPETINSGLWFNSLSVSLTYGPLQGGYKQSVFSGKATCCYAYSYNGPRACKGVYSGELSRDFECGLLVYVTKSDGSRIQTRTEPLVLTQHNYNNITLDKCVAYNIYGRVGQGFITNVTDSVANFSYLADGGLAILDTSGAIDVFVVQGSYGLNYYKVNPCEDVNQQFVVSGGNIVGI
权利要求
1，一种表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，是一种抗传染性喉气管炎和其它禽病毒病的重组鸡痘病毒活载体疫苗，其特征是将鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因和/或其它禽病毒主要保护性抗原基因插入鸡痘病毒弱毒基因组中构建重组鸡痘病毒活载体疫苗。
2，根据权利要求1所述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，其特征是含有传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因全部编码框(ORF)，该ORF含有2619个碱基，编码873个氨基酸；
3，根据权利要求2所述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，其特征是插入的传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的上游有鸡痘病毒早晚期启动子(LP2EP2)。
4，根据权利要求1所述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，其特征是含有传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因；
5，根据权利要求4所述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，其特征是插入的传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因的上游分别连有鸡痘病毒早晚期启动子(LP2EP2)；
6，根据权利要求1所述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，其特征是含有传染性支气管炎病毒S1基因病
7，根据权利要求6所述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，其特征是插入的传染性支气管炎病毒S1基因的上游连有鸡痘病毒早晚期启动子(LP2EP2)；
8，根据权利要求1所述的表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒，其特征是将传染性喉气管炎病毒gB基因和/或其它禽病毒主要保护性抗原基因插入到鸡痘病毒基因组一1.7Kb的EcoRI片段中。
9，一种表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒在预防鸡痘及传染性喉气管炎和/或其它禽病毒病方面的应用。
全文摘要
表达喉气管炎或其它禽病毒基因重组禽痘病毒及其应用，刚出壳的雏鸡个体很小，但面临的病毒性疾病很多，多种疫苗同时注射常常不堪重负。本发明的内容包括将鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因和/或其它禽病毒主要保护性抗原基因插入鸡痘病毒弱毒基因组中构建重组鸡痘病毒活载体疫苗，它利用鸡痘病毒弱毒作为载体构建可以表达传染性喉气管炎病毒gB基因和/或其它禽病毒病主要保护性抗原基因的重组禽痘病毒活载体疫苗，外源病毒基因在禽痘病毒早晚期启动子LP
文档编号C12P21/02GK1472315SQ0313245
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月19日 优先权日2003年6月19日
发明者童光志, 王云峰, 张绍杰, 智海东, 刘胜旺, 仇华吉, 王玫 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所