专利名称：一种从河豚中分离产生河豚毒素的微生物的方法
技术领域：
本发明涉及产生河豚毒素(TTX)的微生物，具体说是一种从河豚中分离产生河豚毒素(TTX)的微生物的方法。
背景技术：
由于河豚鱼肉鲜美，爱食者大有人在，尤其在日本被奉为时尚，但因调制失误而导致中毒事件屡有发生，引起食用者肢体麻木、瘫痪，甚至死亡；但在另一方面，利用TTX具有镇痛、镇静、镇惊、解痛等功效，在临床已可作为局麻药，以及可用于治疗风湿、关节炎、麻风病；近年来还发现可用于解毒、解痉、，对头痛、破伤风、霍乱、伤寒、哮喘、晚期癌症均有疗效，具有很大的开发价值；河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是自然届所发现的毒性最大的神经毒素之一，毒力相当于氰化钠的1250倍，可高选择性、高亲和性地阻断神经兴奋膜上的钠离子通道。河豚毒素以往都是从河豚卵巢或肝脏中分离提取出来的生物活性物质，但从河豚卵巢中提取TTX，不仅河豚鱼捕捞困难，且自然资源有限，困难重重；长期以来，国内外的科技工作者发现河豚毒素(TTX)不仅存在于河豚鱼中，也存在于河豚鱼共生存的微生物中，较多的发现认为海洋细菌、放线菌能产生河豚毒素，但由于所得到的微生物产TTX含量低或产TTX遗传性状不稳定，人工培养时其子代容易失去产TTX特性，因此至今应用微生物源产生河豚毒素研究尚无法进入到应用阶段。为此，从河豚鱼中能分离纯化得到其共生存的能产生TTX含量较高，能人工培养且产TTX遗传稳定的河豚卵巢微生物的方法，已为国内外普遍关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产生TTX量高、遗传性状稳定的从河豚中分离产生河豚毒素的微生物的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为1)选取健康的、新鲜的河豚；2)鱼体擦洗消毒，解剖鱼体，取出新鲜卵巢，加细胞分散液(例如无菌生理盐水或0.2MOL磷酸缓冲液)研磨，获得新鲜河豚卵巢提取液；3)对新鲜河豚卵巢提取液，分别在能分离纯化产生河豚毒素的海洋细菌、放线菌的培养基上(是一种选择性的培养基，其中添加了诱导物河豚卵巢提取液)保温培养。
所述最好河豚为正值产卵期的河豚；最好为红鳍东方豚；保温培养的温度为25~37℃；每1克新鲜卵巢加分散液0.5~1.5毫升；海洋细菌的培养基组成为葡萄糖0.5-1.5％，蔗糖0.5-1.5％，牛肉膏0.1-0.5％，酵母膏0.1-0.5％，蛋白胨0.1-0.5％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量为海水或人工海水，琼脂2％，PH6.5-7.5。
放线菌的培养基组成为A可溶性淀粉0.5-1.5％，蔗糖0.2-1.0％，甘露醇0.1-0.3％，KNO30.1％，K2HPO40.35％，MgSO4.7H2O 0.001％FeSO4.7H2O 0.001％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量为海水或人工海水，琼脂2％，PH7.0～7.2；B葡萄糖0.5-1.5％，蔗糖0.5-1.5％，牛肉膏0.1-0.5％，酵母膏0.1-0.5％，蛋白胨0.1-0.5％，NaCl 1.0-3.5％，河豚卵巢提取液0.005-0.0151％，余量为海水(或人工海水)，琼脂2％，PH6.5～7.5；培养基A或B临用时，在已加热融化的300ml培养基中需进入3％重铬酸钾溶液1ml，再加入1％链霉素溶液0.5ml，及环丙沙星1-5滴，轻轻摇匀，然后倒分离纯化用平皿。
本发明具有如下优点1.操作简单，结果理想，分离效果好，能得到所需的菌株，总成功率在90％以上。
2.分离得到的微生物能产生具有较高含量的河豚毒素，且所获菌株传代10代以上，遗传性状稳定。
图1为TTX标准品的HPLC图谱。
图2为样品RG-3B的HPLC图谱。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1从河豚卵巢中分离产生河豚毒素(TTX)的细菌的方法，可按照以下步骤操作(1)从海洋中选取健康的正值产卵期的红鳍东方豚；(2)对新鲜的红鳍东方豚鱼体用酒精擦洗消毒，立即用无菌解剖刀、薄刀片及镊子，迅速解剖鱼体，准确取出新鲜卵巢，加细胞分散液无菌生理盐水或磷酸缓冲液，用石英沙研磨3-5min(能使卵巢中的微生物充分游离分散，而被分离出来)，获得新鲜河豚卵巢提取液；(3)对新鲜河豚卵巢提取液，用平板稀释法，以10-2，10-3、10-4浓度，在下列组成培养基的平皿上涂平板，然后放到28℃培养箱中保温培养；挑出单菌落分纯(经显微镜观察，然后移殖到斜面上保藏，进行产生河豚毒素(TTX)生物活性物质检测验证。
分离产生河豚毒素细菌培养基组成如下葡萄糖1％，蔗糖1％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.3％，河豚卵巢提取液0.01％，余量为海水(或人工海水)，琼脂2％，PH7.0-7.2；
实施例2与实施例1不同之处在于，对新鲜河豚卵巢提取液，用平板稀释法，以原液一滴及10-1、10-2浓度稀释，在下列组成培养基的平皿上涂平板，然后放到28℃培养箱中保温培养；挑出单菌落分纯(经显微镜观察，然后移殖到斜面上保藏，进行产生河豚毒素(TTX)生物活性物质检测验证。
分离产生河豚毒素放线菌培养基组成为可溶性淀粉1％，蔗糖0.5％，甘露醇0.3％，KNO30.1％，K2HPO40.35％，MgSO4.7H2O 0.001％FeSO4.7H2O 0.001％，河豚卵巢提取液0.01％，余量为海水(或人工海水)，琼脂2％，PH7.0~7.2；培养基临用时，在已加热融化的300ml培养基中需进入3％重铬酸钾溶液1ml，再加入1％链霉素溶液0.5ml，及环丙沙星1-2滴，轻轻摇匀，然后倒分离纯化用平皿。
实施例3与实施例1不同之处在于，分离产生河豚毒素放线菌的培养基组成改为葡萄糖1％，蔗糖1％，牛肉膏0.3％，酵母膏1％，蛋白胨0.3％，NaCL 2.5％，河豚卵巢提取液0.01％，余量为海水(或人工海水)，琼脂2％，PH7.0-7.2；培养基临用时，在已加热融化的300ml培养基中需进入3％重铬酸钾溶液1ml，再加入1％链霉素溶液0.5ml，及环丙沙星1-2滴，轻轻摇匀，然后倒分离纯化用平皿。
实施例4本发明以从河豚卵巢中分离得到的产生河豚毒素(TTX)的芽孢杆菌RG-3B为例，RG-3B在摇瓶发酵68hr后，从中用薄层层析分离，取Rf＝0.77处硅胶带样品，加0.1ml醋酸洗脱，用15,000rpm离心去除硅胶，取上清进行高效液相色谱分析，结果如图1A及B；A为标准TTX，B为河豚卵巢中RG-3B产生的TTX样品。
权利要求
1.一种从河豚中分离产生河豚毒素的微生物的方法，其特征在于1)选取健康的、新鲜的河豚；2)鱼体擦洗消毒，解剖鱼体，取出新鲜卵巢，加细胞分散液研磨，获得新鲜河豚卵巢提取液；3)对新鲜河豚卵巢提取液，分别在能分离纯化产生河豚毒素的海洋细菌、放线菌的培养基上保温培养。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述河豚为正值产卵期的河豚。
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于所述河豚为红鳍东方豚。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述保温培养的温度为25~37℃。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞分散液的加入量为每1克新鲜卵巢加分散液0.5~1.5毫升。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述海洋细菌的培养基组成为葡萄糖0.5-1.5％，蔗糖0.5-1.5％，牛肉膏0.1-0.5％，酵母膏0.1-0.5％，蛋白胨0.1-0.5％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量为海水或人工海水，琼脂2％，PH6.5-7.5。
7.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述放线菌的培养基组成为A可溶性淀粉0.5-1.5％，蔗糖0.2-1.0％，甘露醇0.1-0.3％，KNO30.1％，K2HPO40.35％，MgSO4·7H2O 0.001％ FeSO4·7H2O 0.001％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量为海水或人工海水，琼脂2％，PH7.0～7.2。
8.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述放线菌的培养基组成为B葡萄糖0.5-1.5％，蔗糖0.5-1.5％，牛肉膏0.1-0.5％，酵母膏0.1-0.5％，蛋白胨0.1-0.5％，NaCl 1.0-3.5％，河豚卵巢提取液0.005-0.015％，余量为海水(或人工海水)，琼脂2％，PH6.5～7.5。
9.按权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述放线菌的培养基A或B临用时，在已加热融化的300ml培养基中需进入3％重铬酸钾溶液1ml，再加入1％链霉素溶液0.5ml，及环丙沙星1-5滴，轻轻摇匀，然后倒分离纯化用平皿。
全文摘要
本发明涉及产生河豚毒素(TTX)的微生物，具体说是一种从河豚中分离产生河豚毒素(TTX)的微生物的方法；具体操作为1)选取健康的、新鲜的河豚；2)鱼体擦洗消毒，解剖鱼体，取出新鲜卵巢，加细胞分散液研磨，获得新鲜河豚卵巢提取液；3)对新鲜河豚卵巢提取液，分别在能分离纯化产生河豚毒素的海洋细菌、放线菌的培养基上保温培养。本发明具有如下优点操作简单，结果理想，分离效果好，能得到所需的菌株，总成功率在90％以上；分离得到的微生物能产生具有较高含量的河豚毒素，且所获菌株传代10代以上，遗传性状稳定。
文档编号C12P17/18GK1552884SQ03133530
公开日2004年12月8日 申请日期2003年5月30日 优先权日2003年5月30日
发明者胡江春, 薛德林, 马成新, 刘全永, 王书锦 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所