专利名称：一种激活肝干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及肝干细胞，特别是涉及一种激活肝干细胞的方法。
背景技术：
中国是个肝病大国。目前，慢性乙肝患者就有2000多万人，每年因晚期肝硬化或肝癌而死亡的人数超过50万。肝移植是解决晚期肝脏器质性病变的有效手段，而肝移植面临的最大难题是器官来源短缺。以肝病相对较少的美国为例，每年约有1.85万人准备接受肝移植，但只有不到四分之一的病人有望获得捐赠肝移植，而亚洲严重肝硬化病人就超过10万名之多。解决供体肝脏器官严重缺乏的重要途径之一是进行肝干细胞移植，这需要解决肝干细胞来源问题；另一方面，肝干细胞具有强大的增殖能力，可以定向诱导分化为肝细胞，为肝细胞移植和生物型人工肝提供无限的细胞来源，以缓解供体肝脏严重匮乏的问题。，研究表明，卵圆形细胞(oval cells)是双潜能的肝干细胞，分布于闰管、门管区及管周、肝内的胆管树状分支、及骨髓。成年肝组织的细胞分裂相很少，在2～4万个肝细胞中，约有1个干细胞具有自我更新和增殖能力。在正常情况下，肝干细胞处于休眠静止期(G0期)。肝脏中等程度损伤时，肝组织的再生和修复完全依靠肝实质细胞完成，此时的肝干细胞既未激活，也不增殖。因此，要获取足够量且活率高的肝干细胞，必须建立良好的激活方法，以满足基础研究和临床前动物移植的需要。
通常使用的的肝干细胞的激活方法有如下几种1)采用乙硫氨基酪酸(ethionine)激活卵圆形细胞。Pack等人给成年大鼠饲喂含乙硫氨基酪酸但不含胆碱(肝保护剂)的饲料，经饲喂6、14或22周后，可促使肝卵圆形细胞增殖和激活。此方法的优点是未见肝实质细胞坏死现象。其缺点是所需的时间较长，且长时间使用乙硫氨基酪酸会导致肝细胞癌的发生。如文献1Pack R，Heck R，Dienes H P，Oesch F，SteinbergP.Isolation，biochemical characterization，long-term culture，and phenotypemodulation of oval cells form carcinogen-fed rats.Experimental Cell Research，1993，204198-209。文献2Lenzi R，Liu MH，Tarsetti F et al.Histogenesisof bile duct-like cells proliferating during ethionine hepatocarcinogenesis.Lab.Invest.1992，66390-402所述。2)采用四氯化碳(CCl4)或半乳糖胺(D-galactosamine)激活卵圆形细胞。使用这两种化学试剂均可引起闰管周围的肝干细胞增殖。然而，它们均会引起肝损伤和肝实质细胞坏死四氯化碳中毒使质膜的通透性发生改变，损伤脂蛋白的合成，抑制脂质的运输，从而导致肝细胞内脂肪的堆积和自由基CCl3的形成。急性四氯化碳中毒表现为大量中央小叶坏死并伴有炎症发生。如文献3Le Page RN，Dorling PR.Plasm membranes in acute liver injury.Biochemical changes induced by carbon tetrachloride.Aust J Exp Bio Med Sci，1971，49345-350。文献4Racknagel R O，Glende E A，Carbon tetrachloridehepatoxicityAn example of lethal cleavage.Crit Rev Toxicol，1973，2263-297所述。半乳糖胺可阻断RNA的合成，随后抑制糖蛋白和磷酸蛋白的合成，使肝细胞质膜的通透性发生改变，导致肝细胞死亡。如文献5Dabeva MD，Shafritz DA.Activation，proliferation and differentiation of progenitor cells intohepatocytes in the d-galactosamine model of liver regeneration.Am.J.Pathol.1993，1431606-20所述。3)采用乙酰胺基芴(AAF)+肝部分切除(PH)法。其机理是PH能诱导肝再生。但AAF引起肝细胞死亡，从而阻止了肝细胞的增殖作用。而卵圆形细胞对AAF的毒性具有较强的拮抗作用。因而这一处理最终导致了卵圆形细胞的大量增殖。如文献6Ledda GM，Sell MA，Yokoyama S &Lombardi B.Metabolicproperties of isolated rat liver cell preparations enriched in epithelial cellsother than hepatocytes.Int.J.Cancer，311983，231-237。文献7TatematsuM，Kaku T，Medline A，Farber E.Intestinal metaplasia is a common option ofoval cells in relation to cholangiofibrosis in liver of rats exposed to2-acetylaminofluorene.Lab.Invest.1985，52354-62。文献8Lowes，K M，Croager E J，Olynyk J K，et al.Oval cell-mediated liver regenerationRoleof cytokines and growth factors.Journal of Gastroenterology and Hepatology，2003，18，4-12所述。但是，此法会引起肝实质细胞坏死，且乙酰胺基芴(AAF)损伤肝小叶中央部分。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术的各种激活肝干细胞的方法会损伤肝细胞或是所需时间太长的缺陷，从而提供一种可以在短时间内激活肝干细胞、且对肝细胞无损伤的激活肝干细胞的方法，该方法结合了乙硫氨基酪酸与肝部分切除法，为肝干细胞的基础研究和临床前动物移植实验提供大量的细胞来源。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种激活肝干细胞的方法，其包括如下步骤1)用双蒸水将乙硫氨基酪酸配制为0.15～0.25g/ml溶液，按鼠体重的0.05～0.10wt％的量将成年大鼠每日管饲乙硫氨基酪酸溶液，连续饲喂5～7天，同时大鼠自由饮水和取食；2)按常规方法进行肝大部分切除术；3)肝部分切除术后5～7天，从经步骤2)处理的鼠肝使用常规的胶原酶消化和密度梯度离心方法分离出肝卵圆形细胞。
所述的步骤2)肝大部分切除的具体步骤如下①按每公斤鼠体重使用35～45mg量的戊巴比妥钠，对步骤1)中的鼠进行腹腔麻醉；②对所用手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒；③用酒精对该鼠进行体表消毒，剪开皮肤，再剪开腹腔；④用止血钳固定好皮肤和腹腔肌，将生理盐水加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加生理盐水，用无菌纱布包裹肠系膜；⑤剪断肝被包膜，使左肝小叶和中叶游离出来；⑥用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；⑦切除左肝小叶和中叶，吸出血水后，向腹腔补充含100u/ml青霉素G的生理盐水；⑧用缝线分别缝合内皮和外皮。
所述的步骤3)中使用胶原酶消化和密度梯度离心方法分离肝卵圆形细胞，其具体步骤如下①取出肝脏，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管等纤维组织，使用Hank’s平衡盐溶液洗涤后，剪碎肝组织块；②加入0.03wt％胶原酶，在37℃恒温振动器上消化，加Hank’s平衡盐溶液终止消化；③过滤除去非细胞纤维成分及消化不完全的组织块和部分非游离细胞团，加入DMEM培养基溶液制成细胞悬液；④离心，沉淀用DMEM培养基溶液洗涤后，再次离心；⑤沉淀加入含有0.10％wt/v胶原酶，0.004％wt/v脱氧核糖核酸酶I的DMEM培养基溶液，在37℃恒温振荡器上消化，加Hank’s平衡盐溶液终止消化；
⑥倾出上层清液，加入等体积的含5～10％ v/v胎牛血清的DMEM培养基溶液，过滤；⑦滤液离心，沉淀加入Gey’s平衡盐溶液制成细胞悬液，再离心；⑧沉淀加入Gey’s平衡盐溶液制成细胞悬液；⑨向离心管中依次加入28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，Gey’s平衡盐和细胞悬液，室温下离心，则在17.2％聚乙酰胺吡咯烷酮和28.7％聚乙酰胺吡咯烷酮的交界面富含肝干细胞。
本发明提供的激活肝干细胞的方法的优越性在于①能促使大量的具有双潜能的肝卵圆形细胞激活；②所需的时间较短；③未见肝、心、肾等重要组织和器官病理变化；④能收获大量的卵圆形细胞，每鼠平均获得2×107个细胞。
图1为实施例2中的大鼠肝大部分切除术5天后再生的新生肝组织；图2为实施例2中的大鼠肝部分切除术5天后肝、心和肾等的变化；其中放大倍数(A)×100；(B)×100；(C)×40；图3为实施例3肝部分切除术7天后，从大鼠肝脏分离的卵圆形细胞及其形态特征；其中放大倍数(A)×100；(C)×10000。
具体实施例方式
实验用乙硫氨基酪酸(ethionine)购自美国的Sigma公司，实验用大鼠为军事医学科学院实验动物中心提供的健康雄性Wistar大鼠，体重100～150g，动物级别为2级。
实施例1、使用本发明的方法得到激活肝干细胞用双蒸水将乙硫氨基酪酸配制为0.2g/ml溶液，按鼠体重的0.08wt％的量每日给大鼠管饲乙硫氨基酪酸，连续饲喂6天，同时动物自由饮水和取食；进行肝大部分切除术，其步骤如下①将40mg/kg鼠体重的戊巴比妥钠对步骤1)中的鼠进行腹腔麻醉；②手术间紫外消毒，用70％酒精对该鼠进行体表消毒；
③用无菌的剪刀和镊子剪开皮肤，换用无菌的剪刀和镊子再剪开腹腔，注意不要剪开胸腔膜，以免造成气胸而致死；④用止血钳固定好皮肤和腹腔肌，将0.90％生理盐水加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加0.90％生理盐水，用无菌纱布包裹；⑤用眼科小剪刀剪断肝被包膜，使左肝小叶和中叶游离出来；⑥用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；⑦用剪刀切除左肝小叶和中叶，再用纱布吸出血水，向腹腔补充含100u/ml青霉素G的生理盐水；⑧用缝线分别缝合内皮和外皮；肝部分切除术后5天，按以下方法分离肝卵圆形细胞①小心取出肝脏置于带冰浴平皿内，用眼科剪去除被膜血管等纤维组织，冷Hank’s平衡盐溶液洗三次，小剪刀小心剪碎肝组织块；②加入0.03wt％胶原酶(collagenase)10ml，在37℃恒温振动器上消化20分钟，加冰冷Hank’s平衡盐溶液20ml终止消化；③100目筛网过滤，并以Hank’s平衡液冲洗促进细胞滤过，以此除去非细胞纤维成分及消化不完全的组织块和部分非游离细胞团，加Dulbecco’s minimum essentialmedium(DMEM培养液)制成细胞悬液；④细胞悬液50g离心5min，沉淀用DMEM培养液洗3次，50g离心5min；⑤沉淀加25ml的DMEM液[含0.10％wt/v胶原酶(collagenase)，0.004％wt/v脱氧核糖酶I(Dnase I)]，在恒温振荡器上消化30分钟(37℃)；⑥倾析消化后的上清液，加等体积冷DMEM[含10％v/v的胎牛血清(FCS)]，使最终体积为50ml，混合液过200目筛网；⑦细胞悬液400g离心5min，沉淀加Gey’s平衡盐悬浮，再离心；⑧沉淀用2ml的Gey’s平衡盐悬浮；⑨在离心管底层加2ml 28.7％wt/v28.7％wt/v Percoll(聚乙酰胺吡咯烷酮)，17.2％wt/vPercoll(聚乙酰胺吡咯烷酮)，然后在上面加2ml的Gey’s平衡盐；顶层为2ml细胞悬液，室温下离心400g 15min，则17.2％ Percoll和28.7％Percoll的交界面富含肝干细胞。
对此卵圆形细胞按如下步骤进行存活率判断
(1)用10ml DMEM培养液悬浮分离和纯化的肝干细胞；(2)台盼蓝染色①取数滴分离的细胞悬液与等体积0.4％的台盼蓝相混；②3分钟内将混合的细胞悬液注入有盖玻片的血细胞计数板；③按血细胞计数法，在相差显微镜下计数4个大方格内的着色(死)和未着色(活)的细胞。
经台盼蓝染色测定其存活率为99％，经计数每只大鼠收获2×107的卵圆形细胞。
实施例2、肝大部切除术5天后大鼠的肝、心和肾变化按实施例1中方法用乙硫氨基酪酸溶液连续5天管饲大鼠10只，肝部分切除后5天，随机选取大鼠的肝、心、肾等组织经甲醛固定，酒精脱水，再用氯仿脱酒精，石蜡包埋切片，HE染色，镜检。
在相差显微镜下观察大鼠肝部分切除术5天后肝、心和肾等的变化，绘于图2，由图可见，在如长箭头所示的成熟肝细胞周围，出现大量的卵圆形细胞的增殖(如短箭头所示)。这些卵圆形细胞被公认为是双潜能的肝干细胞，它们具有卵圆形细胞核，核/质比例大。而且肝、心、肾重要等组织未见明显病理变化。
实施例3、按实施例1中方法，用乙硫氨基酪酸溶液连续5天管饲大鼠15只。切除肝2/3部分，术后7天，按实施例1中的方法分离肝卵圆形细胞每只大鼠平均获得了2.3×107的细胞。
将新鲜分离的细胞用2.5wt％冷戊二醛固定30min，PBS洗2次，1wt％冷饿酸后固定4小时，再用PBS冲3次；不同浓度的甲醇脱水，树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，在Philips EM 301电镜观察细胞的超微结构(图3)。
在电镜下观察实施例3中的得到卵圆形细胞，发现分离出的细胞超微结构特征有①卵圆形细胞核；②细胞质少，核/质比例大；③表型不成熟，胞浆内细胞器较少，含未成熟的线粒体(Mi)和内质网(Er)。
实施例4、
用双蒸水将乙硫氨基酪酸配制为0.15g/ml溶液，按鼠体重的0.05wt％的量每日给大鼠管饲乙硫氨基酪酸，连续饲喂5天，同时动物自由饮水和取食；进行肝大部分切除术，其步骤如下①将35mg/kg鼠体重的戊巴比妥钠对步骤1)中的鼠进行腹腔麻醉；②手术间紫外消毒，用70％酒精对该鼠进行体表消毒；③用无菌的剪刀和镊子剪开皮肤，换用无菌的剪刀和镊子再剪开腹腔，注意不要剪开胸腔膜，以免造成气胸而致死；④用止血钳固定好皮肤和腹腔肌，将0.90％生理盐水加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加0.90％生理盐水，用无菌纱布包裹；⑤用眼科小剪刀剪断肝被包膜，使左肝小叶和中叶游离出来；⑥用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；⑦用剪刀切除左肝小叶和中叶，再用纱布吸出血水，向腹腔补充含100u/ml青霉素G的生理盐水；⑧用缝线分别缝合内皮和外皮；肝部分切除术后6天，按以下方法分离肝卵圆形细胞①小心取出肝脏置于带冰浴平皿内，用眼科剪去除被膜血管等纤维组织，冷Hank’s平衡盐溶液洗三次，小剪刀小心剪碎肝组织块；②加入0.03wt％胶原酶(collagenase)10ml，在37℃恒温振动器上消化20分钟，加冰冷Hank’s平衡盐溶液20ml终止消化；③100目筛网过滤，并以Hank’s平衡液冲洗促进细胞滤过，以此除去非细胞纤维成分及消化不完全的组织块和部分非游离细胞团，加Dulbecco’s minimum essentialmedium(DMEM培养液)制成细胞悬液；④细胞悬液50g离心5min，沉淀用DMEM培养液洗3次，50g离心5min；⑤沉淀加25ml的DMEM液[含0.10％wt/v胶原酶(collagenase)，0.004％wt/v脱氧核糖酶I(Dnase I)]，在恒温振荡器上消化30分钟(37℃)；⑥倾析消化后的上清液，加等体积冷DMEM[含5％v/v的胎牛血清(FCS)]，使最终体积为50ml，混合液过200目筛网；⑦细胞悬液400g离心5min，沉淀加Gey’s平衡盐悬浮，再离心；⑧沉淀用2ml的Gey’s平衡盐悬浮；⑨在离心管底层加2ml 28.7％wt/v28.7％wt/v Percoll(聚乙酰胺吡咯烷酮)，17.2％wt/vPercoll(聚乙酰胺吡咯烷酮)，然后在上面加2ml的Gey’s平衡盐；顶层为2ml细胞悬液，室温下离心400g 15min，则17.2％ Percoll和28.7％Percoll的交界面富含肝干细胞。
经台盼蓝染色测定其活率为98％，经计数收获2.1×107的卵圆形细胞。
实施例5、用双蒸水将乙硫氨基酪酸配制为0.25g/ml溶液，按鼠体重的0.10wt％的量每日给大鼠管饲乙硫氨基酪酸，连续饲喂7天，同时动物自由饮水和取食；进行肝大部分切除术，其步骤如下①将45mg/kg鼠体重的戊巴比妥钠对步骤1)中的鼠进行腹腔麻醉；②手术间紫外消毒，用70％酒精对该鼠进行体表消毒；③用无菌的剪刀和镊子剪开皮肤，换用无菌的剪刀和镊子再剪开腹腔，注意不要剪开胸腔膜，以免造成气胸而致死；④用止血钳固定好皮肤和腹腔肌，将0.90％生理盐水加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加0.90％生理盐水，用无菌纱布包裹；⑤用眼科小剪刀剪断肝被包膜，，使左肝小叶和中叶游离出来；⑥用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；⑦用剪刀剪断左肝小叶和中叶，再用纱布吸出血水，加青霉素G，从腹腔补充0.90％生理盐水；⑧用缝线缝合内皮和外皮；肝部分切除术后7天，按以下方法分离肝卵圆形细胞①小心取出肝脏置于平皿内，用眼科剪去除被膜血管等纤维组织，Hank’s平衡盐溶液洗三次，小剪刀小心剪碎肝组织块；②加0.03％胶原酶(collagenase)10ml在恒温振动器上消化20分钟，加Hank’s平衡盐溶液20ml终止消化；③100目筛网过滤，并以Hank’s平衡液冲洗促进细胞滤过，以此除去非细胞纤维成分及消化不完全的组织块和部分非游离细胞团，加Dulbecco’s minimum essentialmedium(DMEM培养基)制成细胞悬液；④细胞悬液50g离心5min，沉淀用DMEM培养液洗3次，50g离心5min；
⑤沉淀加25ml的DMEM液[含0.10％wt/v胶原酶(collagenase)，0.004％wt/v脱氧核糖酶I(Dnase I)]，在恒温振荡器上消化30分钟(37℃)；⑥倾析消化后的上清液，加等体积冷DMEM[含10％v/v的胎牛血清(FCS)]，使最终体积为50ml，混合液过200目筛网；⑦细胞悬液400g离心5min，沉淀加GBSS悬浮，再离心；⑧沉淀用2ml的GBSS悬浮；⑨在离心管底层加2ml 28.7％wt/v28.7％wt/v Percoll(聚乙酰胺吡咯烷酮)，17.2％wt/vPercoll(聚乙酰胺吡咯烷酮)，然后在上面加2ml的GBSS；顶层为2ml细胞悬液，室温下离心400g 15min，则17.2％Percoll和28.7％Percoll的交界面富含肝干细胞。
经台盼蓝染色测定其活率为99％，经计数收获2.35×107的卵圆形细胞。
权利要求
1.一种激活肝干细胞的方法，其包括如下步骤1)用双蒸水将乙硫氨基酪酸配制为0.15～0.25g/ml溶液，按鼠体重的0.05～0.10wt％的量将成年大鼠每日管饲乙硫氨基酪酸溶液，连续饲喂5～7天，同时大鼠自由饮水和取食；2)按常规方法进行肝大部分切除术；3)肝部分切除术后5～7天，从经步骤2)处理的鼠肝使用常规的胶原酶消化和密度梯度离心方法分离出肝卵圆形细胞。
2.按权利要求1所述的激活肝干细胞的方法，其特征在于所述的步骤2)肝大部分切除的具体步骤如下①按每公斤鼠体重使用35～45mg量的戊巴比妥钠，对步骤1)中的鼠进行腹腔麻醉；②对所用手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒；③用酒精对该鼠进行体表消毒，剪开皮肤，再剪开腹腔；④用止血钳固定好皮肤和腹腔肌，将生理盐水加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加生理盐水，用无菌纱布包裹肠系膜；⑤剪断肝被包膜，使左肝小叶和中叶游离出来；⑥用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；⑦切除左肝小叶和中叶，吸出血水后，向腹腔补充含100u/ml青霉素G的生理盐水；⑧用缝线分别缝合内皮和外皮。
3.按权利要求1所述的激活肝干细胞的方法，其特征在于所述的步骤3)中使用胶原酶消化和密度梯度离心方法分离肝卵圆形细胞，其具体步骤如下①取出肝脏，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管等纤维组织，使用Hank’s平衡盐溶液洗涤后，剪碎肝组织块；②加入0.03wt％胶原酶，在37℃恒温振动器上消化，加Hank’s平衡盐溶液终止消化；③过滤除去非细胞纤维成分及消化不完全的组织块和部分非游离细胞团，加入DMEM培养基溶液制成细胞悬液；④离心，沉淀用DMEM培养基溶液洗涤后，再次离心；⑤沉淀加入含有0.10％wt/v胶原酶，0.004％wt/v脱氧核糖核酸酶I的DMEM培养基溶液，在37℃恒温振荡器上消化，加Hank’s平衡盐溶液终止消化；⑥倾出上层清液，加入等体积的含5～10％v/v胎牛血清的DMEM培养基溶液，过滤；⑦滤液离心，沉淀加入Gey’s平衡盐溶液制成细胞悬液，再离心；⑧沉淀加入Gey’s平衡盐溶液制成细胞悬液；⑨向离心管中依次加入28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，Gey’s平衡盐和细胞悬液，室温下离心，则在17.2％聚乙酰胺吡咯烷酮和28.7％聚乙酰胺吡咯烷酮的交界面富含肝干细胞。
全文摘要
本发明涉及一种激活肝干细胞的方法，该方法结合了乙硫氨基酪酸与肝部分切除术法，并使用常规的胶原酶消化和密度梯度离心方法分离出肝卵圆形细胞。本发明提供的方法可以在短时间内激活肝干细胞、且对肝细胞无损伤，为肝干细胞的基础研究和临床前动物移植实验提供大量的细胞来源。
文档编号C12N5/06GK1548528SQ03136410
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月15日 优先权日2003年5月15日
发明者丰美福, 何祖平, 汤越峰, 张好健 申请人:中国科学院动物研究所