专利名称：检测药品中梭菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用聚合酶链式反应(PCR)技术检测药品中梭菌的方法，特别地涉及一种利用聚合酶链式反应扩增特异性扩增破伤风毒素-C片段形成的基因片段来检测药品中破伤风梭菌和肉毒梭菌的方法，以及涉及用于该方法的引物。
背景技术：
药品的微生物学必须符合中国药典规定的标准，这对于制药公司和各药检所来讲是非常重要的。中国、美国和欧洲药典均规定在药品中不得含有破伤风梭菌和肉毒梭菌。所以就药品特别是某些中药制品的污染问题而言，能快速检出破伤风梭菌的方法对于减少药物废品的产生以及避免浪费是非常必要的；而相关的药检部门则可以利用该类方法的敏感性和特异性来保证国民的用药安全。目前，药品中破伤风梭菌和肉毒梭菌的检测均是采用传统的微生物检测方法。
在现有的微生物检测技术中，病原菌的检测主要是利用微生物的培养法、生化反应、血清学方法以及荧光法等。例如JP62-115296A中公开了采用蛋黄培养细菌而后测定的方法，SU825627B公开了在厌氧条件下培养来测定营养品中的梭状芽胞杆菌的方法。RU2084521C公开了一种用淀粉和营养介质来分离和检测梭状芽胞杆菌的方法，该方法可用于控制奶品加工。US6228574B公开了一种以孢子萌发为基础，快速检测与确定分析物例如梭状芽胞杆菌的方法。另外，荧光法是指通过将微生物细胞染色或标记来产生荧光进行检测的方法，例如，在JP11-169194中公开了采用生物发光试剂测定体液样品中的微生物如肉毒梭状芽胞杆菌(C.botulinum)的方法。
然而，众所周知，这些传统的方法费时、耗力，且易出现错误的鉴定结果。随着分子生物学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等常规检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，聚合酶链式(Polymerasechain reaction，PCR)以其敏感、特异、简便、快速的特点已逐步应用于病原菌的检测。聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)是用于在体外酶促扩增特定DNA片段的快速方法。通过这一方法可将极微量的DNA扩增放大数百万倍，用于DNA检测则极大地提高了灵敏度，理论上可测到每个细胞一分子DNA的水平。
另外，发现针对特定药品污染菌DNA进行PCR扩增的特异性引物也成为药品检测方法中研究的重要方向本发明的概述本发明申请人经过多年的试验和探索首次发现了梭菌属中基因上扩增特异性DNA片段的引物，并将这些引物用来检测破伤风梭菌和肉毒梭菌。
在具体实施方案中，本发明设计下列序列片段。
1.命名为TTC-1的正向引物，其核苷酸序列为5’TTTTTAGACCTAACAACC 3’(SEQ ID NO.1)2.命名为TTC-2的反向引物，其核苷酸序列为5’TTAATCATTTGTCCATCC 3’(SEQ ID NO.2)本发明的一个重要方面是用于PCR扩增样品的方法。有生长能力的破伤风梭菌和肉毒梭菌裂解后，从细胞中释放的DNA可以作为PCR扩增合适的模板。通过是否出现大小在1356碱基对范围内的基因片段来判定其是否存在。这个片段可通过琼脂塘凝胶电泳并与DNA标准分子量的比较来加以判定含有靶序列的破伤风梭菌和肉毒梭菌是否存在。
本发明的详细描述本发明的第一个方面涉及用来快速检测被污染药品中的破伤风梭菌和肉毒梭菌的特异性引物及其PCR扩增的方法。这些破伤风梭菌和肉毒梭菌的核苷酸引物被设计可用来扩增破伤风梭菌和肉毒梭菌共有的而与其它种属无关的基因。由于不需要在实验基质中培养细菌，所以减少了检测细菌所需的时间，这些因素使这种方法可用于现场检测。
该方法以DNA的碱基互补为基础。DNA是由核苷酸“碱基”组成的两条反向平行链构成。这些碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，互相形成特有的氢键。腺嘌呤与胸腺嘧啶配对及鸟嘌呤和胞嘧啶配对的DNA双链能通过碱处理或加热的方法变性或转变成单链。当条件合适时，DNA将重新形成双链。聚合酶链式反应即PCR法是将目标DNA区段扩散到可检测水平所通常使用的方法。近来它被用来检测许多病原细菌。在这个过程中，与目标区的两侧区域互补的包含特异序列的DNA引物通过一种DNA聚合酶来引导DNA的酶促合成。DNA聚合酶要求引物来启动互补DNA链的合成。引物是核苷酸片段(18碱基)。在PCR过程中通过温度在退火步骤中控制引导过程。引物的退火条件根据试验来确定，以便提高特异性。退火后，当聚合酶合成互补DNA链时聚合发生。聚合后，PCR反应物被加热到使双链DNA变性。通过使用热稳定性的DNA聚合酶进行退火、聚合、变性的反复循环能够保证该酶不失活。PCR扩增是使用自动热循环设备的常规试验方法。结果可以使目标DNA片段指数倍的扩增。扩增的目的片段可通过琼脂凝胶电泳检测到。
本发明的另一个方面提供了合适的引物，该引物是通过大量破伤风梭菌和肉毒梭菌的DNA序列对比得到的。核酸序列比较软件阐明了基因的高度保守区。从这些区域选择特定的引物位点并合成合适的引物。通过反复试验来决定引物的最佳序列。引物最后的确定遵循以下标准I.从鉴定的破伤风梭菌和肉毒梭菌中扩增出TTC产物。
II.从鉴定的梭菌属中的其它梭菌不能产生目的产物。
III.非梭菌属不能产生目的产物。
VI.从药品样品分离出的未鉴定的梭菌中扩增出TTC产物。
通过标准方法来测定破伤风梭菌和肉毒梭菌形成TTC基因的能力。培养物80℃放置10分钟，随后涂在生长培养基上，经过热处理能存活的细菌具有产生孢子的能力。表1概述了用于在一系列不同菌株培养物进行试验的引物性质的数据。这个引物可以从破伤风梭菌和肉毒梭菌上分别扩增出1356碱基(bp)的片段。
表1显示了引物从破伤风梭菌和肉毒梭菌及未鉴定的该菌中扩增TTC基因的能力。不含TTC基因的细菌，其不能产生目的带。
这些引物可用来筛选从药品提取的DNA，来检测破伤风梭菌。这一方法与传统涂板技术相比极大地减少了周转时间。
这项研究中所用到的菌株见表1。
表1细菌菌株细菌菌株来源 PCR测试破伤风梭菌CMCC64001 CMCC+破伤风梭菌CMCC64008 CMCC+破伤风梭菌CMCC64041 CMCC+破伤风梭菌CMCC64067 CMCC+肉毒梭菌CMCC64353 CMCC+肉毒梭菌CMCC64402 CMCC+蜡状芽孢杆菌ATCC14579 ATCC-枯草芽孢杆菌ATCC6051ATCC-枯草芽孢杆菌ATCC23059 ATCC-巨大芽孢杆菌ATCC14581 ATCC-嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC10149 ATCC-地衣芽孢杆菌ATCC12759 ATCC-球形芽孢杆菌ATCC4525ATCC-产气夹膜梭菌ATCC-金黄色葡萄球菌ATCC25923 ATCC-表皮葡萄球菌ATCC12228 ATCC-化脓链球菌ATCC19615 ATCC-铜绿假单胞菌ATCC27853 ATCC-
肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC注CMCC为中国医学细菌保藏管理中心；ATCC为美国标准菌种收藏所下列步骤导致药品中破伤风梭菌和肉毒梭菌的检测获得成功。
I.在药物样品中加入等体积胰豆胨培养基37℃放置45分钟(1毫升样品即足以对用于分析液体物质)，这使梭菌活化成有生长力的形式，从中提取DNA。
II.煮沸样品10分钟以裂解细胞并释放DNA。
III.等份的样品与，通常为5微升，等份的样品与20微升水，PCR珠(如U.S专利5,593,824中所描述，本文引入作参考)，及含有上述正向和两个反向引物的2微升引物混合物混合。
IV.热循环如下96℃变性2min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，循环30次，最后72℃延伸5min。
V.PCR反应物与电泳上样储存染料混合，在2％的琼脂糖凝胶上电泳。
VI.将琼脂糖凝胶染色观察目的产物。
有些样品可能含有干扰PCR扩增的物质，在这种情况下，可将样品用胰豆胨培养基进行10倍或100倍的稀释可克服这种干扰。在检测任何样品时都需要有阳性及阴性对照，电泳时需有标准分子量对照物。
附图1是TTC引物PCR扩增的电泳图片，其中从左至右依次为引物(TTC-1+TTC-2)检测肉毒梭菌CMCC64353，肉毒梭菌CMCC64402，破伤风梭菌CMCC64001，破伤风梭菌CMCC64008产生1356bp片段以及核酸分子量参照物，其中核酸分子量参照物自上而下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp。
下列是说明使用本发明程序的实施例。这些实施例不应被认为是对本发明的限制。本领域技术人员应理解在形式上和详细内容上的各种改变并不违背在所附权利要求中详细标明的本发明的实质和范围。
实施例1待检药品的处理将待检药品样品加到无菌水中得到1％(W/V)溶液。该溶液经混合均匀后形成溶液或悬液。随后将其与等体积的胰豆胨培养基混合，在37℃孵育45分钟。
实施例2煮沸裂解及PCR扩增破伤风梭菌和肉毒梭菌的孢子转变为有生长能力的细胞后，煮沸10分钟。在煮沸过程中注意试管要打开。5微升样品加入到商品化预制备的PCR缓和物中。混合物提供PCR反应所需的试剂。每个终体积为25微升的PCR反应中含有1.5个单位的Taq DNA聚合酶、10毫摩尔的Tris-HCl(室温pH＝9.0)、50毫摩尔的KCl、1.5毫摩尔的MgCl2、200毫摩尔的每种核苷酸。无菌水及TTC引物加到PCR反应体系中。引物的浓度为0.5毫摩尔。PCR管放在热循环仪上使用上面所描述的程序进行扩增。
实施例3PCR产物的检测是否存在破伤风梭菌和肉毒梭菌可通过产生大约1356bp碱基对分子量范围内的PCR产物来测定。来自特定样品的PCR产物的出现说明破伤风梭菌检测阳性。检测限度见表2。
表2 三种不同药品中PCR孢子检测限度样品 菌数/克药品TTC PCR结果破伤风梭菌培养 2±1.0+肉毒梭菌培养物 2±1.0+锡类散 1.5±0.5 +骨折挫伤散 2±1.0+参柴颗粒2.5±1.5 +尽管本发明针对具体实施方案已加以描述，但对于本领域技术人员来讲本发明的很多其它形式及改进是显而易见的。附加的权利要求及本发明通常应该被解释为可以覆盖所有上述的包含在本发明的主旨范围内的明显的其它形式和改进。
权利要求
1.一种用于检测药品中梭菌的方法，该方法包括a)使用选自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2的引物从所述梭菌的总细胞DNA中扩增出梭菌基因的一部分；b)检测扩增产物的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的梭菌为厌氧菌。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的厌氧梭菌为破伤风梭菌
4.如权利要求2所述的方法，其中所述的厌氧梭菌为肉毒梭菌。
5.如权利要求1-4所述的方法，其中所述的扩增反应可以产生一个范围在1356bp核苷酸长的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中扩增产物的检测是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的。
7.用于权利要求1所述检测方法的引物，其特征在于引物的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。
全文摘要
本发明描述了一种用聚合酶链反应(PCR)技术检测药品中的破伤风梭菌的方法。所公开的和要求保护的是可以用来特异性扩增破伤风毒素－C片段形成基因的新核苷酸引物。这些引物所扩增的基因片段可以用于检测药品中破伤风梭菌。
文档编号C12Q1/04GK1514023SQ0313764
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月19日 优先权日2003年6月19日
发明者胡昌勤, 马越, 李景云, 张力, 张新妹 申请人:中国药品生物制品检定所