专利名称：一种植物果糖1，6－二磷酸醛缩酶编码基因保守区的克隆方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种植物果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因保守区的快速克隆方法。
背景技术：
果糖1，6-二磷酸醛缩酶是植物碳素代谢中催化六碳糖和三碳糖相互转化的关键酶，对植物能量的储存与释放起着重要作用。同时它也参与了植物对外界环境因子(如盐度、光强)变化的应答反应。已经获得的果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基有很多，如烟草(Yamada，S.，Komori，T.，Hashimoto，A.，Kuwata，S.，Imaseki，H.andubo，T.Differential expression of plastidic aldolase genes in Nicotiana plantsunder salt stress.Plant Sci.154(1)，61-69(2000))，豌豆(Razdan，K.Heinrikson，R.L.，Zurcher-Neely，H.，Morris，P.W.and Anderson，L.E.Chloroplast and cytoplasmicenzymesisolation and sequencing of cDNAs coding for two distinct pea chloroplastaldolases JOURNAL Arch.Biochem.Biophys.298(1)，192-197(1992))。目前对其研究大多限于生理生化水平，而对基因结构的研究还十分有限。其中编码基因的获得是关键。目前对于未知序列基因的克隆还存在着一定的难度，所需周期长、背景多、程序负责，直接影响到对基因结构和功能的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因保守区的快速克隆方法。
本发明提出的植物果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因保守区的克隆方法，包括设计两对兼并引物，用于巢式PCR方法，对植物果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因的第一链cDNA进行扩增；该兼并引物的序列为XF15’-atc/t ctc/t ttc/t gag gag ac-3’XF25’-ggc/t atc/t aag/a gtt/a gac aag gg-3’XR15’-gtt cat c/ggc a/gtt caa/g gtt-3’XR25’-acc atg t/cta/g ggc ttg/c aa/g g ag-3’其中，XF1和XR1是一对，XF2和XR2是第二对。这两对兼并引物，具有序列表中序列X的核苷酸序列或将序列X的兼并核苷酸序列以N或其他核苷酸取代。
本发明方法中，还包括从植物中提取果糖1，6-二磷酸醛缩酶总RNA或mRNA，并反转录第一链cDNA，以及对扩增产物的接插载体，转化等，与常规克隆方法相同。
由本发明得到的DNA片段与果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因同源，翻译得到的氨基酸序列与果糖1，6-二磷酸醛缩酶高度同源，通常，其同源度达60％以上，有些同源度达80％以上，甚至更高。
利用上述兼并引物序列克隆植物果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因保守区一般可在3天内完成，具体步骤如下6)提取植物总RNA或mRNA，并反转录第一链cDNA；7)通过巢式PCR方法利用兼并引物对第一链cDNA进行扩增；8)将得到的PCR产物经过回收、连接插入克隆载体；9)转化大肠杆菌；10)对所得到的阳性克隆进行序列分析。
本发明分离鉴定出的植物果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因的保守序列，可用于果糖1，6-二磷酸醛缩酶全长cDNA的克隆。
随着生物工程技术的发展，可通过控制应用本发明克隆到的果糖1，6-二磷酸醛缩酶全长cDNA在植物体内表达，控制植物对瓦解环境因子(如盐度、光强)的反应，从而提高植物在逆境中的生存能力。
具体实施例方式
实施例1、克隆雪松果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因保守区的序列，包括以下步骤1)提取雪松叶片总RNA2)以oligo(dT)为引物，将总RNA反转录成第一链cDNA；3)采用前述二对兼并引物XF1和XF2，XR1和XR2，通过巢式PCR方法对第一链cDNA进行扩增；4)将得到的PCR产物经琼脂糖电泳分离，割胶回收，并连接入T-载体；5)转化大肠杆菌；6)对所得到的阳性克隆进行序列分析；7)所得序列经分析，确定与果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因同源，翻译得到的氨基酸序列与果糖1，6-二磷酸醛缩酶同源高达60％以上，其氨基酸序列见SEQ ID NO.1。SEQ ID NO.1gikvdkglvp lagsndeswc qgldglasrc aayyqqgarf akwrtvvsip tgpsalavkeaawglaryaa iaqdnglvpi vepeimldge hgidrtfevs lkvwsevffy laennvl fegillkpsmvtp gaeckdrasp etvaqytlsl lrrrippsvp gimflsggqs eveatlnlnamnqapnpwhv sfsyaralqn tclktwagrp envdaaqkvl lvrakansla qlgkysaegesaeskegmfv kgyty
权利要求
1.一种植物果糖1，6-二磷酸醛缩酶编码基因保守区的克隆方法，其特征在于包括设计两对兼并引物，用于PCR方法，对果糖1，6-二磷酸醛缩酶的编码基因的第一链cDNA进行扩增，该兼并引物的序列为XF15’-atc/t ctc/t ttc/tgag gag ac-3’XF25’-ggc/t atc/t aag/a gtt/a gac aag gg-3’XR15’-gtt cat c/ggc a/gtt caa/g gtt-3’XR25’-acc atg t/cta/g ggc ttg/c aa/g g ag-3’其中，XF1和XR1是一对，XF2和XR2是第二对。
2.根据权利要求1所述的克隆方法，其特征在于所述引物具有序列表中序列X的核苷酸序列，或将序列X的兼并核苷酸序列以N或其它核苷酸取代。
3.根据权利要求1所述的克隆方法，具体步骤如下1)提取植物总RNA或mRNA，并反转录第一链cDNA；2)通过巢式PCR方法利用兼并引物对第一链cDNA进行扩增；3)将得到的PCR产物经过回收，连接插入克隆载体；4)转化大肠杆菌；5)对所得到的阳性克隆进行序列分析。
全文摘要
本发明为一种普遍适用的植物果糖1，6－二磷酸醛缩酶编码基因保守区的快速克隆方法。其中，包括设计了二对兼并引物XF1和XF2，XR1和XR2，用于巢式PCR方法，对其第一链cDNA进行扩增。PCR得到的DNA片段与果糖1，6－二磷酸醛缩酶编码基因同源，翻译得到的氨基酸序列与果糖1，6－二磷酸醛缩酶高度同源。该序列可用于植物果糖1，6－二磷酸醛缩酶全长cDNA的克隆。
文档编号C12P19/34GK1514008SQ0314181
公开日2004年7月21日 申请日期2003年7月25日 优先权日2003年7月25日
发明者张小宁, 钟扬, 南蓬, 沈大棱 申请人:复旦大学, 上海生物信息技术研究中心