专利名称：一种高效建立纯系基因剔除小鼠模型的方法
技术领域：
本发明涉及转基因技术领域。更具体地，涉及一种纯系基因剔除小鼠模型、建立该纯系基因剔除小鼠模型的方法，以及该纯系基因剔除小鼠模型的用途。
背景技术：
自基因剔除技术问世以来，在生命科学研究中得到了广泛应用。基因剔除技术本身也在不断发展，出现了发育阶段特异性、组织类型特异性和药物诱导性等条件性基因剔除技术，大大方便了对基因功能的细致研究。基因剔除技术已成为基因功能研究的最重要手段之一。
目前，从发生同源重组的细胞获得基因剔除小鼠主要有三种途径。
一是在ES细胞水平进行基因打靶，获得同源重组ES细胞克隆，然后经显微注射至囊胚内或与早期胚胎聚合，将胚胎移植给假孕动物，发育成嵌合体动物。如果ES细胞嵌合到生殖系，嵌合体动物的子代小鼠中就会出现ES细胞来源的动物，其中一半应为基因剔除杂合子。第一种途径是目前应用最广、技术最成熟的方法。然而获得同源重组ES细胞克隆要经过电转移、药物筛选、扩大培养等过程，重组ES细胞克隆向生殖系细胞分化的能力存在较大差异，导致嵌合体小鼠与C57BL/6黑色小鼠交配获得灰色小鼠即基因剔除杂合子(50％)的几率具有较大的不确定性。在部分情况下也会因基因剔除小鼠遗传背景差异而影响表型分析。
二是利用四倍体的胚胎只能发育成胚外组织的特点，将同源重组的ES细胞与四倍体囊胚嵌合后移植给假孕动物，后代都是基因剔除杂合子。这种方法对ES细胞的分化全能性要求很高，成功率较低，应用较少。
近年来，随着克隆(核移植)技术的发展，从同源重组细胞到基因剔除动物出现了一种新的途径按核移植的方法，将同源重组细胞(ES或其它体细胞)的细胞核移植给去核的卵细胞，发育成的个体全部是基因剔除杂合子。由于目前克隆动物普遍存在各种健康问题，这一方法亦很少用于基因剔除小鼠。
因此，本领域迫切需要开发高效建立纯系基因剔除小鼠模型的技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种用于高效建立纯系基因剔除小鼠模型的方法，以及用于该方法的转基因小鼠模型。
本发明的另一目的是提供该纯系基因剔除小鼠模型的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种产生精原细胞特异性表达自杀基因的转基因非人哺乳动物的方法，包括步骤(a)提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)IAP启动子，(b)与启动子操作性相连的自杀基因，(c)终止密码子；(b)用显微注射技术将步骤(a)中的线性化的转基因构建物基因引入非人哺乳动物受精卵的雄原核中；(c)将步骤(b)的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管；(d)产生转基因的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中整合有自杀基因表达盒，所述表达盒含有(a)IAP启动子，(b)与启动子操作性相连的自杀基因，(c)终止密码子。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(e)对步骤(d)获得的转基因动物进行鉴定。
在另一优选例中，所述方法，还包括步骤(f)使获得的转基因动物进行交配建系，获得子代。
在另一优选例中，所述的自杀基因是hsv-TK、胞嘧啶脱氨酶基因、或VIV-TK。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、猴。更佳地是小鼠和大鼠。
在另一优选例中，所述的IAP启动子含有Genebank登录号为X04120中第1-1296位的核苷酸序列。
在另一优选例中，在转基因构建物中所述终止子密码子后还含有IAP的3’端长末端重复序列。
在本发明的第二方面，提供了一种用上述方法获得的非人哺乳动物的用途，用作基因敲除技术中的囊胚供体。
在本发明的第三方面，提供了一种产生纯系基因剔除非人哺乳动物的方法，包括步骤(a)将本发明上述方法获得的非人哺乳动物用作基因敲除技术中的囊胚供体，获得其囊胚；(b)将同源重组的ES细胞与囊胚供体形成嵌合囊胚，从而获得嵌合体胚胎；(c)从嵌合体胚胎产生基因剔除的非人哺乳动物；其中，在嵌合体胚胎发育过程中或在动物出生后用选自下组的自杀基因诱导剂诱导供体囊胚来源的精原细胞死亡。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。
图1显示了转基因构建物的结构图谱。
图2显示了IAP-TK转基因阳性鼠的PCR鉴定图。转基因阳性出现765bp带，野生型或阴性鼠无特异性扩增。
图3显示了RT-PCR分析hsv-TK的组织表达谱。1为野生型小鼠睾丸，2为未经逆转录的转基因小鼠睾丸RNA，3-13分别为转基因小鼠的睾丸、附睾、凝结腺、精囊腺、心、肝、肺、脾、肾、肌肉、脑。除转基因小鼠睾丸之外的其余组织均无特异带扩增。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，建立了精原细胞特异性的转自杀基因(如hsv-TK)小鼠，将该小鼠作为囊胚供体，在嵌合体发育过程中或发育成熟后用药物(如gancyclovir)诱导囊胚来源的精原细胞死亡，则仅重组ES细胞来源的精原细胞可以存活。这样的嵌合体小鼠与ES细胞同品系的小鼠交配就可得到遗传背景单一的子代小鼠，甚至大大增加获得基因剔除杂合子小鼠的机会。在此基础上完成了本发明。
可用于本发明的自杀基因没有特别限制，可以选用本领域常规使用的各种自杀基因。代表性的例子包括(但并不限于)hsv-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)，VIV-TK等。
可用于本发明的IAP启动子没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)来源于WEHI-3B细胞的IAP启动子、其它来源或其它类型的IAP启动子等。IAP启动子即囊内A颗粒(intracisternal A-particle)启动子，IAP的序列信息可从Genebank中找到，其登录号为X04120，其中5’端重复序列(IAP5’)(也称为IAP启动子)为第1-1296位，3’端重复序列(IAP3’)为第3741-5095位。
在本发明中，自杀基因的表达受在精原细胞特异性表达的IAP启动子(即含有登录号X04120所示序列的第1-1296位)控制，从而实现在精原细胞的特异性表达。在优选例中，在自杀基因的3‘端还含有IAP的3’端重复序列(IAP3’)，例如含有X04120所示序列的第3741-5095位的核苷酸序列，以便进一步提高表达的特异性和稳定性。
此外，在自杀基因中，除了可以选用其自身的polyA尾之外，还可选用其他来源的polyA尾，例如SV40的polyA尾。
在本发明中，非人哺乳动物的例子包括(但并不限于)小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳地是大鼠和小鼠(如C57BL/6J纯系小鼠)。
在本发明的产生转基因动物的方法中，首先构建一构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)IAP启动子，(b)与启动子操作性相连的自杀基因，(c)终止密码子。
在获得了构建物之后，可用常规方法将线性化的转基因构建物转入受精卵中。待小鼠出生后用PCR检测等方法鉴定自杀基因是否发生整合入其基因组，从而获得转基因小鼠。
用本发明方法获得的转基因小鼠具有生殖能力，自杀基因(如hsv-TK)以孟德尔规律遗传给后代小鼠。
用本发明的转基因小鼠建立纯系基因剔除小鼠时，可通过显微注射，在小鼠胚胎期将同源重组的ES细胞引入精原细胞特异性表达自杀基因的小鼠。
由于启动子的组织特异性，在本发明的转基因小鼠中，自杀基因仅仅在睾丸组织中特异性表达，因此用自杀基因诱导剂，如9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(gancyclovir)，无环鸟苷(acyclovir)或pencyclovir可选择性地诱导供体囊胚来源的精原细胞死亡，从而嵌合体小鼠的精原细胞全部来源于ES细胞。这样，提高ES细胞来源的精原细胞的绝对数量，进而提高嵌和体小鼠后代中出现基因剔除小鼠的几率。此外，由于嵌合体可直接与ES细胞同品系的小鼠交配，从而便于获得遗传背景单一的基因剔除小鼠。
在本发明的一个优选例中，从WEHI-3B小鼠白血病细胞(可购自保藏机构ECACC，England)基因组DNA中克隆了IAP(intracisternal A-particle)除CDS外的全部序列，构建了IAP-TK转基因质粒，经显微注射获得了11只转基因阳性小鼠，经交配繁育建立了3个转基因小鼠系。用RT-PCR方法对49系雄性小鼠各种组织中hsv-TK的表达进行检测。结果发现，hsv-TK只在睾丸组织中特异性表达。
本发明的主要优点在于(a)本发明转基因小鼠可高效地产生纯系基因剔除小鼠模型。
(b)本发明可以提高获得基因剔除小鼠的效率下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1IAP-TK质粒的构建合成引物IAPP1和IAPP2，以小鼠细胞基因组DNA为模板，扩增含IAP3’端的片段IAPP1P2；合成引物IAPP3和IAPP4，扩增含IAP5’端的片段IAPP3P4。
表I引物序列
将经BamHI和SalI酶切的IAPP1P2片段克隆至pGL3-basic(Promega公司)的SalI-BamHI位点，随后将全长的hsv-TK基因(此片段来自于pPNT(可购自University of Michigan的转基因动物模式中心))克隆至XbaI-XhoI位点，最后将IAPP3P4片段克隆至KpnI-SmaI位点，获得转基因质粒IAP-TK的构建(图1)。
实施例2hsv-TK经显微注射引入小鼠受精卵以及转基因阳性鼠的产生转基因质粒IAP-TK用SalI和NotI线性化后，回收含有IAP和hsv-TK基因基因的片段。
线性化的DNA(约500拷贝)注射至小鼠受精卵的雄原核中，注射后的受精卵移植给假孕小鼠。约20天后，小鼠出生。小鼠出生3周后，剪尾提取DNA，PCR(hsv-TK基因特异引物5’-CCCCTTCTTCGCTGGTACGAGGAG-3’(SEQ ID NO5)和5’-AAGCGCGTGGAGTTGACCTGAAGT-3’(SEQID NO6))检测分析是否有转基因整合。
结果如图2所示。共获得转基因阳性小鼠11只，这些小鼠经交配繁育建系，共建立了3个转基因小鼠系。
实施例3转基因在小鼠睾丸组织中的表达为了检测IAP-TK融合基因在小鼠体内是否表达，用Trizol试剂按常规方法提取小鼠唾液腺总RNA。按Takara RNA PCR Kit(Ver2.1)说明书进行逆转录，然后进行PCR扩增检测hsv-TK表达。对转基因小鼠睾丸、附睾、凝结腺、精囊腺、心、肝、肺、脾、肾、肌肉、脑等组织总RNA进行分析。
结果表明，hsv-TK只在睾丸组织中表达(图3)。
实施例4该转基因小鼠可用于提高基因剔除小鼠技术的效率将实施例3获得的IAP-TK转基因小鼠作为基因剔除技术中的囊胚供体，在嵌合体胚胎发育过程中或出生后，用药物9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(gancyclovir)，无环鸟苷(acyclovir)或pencyclovir诱导供体囊胚来源的精原细胞死亡，只有来源于ES细胞的精原细胞被保留，甚至被杀死的精原细胞可能由来源于ES细胞的精原细胞代偿，提高ES细胞来源的精原细胞的绝对数量，从而提高嵌和体小鼠后代中出现基因剔除小鼠的几率。
实施例5利用该转基因小鼠获得遗传背景单一的基因剔除小鼠将实施例3获得的IAP-TK转基因小鼠作为基因剔除技术中的囊胚供体，在嵌合体胚胎发育过程中或出生后，用药物9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(gancyclovir)，无环鸟苷(acyclovir)或pencyclovir诱导供体囊胚来源的精原细胞死亡，嵌合体小鼠的精原细胞全部来源于ES细胞。嵌合体无需与C57BL/6小鼠交配，而与ES细胞同品系的小鼠交配获得遗传背景单一的基因剔除小鼠。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海南方模式生物科技发展有限公司中科院上海生命科学研究院上海第二医科大学健康科学中心上海第二医科大学上海南方模式生物研究中心<120>一种高效建立纯系基因剔除小鼠模型的方法<130>033916<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>6aagcgcgtgg agttgacctg aagt 2权利要求
1.一种产生精原细胞特异性表达自杀基因的转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤(a)提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)IAP启动子，(b)与启动子操作性相连的自杀基因，(c)终止密码子；(b)用显微注射技术将步骤(a)中的线性化的转基因构建物基因引入非人哺乳动物受精卵的雄原核中；(c)将步骤(b)的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管；(d)产生转基因的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中整合有自杀基因表达盒，所述表达盒含有(a)IAP启动子，(b)与启动子操作性相连的自杀基因，(c)终止密码子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(e)对步骤(d)获得的转基因动物进行鉴定。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括步骤(f)使获得的转基因动物进行交配建系，获得子代。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的自杀基因是hsv-TK、胞嘧啶脱氨酶基因、或VIV-TK。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、猴。
6.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的IAP启动子含有Genebank登录号为X04120中第1-1296位的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在转基因构建物中所述终止子密码子后还含有IAP的3’端长末端重复序列。
8.一种用权利要求1所述方法获得的非人哺乳动物的用途，其特征在于，用作基因敲除技术中的囊胚供体。
9.一种产生纯系基因剔除非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤(a)将权利要求1的所述方法获得的非人哺乳动物用作基因敲除技术中的囊胚供体，获得其囊胚；(b)将同源重组的ES细胞与囊胚供体形成嵌合囊胚，从而获得嵌合体胚胎；(c)从嵌合体胚胎产生基因剔除的非人哺乳动物；其中，在嵌合体胚胎发育过程中或在动物出生后用选自下组的自杀基因诱导剂诱导供体囊胚来源的精原细胞死亡。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。
全文摘要
本发明提供一种用于产生纯系基因剔除小鼠模型的转基因非人哺乳动物，在该动物的基因组中转入了外源性的自杀基因，所述表达盒含有(a)启动子，(b)与启动子操作性相连的自杀基因，(c)终止密码子。转基因动物(如小鼠)建系后，自杀基因仅在睾丸组织中表达。该转基因动物可用做基因敲除技术中的囊胚供体，以提高基因剔除技术的效率及解决基因敲除小鼠遗传背景不纯的问题。
文档编号C12N15/87GK1580251SQ0314210
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月8日 优先权日2003年8月8日
发明者王铸钢, 赵旭东, 任维华, 王龙, 孔辉 申请人:上海南方模式生物科技发展有限公司, 中国科学院上海生命科学研究院上海第二医科大学健康科学中心, 上海第二医科大学, 上海南方模式生物研究中心