专利名称：一种生产基因工程重组192肽人生长激素的方法
技术领域：
本发明属于分子生物技术领域，尤其是一种生产基因工程重组192肽人生长激素的方法。
背景技术：
人生长激素(hGH)是脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种蛋白质激素，由191个氨基酸组成。正常成年人血浆hGH水平约为1～5ng/ml，半衰期为15～20分钟。
hGH是人体内含量最高的几种激素之一，由于影响全身细胞、骨骼、肌肉合器官的生长，因此对于人体新陈代谢合各种生理功能有着广泛的调节作用，如hGH促进脂肪分解而使血浆游离脂肪酸升高；促进许多组织中RNA及蛋白质的合成，出现正氮平衡，使软骨、骨骼、肌肉结缔组织及内脏等组织合成胰岛素生长因子ILG，从而促进软骨细胞的分裂和基质增生，与骨骼和结缔组织的生长有关；又有胰岛素样作用，能促进脂肪组织、肌肉组织等对葡萄糖的摄取氧化，增强肌肉中蛋白质的合成。
目前，美国、欧洲和中国都已经生产出重组hGH产品上市，但所有厂家均采用大肠杆菌表达的重组hGH产品，按照表达方式又分为细胞内表达与分泌型表达这两种。大肠杆菌内表达的hGH形成包涵体而成为不溶性，提取困难，需要经过变性复性的复杂步骤，故损失很大；有些是分泌型表达的，但大肠杆菌表达宿主含有内毒素，为了从产品中去除内毒素需要更加繁复的提纯步骤，致使产品得率更加降低，粗品中仍然含有大量的大肠杆菌杂蛋白，特别是表达宿主所特有的大肠杆菌内毒素。为了去除这些对人体有害的成分，必须经过繁复的提纯步骤，损失也很大，最终的产品得率很低(25mg/L)。由于此表达系统所固有的缺陷，导致生产成本居高不下。
发明内容
本发明的目的在于针对已有技术所存在的缺点，提供一种用基因工程重组法生产192肽人生长激素的方法。
本发明所生产的重组hGH是192肽，即在天然人生长激素的N端加上了一个甲硫氨酸，作为翻译起始子。完整的192肽hGH序列如下MFPTIPLSRL FDNAMLRAHR LHQLAFDTYQ EFEEAYIPKEQKYSFLQNPQ TSLCFSESIP TPSNREETQQ KSNLELLRISLLLIQSWLEP VQFLRSVFAN SLVYGASDSN VYDLLKDLEEGIQTLMGRLE DGSPRTGQIF KQTYSKFDTN SHNDDALLKNYGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC GF本发明的技术方案由以下步骤组成(一)、获取192肽人生长激素基因以Phil-D2质粒作为穿梭质粒，将生长激素cDNA转入酵母细胞内，通过与酵母细胞染色体上的基因之间的同源重组，构建了基因工程hGH酵母；(二)、表达系统用毕赤酵母的菌株作为表达宿主、以细胞内表达的方式进行192肽人生长激素表达；(三)、诱导hGH酵母表达生产人生长激素。
把人生长激素cDNA克隆进pHil-D2质粒中，构建成重组质粒pHil-D2/hGH，此重组质粒包含一个HGH基本表达单元，此表达单元由三部分组成毕赤酵母酒精氧化酶(AOX)启动子、192肽人生长激素cDNA序列、毕赤酵母酒精氧化酶(AOX)转录终止序列。然后将此重组质粒转化入酵母细胞内，通过与酵母细胞染色体上的基因之间的同源重组，使得人生长激素的基因整合进酵母染色体中特定的基因位点之一，构建了基因工程HGH酵母。
其中步骤一中所使用的酵母菌株为毕赤酵母，包括GS115、SMD1163、SMD1165、SMD1168或其他经过基因修饰的合适的毕赤酵母菌株。
其中步骤一中所使用酵母染色体上的基因为HIS4基因或AOX1基因，相应地，所构建成的基因工程HGH酵母菌株的表型分别为Mut+和Mut-。
其中步骤一中所构建的HGH酵母含单拷贝或者多拷贝的HGH基本表达单元，其中多拷贝表达单元以头尾相连的方式排列。
其中步骤三中所使用的诱导物为甲醇，通过诱导AOX启动子，启始hGH基因的转录与翻译，完成hGH蛋白的细胞内表达。
人生长激素蛋白的表达水平因HGH酵母所含表达单元拷贝数的不同而有显著差异，本专利中HGH酵母的最高表达水平是250mg/100g湿重酵母。
其中步骤一中所使用酵母染色体上的基因为HIS4基因或AOX1基因。
本发明的有益效果本发明用毕赤酵母的4种特定的菌株作为表达宿主，以细胞内表达的方式来生产基因工程重组192肽人生长激素。酵母既是一种微生物，同时又是一种真核细胞型生物(不同于原核生物的大肠杆菌)，具有很接近高等生物的细胞结构。所以，酵母作为表达宿主来生产人体激素和细胞因子，具有特别的优势。与大肠杆菌相比，酵母细胞内环境更加适合所表达的人体蛋白质分子的正确折叠，其表达的基因工程蛋白质都是可溶型、构象正确的产物。同时，酵母表达宿主不含内毒素，无须经过去处内毒素的方法步骤，保证了产品的高得率。
就基因工程领域而言，在所有的酵母中，毕赤酵母是最优秀的表达系统，它生长旺盛，每升培养液含酵母菌体量湿重可达450g，对外源基因的表达良好，表达产物为可溶于水，产品易纯化，收得率高，其表达水平也远高于酿酒酵母。毕赤酵母无毒无害，含高蛋白，富含维生素B，本身就是很好的营养品。
由于毕赤酵母把外源蛋白质cDNA通过基因重组整合入其染色体基因组中，人生长激素基因已成为酵母宿主染色体DNA的一部分，所以遗传学性状十分稳定，彻底解决了其他基因工程表达系统(例如酿酒酵母、大肠杆菌)的宿主细胞在传代过程中因选择压力而丢失外源基因载体(例如附着体、质粒)的问题。
毕赤酵母表达系统使用价格低廉的酵母培养液，诱导表达所用的甲醇也很便宜，所以生产成本相当低。
毕赤酵母生长旺盛，单位体积培养液中可收获的菌体含量极高(每升培养液可以收获450克湿重的酵母)，而酵母本身又是不含有害成分、营养特别丰富的食品，所以非常适合开发成口服、喷雾等剂型的保健品。
本产品是酵母细胞内表达，蛋白质分子没有糖基化，因而与天然的人生长激素分子完全相同，也就不存在分泌型表达产品因糖基化而对人体产生抗原性的问题。
具体实施例方式(一)人生长激素cDNA的合成、克隆和序列测定1.脑垂体前叶组织总RNA的提取(使用Stratagene公司的Absolutely RNATMRT-PCR Miniprep KitCatalog#400800，Revision#021002)(1)、脑垂体前叶组织一旦从尸体上解剖分离，马上放入液氮内进行快速冷冻处理。
(2)、切取一小块冷冻的组织，快速称量后即移入新鲜配制的β基乙醇-组织裂解缓冲液内，裂解液用量为每50mg脑垂体组织用1mg裂解缓冲液。
(3)、对脑垂体组织进行匀浆破细胞，预过滤离心一次，收集滤出液。
(4)、加入等体积的70％乙醇，震荡混匀，移入RNA结合管内，离心，弃去滤出液。
(5)、分别用1X低盐洗涤缓冲液、Dnasel溶液、1X高盐洗涤缓冲液、1X低盐洗涤缓冲液先后洗涤冲洗。
(6)、加入洗脱缓冲液，室温下放置2分钟，离心洗涤，收集纯化的RNA，常规方法定量。
2.用逆转录方法合成总cDNA(1)、去1～5μg总RNA，加入1ugOligodT和适量dH2O至总体积为11μl。
(2)、加热上述反应液，70℃，10分钟。
(3)、离心，加入4μl 5X Frist Strand Buffer，1μl 10mMdNTP，混匀，置于42℃2分钟。
(4)、加入11μl SuperScriptTMIITranscriptase，混匀，置于42℃50分钟，70℃15分钟。
3.用聚合酶链式反应(PCR)扩增hGH cDNA。
(1)、设计下列2个引物用于PCR扩增，并配成20μM。
(2)、HGH5’端引物5’ATGTTCCCAACCATTCCC3’HGH3’端引物5’CTAGAAGCCACAGCTGC3’(3)把下述试剂加入PCR管内，1μl cDNA，1ul 5’端引物，1μl3’端引物，5μl 2mM dNTP，0.5μl Vent酶，5μl 10X Vent Buffer，36.5μldH2O。
(4)PCR反应程序如下第一步变性95℃3分钟，第二步做30个循环，每个循环由以下3个步骤组成a、变性95℃30秒，b、退火55℃30秒，c、延伸72℃1分钟，第三步最终72℃10分钟。
(4)PCR反应程序如下第一步变性95℃3分钟，第二步做30个循环，每个循环由以下3个步骤组成a、变性95℃30秒，b、退火55℃30秒，c、延伸72℃1分钟，第三步最终72℃10分钟。
4.PCR产物(即hGH cDNA)的纯化。
(使用Qiagen公司的QIAquickTMGel Extraction Kit Cat.No.28706)(1)、用常规琼脂糖凝胶电泳法分离上述PCR反应产物，琼脂糖凝胶浓度为1％，恒电压90V，电泳60分钟，电泳标准品用5μl.λ/Hind III+EcoRI。
(2)、在紫外线灯下，在凝胶上580bp处切取DNA条带，称重(100mg相当于100μl)。
(3)、加入3倍体积的QG缓冲液，加热溶解凝胶，加入1倍体积异丙醇，混匀。
(4)、把样品加入QIAquick柱内，吸附DNA，用PE缓冲液洗涤一次。
(5)、加入dH2O，离心洗脱，收集纯化的DNA。
5.hGH cDNA的克隆(使用Invitrogen公司的Zero Blunt TM PCR Cloning KitCatalog No.K2700-20/40).
(1)、连接反应如此进行1μlPCR纯化产物，0.5μl PCR-Blunt质粒，0.5μl T4 DNA Ligase，1μl 10X T4 DNA Ligase Buffer，7μl dH2O。12℃放置过夜。
(2)、取5μl上述连接反应液，用常规的热休克方法转化感受态DH5α细菌。
(3)、把转化菌铺于LB固体培养板上(含kanamycin50μg/ml)37℃过夜。
(4)、次日，用接种棒从LB培养板上挑取9株菌落，培养阔增。
(5)、常规方法抽提重组质粒DNA，然后分别用单个限制性内切酶EcoRI和联合酶切(Bsu36I+Xbal)的方法，确认hGH cDNA的插入。
酶切反应结果可以用常规琼脂糖凝胶电泳法确认。
6.hGH cDNA的序列测定(使用Amersham Pharmacia Biotech公司的Thermo Sequenasecycle sequecing kit，Product No.US78500)在上述含有hGH cDNA插入的重组质粒Pcr-Blunt/hGH中选取3个做DNA序列测定。
(1)、分别对M13反向和M13正向引物做5’端同位素标记，标记使用[γ-32P]ATP。
(2)、用M13反向和M13正向引物所选的3株重组质粒做序列测定。根据这两个引物的溶解温度，热反应循环程序设计如下95℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，共做55个循环。
(3)、把热循环反应产物走凝胶电泳(6％凝胶)，总共加样3次。电泳结束后，干燥凝胶，放置X线底片进行曝光。冲洗底片，读取DNA序列。
结果显示所选取的3个重组质粒都有hGH cDNA插入，且序列全部正确，与其开放阅读框相对应的氨基酸为192肽(其中第一个氨基酸是翻译起始子甲硫氨酸)，完整的氨基酸序列如下MFPTIPLSRL FDNAMLRAHR LHQLAFDTYQ EFEEAYIPKEQKYSFLQNPQ TSLCFSESIP TPSNREETQQ KSNLELLRISLLLIQSLEP VQFLRSVFAN SLVYSKFDTN VYDLLKDLEEGIQTLMGRLE DGSPRTGQIF KQTYSKFDTN SHNDDALLKNYGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC GF电子计算机检索确认此氨基酸序列与国际基因库中人生长激素序列完全一致。
(二)重组质粒pHil-D2/hGH的构建与线性化1.用限制性内切酶EcoRI把hGH cDNA片段从重组质粒pCR-Blunt/hGH中切除下来，按(一)4.步骤所示的方法纯化。
2.用限制性内切酶EcoRI把质粒pHil-D2线性化，然后加入1μl硷性磷酸酶以作5’脱磷酸。
最后按(一)4.步骤所示的方法纯化。
3.把上述hGH cDNA片段克隆进pHil-D2质粒中去克隆方法按照(一)5.(1)～(4)进行，但细菌转化以后铺板和后来培养所用的抗菌素是100μg/ml的Ampicillin而不是Kanamycin。
4.常规方法抽提重组质粒DNA，然后分别用单个限制性内切酶EcoRI和联合酶切(PstI+XbaI)的方法，确认hGH cDNA的插入及定向。
酶切反结果用常规琼脂糖凝胶电泳法确认。
5.重组质粒pHil-D2/hGH中hGHcDNA序列的确认。
根据上述步骤(4)的结果，选取第1和第7株质粒作DNA序列测定。方法按照(一)6.步骤进行，测序反应所用的引物分别是AOX5’和AOX3’引物。
测序结果显示，这些重组质粒中的hGH cDNA的序列和插入方向都是正确的。
6.分别使用限制性内切酶SalI和NotI对pHil-D2/hGH进行酶切使其线性化，用(一)4.步骤所示的方法纯化。
(三)HGH酵母表达宿主的建立(操作方法参照Invitrogen公司的The Pinchia Expression Kit)表达宿主使用毕赤酵母GS115株，SMD1163株，SMD1165株，SMD1168株，以下构建成的hGH酵母即包括了上述这4种毕赤酵母细胞株。
1.毕赤酵母的转化(1)、把酵母常规培养至OD600在0.2～0.3之间，收获细胞。
(2)、分别用蒸馏水，SED溶液，1M山梨醇洗涤细胞，每次洗完后既低速离心，收集细胞，弃去洗涤溶液。
(3)、把细胞重悬于SCE缓冲液中，加入适量的Zymolyase酶，然后把细胞管子置于30℃水浴内，制备原生质球。
(4)、当原生质球比例达到70％，低速离心收集细胞，然后用1M山梨醇和CaS溶液分别洗涤一次，最后将酵母重悬于适当体积的CaS溶液内，分成数管。
(5)、对于每一个转化，加入1～10μg(二)6.步骤所制备的DNA，室温放置10分钟，加入10倍体积的PEG/CaT，室温放置10分钟。
(6)、低速离心收集细胞，重悬于150μlSOS培养液内，室温放置20分钟，加入850μl 1M山梨醇。
(7)、把上述细胞悬液加入融化的RD培养基内，混匀后倒在RDB培养板上。等上层RD培养基凝结以后，把培养板倒置于30℃培养箱内。
(8)、4天以后，转化成功的酵母细胞就开始长出来。
2.高表达酵母宿主的筛选(1)、对于每一个毕赤酵母细胞株，都从相应的RDB培养板上挑取54个单集落转化菌培养扩增。
(2)、常规方法提取酵母细胞总DNA。
(3)、以hGHcDNA为模板，制备放射性标记的cDNA探针，标记使用[α-32P]dATP。
(4)对于每一个样品，滴加2μl酵母总DNA于硝酸纤维素膜上，然后做DNA斑点印迹杂交分析。杂交温度为32℃，过夜。洗涤温度为65℃，分别用2XSSC和0.1XSSC洗涤一次，然后根据放射性信号强度决定再洗涤的温度和次数。
(5)、放置X线底片曝光，冲洗底片，分析信号强度。
(6)在54株转化酵母中，斑点印迹放射性的强弱代表了染色体中插(7)入hGHcDNA拷贝数的多少。从每一种酵母细胞株的转化体中选(8)取8个含hGH基因不同拷贝数的酵母，用YPD培养液常规培养48小时，然后把培养液换成YPM，继续诱导表达72小时。
(9)收获酵母细胞，重悬于裂解缓冲液内，加入细胞璃珠，用机械震荡的方法破碎细胞。
(10)用免疫印染法(Western-Blot)检测上述破菌上清掖，阳性对照为大肠杆菌表达的hGH。所用第一抗体为兔抗hGH(Sigma公司产品G2894)，第二抗体为酶标记羊抗兔lgG抗体。对于4种酵母的8种转化体中，在各自的8个受检转化菌中，选取表达水平最高的一株作为这个酵母菌株的hGH酵母。检测结果显示，毕赤酵母的4个菌株，即GS115株、SMD1163株、SMD1165株、SMD1168株的2种整合方式(即His+Mut+和His+Mut-)对hGH的最高表达水平相同，都为250mg/100g湿重酵母。
(四)重组人生长激素的纯化匀浆破碎酵母，用小鼠抗hGH单抗亲和层析柱提取匀浆上清液内的hGH，得到纯化的重组人生长激素。
(五)重组人生长激素的活性考核1去垂体大鼠增重试验体重80～100克的雄性Sprague-Dawley大鼠做脑垂体切除手术，2周后开始实验。
第1天，每个大鼠皮下注射40μg醋酸可的松。
第2天和第3天，重复注射醋酸可的松。
第4天和第5天，腹腔内注射L-甲状腺素。
第6～15天每天接受2次生长激素皮下注射(按照注射剂量分成2组，6μg/天和60μg/天)，阴性对照使用空白酵母提取纯化品，阳性对照使用从人脑垂体提取的生长激素(Sigma公司)。
第16天，试验结束，动物称取最终体重。
去垂体大鼠增重试验结果动物个数体重变化(克)第8天 第10天 第13天 第16天酵母hGH6μg/ 107.6±1.1 16.8±0.5 23.8±1.0 27.9±1.2天
60μg 1011.3±0.723.6±1.138.1±1.4 48.2±1.6天阴性对照 103.4±0.5 7.2±0.4 9.8±0.7 12.3±0.9阴性对照6μg 107.2±0.8 17.1±0.424.1±0.9 26.9±0.8天60μg 1012.1±0.322.9±0.839.2±0.9 47.9±1.2天2 大鼠淋巴瘤细胞增殖试验大鼠淋巴瘤细胞Nb2的培养按常规，培养液含10％胎牛血清/10％马血清。
第一天，培养液改用1％胎牛血清/10％马血清；第二天，培养液改用10％马血清，并且加入生和激素做检测，阴性对照使用空白酵母提取纯化品，阴性对照使用从人脑垂体提取的生长激素(Singma公司)。
3 大鼠淋巴瘤细胞增殖试验大鼠淋巴瘤细胞Nb2的培养按常规，培养液含10％胎牛血清/10％马血清第一天，培养液改用1％胎牛血清/10％马血清；
第二天，培养液改用10％马血清，并且加入生和激素做检测，阴性对照使用空白酵母提取纯化品，阴性对照使用从人脑垂体提取的生长激素(Singma公司)。
第5天，计数细胞。
大鼠淋巴瘤细胞增殖试验结果实验组1含10％马血清的培养液；实验组2含10％胎牛血清的培养液；实验组3酵母rhGH；实验组4空白对照；实验组5阴性对照；实验组6阴性对照。
权利要求
1.一种生产基因工程重组192肽人生长激素的方法，其特征在于它由以下步骤组成(一)、获取192肽人生长激素基因以Phil-D2质粒作为穿梭质粒，将生长激素cDNA转入酵母细胞内，通过与酵母细胞染色体上的基因之间的同源重组，构建了基因工程hGH酵母；(二)、表达系统用毕赤酵母的菌株作为表达宿主、以细胞内表达的方式进行192肽人生长激素表达；(三)、诱导hGH酵母表达生产人生长激素。
2.根据权利要求1所述的生产基因工程重组192肽人生长激素的方法，获取192肽人生长激素基因的方法如下把人生长激素cDNA克隆进pHil-D2质粒中，构建成重组质粒pHil-D2/hGH，此重组质粒包含一个HGH基本表达单元，此表达单元由三部分组成毕赤酵母酒精氧化酶(AOX)启动子、192肽人生长激素cDNA序列、毕赤酵母酒精氧化酶(AOX)转录终止序列。然后将此重组质粒转化入酵母细胞内，通过与酵母细胞染色体上的基因之间的同源重组，使得人生长激素的基因整合进酵母染色体中特定的基因位点之一，构建了基因工程HGH酵母。
3.根据权利要求1或2所述的生产基因工程重组192肽人生长激素的方法，其中步骤一中所使用的酵母菌株为毕赤酵母，包括GS115、SMD1163、SMD1165、SMD1168或其他经过基因修饰的合适的毕赤酵母菌株。
4.根据权利要求1或2所述的生产基因工程重组192肽人生长激素的方法，其中步骤一中所使用酵母染色体上的基因为HIS4基因或AOX1基因，相应地，所构建成的基因工程HGH酵母菌株的表型分别为Mut+和Mut-。
5.根据权利要求1或2所述的生产基因工程重组192肽人生长激素的方法，其中步骤一中所构建的HGH酵母含单拷贝或者多拷贝的HGH基本表达单元，其中多拷贝表达单元以头尾相连的方式排列。
6.根据权利要求1或2所述的生产基因工程重组192肽人生长激素的方法，其中步骤三中所使用的诱导物为甲醇，通过诱导AOX启动子，启始hGH基因的转录与翻译，完成hGH蛋白的细胞内表达。
7.根据权利要求6所述的生产基因工程重组192肽人生长激素的方法，人生长激素蛋白的表达水平因HGH酵母所含表达单元拷贝数的不同而有显著差异，本专利中HGH酵母的最高表达水平是250mg/100g湿重酵母。
8.根据权利要求3所述的生产基因工程重组192肽人生长激素的方法，其中步骤一中所使用酵母染色体上的基因为HIS4基因或AOX1基因。
全文摘要
本发明属于分子生物技术领域，尤其是一种生产基因工程重组192肽人生长激素的方法。其技术方案为(一)、获取192肽人生长激素基因以Phil－D2质粒作为穿梭质粒，将生长激素cDNA转入酵母细胞内，通过与酵母细胞染色体上的基因之间的同源重组，构建了基因工程hGH酵母；(二)、表达系统用毕赤酵母的菌株作为表达宿主、以细胞内表达的方式进行192肽人生长激素表达；(三)、诱导hGH酵母表达生产人生长激素。
文档编号C12N1/19GK1524959SQ03146818
公开日2004年9月1日 申请日期2003年9月16日 优先权日2003年9月16日
发明者周琪, 肖可见, 彭立云, 叶健华, 周 琪 申请人:周琪, 周 琪