专利名称：人炎性乳腺癌细胞系及其建立方法
技术领域：
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种人炎性乳腺癌细胞系的建立及其建立方法。
背景技术：
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，血道转移与淋巴道播散是乳腺癌最重要的两条转移途径。远处转移是影响肿瘤疗效和预后，导致患者死亡的主要因素。炎性乳腺癌(inflammatory breast cancer，IBC)是一种较罕见的高度恶性、预后极差的特殊类型乳腺癌，其组织病理学特征为广泛的淋巴道播散-真皮淋巴管内瘤栓浸润导致乳腺皮肤红肿等“炎性”改变，短期内出现远处转移。绝大多数病例就诊时已无手术指征，患者平均生存期低于2.5年。
目前对炎性乳腺癌特殊生物学特征的分子机制尚不十分清楚，也无理想的治疗方案和药物。迄今为止，炎性乳腺癌自发性动物模型尚未成功建立，无法利用在体肿瘤转移的生物学研究模型进行探索预测肿瘤转移的早期、敏感、特异的指标；无法进行筛选和验证创新药物；无法为进一步提高肿瘤的综合防治效果提供技术支撑。
建立肿瘤细胞系的常用方法是采用肿瘤患者标本直接接种裸鼠，在裸鼠体内大量增殖并通过在体筛选过程，建立稳定的移植瘤模型，再行体外连续培养，得到稳定传代的细胞系。另一种方法是取患者肿瘤组织块或细胞体外直接进行原代培养，筛选和建立稳定传代的细胞系。影响肿瘤细胞系建立的因素很多，如肿瘤组织的活力状态、组织块的大小、培养基的种类选择等。目前普遍应用的人癌转移模型，是人癌接种于免疫缺陷动物，主要是指在裸小鼠体内形成的人癌裸鼠转移模型，和能在免疫缺陷动物体内发生转移的人癌细胞系。人乳腺癌移植模型成功率仅10％左右。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高转移表型的人炎性乳腺癌细胞系，为研究炎性乳腺癌的特殊生物学特性和肿瘤转移的分子机制提供细胞模型与研究工具。
本发明的另一目的是提供高转移表型的人炎性乳腺癌细胞系的建立方法。
本发明采用人类炎性乳腺癌裸鼠移植瘤动物模型(邵志敏等，中华外科杂志)，用体外连续培养方法，筛选建立能稳定传代的炎性乳腺癌细胞系，命名IBC-1。
本发明人炎性乳腺癌细胞系IBC-1，癌细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，贴壁牢固，难消化分离，染色体呈亚三倍体核型，染色体结构畸变，染色体众数范围49~61条，占总数的71.6％，细胞增殖周期与凋亡符合肿瘤细胞特征，S期42.90％，G2/G11.89，成瘤率高，能再现炎性乳腺癌的临床特征，指数增殖期在第3~6天，蛋白印迹E-cadherin阳性。细胞冻存复苏后生长良好，能够连续传代。
本发明通过下述方法和步骤建立炎性乳腺癌细胞系。
1、原代及传代移植1)按已知方法无菌切取肿瘤组织，进行原代皮下原位接种。
2)按原代移植的方法继续系列传代。
2、瘤细胞原代培养取新鲜炎性乳腺癌裸鼠移植瘤组织块，切成1mm3并均匀贴附于50ml Corning塑料培养瓶中，加入5ml DMEM培养基，含20％胎牛血清(FCS)。CO2培养箱，37℃干贴壁培养，待组织块周围游离并长出细胞，增殖达一定面积时胰酶消化，M-199培养基连续培养。
3、建立细胞系隔5d传代1次，分种率1∶2。体外传代至第16代后，进行各项生物学指标检测，记作IBC-1。至25代后培养基中FBS减至5％浓度并维持传代。
本发明IBC-1细胞系裸鼠皮下原位接种成瘤率100％，有真皮淋巴管及血管浸润。4周后自发性肺转移率为100％，组织病理学检查证实为转移性腺癌。上述移植瘤模型的肿瘤生长曲线符合Gompertz函数模型，为潜伏期后呈指数模式生长。FCM分析显示细胞增殖周期分布在人炎性乳腺癌细胞系IBC-1与裸鼠移植瘤细胞一致，表明模型中传代肿瘤细胞分裂增殖趋于稳定，能较好的再现人炎性乳腺癌生长增殖的生物学特征。
图1为倒置显微镜下IBC-1细胞形态。
图2a为IBC-1细胞系染色体，2b为IBC-1染色体核型分析(亚三倍体)。
图3为IBC-1裸鼠原位接种移植瘤组织病理学形态(HE×400)。
图4为人炎性乳腺癌细胞系IBC-1裸鼠接种模型。
具体实施例方式
实施例1建立炎性乳腺癌细胞系1)原代及传代移植无菌切取肿瘤组织，进行原代皮下原位接种。
原位移植清除纤维、脂肪等非瘤组织和坏死部分，灭菌生理盐水漂洗，瘤块剪切成0.5mm3。动物腹腔麻醉后，碘酒、酒精消毒雌性裸小鼠乳腺表面皮肤，将瘤组织接种于皮下脂肪垫。原代移植瘤肿瘤长至约2cm3时，处死裸小鼠，切取原代移植瘤；按原代移植的方法继续系列传代。
2)瘤细胞原代培养取新鲜炎性乳腺癌裸鼠移植瘤组织块，切成1mm3并均匀贴附于50ml Cornin塑料培养瓶中，加入5ml DMEM培养基(20％FCS)。贴附面向上将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃干贴壁4h，待组织块牢固贴壁后，翻转培养瓶，使组织块浸于培养基中继续培养，待组织块周围游离并长出细胞，增殖达到培养瓶底60％面积时胰酶消化，M-199培养基连续培养，可裂解细胞团中混入的红细胞，并抑制成纤维母细胞的竞争性生长。
3)建立细胞系每隔5d传代1次，分种率1∶2。体外传代至第16代后，进行各项生物学指标的检测，记作IBC-1。至25代后培养基中FBS减至5％浓度并维持传代。
进行实验观察与验证，体外生长的IBC-1具有以下特征1)细胞形态癌细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，与培养瓶壁贴附牢固，较难消化分离。
2)染色体分析挑选染色体分散良好的100个中期的分裂相细胞进行染色体分析。统计显示，细胞染色体呈亚三倍体核型，有染色体数目和结构畸变；染色体众数范围49~61条，占总数的71.6％。表1是炎性乳腺癌细胞系IBC-1染色体核型分析。
表1.
53，xx，der(1)t(1；7)，+add(1)(q21)，(q10；q10)，+add(3)(p21)，+add(3)(p13)，add(4)(q21)，+5，add(6)(p23)，add(7)(q22)，add(8)(p21)，add(8)(p11.2)，add(9)(p12)，+add(9)(q12)，add(11)(p11.2)，der(13)t(11；13)add(14)(p11.2)，add(15)(q26)，+add(16)(q11.2)，？t(18；19)(q11.2；q12)add(20)(q13.3)，add(21)(p12)，-22，+mar1，+mar2[14]/100~104，xxxx，idem，-12，-13，-14，-14，-17，-18，-18[CP2].
3)基因组DNA微卫星序列检测人炎性乳腺癌细胞系IBC-1、原代移植瘤、传代移植瘤三个随机位点微卫星(D14S68、D18S69、D20S199)均扩增出完全相同的片段，而裸鼠正常乳腺组织没有扩增出相应的带型。
4)细胞增殖周期与凋亡流式细胞分析，检测炎性乳腺癌移植瘤细胞S期39.38％，G2/G11.83；IBC-1细胞系S期42.90％，G2/G11.89，二者细胞周期均符合肿瘤细胞特征，具有一致性。
5)成瘤率和生长模式成瘤率为100％，肿瘤生长符合Gompertzian指数函数模型。
6)炎性乳腺癌细胞系IBC-1生长曲线，指数增殖期在第3~6天。
7)炎性乳腺癌细胞系IBC-1以及原位移植模型生物学特性蛋白印迹检测显示IBC-1及移植瘤细胞E-cadherin阳性。
8)细胞冻存与复苏细胞冻存复苏后生长良好，能够连续传代。微生物污染检测细胞无细菌、真菌或支原体污染。
权利要求
1.一种人炎性乳腺癌细胞系，其特征在于能在体外长期生长和稳定传代，具有下列生物学特征和遗传学特征(1)细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，贴壁牢固，难消化分离，接触性生长抑制丧失；(2)细胞为亚三倍体，染色体数目和结构畸变；(3)原位接种成瘤率和自发性肺转移率为100％，能再现炎性乳腺癌的临床特征。
2.按权利要求1所述的人炎性乳腺癌细胞系，其特征在于所述染色体众数范围49~61条，占总数的71.6％。
3.一种按权利要求1所述的人炎性乳腺癌细胞系，其特征在于通过下述方法建立(1)原代及传代移植无菌切取肿瘤组织后进行原代皮下原位接种。(2)瘤细胞原代培养取新鲜炎性乳腺癌裸鼠移植瘤组织块，贴附于培养瓶中，加入5mlDMEM培养基(20％FCS)，CO2培养箱，37℃干贴壁4h，贴壁后，组织块浸于培养基中继续培养，增殖，胰酶消化，M-199培养基连续培养。(3)建立细胞系每隔5d传代1次，分种率1∶2。体外传代至第16代后，生物学指标检测，验证。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种人炎性乳腺癌细胞系的建立及其建系方法。本发明利用人炎性乳腺癌裸鼠模型移植瘤组织作为建系瘤源，采用体外培养方式进行传代，建成具有高转移表型的人炎性乳腺癌细胞系。本发明细胞系细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，贴壁牢固，难消化分离，细胞为亚三倍体，染色体数目和结构畸变，原位接种成瘤率和自发性肺转移率为100％，能再现炎性乳腺癌的临床特征，是一个较理想可靠的研究模型，适用于炎性乳腺癌的在体、体外研究，具有重要的基础研究与临床应用价值。
文档编号C12N5/06GK1490403SQ03150538
公开日2004年4月21日 申请日期2003年8月25日 优先权日2003年8月25日
发明者邵志敏, 刘刚 申请人:复旦大学附属肿瘤医院