专利名称：表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因工程酵母菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA技术领域，具体地说，本发明涉及从地衣芽孢杆菌中克隆的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因。本发明还涉及在毕赤酵母中表达β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法，以及分泌表达β-1，3-1，4葡聚糖酶的毕赤酵母。
背景技术：
β-葡聚糖广泛分布于植物和微生物细胞壁中，不同来源的β-葡聚糖的葡聚糖苷键的结合方式和比例不尽相同。大麦中的葡聚糖含量很高，而且这些葡聚糖是有葡萄糖经由β-1，3和β-1，4键，以30％和70％的比例聚合而成的高分子化合物，具有很高的黏度，在以麦类为原料的啤酒生产领域和以麦类为饲料原料的动物养殖领域，都是不良影响因子，由于其特性会增加啤酒生产中的过滤困难和降低原料的利用率，同时，葡聚糖是一种抗营养因子，它在肠道中会形成很粘稠的物质，影响营养物质吸收，有害于肠道健康，有利于一些病原菌繁殖，增加发病率。因此，研究能够降解葡聚糖的葡聚糖酶具有重要意义；β-葡聚糖酶是一类能够降解β-葡聚糖的酶类。国内外研制的葡聚糖酶90％以上都为β-1，4葡聚糖酶，而对于降解葡聚糖更为实用和有效的β-1，3-1，4葡聚糖酶很少研究，更少有产业化。因此，β-1，3-1，4葡聚糖酶的研制具有比β-1，4葡聚糖酶更重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明筛选得到一株产β-1，3-1，4葡聚糖酶的菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)EGWO39(CGMCC NO0635)。
本发明提供了从芽孢杆菌菌株地衣芽孢杆菌EGWO39中克隆的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因。
本发明还提供了含有不带有DNA原基因信号肽编码序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因的重组表达载体。
本发明进一步提供了在毕赤酵母中表达β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法，该方法包括将上述重组表达载体转化毕赤酵母PMAD16得到了重组子。
发明详述本发明涉及从芽孢杆菌菌株地衣芽孢杆菌EGW039中克隆的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因，称之为eg1314基因。
本发明制备了含有不带有DNA原基因信号肽编码序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因的重组表达载体。在一个优选的实施方案中，将不带有原信号肽编码序列的β-1，3-1，4-葡聚糖基因经EcoRI和BamHI双酶切后与EcoRI和BamHI双酶切的pMETaA载体(从Invitrogen购买)连接，得到酵母重组表达载体pMETaA-1。
本发明制备了含有不带有DNA原基因信号肽编码序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因eg1314基因的酵母重组子。
在一个优选的实施方案中，将酵母重组表达载体pMETaA-1，经酶切后得到线性化pMETaA-11，用于转化毕赤酵母PMAD16得到了能够分泌表达β-1，3-1，4葡聚糖酶的重组毕赤酵母。
本发明提供了生产β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法。在一个优选的实施方案中，将上述含有不带有DNA原基因信号肽编码序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因eg1314基因的重组毕赤酵母PMAD16进行诱导发酵，分泌获得β-1，3-1，4葡聚糖酶。
有益效果本发明利用基因工程手段制备了能够分泌表达β-1，3-1，4葡聚糖酶的重组子。首先实现了β-1，3-1，4葡聚糖酶的生产的产业化。
图1.eg1314 PCR琼脂糖电泳。其中1号样品为MW标记物；5，6号为以出发菌株基因组为模板的eg1314PCR产物；2，3，4号样品为以重组载体总DNA为模板的eg1314PCR产物。
图2.eg1314 PCR产物序列和编码的AA序列(以出发菌株基因组为模板)图3.pMETaA-1的构建过程。
图4.pMETaA-1 PCR产物和序列测定结果。
图5，基因组DNA，重组质粒，线性化重组质粒电泳图谱。其中样品1为DNA MW标记物；样品2为环状重组载体pMETaA-1；样品3为单酶切线性化重组载体pMETaA-1；样品4为单点双酶切线性化重组载体pMETaA-11(6.5kb+2.2kb)。
图6.eg1314目标阳性重组子筛选。
图7.重组酵母外源eg1314PCR产物琼脂糖电泳图谱。
图8.重组酵母表达EG1314的SDS-PAGE电泳图谱。其中1号为MW标记物；2号样品为EG1314。
下面描述实现本发明的优选的实施方式。
本发明使用的酶和试剂限制酶，pfuDNA聚合酶，T4DNA连接酶，溶菌酶等分别购自Biolabs，Invitrogen和Promega公司。四种dNTP购自Promega公司。大麦葡聚糖购自Sigma公司，DNA和蛋白质分子量标准为Biolabs产品，其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。
使用的培养基LB培养基，YPAD，BMDY，BMMY，MW，MD培养基见Invitrogen毕赤酵母操作手册。
SDS-PAGE参照BIO-RAD实验手册进行。下面实施例中涉及的菌种和质粒概述于表1。
表1 供试菌种和质粒材料与质粒 特性来源说明地衣芽孢杆菌EGW039 beta-1，3-1，4- 发明专利01134381.8CGMCC0635 endoglucanase基因 CGMCC0635E.coli DH5 Sup E44，ΔlacU169，从国鼎生物技术公司hsdR17，recA1， 购买gryA966，thi-1，relA1嗜甲醇毕赤酵母PMAD16ade2-11 pep4从Invitrogen公司购买PMAD16(pMETaA-1)重组酵母本发明构建pMETaA 起始载体，8023bp从Invitrogen公司购买pMETaA-1Amp+8.7kb 本发明构建pMETaA-11 --Amp+0.6kb 本发明构建实施例一β-1，3-1，4葡聚糖酶基因的克隆与基因特征一、总DNA的提取取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)EGW039 CGMCC NO0635(CN01134381.8)的湿菌体6g悬浮于50ml 0.05mol磷酸钠缓冲液中(内含0.6mol/L蔗糖)加入溶菌酶(终浓度达0.5mg/ml)，37℃，温育1小时；离心收取沉淀，沉淀用无菌水和1.5mol/LNaCl(0.034mol/LNa3citrate)分别洗二次；离心后收取沉淀重悬于0.6ml无菌水中，加入25ul RNase，37℃温育10分钟；离心后上清液用等体积酚，酚氯仿，氯仿依次抽提，异丙醇常温沉淀，沉淀用70％乙醇洗后真空干燥，溶于50ul无菌水中备用。
二、PCR扩增用Techgene0.5型扩增仪扩增，扩增条件94℃5min；94℃1min 55℃1min72℃1min，35循环；72℃10min。合成特异性引物上游引物Plf5′ACAATTGAATTCATGCAAACAGGTGGATCGTTTTTTG3′；下游引物Plr5′ACGATCGGATCCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG3′在上游引物Plf中引入EcoRI酶切位点(下划线标示)，下游引物中引入BamHI酶切位点(下划线标示)。以地衣芽孢杆菌EGW039染色体DNA为模板克隆出去掉信号肽编码序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因eg1314，扩增出约650bp的DNA片段(图1)。
该基因不含N端28AA信号肽序列，eg1314长645bp，A 31％，C 20％，G23％，T 26％，G+C％43％。215 AA，MW 23.1kDa。同源性与3个枯草芽孢杆菌(Murphy，N.，et al.，1984；Borriss A.，1990；van Rensburg，P.，etal.，1997)，Bacillus alkalophilus(Hillen，W.，et al.，2001)，Bacillus circulans(Lee，D.-S.，et al.，2000)bgl同源性分别90％，80％，91％，41％和34％。
AA特征图2是该基因PCR产物序列测定结果，分析具有如下特征，尤其是同类蛋白质所具有的3个特征序列(Llobera J.，1991)(1)endoglucanase CenA序列AA89-126SSFFTYTGPTDGTPWDE(106)IDIE(110)FLGKDTTKVQFNYYTNG；
(2)T4Lysozyme序列AA104-128DIEFLGKDTTKVQFNYYTNGVG；(3)卵清Lysozyme序列AA130-150HEKIVNLGFDAANSYHTYAFD；(4)以Pichia methanolica分泌特征3个N-糖基化位点Asn-X-Ser/Thr，X为任意AA)AA32-34，39-41，65-67实施例2酵母重组表达载体的构建一.酵母重组表达载体pMETaA-1的构建不带有原信号肽编码序列的β-1，3-1，4-葡聚糖基因经EcoRI和BamHI双酶切后回收转化片段。此片段与EcoRI和BamHI双酶切的pMETaA载体(从Invitrogen购买)连接，可得到pMETaA-1(图3)，电泳显示约8.9kb大小(图4，图5)，与设计大小吻合。DNA片段用QIAgene公司的PCRPurification Kit和Gel Extraction Kit回收，酶切，连接和转化等实验程序共同参照《分子克隆实验指南》3版(中文译本，科学出版社，2002年)和所购买相关试剂的试验说明进行。
因pMETaA中在13bp和5830bp有PacI限制性酶切位点，而在eg1314上无此切点，所以该质粒经PacI酶切后可出现约2.2kb和约6.7kb两片段(图6)，eg1314和后续表达元件位于大片段上，而抗性标记因子位于小片段上，后续工作无须此标记而又无其他表达元件，因此在此丢弃此片段并不影响以后的工作；如从图5和图6可以看出，重组质粒长度符合理论值。序列测定结果(图5)表明，整个开放阅读框系列完全正确。
二酵母重组表达载体pMETaA-1的鉴定以重组质粒为模板，分别以原始基因eg1314特异性引物Plf和Plr，和包含插入片段在内的原始质粒的特异性引物Pfactorf和PAUGlr做PCR从DNA水平上验证外源基因插入是否正确。2种引物所得PCR产物序列(见图1和图5)分别长645bp和849bp。经过酵母分泌表达二者在AA序列上分析均有3个潜在N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意AA)，与出发菌株地衣芽孢杆菌EGW039原始基因eg1314序列以及其他特征一致。总的结论验证结论是eg1314插入位点、方向和序列正确(图5)。
(1)上游引物Plf5′ACAATTGAATTCATGCAAACAGGTGGATCGTTTTTTG3′；下游引物Plr5′ACGATCGGATCCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG3′→645bp(图1)；
(2)Pfactorf5′TACTATTGCCAGCATTGCTGC3′+PAUGlr5′GAAGAGAAAACATTAGTTGGC-3′→849bp(图5)；(3)总的结论验证结论是eg1314插入位点、方向和序列正确(图5，图6)；(4)PacI→pMETaA-1→2.2kb和6.7kb，与设计吻合(图6)。
实施例3含有β-1，4葡聚糖酶基因重组酵母的制备一.β-1，3-1，4葡聚糖酶基因重组酵母的转化和筛选不带有原信号肽编码序列的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因经EcoRI和BamHI双酶切后以正确的阅读框架克隆到表达载体pMETaA上的酵母α-factor信号肽编码序列之后，得到重组质粒pMETaA-1。pMETaA-1经PacI或者AscI酶切，得到线性化重组载体pMETaA-11，其核苷酸序列长6.5kb，含有插入片段，而氨卞抗性标记基因随着另外一个2.2kb的小片段被丢弃；酵母菌株嗜甲醇毕赤酵母PMAD16(从Invitrogen公司购买)于50ml的YPAD中30℃培养A600＝0.6-1.0，1500g离心收集菌体，用40ml LKD缓冲液30℃保温15min后，离心去上清，用50ml预冷STM缓冲液洗二次，离心后菌体用1ml预冷STM缓冲液悬浮，取100ul加入1-3ug经PacI线性化重组pMETaA-11，冰浴5min，用电转化仪电击，电击结束后立即加入1ml上YPAD，30℃培养1小时后，离心，沉淀悬浮于200ul 1XYNB中，取100ul平铺于固体MD平板上，30℃培养3-4天直到平板上出现转化子，用牙签挑取白色转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2天，在MD生长而在MM上生长不正常或不生长转化子为阳性克隆子。
重组酵母具有如下特性嗜甲醇毕赤酵母PMAD16为腺嘌呤缺陷型(Ade-)，缺乏ADE2基因而具有复制起始子；而重组载体pMETaA-11上带有ADE2基因而无酵母复制起始子。在不加腺嘌呤的选择培养基MM上缺少ADE2基因的非重组菌株呈红色或粉红色菌落，而pMETaA-11的ADE2基因整合到酵母染色体上的重组酵母呈白色菌落。另外，外源基因非同源重组到酵母染色体上后会破坏受体酵母的酒精氧化酶基因，使它不能利用甲醇作为碳源正常生长，这样，重组子(Mut-)在以甲醇作为唯一碳源的MM培养基上就不生长或缓慢生长，而在以葡萄糖为碳源的MD培养基上能正常生长，靠肉眼就能够判断白色单一的菌落是重组酵母；在MM培养基上就不生长或缓慢生长，而在以葡萄糖为碳源的MD培养基上能正常生长的就是阳性重组酵母。(图6)。
二.重组酵母的培养和诱导表达将重组酵母于25ml BMDY培养基中，于30℃剧烈振荡培养16-18h后至饱和状态(A600＝10-20)，离心收集菌体，加入2.5mlBMMY培养基30℃继续培养(每24h添加甲醇至终浓度为0.5％)。
实施例4β-1，3-1，4葡聚糖酶基因重组酵母分子水平的鉴定重组酵母基因组作为模板，以β-1，3-1，4葡聚糖酶基因特异性引物Plf5′ACAATTGAATTCATGCAAACAGGTGGATCGTTTTTTG3′；Plr5′ACGATCGGATCCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG3′做PCR，PCR产物的测序结果(图8)与原始供体的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因序列完全一样。
实施例5摇瓶水平上，β-1，3-1，4葡聚糖酶基因重组酵母功能性检测酶活性的测定用重组酵母诱导所产生粗酶液水解大麦葡聚糖(Sigma)，用DNS法测定反应液中的还原糖产物量。酶活力单位定义在最适反应条件下，以每1min生成1umol还原糖所需酶量为一个活力单位(IU)。
对300多个转化子在试管水平上做表达筛选，其中0-39号在64小时分泌的酶活性达到26U/ml(表2)，比摇瓶水平上的出发菌株的酶活性低16％，其他的更低；从转基因技术路线来讲本发明筛选转化子的基因转化是成功的(图7，图8)，所转入基因得到正常表达，表达产物也具有正常的功能性(表2)，因为空白对照是0。依据该表达系统的高耗氧和对生物量依赖性高的特性，预期预期通过上罐加大通气量后能够满足该工程菌株的表达特性的需求而大幅度提高表达水平，是有科学依据的；比较研究β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因重组酵母和其供体菌株产酶水平和所产酶性质发现转化子所产酶性质却发生一些有益的改变(表3)。以上转化子表达的水平较低和酶的性质发生变化的特性可能与从原核生物向真核生物转化存在较多未知的变量因素有关。
表2.工程菌株表达(试管水平)异源蛋白质β-1，3-1，4葡聚糖酶的功能性测定菌株eg1314重组子No.活性，U/ml +/--相同时间的供体菌株(64h)1)0-392683.9％2)4-3511.1 35.8％3)4-455.7 18.4％原始菌株 31100％*与试管水平相比，发酵罐规模时重组酵母表达EG1314增加5-10倍。
表3.重组子与出发菌株EG1314酶学性质差异出发菌株重组酵母最适温度，℃ 37 55最适宜pH 7 4.5分子量，kDa 23 25糖基化位点-- 3
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序列表<110>中国农业科学院饲料研究所<120>表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因工程酵母菌株<160>1<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>849<212>DNA<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)<220><400>1TATCTCTCGA GAAAGAGAGG CTGAAGCTGA ATTCATGCAA ACAGGTGGAT CGTTTTTTGA 60ACCTTTTAAC AGCTATAACT CCGGATTATG GCAAAAAGCA AATGGTTACT CCAATGGAGA 120TATGTTCAAC TGCACGTGGC GTGCAAATAA TGTATCCATG ACGTCATCAG GTGAAATGCT 180TTTGGCGCTG ACAAGCCCGT CTTATAACAA GTTTGACTGC GGGGAGAACC GCTCCGTTCA 240AACCTATGGC TATGGACTTT ATGAAGTCAG AATGAAACCG GCTAAAAACA CAGGGATCGT 300TTCATCGTTC TTCACTTATA CAGGTCCAAC GGATGGAACT CCTTGGGATG AGATTGATAT 360TGAATTTTTA GGAAAAGACA CAACAAAGGT TCAATTTAAT TATTATACAA ATGGCGCGGG 420AAACCATGAG AAGGTTGCGG ATCTCGGATT TGACGCGGCC AATGCCTATC ATACGTATGC 480GTTCGATTGG CAGCCAAACT CTATTAAATG GTATGTCGAT GGGCAATTAA AACATACTGC 540GACAAGCCAA ATCCCGACAA CACCGGGAAA GATCATGATG AACTTGTGGA ATGGGATAGG 600TGTCGATGAC TGGCTCGGTT CCTACAATGG TGTAAATCCG CTATACGCTC ATTATGACTG 660GGTGCGCTAT ACAAAAAAAT AAGGATCCAC GCGTCGTCGA CCCGCGGCGG CCGCCAGCTT 720ACTAGTAGGT AAGCCTATCC CTAACCCTCT CCTCGGTCTC GATTCTACGC GTACCGGTCA 780TCATCACCAT CACCATTGAT CTAGTATACA ATTCTAGGGC TGCCTGTTTG GATATTACTA 840TACCAGCGA
权利要求
1.一种含有不带有DNA原基因信号肽编码序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因的重组表达载体。
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，它是酵母重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其中不带有原信号肽编码序列的β-1，3-1，4-葡聚糖基因克隆到表达载体上的酵母-factor信号肽编码序列之后。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，是通过将经β-1，3-1，4-葡聚糖基因经EcoRI和BamHI双酶切后与EcoRI和BamHI双酶切的pMETaA载体连接，得到的酵母重组表达载体pMETaA-1。
5.含有权利要求1-4任一项所述的重组表达载体的重组子。
6.根据权利要求5所述的重组子，它是酵母。
7.根据权利要求6所述的重组子，它是毕赤酵母PMAD16。
8.生产β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法，将权利要求5-7任一项所述的的重组子进行诱导发酵，分泌获得β-1，3-1，4葡聚糖酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中发酵包括在BMDY培养基中，于30℃剧烈振荡培养16-18小时后至饱和状态(A600＝10-20)，离心收集菌体，加入BMMY培养基，30℃继续培养(每24小时添加甲醇至终浓度为0.5％)。
全文摘要
从芽孢杆菌菌株Bacillus licheniformis EGW039中克隆出β－1，3－1，4葡聚糖酶基因，将不带有DNA原基因信号肽编码序列的β－1，3－1，4葡聚糖酶基因插入到毕赤酵母表达载体pMETaA上，得到重组载体pMETaA－1，将pMETaA－1经酶切后得到更短的线性化重组载体pMETaA－11，用以转化毕赤酵母PMAD16得到了重组子，该基因在毕赤酵母中实现了分泌表达。将重组酵母进行诱导发酵，对重组酶进行初步酶学性质分析表明，最适反应pH约为5.5，最适反应温度约为55℃。
文档编号C12N9/46GK1485431SQ0315363
公开日2004年3月31日 申请日期2003年8月19日 优先权日2003年8月19日
发明者王建华, 滕达, 姚怡 申请人:中国农业科学院饲料研究所, 王建华