专利名称：生产左旋二酮的方法
技术领域：
本发明涉及通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文指NADPH)脱氢酶从2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮(下文指酮异佛尔酮(ketoisophorone))生产(6R)-2，2，6-三甲基-环己烯-1，4-二酮(下文指左旋二酮(levodione))的方法。左旋二酮是类胡萝卜素(例如玉米黄素)合成中重要的中间体。
背景技术：
从酮异佛尔酮生产左旋二酮的微生物方法是已知的，见例如美国专利4,156,100。
我们却意外发现用NADPH脱氢酶作为催化剂可从酮异佛尔酮形成左旋二酮。本发明方法中用作催化剂的NADPH脱氢酶一般都被称为老黄酶(old yellow enzyme，OYE)，根据国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology)所提供的酶命名法(Academic Press，1992)，它是酶E.C.1.6.99。
发明内容
本发明涉及从酮异佛尔酮生产左旋二酮的方法，其包含在存在NADH或NADPH的含水(aqueous)培养基中令酮异佛尔酮接触NADPH脱氢酶，并从所述反应混合物分离所得左旋二酮。
本文所用术语“NADPH脱氢酶”包括能在NADH或NADPH存在时催化从酮异佛尔酮到左旋二酮的酶促反应的蛋白，如根据国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会所提供的酶命名法分类为EC 1.6.99的老黄酶(OYE)。
本发明特别涉及从酮异佛尔酮生产左旋二酮的方法，其中催化所述反应的NADPH脱氢酶是被限定为酶E.C.1.6.99的OYE。
本发明方法中用作催化剂的OYE可从适合生产所述酶的任何适宜微生物获得或分离，所述微生物包括但不限于糖酵母菌属(Saccharomyces)，接合酵母属(Zygosaccharomyces)，念珠菌属(Candida)，葡糖杆菌属(Gluconobacter)，贝内克菌属(Beneckea)，或弧菌属(Vibrio)。上述微生物也包括它们按照国际原核生物命名代码(the Internatinal Code of Nomenclatureof Prokaryotes)所限定的具有相同物化性质的同物异名体(synonym)或基原异名体(basonym)。
表达NADPH脱氢酶的转化的微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)也可用作起始微生物。
本发明实施方案中，适合生产NADPH脱氢酶如OYE的微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)，10801 University Boulevard Manassas，VA20100-2209，U.S.A面向公众发放的酿酒酵母S288C(ATCC 204508)。可用众所周知的纯化方法制备所述酶(见Abramovitz，A.S.，& Massey.V.，J.Biol.Chem.251，5321-5326，1976)。本发明也可用所述微生物的功能等效物(Functional equivalent)，传代培养物(subculture)，突变体(mutant)和变种(variant)。
本发明实施方案中，商品化的OYE(如，NADPH-FMN Oxidoreductase(Sigma，U.S.A.))可用于将酮异佛尔酮催化裂解为左旋二酮。
本发明优选使用的OYE由分子量分别为45.0kDa和44.9kDa的OYE2和OYE3这两个亚基组成。已惊讶发现OYE2和OYE3不仅能用NADPH，而且能用NADH作为辅因子来催化本发明的反应。
因此，本发明另一方面提供了一种方法，其中用于催化酮异佛尔酮成为左旋二酮的反应的OYE由来自酿酒酵母S288C(ATCC 204508)的oye2或oye3基因编码。
本发明OYE在辅因子存在时根据下列公式催化酮异佛尔酮还原成为左旋二酮酮异佛尔酮+NADH(NADPH)左旋二酮+NAD(NADP)例如，标准酶反应如下进行向基础(basal)反应混合物(100μl的1MTris-HCl缓冲液，pH 8.0，100μl的80mM NADH，100μl的0.13M酮异佛尔酮，并用水补足到总体积1ml)中添加5μl所述酶溶液，并在20-40℃保温5-300分钟，优选在25℃保温30分钟。用1ml有机溶剂如乙酸乙酯，正己烷，甲苯，或正丁基乙酸酯抽提所述反应混合物，以使左旋二酮回收到(recover)所述有机溶剂层。用已知方法如气相色谱，高效液相色谱，薄层色谱或纸色谱等分析所述抽提物。
在气相色谱的情况下，可应用如下条件作为一个实施方案柱ULBON HR-20M(Shinwa，Japan)0.25mmΦ×30m柱温度160℃(恒定)注射器温度250℃载气(carrier gas)He(ca.1ml/min)所述反应可在pH值约4.5-约8.5并有NADH或NADPH存在的溶剂中进行，所述溶剂如Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液等。优选，所述pH为5.0-8.0。
本发明涉及借助OYE从酮异佛尔酮生产左旋二酮的方法，其中所述反应在pH值4.5-8.5及温度20-40℃进行。优选，所述反应在pH值5.0-8.0及温度25-35℃进行。
可根据所来源的微生物(例如酿酒酵母)的基因组序列信息，克隆编码本发明OYE2和OYE3蛋白的基因，并在适宜的宿主生物如大肠杆菌中过表达所述基因。可用众所周知的重组技术(见Molecular cloninga LaboratoryManual，2nd Edition/Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)制备所述表达NADPH脱氢酶的重组微生物，如大肠杆菌。
因此，本发明涉及从酮异佛尔酮生产左旋二酮的方法，其包括在存在NADH或NADPH的情况下，在含水培养基中将酮异佛尔酮接触表达NADPH脱氢酶的重组微生物或其无细胞提取物，并从所述反应混合物中分离所得左旋二酮。优选，所述重组微生物是大肠杆菌。
本发明另一方面中，由重组微生物表达的NADPH脱氢酶是被限定为酶EC 1.6.99的OYE。
用于在重组微生物中进行表达的OYE具体可以来自选自如下的微生物糖酵母菌属，接合酵母属，念珠菌属，葡糖杆菌属，贝内克菌属和弧菌属或其功能等效物，传代培养物，突变体和变种。所述OYE优选来自酿酒酵母，更优选酿酒酵母S288C(ATCC 204508)。最优选的是由来自酿酒酵母S288C(ATCC 204508)的oye2或oye3基因编码的OYE。
所述表达NADPH脱氢酶的重组微生物(例如大肠杆菌)可在营养培养基中培养，所述培养基包含糖类如葡萄糖或蔗糖，醇类如乙醇或甘油，脂肪酸如油酸，硬脂酸或其酯，或油类如菜籽油(rapeseed oil)或豆油(soybean oil)作为碳源；硫酸铵，硝酸钠，蛋白胨，氨基酸，玉米浆(corn steep liquor)，麦麸，酵母提取物等等作为氮源；硫酸镁，氯化钠，碳酸钙，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾等等作为无机盐来源；以及麦芽提取物，肉提取物等等作为其他营养来源。可在有氧条件下进行所述培养，一般是，在pH 3.0-9.0的培养基中于10-40℃培养1-7天。优选在pH 5.0-8.0的培养基中于25-35℃培养2-4天。
OYE可用作从酮异佛尔酮生产左旋二酮的催化剂。在一个实施方案中，用重组微生物从酮异佛尔酮生产左旋二酮的反应可在pH值约4.5-约8.5，在NADH或NADPH存在时，在溶剂(如Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液等等)中进行。在优选实施方案中，所述反应在pH 5.0-8.0进行。
进行所述反应的一个优选温度范围是20-40℃。当分别设定所述pH和温度在5.0-8.0及25-35℃时，所述反应通常会产生最好的结果。
另一实施方案中，用重组微生物生产左旋二酮的反应在pH值4.5-8.5和温度20-40℃进行。优选在pH值为5.0-8.0并且温度为25-35℃进行所述反应。
酮异佛尔酮在溶剂中的浓度可根据其他反应条件变化，但通常在1mM-2M，优选在10mM-100mM。
在所述反应中，OYE也可以是用适宜载体固定的状态。本领域通常已知的任何固定化酶方法痘可以使用。例如，所述酶可直接结合到膜，颗粒或类似的具有一或多个功能基团的树脂上，或者可以通过具有一或多个功能基团的桥连化合物(例如戊二醛)结合到树脂上。
反应后，可通过用有机溶剂抽提从所述反应混合物回收左旋二酮，所述有机溶剂与水不互溶并很容易使左旋二酮溶解，如乙酸乙酯，正己烷，甲苯或正丁基乙酸酯。左旋二酮的进一步纯化可以是，通过浓缩所述抽提物来直接结晶左旋二酮，或通过组合多种色谱，例如，薄层色谱，吸附色谱，离子交换层析，凝胶过滤色谱或高效液相色谱来进行纯化。
下述实施例进一步解释本发明。
实施例1从酿酒酵母基因组DNA克隆oye2和oye3基因用乙酸钾方法制备酿酒酵母S288C(ATCC 204508)基因组DNA。用所述制得的基因组DNA作为模板，用热循环仪(Perkin Elmer 2400，U.S.A.)通过两步(two-step)PCR方法获得oye2和oye3的基因片段。所述PCR混合物(0.02m1)含每种引物5pmol，每种dNTP 0.312mM，和2.5U的Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.LTD/Kyoto，Japan)。用100ng的酿酒酵母S288C(ATCC204508)的基因组DNA作为第一个PCR反应的模板。在所述反应后所述混合物用水稀释为1∶20，并用它作为第二个PCR反应的模板。对于第一个PCR，将98℃10秒，55℃30秒和72℃90秒的循环重复25次。对于第二个PCR，将98℃10秒，51℃30秒和72℃90秒的循环重复25次。
为克隆所述oye2基因，用如下引物进行第一个PCR反应OYE2-1(5′-CGGTCCAGATATAGAATAAATCATCATATTAAG-3′)(SEQ ID NO1)，和OYE2-2(5′-GAAATGGTGCTACAAAGTACGGTTAACAC-3′)(SEQ ID NO2)。此反应扩增了包含所述oye2基因的DNA片段(1250bp)。用下述引物进行第二个PCROYE2-3(5′-TTAGAAGAATTCATGCCATTTGTTA-3′)(SEQ IDNO3)，和OYE2-4(5′-AGATTTCTGCAGTTAATTTTTGTCC-3′)(SEQ ID NO4)。
此反应扩增了仅包含所述oye2基因ORF的DNA片段(1200bp)。用EcoRI和PstI处理该扩增的oye2基因，并与已用EcoRI和PstI消化的载体pKK223-3(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，England)连接来构建质粒pKK223-3/OYE2。用所述连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并选择数个克隆来进行序列分析。用“Thermo Sequenase II dye terminator cycle sequencing kit”(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，England)和自动序列分析仪(ABIprism 377)测定每个待选克隆的克隆化oye2基因的序列。用于所述序列分析的引物如下PKK223-3(+)(5′-GACATCATAACGGTTCTGGCA-3′)(SEQ ID NO5)PKK223-3(-)(5′-TTATCAGACCGCTTCTGCGTT-3′)(SEQ ID NO6)OYE2-5(5′-GGTATCTGGTCCGAAGAACA-3′)(SEQ ID NO7)YE2-6(5′-GACACGAGGTTCAAGTAGATG-3′)(SEQ ID NO8)
选择显示与酿酒酵母S288C(ATCC 204508)的已知oye2序列具有完全相同序列的克隆之一，用于进一步实验。为克隆所述oye3基因，用如下引物进行第一个PCR反应OYE3-1(5′-GTACGTACTTGATATATACAACAACTGTAG-3′)(SEQ ID NO9)和OYE3-2(5′-GCTGCCCTATATAAACAAAGATCGAGTC-3′)(SEQ ID NO10)。
此反应扩增了包含oye3基因的DNA片段(1250bp)。用下述引物进行第二个PCROYE3-5(5′-TTAGAACAATTGATGCCATTTGTAA-3′)(SEQ ID NO11)OYE3-4(5′-AGATTTCTGCAGTCAGTTCTTGTT-3′)(SEQ ID NO12)。
此反应扩增了仅包含oye3基因ORF的DNA片段(1200bp)。用MfeI和PstI处理该扩增的oye3基因，并与已用EcoRI和PstI消化的载体pKK223-3(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，England)连接来构建质粒pKK223-3/OYE3。用所述连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并选择数个克隆来进行序列分析。用“Thermo Sequenase II dye terminator cycle sequencing kit”(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，England)和自动序列分析仪(ABIprism 377)测定每个待选克隆的克隆化oye3基因的序列。用于所述序列分析的引物如下PKK223-3(+)(5′-GACATCATAACGGTTCTGGCA-3′)(SEQ ID NO13)PKK223-3(-)(5′-TTATCAGACCGCTTCTGCGTT-3′)(SEQ ID NO14)OYE3-6(5′-GACTGTGCATCTGACAGAGT-3′)(SEQ ID NO15)。
选择显示与酿酒酵母S288C(ATCC 204508)的已知oye3序列具有完全相同序列的克隆之一，用于进一步实验。
实施例2用含有酿酒酵母oye2或oye3基因的大肠杆菌菌株的无细胞提取物生产左旋二酮将在实施例1构建的并分别包含oye2和oye3的完整DNA序列的质粒pKK223-3/OYE2和pKK223-3/OYE3引入大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109[pKK223-3/OYE2]和JM109[pKK223-3/OYE3]。
制备菌株JM109[pKK223-3]作为对照。将这些菌株中的每株接种到M9基本培养基(2×500ml，在2L-坂口瓶(Sakaguchi flask)中)中并在37℃培养，所述培养基含0.05mg/ml的氨苄青霉素和2％(w/v)的水解酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratories，U.S.A.)。当610nm的光密度达到0.4，将IPTG(异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside))加入所述培养基使其浓度为0.01mM，继续培养另外的8-10小时。然后通过离心收集细菌细胞。从1升所述液体培养基获得约10g湿细胞。取细胞组分(fraction)(0.7g)在1.4ml含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇(DTT)，200mM KCI和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的缓冲液中重悬，所述细胞用超声震荡器破裂15分钟。离心后用所得上清作为无细胞提取物来如下生产左旋二酮。在1ml由25mM Tris-HCl(pH 8.0)，66mMNADH或55mM NADPH，和13mM酮异佛尔酮组成的反应混合物中使用每份从JM109[pKK223-3/OYE2]，JM109[pKK223-3/OYE3]或JM109[pKK223-3]细胞获得的含2mg蛋白的无细胞提取物。在25℃进行所述反应30分钟。用1ml乙酸乙酯抽提所述反应混合物来将左旋二酮回收到乙酸乙酯层。用气相色谱[柱ULBON HR-20M(Shinwa，Japan)0.25mmΦ×30m，柱温度160℃(恒定(constant))，注射器温度250℃，载气He(ca.1ml/min)]分析所述抽提物。所述结果见表1。
表1
在另一实验中结合使用JM109[pKK223-3/OYE2]的无细胞提取物和NADH-再循环系统，所述左旋二酮的产量达到95％。这种情况下，在由250mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.31mM NAD+，220mM D-葡萄糖，12.5单位/ml葡萄糖脱氢酶和65mM酮异佛尔酮组成的25ml反应混合物中使用含30mg蛋白的JM109[pKK223-3/OYE2]的无细胞提取物。所述反应在室温进行90分钟。用7％氨水控制所述反应混合物的pH高于7.0。结果产出了9.5g/l的左旋二酮(所用的酮异佛尔酮的95％被转化)。用手性(chiral)毛细柱BGB-176(BGB AnalytikAG，Switzerland)通过气相色谱分析所述产物的光纯度，结果为94.6％(对映异构体过量(enantiomeric excess)；e.e.)。
实施例3用具有酿酒酵母oye基因的大肠杆菌菌株细胞生产左旋二酮将实施例2所得菌株JM109[pKK223-3/OYE2]和JM109[pKK223-3]分别接种到含0.05mg/ml氨苄青霉素和2％(w/v)的水解酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratories，U.S.A.)的M9基本培养基(5ml，在试管中)中并在37℃培养。当610nm的光密度达到0.4，将IPTG加入所述培养基使其浓度为0.01mM并继续培养另外8-10小时。然后通过离心收集所述细菌细胞，并在2ml 100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中重悬。将此悬液分为两份(每份1ml)，在有/无0.37mM(f.c.)NAD+，15单位/ml(f.c.)葡萄糖脱氢酶的情况下，通过加入33mM(终浓度，下文简称f.c.)酮异佛尔酮和280mM(f.c.)D-葡萄糖来启动所述反应。使所述反应在30℃过夜进行。通过乙酸乙酯抽提所述反应混合物来将左旋二酮回收到乙酸乙酯层。如实施例1所述用气相色谱来分析所述抽提物。结果见表2。
表2
序列表<110>罗氏维生素公司(Roche Vitamins AG)<120>生产左旋二酮的方法<130>21147<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-1<400>1cggtccagat atagaataaa tcatcatatt aag 33<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-2<400>2gaaatggtgc tacaaagtac ggttaacac 29<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-3<400>3ttagaagaat tcatgccatt tgtta 25<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-4<400>4agatttctgc agttaatttt tgtcc 25<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PKK223-3(+)<400>5gacatcataa cggttctggc a 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PKK223-3(-)<400>6ttatcagacc gcttctgcgt t 21<210>7<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-5<400>7ggtatctggt ccgaagaaca20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-6<400>8gacacgaggt tcaactagat g 21<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-1<400>9gtacgtactt gatatataca acaactgtag 30<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-2<400>10gctgccctat ataaacaaag atcgagtc28
<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-5<400>11ttagaacaat tgatgccatt tgtaa 25<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-4<400>12agatttctgc agtcagttct tgtt 24<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PKK223-3(+)<400>13gacatcataa cggttctggc a 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PKK223-3(-)<400>14ttatcagacc gcttctgcgt t 21<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-6<400>15gactgtgcat ctgacagagt20
权利要求
1.从酮异佛尔酮生产左旋二酮的方法，其包括在存在NADH或NADPH的情况下，使酮异佛尔酮在含水培养基中与NADPH脱氢酶接触，并从所述反应混合物分离所得到的左旋二酮。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NADPH脱氢酶是被限定为酶EC 1.6.99的老黄酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶可从适宜生产所述NADPH脱氢酶的微生物获得。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述微生物选自糖酵母菌属，接合酵母属，念珠菌属，葡糖杆菌属，贝内克菌属，或弧菌属。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述微生物是酿酒酵母。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述微生物是酿酒酵母S288C(ATCC 204508)，其功能等效物，传代培养物，突变体或变种。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述NADPH脱氢酶是由来自酿酒酵母S288C(ATCC 204508)的oye2或oye3基因所编码的老黄酶。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其中所述反应在pH值4.5-8.5和温度20-40℃进行。
9.根据权利要求1-7任一所述的方法，其中所述反应在pH值5.0-8.0和温度25-35℃进行。
10.从酮异佛尔酮生产左旋二酮的方法，其包括在NADH或NADPH存在的情况下，使酮异佛尔酮在含水培养基中与表达NADPH脱氢酶的转化的微生物或其无细胞提取物接触，并从所述反应混合物分离所得到的左旋二酮。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组微生物是大肠杆菌。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述NADPH脱氢酶是被限定为酶EC 1.6.99的老黄酶。
13.根据权利要求10所述的方法，其中由所述转化的微生物表达的酶来自选自如下的微生物糖酵母菌属，接合酵母属，念珠菌属，葡糖杆菌属，贝内克菌属，或弧菌属。
14.根据权利要求10-13任一所述的方法，其中由所述转化的微生物表达的酶来自酿酒酵母，优选酿酒酵母S288C(ATCC 204508)。
15.根据权利要求10-14任一所述的方法，其中由所述转化的微生物表达的NADPH脱氢酶为由来自酿酒酵母S288C(ATCC 204508)的oye2或oye3基因所编码的老黄酶。
16.根据权利要求10-15任一所述的方法，其中所述反应在pH值4.5-8.5和温度20-40℃进行。
17.根据权利要求10-15任一所述的方法，其中所述反应在pH值5.0-8.0和温度25-35℃进行。
18.基本如本文上述的本发明，具体参照所述实施例。
全文摘要
本发明提供了烯酮还原酶，特别是来自酵母的烯酮还原酶，以及一种从酮异戊酯制备左旋二酮的方法，所述烯酮还原酶的特征在于，分子量为61,300±5,000Da；以NADPH和NADH为辅因子；在pH7.4时的最适温度为55－60℃；最适pH为4.5－8.5，并且对α，β－不饱和酮有底物特异性。
文档编号C12N15/09GK1639347SQ03804423
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月15日 优先权日2002年2月22日
发明者清水昌, 和田大 申请人:Dsm Ip资产公司