用于产生不饱和脂肪酸的方法

专利名称：用于产生不饱和脂肪酸的方法
描述本发明涉及通过重组表达鳞翅目(Lepidoptera)昆虫中的去饱和酶而产生不饱和脂肪酸的方法，优选地产生共轭多不饱和脂肪酸例如共轭亚油酸(CLA)。表达优选地在选自植物生物体、酵母、真菌和藻类的生物体中进行。此外，本发明也涉及可用于重组表达鳞翅目昆虫的去饱和酶的重组表达盒以及由其转化的转基因生物体。
脂肪酸和甘油三酯被广泛地应用在食品工业、动物营养、化妆品和制药领域。尤其有价值和试图获得的不饱和脂肪酸是那些共轭不饱和脂肪酸。共轭多不饱和脂肪酸相对其他多不饱和脂肪酸较为稀少。共轭不饱和脂肪酸的例子有共轭亚油酸(CLA)、α-杷荏酸(18:4十八碳四烯酸)、桐油酸(18:3十八碳三烯酸)、共轭亚麻酸、dimorphecolic acid和calendulicacid(见

图1)图1共轭多不饱和脂肪酸 calendulic acid α-杷荏酸 α-桐油酸 dimorphecolic acid
CLA是所有亚油酸位置和结构异构体的总称，其明显特征为从碳原子8、9、10或11开始的共轭双键体系。一些例子如图2所示。
这些位置异构体的每一种都存在几何异构体，即顺-顺、反-顺、顺-反、反-反四种形式。
图2共轭亚油酸的四种异构体 10t.12c-CLA 11c.13t-CLACLA异构体(9Z，11E)-CLA和(10E，12Z)-CLA已知为具有生物学活性。CLA主要在动物源性食物中存在。发现高浓度的CLA特别存在于肉类和反刍动物的奶产品中大约3-4mg CLA/g牛羊脂肪(Chin等人(1992)J Food Comp Anal 5185-197)和大约3-7mg CLA/g奶产品脂肪中(Dhiman等人(1999)J Dairy Sci 822146-56)，其中(9Z，11E)-CLA的浓度几乎高达80％，在各种情况下均是主要异构体。高等植物中只含微量CLA，且上述两种具生物学活性的CLA异构体至今尚未在植物中发现。
CLA的一系列积极效应已经被发现。因此，施用CLA可以减少人和动物体内脂肪，增加在动物中饲料转化为体重的速度(Park等人(1997)Lipids 32853-858；Park等人(1999)Lipids 34235-241；WO 94/16690；WO96/06605；WO 97/46230；WO 97/46118)。施用CLA还对诸如过敏症(WO 97/32008)或者癌症(Banni等人(1999)Carcino genesis 201019-1024，Thompson等人(1997)Cancer Res 575067-5072)有积极作用。CLA的抗动脉硬化效用也被确认(Wilson等人(2000)Nutr Res 201795-1805)。对异构体及异构体混合物进行了研究。
CLA可以通过亚油酸的碱异构化合成。高亚油酸含量的植物油主要用于工业生产，例如向日葵油、红花油。在碱性条件下加热到180℃以上催化下面两个反应(1)甘油三酯骨架的脂肪酸脂键水解和游离脂肪酸释放，(2)具有两个或多个双键的非共轭不饱和脂肪酸共轭化。
市售的CLA油是含有多种CLA异构体和其它饱和、不饱和脂肪酸的混合物。由于这些无生物学活性和非天然异构体的存在，需要繁重的生物学活性异构体(9Z，11E)CLA和(10E，12Z)CLA纯化工艺，或者需要证实异构体混合物对人和动物的健康无害。迄今为止，还不能够以较为经济的方法通过碱异构化获得单一CLA异构体。分级结晶使分别浓缩异构体(9Z，11E)CLA和(10E，12Z)CLA成为可能。但是，上述提到的方法还不足以制备高质量的单一异构体。在上述提及的方法中，反应产物通常被转化为甲基或乙基酯，因此天然形式的CLA即游离脂肪酸或三酰甘油不可能获得。
这些化学转化的劣势可以通过生物催化转化亚油酸生成CLA的方法加以克服。例如反刍动物瘤胃中的多种微生物都可以在生物氢化途径中将亚油酸转化为CLA。这特别是通过CLA异构酶的酶促活性实现的。这一酶促活性在溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)(Kepler和Tovee(1966)J Biol Chem 2411350)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(Deng等人，关于CLA的第一次国际讨论会，2001，Alesund，Norway)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)(WO 99/32604；WO 01/00846)中有所描述。迄今，CLA异构酶被描述为使用游离脂肪酸作底物。来自罗伊氏乳杆菌和疮疱丙酸杆菌的CLA异构酶编码基因已经被克隆，而且来自丙酸杆菌属的异构酶在异源微生物中得到功能性表达。尽管利用微生物将亚油酸转化为CLA相比碱异构化法具有质的优势，但却由于发酵费用和只能产生游离脂肪酸而非甘油三酯而处于经济劣势。然而，游离脂肪酸由于气味不佳而实质上并不适合用于食品和饲料行业。进一步转化游离脂肪酸—例如用脂肪酶催化产生甘油或甘油酯-虽然可能，但也十分复杂。
基于细菌CLA异构酶的方法也常常可以应用到其它生物。迄今已有CLA异构酶转化游离亚油酸成为CLA的报道(Cepler和Tove(1967)JBiochem Chem 2425686-5692)。在诸如植物的高等生物中亚油酸主要以酯化的形式存在。脂类如三酰甘油酯构成游离脂肪酸的存贮形式，而硫酯例如脂酰辅酶A构成脂肪酸的活性形式。
具有反式双键的脂肪酸极其稀少。一些植物种子油含有在反式位置具有双键的脂肪酸。因此，E5-脂肪酸在很多唐松草属(Thalictrum)植物种子油中被发现(Rankoff等人(1971)J Amer Oil Chem Soc 48700-701)。而且E5去饱和酶活性在普通耧斗菜(Aquilegia vulgaris)中也有所描述(Longman等人(2000)Biochem Soc Trans 28641-643)。然而，没有植物报道含有反式-异油酸(E11-十八碳烯酸)或E10-十八碳烯酸。
已经知道在植物中脂肪酸的去饱和化可以主要基于两个机制发生(1)在质体中，脂肪酸ACP酯被可溶性去饱和酶去饱和，主要发生在第9位，以及(2)在内质网、膜脂，特别是磷脂酰胆碱，优选地进一步在第6、12、15位被膜结合去饱和酶去饱和。
在一些植物中，共轭脂肪酸的产生是通过共轭酶(conjugase)的活性(Crombie等人(1984)J Chem Soc Chem Commun 15953-955；Crombie等人(1985)J Chem Soc Perkin Trans 12425-2434；Fritsche等人(1999)FEBSLetters 462249-253；Cahoon等人(2001)J Biol Chem 2762637-2643；Qiu等人(2001)Plant Physiol 125847-855)。共轭脂肪酸例如calendulic acid、桐油酸或石榴酸的生物合成为先通过D12-去饱和酶催化去饱和油酸以产生亚油酸，再由特异的形成共轭三烯的去饱和酶(共轭酶)进一步催化去饱，并进行Z9-或Z12-双键重排形成共轭三烯脂肪酸。除描述了calendulic acid的产生(Qui等人(2001)Plant Physiol 125847-855)外，对通过共轭酶的酶活性产生共轭亚油酸也有描述。然而，所述的第二活性的劣势在于酶活性导致不想要的共轭亚油酸8，10-异构体的产生。
鳞翅目昆虫的信息素去饱和酶表现出广泛的底物特异性和去饱和机制(Roelofs和Wolf(1988)J Chem Ecol 142019-2031；Roelofs(1995)ProcNat Acad Sci USA 9244-49；Tillman等人(1999)Insect Biochem29481-514)。这些酶活性诱导产生不一般的不饱和脂肪酸辅酶A衍生物，具有不同链长、不同双键位置以及不同构型。它们作为信息素生物合成的起始物质。Liu等人描述了来自蛾子(苹果浅褐卷蛾(light brown applemoth))信息素腺的E11-去饱和酶，它可能在信息素的生物合成过程中起到重要作用(Liu WT等人(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99(2)620-624)。
Knipple等人(Genetics 2002年12月；162(4)1737-52)对从蛾和苍蝇的信息素腺分离出的多种不同的整合性膜去饱和酶进行比较。描述了棉花红铃虫(Pectinophora gossypiella)的脂酰辅酶A去饱和酶片段(PgosVASQ)。其相应序列存放在GeneBank Acc.No.AF482921。对该去饱和酶的全长序列和特异活性都没有进行描述。它仅仅是在与其它去饱和酶的同源性比较的基础上命名的。
本发明的一个目的是提供下述新方法，所述方法产生富含不饱和脂肪酸，优选地产生富含如CLA的共轭不饱和酸的甘油三酯。我们发现这个目的通过本发明已经达到。
本发明的第一主题涉及通过重组表达至少一种来自鳞翅目昆虫的脂肪酸去饱和酶，来生产包含不饱和脂肪酸的甘油三酯的方法。
优选地，这种包含不饱和脂肪酸的甘油三酯的产生方法包括在选自植物生物体、酵母、真菌和藻类的生物体内重组表达至少一种来自鳞翅目昆虫的脂肪酸去饱和酶。
在一个优选的实施方案中，使用了在脂肪酸、脂肪酸辅酶A酯或其他脂肪酸衍生物中的C8，C9，C10，C11或C12位能产生双键的脂肪酸去饱和酶。尤其优选的是那些能够在具有16或18个碳原子链长的脂肪酸、脂肪酸辅酶A酯或其它脂肪酸衍生物中特异产生顺式或反式双键的脂肪酸去饱和酶。更为优选的是那些与SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或22所描述的一种脂肪酸去饱和酶具有至少65％同源性的脂肪酸去饱和酶。
在一个优选的实施方案中，这个方法被用来产生作为不饱和脂肪酸的共轭亚油酸。
而且，本发明描述了根据本发明方法制备的甘油三酯，以及它们在制备食品、饲料、化妆品或精细化学品的用途。
在大量的生物体中，包括在植物中，这些脂肪酸主要以辅酶A酯的形式在胞质中存在。在酵母和动物中，脂酰辅酶A脂肪酸的去饱和是不饱和脂肪酸的主要合成途径，而这种机制在植物中却很少见(Cahoon EB等人(2000)Plant Physiol.124243-251)。令人惊讶的是，重组表达来自鳞翅目的去饱和酶能够导致饱和、不饱和脂肪酸辅酶A酯的去饱和化。最后的结果是两种活性CLA异构体都被产生而且被整合到贮藏脂中。
根据本发明该方法的优势特别在于直接产生含CLA的甘油三酯的可能性，产生始于生物体，优选地为植物、酵母、真菌或者藻类，所述生物体具有高的含油量，譬如油菜籽或向日葵。使用来自鳞翅目昆虫的真核酶使得可以进行良好的表达，同时不产生通常与原核蛋白相关的毒性作用。
“脂肪酸去饱和酶”指能够在脂肪酸或它们的衍生物例如优选地在脂肪辅酶A酯中引入双键的酶。如果合适，辅因子如NADPH，NADH或氧也是达到这个目的额外需要的。在本文中优选那些能够利用脂酰辅酶A脂肪酸作为底物的去饱和酶，其中所述脂酰辅酶A脂肪酸具有14、16、18或20个碳原子链长，优选18碳原子。
优选地，脂肪酸去饱和酶这个术语包含那些能够在脂肪酸或其衍生物例如优选地为脂肪酸辅酶A酯的C8、C9、C10、C11或C12位置上产生双键的酶。也优选那些能够产生特异结构异构体的去饱和酶，即具有顺式或反式双键特异性。特别地在本文中理解为所讨论的异构体的形成量至少为60％，优选至少80％，非常尤其优选至少90％，最优选至少95％。非常特别优选的去饱和酶是那些能够在脂肪酸或其衍生物如优选脂肪酸辅酶A酯产生双键的酶，其中所述双键为像在CLA异构体所发现的那样。
来自鳞翅类昆虫的脂肪酸去饱和酶的“优选的基本特性”指具有至少一种下列特性的酶i)在C8、C9、C10、C11或C12位置顺式双键或在C8、C9、C10、C11或C12位置反式双键的特异产生。
ii)具有16和/或18个碳原子链长的脂肪酸、脂肪酸辅酶A酯和其它脂肪酸衍生物的底物特异性。在本文中，底物特异性指脂肪酸去饱和酶转化所述链长的底物要比其它不同链长的底物快的特性。在本文中，与不优选的底物相比，优选底物的转化率至少能提高50％，优选地至少提高100％，非常特别优选地至少提高200％，最优选地至少提高500％。
优选的是在各种情况下至少具有特性i)和特性ii)其中一种。
脂肪酸去饱和酶这个术语包括能引入孤立双键的酶，以及从底物的一个双键开始能产生共轭双键体系的共轭酶。在本文中，优选地是移动了的第一个双键。
优选的共轭酶的例子是a)将Z11双键转化成两个E10和Z12双键的共轭酶(“Z11-(E10，Z12)-共轭酶”)。
b)将E11双键转化成两个E10和Z12双键的共轭酶(“E11-(E10，Z12)-共轭酶”)c)将Z10双键转化成两个E10和Z12双键的共轭酶(“Z10-(E10，Z12)-共轭酶”)。
总之，这些酶可称为(E10，Z12)-共轭酶。这些酶也可称为E10-去饱和酶。非常特别优选的E10-去饱和酶的基本特性是在其中具有18C原子脂肪酸链长的脂肪酸或脂肪酸辅酶A酯的C-10位引入反式双键。
此外，优选的共轭酶是d)将Z10双键转化成两个Z9和E11双键的共轭酶(“Z10-(Z9，E11)-共轭酶”)，e)将E10双键转化成两个Z9和E11双键的共轭酶(“E10-(Z9，E11)-共轭酶”)，
f)将Z11双键转化成两个Z9和E11双键的共轭酶(“Z11-(Z9，E11)-共轭酶”)。
总之，这些酶可称为(Z9，E11)-共轭酶。这些酶也称为E11-去饱和酶。非常特别优选的E11-去饱和酶的基本特性是在其中具有18C原子脂肪酸链长的脂肪酸或脂肪酸辅酶A酯的C11位引入反式双键。
最优选的是这样的E10-、E11-、Z10-和Z11-去饱和酶，及Z11-(E10，Z12)-共轭酶、E11-(E10，Z12)-共轭酶、Z10-(Z9，E11)-共轭酶和E10-(Z9，E11)-共轭酶，这些共轭酶对具有18C原子脂肪酸链长的脂肪酸或脂肪酸衍生物例如脂肪酸辅酶A酯具有底物特性。
脂肪酸去饱和酶优选地源于鳞翅目科，这些科选自邻菜蛾科(Acrolepiidae)、虎蛾科(Agaristidae)、灯蛾科(Arctiidae)、蚕蛾科(Bombycidae)、果蛀蛾科(Carposinidae)、细卷蛾科(Cochylidae)、木蠹蛾科(Cossidae)、毛顶蛾科(Eriocraniidae)、麦蛾科(Gelechiidae)、尺蛾科(Geometridae)、细蛾科(Gracillariidae)、蝙蝠蛾科(Hepialidae)、透翅蝶科(Ithomiidae)、枯叶蛾科(Lasiocampidae)、灰蝶科(Lycaenidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、潜蛾科(Lyonetiidae)、微蛾科(Nepticulidae)、夜蛾科(Noctuidae)、天社蛾科(Notodontidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、织叶蛾科(Oecophoridae)、凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、毛蠓科(Psychidae)、羽蛾科(Pterophoridae)、螟蛾科(Pyralidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、透翅蛾科(Sesiidae)、天蛾科(Sphingidae)、卷蛾科(Tortricidae)、巢蛾科(Yponomeutidae)和斑蛾科(Zygaenidae)。尤其优选的是选自卷蛾科、螟蛾科、凤蝶科、夜蛾科和尺蛾科的鳞翅目科的脂肪酸去饱和酶。
E11-去饱和酶或编码它们的核酸序列，优选地从甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata)、Diaphania nitidalis、茄白翅野螟(Leucinodesorbonalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、Sesamia grisescens、甘薯麦蛾(Brachmia macroscopa)、Paraargyresthia japonica、Mnesictenaflavidalis、Telorta edentata、Epiplema moza、Argyresthia chamaecypariae、暗水螟属的某些种(Bradina sp.)、Dichrocrocis punctiferalis、高梁穗隐斑螟(Cryptoblabes gnidiella)、Palpita unionalis、Sceliodes cordalis、Anisodes sp.、茶细蛾(Caloptilia theivora)、Phyllonorycter ringoniella、Deilephila elpenor、烟草夜蛾(Manduca Sexta)、Scirpophagaexcerpalis、甘蔗白螟(Scirpophaga nivella)、三线茶蚕蛾(Andracabipunctata)、棉花红铃虫或小蔗螟(Diatraea saccharalis)这些物种的生物体中分离出来。E11-去饱和酶或编码它们的核酸序列，尤其优选地为从上述昆虫的信息素腺中分离出来。可以提到的例子是来自苹果浅褐卷蛾(Epiphyas postvittana)(SEQ ID NO2)、欧洲玉米螟(SEQ ID NO4)和Ostrinia furnicalis(SEQ ID NO6)的信息素腺的E11-去饱和酶。特别优选的是如SEQ ID NO22所示的来自棉花红铃虫的E11-去饱和酶。来自上面提到的生物体的E11-去饱和酶以植物脂酰辅酶A脂肪酸衍生物作为底物。
使用这些去饱和酶或它们的变体对使产生E11双键成为可能是特别有利的。如果去饱和酶已经不能做到优选地转化C16和/或C18脂酰辅酶A底物(例如，如SEQ ID NO22所示的来自棉花红铃虫的去饱和酶)，则优选地优化所述去饱和酶，目的在于使其能优选地转化C16和/或C18脂酰辅酶A底物。本发明的另一主题因此涉及具有E11-去饱和酶活性的多肽，所述多肽优选地转化C16和/或C18脂酰辅酶A脂肪酸，而且包含选自以下的至少一个序列a)如SEQ ID NO2、4、6和22所示的氨基酸序列，和b)与SEQ ID NO2、4、6或22所示的其中一种氨基酸序列具有至少65％同源性的氨基酸序列，和c)包含如SEQ ID NO2、4、6或22所示序列中的至少20个连续氨基酸残基片段的氨基酸序列。
所述多肽特别优选地以SEQ ID NO22所示的氨基酸序列描述。本发明的另一主题涉及编码上述去饱和酶的核酸分子。序列特别优选地为如SEQ ID NO21中所示。
E10-去饱和酶或编码它们的核酸序列优选地从Dichrocrocischlorophanta、桃蛀螟(Dichrocrocis punctiferalis)、桑树桑野蚕(Bombyxmandarina)、家蚕(Bombyx mori)、Coloradia velda、Hemileucaeglanterina、Hemileuca electra electra、Hemileuca electra mojavensis、Hemileuca nuttalli或棉卷叶野螟(Notarcha derogata)等物种生物体中分离。E10-去饱和酶或编码它们的核酸序列特别优选地从上述昆虫的信息素腺中分离。
E9-去饱和酶或编码它们的核酸序列优选地从Epiplema plaqifera、Phyllonorycter coryli、Phyllonorycter sylvella、Gelechiinae、Bryotrophasp.、Bryotropha terrella、Gelechia betulae、Adoxophyes orana、Exartemaappendiceum、Zeiraphera canadensis、Loxostege neobliteralis、欧洲玉米螟、Dioryctria clarioralis、Dioryctria merkeli、Dioryctria resinosella、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、Spodoptera triturata oder Polia grandis等物种生物体中分离。E9-去饱和酶或编码它们的核酸序列特别优选地从上述昆虫的信息素腺中分离。
E8-去饱和酶或编码它们的核酸序列优选地从Phyllonoryctersaportella、Phyllonorycter sp.或Dichrocrocis punctiferalis等物种生物体中分离。E8-去饱和酶或编码它们的核酸序列特别优选地从上述昆虫的信息素腺中分离。
可有利地用来产生Z11-18碳烯酸的Z11-去饱和酶已经在家蚕(Ando等(1988)Agric Biol Chem.52473-478)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)和玉米夜蛾(Helicoverpa zea)(Knipple等(1998)Proc Nat Acad Sci USA9515287-15292)有发现。更多的Z11-去饱和酶或编码它们的核酸序列可优选地从烟草夜蛾、西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella)、Eariasinsulana、Earias vittella、小菜蛾(Plutella xylostella)、家蚕或Diaphanianitidalis中分离。可以提到的例子是来自玉米夜蛾(SEQ ID NO8)、粉纹夜蛾(SEQ ID NO10)和红带卷蛾(Argyrotaenia velutinana)(SEQ IDNO12)的去饱和酶。Z11-去饱和酶或编码它们的核酸序列优选地从上述昆虫的信息素腺中分离。
Z10-去饱和酶或编码它们的核酸序列优选地从Ctenopseustisfilicis、Pseudexentera spoliana、Hemileuca eglanterina、Hemileucaelectra electra、Hemileuca electra mojavensis、Hemileuca nuttalli、Eurhodope advenella、Mamestra configurata或Dichrocrocis punctiferalis等物种生物体中分离，特别优选地从述昆虫的信息素腺中分离。可以提到的例子是来自Planototrix octo(SEQ ID NO14)的去饱和酶。
(E10，Z12)-共轭酶或编码它们的核酸序列优选地从家蚕、Phyllonorycter crataegella、Amorbia cuneana、Notocelia incarnatana、Notocelia uddmanniana、桑树桑野蚕、Coloradia velda、Hemileucaeglanterina、Hemileuca electra electra、Hemileuca electra mojavensis、Hemileuca nuttalli、棉卷叶野螟、桑树桑蟥(Rondotia menciana)、Amphion floridensis、Hyles gallii、Hyloicus pinastri、烟草天蛾、Sphinxdrupiferarum、Earias insulana、Nola confusalis或Notarcha basipunctalis中分离。(E10，Z12)-共轭酶或编码它们的核酸序列特别优选地从上述昆虫的信息素腺中分离。
(Z9，E11)-共轭酶或编码它们的核酸序列优选地从小蔗螟、Xyrosarislichneuta、Dioryctria abietella、Stenoma cecropia、Phalonidia manniana、Pselnophorus vilis、Dioryctria abietella；微红梢斑螟(Dioryctria rubella)、Myelopsis tetricella、Jodis lactearia、真小姬尺娥(Scopula personata)、Spodoptera descoinsi、南部灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)、Spodopteralatifascia、灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)或斜纹夜蛾(Spodoptera litura)中分离。(Z9，E11)-共轭酶或编码它们的核酸序列特别优选地从上述昆虫的信息素腺中分离。
Z11-去饱和酶和Z11-共轭酶都能接受以植物脂酰辅酶A脂肪酸衍生物作为底物，这两类来自鳞翅目类的去饱和酶在植物中的联合表达能导致(10E，12Z)-CLA的产生，并整合到贮藏脂中。
有几种可能的共轭酶或去饱和酶相互之间的组合或与植物酶的组合，以产生目的CLA异构体，特别是(9Z，11E)-CLA和(10E，12Z)-CLA。下面以举例而不是限制的方式理解这些方法1)从硬脂酸开始通过C11-位置的反式-去饱和，例如通过E11-去饱和酶，就可以产生反式-异油酸(图3)。
图3从硬脂酸开始产生(9Z，11E)-CLA和(10E，12Z)-CLA的生物合成途径从棕榈酸开始，通过C9位置的反式-去饱和，例如用E9-去饱和酶，可以产生棕榈油酸(9E十六碳烯酸)，接着通过延伸酶的酶促活性，延长棕榈油酸得到反式-异油酸(图4)。
图4从棕榈酸开始产生(9Z，11E)-CLA和(10E，12Z)-CLA的生物合成途径反式-异油酸接下来可以通过D9-去饱和酶转化得到(9Z，11E)-CLA异构体。已经证明哺乳动物和人类通过内源性D9-去饱和酶的酶促活性，将反式-异油酸转化为CLA(WO 99/20123；Santora JE等(2000)J Nutr130208-215；Adlof RO等(2000)Lipids 35131-135)。同样，也已经证明了表达E11-去饱和酶的昆虫细胞能将得到的E11-脂肪酸起始物转化成Z9，E11-脂肪酸(Liu WT等人(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99(2)620-624。同样，植物D9-去饱和酶能催化反式-异油酸转化为(Z9，E11)-CLA异构体。在一个特别优选的实施方案中，额外的Z9-去饱和酶表达能进一步增加这种转化。本文中优选的是具有胞质活性的Z9-去饱和酶，例如酵母Z9-去饱和酶。因而，通过表达反式-去饱和酶，在植物中产生(Z9，E11)-CLA异构体是可能的。作为植物Z9-去饱和酶作用的结果，形成了特别有利的(9Z，11E)-CLA异构体。
2)从硬脂酸开始，相应的E10-十八碳烯酸可以最初通过C10位置上反式-去饱和化产生(图3)。作为可选择方案，E8-十六碳烯酸可以从棕榈酸开始经过C8位置的反式-去饱和而产生。E8-十六碳烯酸接着通过碳链延伸酶的酶促活性延长得到E10-十八碳烯酸(图4)。该脂肪酸将被D12-去饱和酶转化得到(E10，Z12)-CLA异构体。该反应也可以被植物D12-去饱和酶催化。在一个特别优选的实施方案中，额外的Z12-去饱和酶的表达能进一步的增加此转化率。
3)来自鳞翅目类的相应(E10，Z12)-共轭酶也能用到。这些共轭酶转化例如Z11-十八碳烯酸(顺式-异油酸)、E11-十八碳烯酸(反式-异油酸)或Z10-十八碳烯酸产生(E10，Z12)-CLA。为此目的，首先将硬脂酸转化为Z11-十八碳烯酸，其中在Z11-去饱和酶的作用下，转化为上述的反式-异油酸或首先将硬脂酸在Z10-去饱和酶的作用下转化为Z10-十八碳烯酸。
4)来自鳞翅目类的(Z9，E11)-共轭酶也可进一步有利地与(Z11)-、(Z10)-或(E10)-去饱和酶组合。从硬脂酸开始，这些去饱和酶产生Z11-十八碳烯酸(顺式-异油酸)、Z10-十八碳烯酸或E10-十八碳烯酸，它们随后通过(Z9/E11)-共轭酶转化产生(Z9，E11)-CLA。
这样制备的CLA脂肪酸或者它们的衍生物例如脂肪酸辅酶A酯，被储存于膜脂和甘油三酯中。
在鳞翅目昆虫中尤其是在上述昆虫物种中已经定位了所期望的酶活性。本发明所提供的鉴定体系被用于此目的(实施例2、3和4)。
编码这些活性的酶或编码它们的核酸序列可以从所讨论的生物体中以本领域技术人员所熟悉的方式分离或通过相应已知序列的诱变推理出来。
对于一种酶促活性、功能性或表型，找到蛋白质序列或相应的cDNA序列是生物化学和分子生物学的一项常规任务。本领域技术人员熟悉多种解决这一问题的方法。例如这些方法为基于本发明所提供的用来确定去饱和酶或共轭酶活性的测定法(特别是见实施例3)。所讨论的去饱和酶/共轭酶的特定活性如实施例2、3和4所述，例如通过气相色谱法分析脂肪酸样本确定。从已经确定具有去饱和酶或共轭酶活性的生物材料开始，用此测定法使得分离所讨论的具有去饱和酶或共轭酶活性的蛋白质或编码这一蛋白质的核酸并分析它成为可能。
例如，表达克隆可以采用这种方法。这种方法已经频繁的用于，从特定酶活性、特殊功能性或特殊表型开始，分离与之相应的基因或这个基因相对应的cDNA(Dalboge H(1997)FEMS Microbiology Reviews21(1)29-42，Simonsen H和Lodish HF(1994)Trends Pharmacol Sci15(12)437-441)。常规的表达克隆方法已经在大量场合中有描述。例如对于膜蛋白、分泌因子和跨膜通道(Masu Y等(1987)Nature329(6142)836-838；Wong GG等(1985)Science 228(4701)810-815；LustigKD等(1996)Development 122(12)4001-4012；Smith WC和Harland RM(1992)Cell 70(5)829-840；Lemaire P等(1995)Cell 81(1)85-94；GillissenB等(2000)Plant Cell 12(2)291-300；Lotan T和Hirschberg J(1995)FEBSLetters 364125-128)。
在下文中描述的称为表达克隆的通用方法中，用到了通常的重组和克隆技术，这些技术例如在Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)和在Silhavy TJ，Berman ML和Enquist LW，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和在Ausubel FM等(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience中进行了描述。
一般，从能产生去饱和酶和共轭酶活性的生物体、细胞或组织开始可以产生表达文库。例如，首先从所述生物体、细胞或组织中用本领域技术人员所熟悉的方式分离mRMA或，优选地，多聚(A)-mRMA，在分离所得到的mRNA的基础上制备cDNA(Gubler U，Hoffman BJ(1983)Gene25263-269)。本领域技术人员熟悉多种用于分离mRNA或多聚(A)-mRNA的体系，并且这些体系有市售。例如，可用“Quick Prep Micro mRNAPurification Kit”(Amersham Pharmacia Biotech)进行合成。第一链cDNA优选地用寡聚(dT)引物，采用逆转录酶合成(Borson ND等(1992)PCRMethods Appl 2144-148；Chenchik A等(1994)CLONTECHniques9(1)9-12)。使得全长cDNA产生的许多系统是已知的并已市售。一个可以提到的例子是“SMARTTMcDNA Library Construction Kit”(Clontech，Cat.#K1051-1)。在该试剂盒中，SMARTTM技术(SMART＝SwitchMechanism At the 5’end of RNA Templates)用来产生cDNA文库(HerrlerM(2000)J Mol Med 78(7)B23)。使用了特定的寡核苷酸和被称为长程PCR的方法。该方法在实施例4中描述。
可将具有单股突出链的接头连接到双链cDNAs；这些接头使得例如在表达载体中克隆成为可能，其中所述表达载体已由限制性酶切开并具有相容的粘性末端。优选地，克隆是定向的，这样阅读的方向是固定的，任一存在的启动子产生始于cDNA插入的有义RNA。在用来举例的SMARTTM体系中，相容的SfiI(A)和SfiI(B)突出端被用来定向克隆入SfiI(识别序列GGCCNNNN！NGGCC)切割的载体中。在各种情况下，一个cDNA分子被克隆进一个载体分子，这样最后产生了基于相同的基本载体并根据整合的cDNA而不同的多种载体并形成表达文库。该表达文库还包含能够表达去饱和酶或共轭酶转基因的载体。适合的表达载体原则上是指所有那些能够在转化生物体中重组表达活性形式的去饱和酶或共轭酶的载体。可提及的例子有用来在大肠杆菌(E.coli)中重组表达的λTriplEX2载体(pTriplEX2载体切除后；生产商Clontech)或用来在酿酒酵母(S.cerevisiae)中重组表达的载体pYES2(生产商Invitrogen)(见实施例4)。
根据需要，可以进行校正以补偿个体基因在表达水平上的差异，这样每个被表达基因的cDNA在表达文库里以相似的拷贝数表示，与实际表达水平无关。许多体系被描述用来产生多聚(A)-mRNA，cDNA和标准cDNA(US 5,482,845)(Soares MB等(1994)Proc Natl Acad Sci USA919228-9232；Carninci P等(2000)Genome Res 101617-1630；BonaldoMF等(1996)Genome Res 6791-806)。
然而，也可建立扣除表达文库。在该方法中，具有去饱和酶或共轭酶的生物体、细胞或组织的cDNA和没有此活性的生物体、细胞和组织的cDNA比较，如果可能的活对同一属和种的cDNA进行比较。本领域技术人员熟悉有目标的分离仅在具有去饱和酶或共轭酶活性的生物材料中表达的cDNA的方法。对此类方法和体系进行了描述并且有市售。可以提到的例子是“PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit”(生产商Clontech)或“SubtractorTMKit”(生产商Invitrogen)，所述试剂盒可以超过1000倍浓缩稀有和/或选择性表达的cDNA。用扣除杂交法删除所有在两种生物材料中均出现的cDNA(Chu ZL等(1997)Proc Nat Acad Sci USA9410057-10062；Hudson C等(1997)Cell 91397-405；Mueller CGF等(1997)J Exp Med 186655-663；von Stein OD等(1997)Nucleic Acids Res252598-2602；Wong BR等(1997)J Biol Chem 27225190-25194；Yokomizo T等(1997)Nature 387620-624；Zhicheng S和Jacobs-Lorena M(1997)J Biol Chem 27228895-28900)。
在表达文库中的cDNA可以例如在原核或真核细胞中重组表达，对这些细胞接下来测定去饱和酶或共轭酶蛋白质，例如测定去饱和酶或共轭酶的活性。
为了将重组表达去饱和酶或共轭酶的载体从表达文库中分离出来，优选地将表达文库转化进生物体中。优选地，上述生物体的单独细胞以这种方法被转化每一细胞或从该细胞再生的每一生物体仅用一种类型的载体分子转化。原则上，所有这些能重组表达活性去饱和酶或共轭酶的生物体或来自这些生物体的细胞都适合转化。这些生物体可以是原核的和真核的。优选地是所有植物、来自它们的细胞，但也可以是其它光合作用生物体，例如藻类。可以提到的例子是，但不仅仅局限于这些例子，那些基于在细菌如大肠杆菌、酵母如酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)，哺乳动物细胞如COS或CHO细胞，或具有光合活性生物体如集胞藻属的细胞中重组表达的系统。优选的生物体是真核生物体，非常特别优选的是能够合成脂肪酸或脂酰辅酶A脂肪酸的真核生物体。优选地，用来转化的表达载体包含选择性标记，例如抗生素抗性或用以选择氨基酸缺陷的氨基酸合成基因，它使得选择出转化成功的细胞成为可能。更进一步的选择方法将在下文描述。
在一个优选的实施方案中，表达克隆能在酵母中实施。为此目的，可例如使用来自Invitrogen的基于pYES2载体的酵母表达体系。pYES2是一个高拷贝的游离型载体，用以在酿酒酵母中诱导表达重组蛋白质。转化的酵母菌株可以基于尿嘧啶缺陷被挑选出来(pYES2包含ura3基因)进一步优选的表达载体和产生转化生物体的转染方法和通常用来产生转基因生物体的方法一致。
从所有数目的转化生物体或来自于它们的细胞开始，集中并分离那些能够重组表达去饱和酶或共轭酶和/或具有相应去饱和酶或共轭酶活性的转化生物体或来自于它们的细胞。
一般，去饱和酶活性可以通过培养转化生物体或来自它的细胞，将它/它们置于合适的缓冲液或溶剂中消化，将消化物和脂肪酸或者脂酰辅酶A脂肪酸接触，而且，根据需要，加入辅因子如NADH或NADPH或氧，然后测定由此得到的去饱和脂肪酸或脂酰辅酶A脂肪酸。如果生物体或来自于它的细胞本身能合成脂肪酸或脂酰辅酶A脂肪酸，脂肪酸或脂酰辅酶A脂肪酸优选地来自经转化的生物体自身。然而如果不能合成，也可加入脂肪酸或脂酰辅酶A脂肪酸。
根据需要，在用溶剂例如乙酸乙酯从孵育混合物提取后，被去饱和酶或共轭酶修饰过的脂肪酸或脂酰辅酶A脂肪酸能通过本领域技术人员熟悉的常规方法所检测。分离方法如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)和检测方法如质谱法(MS或MALDI)，紫外光谱分析法(UV)或放射自显影法可用于此目的。优选地，气相色谱法的检测方法如实施例3、4和5所述的那样实施。
能够重组表达去饱和酶或共轭酶的转化生物体或来自它们的细胞能例如通过把所有数量的细胞分成亚组，培养这些亚组，如果分离得合适，测量每个独立亚组去饱和酶或共轭酶的活性而进行分离。包含一种能重组表达去饱和酶或共轭酶功能活性形式蛋白的细胞类型的亚组具有增强的去饱和酶或共轭酶活性。这些亚组被进一步划分并重复这一过程直到得到单克隆培养物，即培养物仅包含编码去饱和酶或共轭酶的特定cDNA的一种载体。
包含编码去饱和酶或共轭酶的核酸的载体可以从转化生物体或细胞中回收。这可以通过例如聚合酶链反应(PCR)进行。为此目的，使用了与去饱和酶或共轭酶cDNA插入片段侧翼的载体序列互补的寡核苷酸引物。在本文中不需要知道去饱和酶或共轭酶核酸序列。作为选择方案，如果载体没有整合到宿主基因组中，可以从细胞中回收，转化进大肠杆菌中，增殖并测序以便获得编码去饱和酶或共轭酶的核酸序列。根据上述的方法，去饱和酶或共轭酶核酸序列也可以用PCR的方法从分离的载体中分离出来，而不需要知道其序列顺序。并且，使得定向克隆成为可能的接头能在PCR反应之后被加入到扩增子中。然而，克隆也可以通过本领域技术人员所熟悉的用平末端连接或T-突出末端连接的方法实施。用PCR方法选择性扩增的去饱和酶或共轭酶cDNA因而也可直接克隆进适合产生表达去饱和酶或共轭酶的转基因生物体的载体中，而不需要事先阐明序列。该克隆过程可以通过例如用技术人员熟悉的平末端克隆的方法实施。如上面所引用的常规重组和克隆技术被用于此目的。
上面提到的表达克隆方法可以特别优选地在酿酒酵母中实施。为了达到此目的，也可用到一些这样的体系，在这些体系中，重组表达的cDNA通过同源重组整合进一个已经产生了的整合平台(Lagarde D等(2000)Applied and Environmental Microbiology 66(1)64-72)作为备选方案，表达克隆的方法也可以在体外用上述的非扩增表达文库实施。合适的体系有描述而且有市售。可以提到的例子是“TNTTMCoupled Reticulocyte Lysate System”(Promega；Promega Notes Number67，1998，p.02)。Kirschner等人已经研发了一种体外方法(IVEC＝“体外表达克隆”)，这种方法不需要活细胞(US 5,654,150；King RW等(1997)Science 277，973)。该体系已成功运用于尤其是酶和激酶。Kirschner等已经鉴别出激酶底物和蛋白酶(Lustig KD等(1997)Meth Enzymol 28383；Stukenberg PT等(1997)Curr Biol 7338；Kothakota S等(1997)Science278294)。在“体外表达克隆”(IVEC)中，使用了小部分表达文库。在每种情况下，约50到100个cDNA克隆存在于质粒中，且通过基于网质红细胞裂解物的体外偶联转录/翻译体系翻译为它们相应的蛋白质。为达到此目的，如上所述构建寡聚(dT)-引物cDNA文库，并用T3、T7或SP6启动子克隆进高拷贝表达质粒中。该质粒文库然后转化进大肠杆菌中。在各种情况下，大约50到100个独立的转化子在具有相应选择抗生素的琼脂平板上培养成大约1mm的菌落，然后收集并集中起来。质粒DNA从部分该细菌池中分离出来。这些被用作模板的质粒DNA直接在网织红细胞体系中转录和翻译。具体的操作方法可以在例如生产商手册(TNTTMCoupledReticulocyte Lysate Systems Technical Bulletin#TB126，PromegaCorporation)中找到。根据文库中全长cDNA克隆的数目，每个单独混合物大约有30到50个蛋白质合成。测试这些已经产生的蛋白质的去饱和酶和共轭酶活性。具有增强的去饱和酶或共轭酶活性的单独混合物被进一步细分。单独混合物的细分能找到编码去饱和酶或共轭酶的cDNA。编码去饱和酶或共轭酶的核酸能从存在于该制备物中的载体用PCR的方法扩增，而且如果合适，不需要知道序列并分析它，如上所述使用所述核酸产生重组表达去饱和酶或共轭酶的生物体。作为兔网质红细胞提取物的可选择方案，麦胚提取物也可以用于联合的转录/翻译步骤。
在更具有利的应用中，可将cDNA克隆进逆转录病毒载体中。这允许高效率的细胞转化。逆转录病毒表达载体和表达体系已有描述(KitamuraT，International Journal of Hematology 1998，67351-359)和有市售(例如来自Clontech；New Retroviral&ClonCapture Expression Libraries；CLONTECHniques，1998年10月，XIII(4)22-23)。转染最初是在包装细胞系中进行(例如EcoPackTM-293或RetroPackTMPT67细胞系，来自Clontech)。用产生于这种方式的病毒，可转染所讨论的靶细胞系并选择目的活性。然后，插入片段可以获得和分析，例如通过PCR。此外，它们能被直接克隆进合适的表达载体中，甚至不需要预先对它们进行序列分析，然后这些表达载体能被用来产生重组表达去饱和酶或共轭酶的生物体。
通过诱变修饰已知的顺式-去饱和酶可获得这样的E10-或E11-去饱和酶，即它们具有反式位置去饱和的特异性。为达到这个目的，例如下列编码顺式去饱和酶的核酸序列能作为起始序列，然后进行诱变i)来自玉米夜蛾的编码Z11-去饱和酶的核酸序列，SEQ ID NO7ii)来自粉纹夜蛾的编码Z11-去饱和酶的核酸序列，SEQ ID NO9iii)来自红带卷蛾的编码Z11-去饱和酶的核酸序列，SEQ ID NO11或iv)来自绿头卷蛾(Planotortrix octo)编码Z10-去饱和酶的核酸序列，SEQ ID NO13而且，可通过诱变E11-去饱和酶使其能更有效或完全转化长链脂肪酸。下面是可以使用的起始序列a)来自苹果浅褐卷蛾编码E11-去饱和酶的核酸序列，SEQ ID NO1，b)来自欧洲玉米螟编码E11-去饱和酶的核酸序列，SEQ ID NO3，或c)来自亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)编码E11-去饱和酶的核酸序列，SEQ ID NO5。
通过诱变的方法改变上面提到的去饱和酶引入双键位置的特异性也是可以想象的。
通过诱变的方法去改变特性，例如去饱和酶的底物特异性的方法已经知道(Cahoon等(1997)Proc Nat Acad Sci USA 944872-4877；WO98/06735)。更进一步合适的方法用来描述了其它脂类代谢酶，例如脂肪氧化酶，而且能被类似地应用(Hornung等(2000)Biochem Soc Trans28825-826；Schwarz等(2001)J Biol Chem 276773-779)。
用于本发明方法中的编码去饱和酶/共轭酶的核酸序列也能用聚合酶链反应从上面提到的鳞翅目物种各自的cDNA制备物或文库分离，所述聚合酶链反应采用合适的简并寡核苷酸引物。那些被优选采用的是在SEQ IDNO15和16中描述的寡核苷酸引物对或在SEQ ID NO17或18中描述的寡核苷酸引物对。
用于本发明方法中的来自鳞翅目脂肪酸去饱和酶的核酸序列优选地a)在其有义链中包含SEQ ID NO15或17所述的序列基序，或b)在其反义链中包含SEQ ID NO16或18所述的序列基序。
在一个进一步优选的实施方案中，在本发明方法中用到的来自鳞翅目的脂肪酸去饱和酶的蛋白质序列与SEQ ID NO2、4、6、8、10、12或14中描述的其中一种脂肪酸去饱和酶序列优选地具有至少65％，优选地至少70％，特别优选地至少80％，非常特别优选地至少90％的同源性，而且任选地和优选地具有去饱和酶或共轭酶的优选基本特性中的至少一种。这些蛋白质也包含来自上面提到的去饱和酶核酸序列以及来自其它动物或植物属种的它们的同系物之一的天然或人工突变。突变包括替代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。当插入、缺失或替代，例如碱基转换和碱基颠换适用时，可以采用本来已知的技术，例如体外诱变、引物修复、限制性酶切作用和连接作用。可提供片段的互补末端用于连接，通过运用例如限制性酶切、回切(chewing-back)或填平突出端得到平末端。类似的结果也可以通过采用特定寡核苷酸引物的聚合酶链反应(PCR)得到。
在一个更进一步优选的实施方案中，用于本发明方法中的来自鳞翅目的编码脂肪酸去饱和酶的核酸序列与SEQ ID NO1，3，5，7，9，11或13中所述的其中一种脂肪酸去饱和酶核酸序列优选地具有至少65％，优选地至少70％，特别优选地至少80％，非常特别优选地至少90％的同源性，而且其任选地且优选地编码这样的蛋白质，所述蛋白质具有去饱和酶或共轭酶优选基本特性中的至少一种。
两条核酸或多肽之间的同源性理解为在各种情况下全部序列长度的核酸序列的同一性，这种同一性是借助于GAP程序算法通过序列比对计算的(Wisconsin Package Version 10.0，University of Wisconsin，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，USA)，设置如下参数缺口权重12 长度权重4
平均匹配2.912平均未匹配-2.003在一个更优选的实施方案中，本发明方法所采用的来自鳞翅目的编码脂肪酸去饱和酶的核酸序列优选地在标准条件下，与上面提到的编码去饱和酶的核酸序列的其中之一，优选地与如SEQ ID NO1，3，5，7，9，11或13中所示的序列杂交。
术语标准杂交条件应该广义地理解为严格的或较不严格的杂交条件。此类杂交条件特别地描述在以下书中Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T等，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989，pages 9.31-9.57页)或Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤的条件可以选自一定范围内的条件，这些条件被分为低严格条件(约0.2X SSC在50℃下)和高严格条件(约0.2X SSC在50℃下，优选地在65℃下)(20X SSC0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH 7.0)。而且，在洗涤阶段的温度可以从在室温下的低严格条件，约22℃，升高到约65℃的高严格条件。对盐浓度和温度这两个参数可同时改变，或者这两个参数之一保持不变而只改变另一个参数。在杂交反应期间也可使用变性剂如甲酰胺或SDS。在存在50％甲酰胺时，杂交反应优选地在42℃进行。用于杂交和洗涤步骤的条件的一些例子详述如下(1)杂交条件，例如，a)4X SSC在65℃下b)6X SSC在45℃下c)6X SSC在68℃下，100μg/ml变性鱼精子DNAd)4X SSC，50％甲酰胺，在42℃下e)2X或4X SSC在50℃下(低严格条件)，或f)2X或4X SSC，30到40％甲酰胺，在42℃下(低严格条件)。
(2)洗涤步骤，例如a)0.1X SSC，在65℃下，或b)0.1X SSC，0.5％SDS，在68℃，或
c)0.1X SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，在42℃下，或，d)0.2X SSC，0.1％SDS，在42℃下，或e)2X SSC，在65℃下(低严格条件)。
为了本发明目的，“核酸序列”指的是，例如，基因组或互补DNA(cDNA)序列或RNA序列，和它们的半合成或全合成类似物。这些序列能以线状或环状的形式存在，存在于染色体外或整合进基因组里。本发明表达盒或核酸的核苷酸序列可以合成产生或天然地获得，或包含合成的和天然的DNA组分混合物，和由来自不同生物体的不同异源基因片段组成。而且，人工核酸序列只要它们具有目的基本特点就是合适的。例如，可产生具有被转化植物优选的密码子的合成核苷酸序列。这些被植物优选的密码子通常可以常规方式通过基于来自具有最高蛋白质频率的密码子的密码子使用来确定。特别合适的是根据宿主植物特异的密码子使用通过将多肽序列反向翻译而获得的编码核苷酸序列。为了防止不希望的植物调节机制，可以例如从来自鳞翅目昆虫去饱和酶的氨基酸序列开始，并考虑植物的密码子使用，从而反向翻译DNA片段和用此结果产生完整的优化以在植物中使用的外源去饱和酶序列。
所有上面提到的核苷酸序列可以从核苷酸单元通过本身已知的方式化学合成，例如，通过片段缩合双螺旋的单独的交叠互补核酸单位。寡核苷酸可以被化学合成，例如以本身已知的磷酰亚胺(phosphoamidite)法(Voet，Voet，第2版，Wiley Press New York，896-897页)。当制备核酸构建体时，可操作不同的DNA片段，以获得具有正确阅读方向和正确阅读框的核苷酸序列。接头或衔接子可以加入到片段中以便核酸片段互相连接起来。合成的寡核苷酸的添加、借助于DNA聚合酶克列诺片段的缺口填平、连接反应和一般克隆方法由Sambrook等(1989)Molecular cloningAlaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press一书中描述。
当谈及，例如，核酸序列、表达盒、载体或生物体时，“转基因”/“重组”指的是那些以重组方法产生的基因构件，或指它们的用途，其中a)编码去饱和酶的核酸序列或
b)可操作地连接至编码去饱和酶的核酸序列上的基因调控序列例如启动子，或c)(a)和(b)都不在它们天然的遗传环境中或已经通过重组法修饰，这种修饰例如采取替代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。术语天然遗传环境指的是在最初生物体中天然的染色体座或指的是在基因组文库中的存在。在基因组文库这种情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地至少部分保留。所述环境至少单边位于核酸序列侧翼，具有至少50bp的序列长度，优选地至少500bp，特别优选地至少1000bp，非常特别优选地至少5000bp。天然存在的表达盒，例如天然存在的具有其天然启动子的编码去饱和酶基因序列的组合体当被非天然的、合成的(“人工的”)方法，例如诱变修饰，就变成重组表达盒。
重组表达指的是用于表达核酸序列的重组表达盒的使用。
本发明此外涉及包含编码去饱和酶的核酸序列的重组表达盒，和包含这些表达盒的载体。
在上述重组表达盒中编码去饱和酶的核酸分子优选地与至少一种基因调控元件(例如启动子)可操作地连接，所述调控元件能确保上述去饱和酶在生物体、优选地在植物、植物组织、藻类、酵母、或真菌中重组表达(转录和/或翻译)。如果重组表达盒欲直接导入植物中，而且去饱和酶欲在植物中表达，植物特异的基因调控元件(例如启动子)是优选的。然而，去饱和酶也可以在其它生物体中或体外表达。在这里，优选的原核或真核基因调控元件(例如启动子)是那些能允许各种情况下于所选择生物体中产生表达的启动子。
本发明因此还涉及这样的重组表达盒，所述重组表达盒包含至少一种来自鳞翅目昆虫的，在植物、藻类、酵母、或真菌中发挥作用的启动子调控下的编码脂肪酸去饱和酶的核酸序列。优选地，表达盒中的核酸序列编码的多肽包含至少一种选自以下的序列
a)如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或22中所示的氨基酸序列，以及b)与如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或22中所示的氨基酸序列之一具有至少65％同源性的氨基酸序列，和c)包含如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或22中所示序列的至少20个连续氨基酸序列片段的氨基酸序列。
脂肪酸去饱和酶在本文中特别优选地为如SEQ ID NO22所示的氨基酸序列。
本发明此外涉及包含至少一种本发明表达盒的重组表达载体，以及涉及包含至少一种本发明重组表达盒或至少一种本发明重组表达载体的转基因生物体。优选地，转基因生物体是植物生物体，特别优选地选自用于油料生产的植物，例如向日葵、芝麻、红花、橄榄树、大豆、亚麻子、花生、蓖麻、油棕、玉米、小麦、可可树和坚果种类。
可操作的连接理解为，例如启动子和欲表达的去饱和酶核酸序列而且根据需要，包括进一步的调控元件例如终止子的依次排列，使得在核酸序列被重组表达时，每个调控元件都能实现其功能。不一定需要化学意义上的直接连接来达到这个目的。基因调控序列例如增强子序列也能对目标序列从远离的位置或对实际上来自其它的DNA分子发挥功能。优选的排列为欲重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列之后，从而两个序列被共价地彼此连接。启动子序列与欲重组表达的核酸序列间距离优选为200碱基对以内，更优选100碱基对以内，非常特别优选50碱基对以内。
可操作的连接和转基因表达盒均可通过常规的重组和克隆技术产生，这些技术例如在Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)，在Silhavy TJ，Berman ML und Enquist LW(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)，在Ausubel FM等(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience以及在Gelvin等(1990)Plant Molecular Biology Manual中描述。然而，其它序列，例如具有限制性酶特异切割切点的接头或是信号肽也可位于这两个序列之间。而且，插入序列可导致融合蛋白的表达。优选地，包含连接到欲表达核酸序列上的启动子的重组表达盒能以载体整合的形式存在并被插入植物基因组，例如通过转化插入。
然而，转基因表达盒也可以理解为这样的构建体，其中编码去饱和酶的核酸序列置于内源性启动子之后，通过这种方式，后者调控去饱和酶的表达。通过插入产生的内源启动子和去饱和酶核酸序列的融合是为了本发明目的的重组表达盒。
植物特异性的启动子理解为任何能调控基因、特别是外源基因在植物或植物的一部分、植物细胞、植物组织或植物培养物中表达的启动子。在本文中，表达可是例如组成型、诱导型、或发育依赖型的。下面的是优选的启动子a)组成型启动子优选的载体是那些使在植物中组成型表达成为可能的载体(Benfey等(1989)EMBO J.8，2195-2002)，“组成型”启动子指的是这样的启动子，它们是能确保在大量、优选的是全部的组织，并且在植物发育的相当长期间，优选地在植物全部发育期表达的启动子。特别优选使用植物启动子和来自植物病毒的启动子。CaMV(花椰菜花叶病毒)35S转录本(Franck等(1980)Cell 21285-294；Odell等(1985)Nature 313810-812；Shewmaker等(1985)Virology 140281-288；Gardner等(1986)Plant Mol Biol 6221-228)启动子或19 S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等人(1989)EMBO J 82195-2202)是特别优选的。另一合适的组成型启动子是Rubisco小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank Acc.No.X03677)、来自农杆菌的胭脂碱合成酶启动子、TR双启动子、来自农杆菌的OCS(章鱼碱合酶)启动子、泛素启动子(Holtorf S等(1995)Plant MolBiol 29637-649)、泛素1启动子(Christensen等(1992)Plant Mol Biol18675-689；Bruce等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869692-9696)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亚基启动子，或是小麦中富含脯氨酸的蛋白质的启动子(WO 91/13991)，并且在植物中组成型表达的基因的其它启动子为本领域技术人员公知。
b)组织特异型启动子进一步优选地是具有花粉、子房、花、叶、茎、根和种子特异性的启动子。
种子特异性启动子例如，云扁豆蛋白启动子(US 5,504,200；Bustos MM等(1989)PlantCell 1(9)839-53)、25清蛋白基因启动子(Joseffson LG等(1987)J BiolChem 26212196-1220 1)、豆球蛋白启动子(Shirsat A等(1989)Mol GenGenet 215(2)326-331)、USP(未知的种子蛋白)启动子(Bumlein H等(1991)Mol Gen Genet 225(3)459-67)、napin基因启动子(US 5,608,152；Stalberg K等(1996)L Planta 199515-519)、蔗糖结合蛋白启动子(WO00/26388)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Bumlein H等(1991)Mol GenGenet 225121-128；Bumlein等(1992)Plant Journal 2(2)233-9；Fiedler U等(1995)Biotechnology(NY)13(10)1090f)、Arabidopsis oleosin启动子(WO 98/45461)、和芸苔Bce4启动子(WO 91/13980)。进一步合适的种子特异性启动子是那些编码高分子量麦谷蛋白、麦醇溶蛋白、分枝酶、ADP葡萄糖焦磷酸酶(AGPase)或淀粉合酶基因的启动子。此外优选的启动子是那些允许在单子叶植物，例如玉米、大麦、小麦、裸麦、稻等中进行种子特异性表达的启动子。lpt2或lpt1基因的启动子(WO 95/15389，WO95/23230)或在WO 99/16890中描述的启动子(大麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、oryzin基因、谷醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、casirin基因或黑麦碱基因的启动子)优选地采用。
块茎-、储藏根-或根-特异性启动子，例如I类patatin启动子(B33)和来自马铃薯的组织蛋白酶D抑制剂启动子。
叶-特异性启动子例如马铃薯胞质FBPase启动子(WO 97/05900)、Rubisco(核酮糖1.5二磷酸羧化酶)SSU启动子(小亚基)或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等(1989)EMBO J 82445-2451)。
花-特异性启动子例如八氢番茄红素合酶启动子(WO 92/16635)或P-rr基因启动子(WO98/2259 3)。
花药-特异性启动子例如5126启动子(US 5,689,049，US 5,689,051)、glob-l启动子和g-玉米醇溶蛋白启动子。
c)化学诱导型启动子重组表达盒也可包含化学诱导型启动子(综述文章Gatz等(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 4889-108)，通过这种方式，在植物中的外源基因表达可以及时的在特定点被调控。这样的启动子例如，PRP1启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 0 388 186)、四环素诱导型启动子(Gatz等(1992)Plant J 2397-404)、脱落酸诱导型启动子(EP 0 335528)或乙醇-或环己酮诱导型启动子(WO 93/21334)可同样被利用。
d)应激或病原体诱导型启动子其它优选地启动子是那些被生物或非生物胁迫诱导的启动子，例如，PRP1基因的病原体诱导型启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol22361-366)、来自番茄的热诱导型hsp70或hsp80启动子(US 5,187,267)、来自马铃薯的低温诱导型α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)、光诱导型PPDK启动子或创伤诱导的pinII启动子(EP375091)。
病原体诱导型启动子包括作为病原体攻击结果而被诱导产生的基因例如PR蛋白、SAR蛋白、b-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等的启动子(例如Redolfi等人(1983)Neth J Plant Pathol 89245-254；Uknes等人(1992)The PlantCell 4645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral 4111-116；Marineau等人(1987)Plant Mol Biol 9335-342；Matton等人(1987)MolecularPlant-Microbe Interactions 2325-342；Somssich等人(1986)Proc NatlAcad Sci USA 832427-2430；Somssich等人(1988)Mol Gen Genetics293-98；Chen等人(1996)Plant J 10955-966；Zhang和Sing(1994)ProcNatl Acad Sci USA 912507-2511；Warner等人(1993)Plant J 3191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell 1961-968(1989)。
也包括在内的是创伤诱导型启动子，例如pinII基因(Ryan(1990)AnnRev Phytopath 28425-449；Duan等人(1996)Nat Biotech 14494-498)、wun1和wun2基因启动子(US 5,428,148)、win1和win2基因的启动子(Stanford等人(1989)Mol Gen Genet 215200-208)、系统素启动子(McGurl等人(1992)Science 2251570-1573)、WIP1基因启动子(Rohmeier等人(1993)Plant Mol Biol 22783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Letters32373-76)、MPI基因启动子(Corderok等人(1994)The Plant J6(2)141-150)等。
e)发育依赖型启动子其它合适的启动子是，例如，水果成熟特异性启动子，如来自番茄的水果成熟特异性启动子(WO 94/21794，EP 409 625)。因为一些组织随着发育的进行而自然形成，因而发育依赖型启动子包括一些组织特异性启动子。
其它合适在植物中表达的启动子已经被描述(Rogers等人(1987)Methin Enzymol 153253-277；Schardl等人(1987)Gene 611-11；Berger等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA 868402-8406)。尤其优选组成型和种子特异型启动子。
而且，使得表达在其它植物组织或在其它生物体例如大肠杆菌中成为可能的其它启动子可以可操作地与欲表达的核酸序列连接。合适的植物启动子原则上是所有上述的启动子。
存在于本发明重组表达盒或载体中的核酸序列可被可操作地与除操纵子之外的其它基因调控序列连接，基因调控序列这个术语要广义地理解，它指所有那些对本发明的表达盒建立或功能有影响的序列。基因调控序列改变例如在原核或真核生物体中的转录和翻译。本发明的重组表达盒优选地包含具有在所要重组表达的核酸序列5’上游区的能特异性地在胚皮和/或花中表达的启动子，和作为额外的基因调控序列的3’下游区终止子序列，以及，根据需要，在各种情况下可操作地与欲重组表达的核酸序列相连接的其它常规调控元件。
基因调控序列也包括其它能改变表达调控特性的启动子、启动子元件或最小启动子。因而，基因调控序列能例如致使额外依赖于某些胁迫因素的组织特异性表达。这些因素可描述为，例如为水胁迫和脱落酸(Lam E和Chua NH，J Biol Chem 1991；266(26)17131-17135)和热胁迫(Schoffl F等人(1989)Mol Gen Genetics 217(2-3)246-53)。
其它有利的调控序列是例如在革兰氏阳性启动子amy和SPO2中以及在酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。
原则上，如那些启动子一样，所有具有调控序列的天然启动子均可用于本发明的方法。而且，也可有利地使用合成启动子。
基因调控序列也进一步地包括基因的5’非翻译区、内含子、或非编码的3’区，例如，肌动蛋白-1内含子或Adh1-S内含子1、2和6(对于概述性参考文献，见The Maize Handbook，116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，New York(1994))。已经证明这些调控序列在调节基因表达中起显著作用。因而，已经证明5’非翻译序列能增强异源基因的瞬时表达。可以举例的方式提到的翻译增强子是烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie等人(1987)Nucl Acids Res 158693-8711)等。它们此外可提高组织特异性(Rouster等人(1998)Plant J 15435-440)重组表达盒有利地可包含与启动子可操作连接的一个或多个已知的增强子序列，这些增强子序列使得核酸序列重组表达的增强成为可能。其它有利的序列如其它调控元件或终止子也可插入至欲重组表达的核酸序列的3’末端。在基因构建体中可存在一个或多个拷贝的欲重组表达的核酸序列。
适合做调控序列的多聚腺苷酸信号序列是植物多聚腺苷酸信号，优选地是那些基本上对应于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA多聚腺苷酸信号的序列，特别是Ti质粒pTiACHS的T-DNA的基因3(章鱼碱合酶)(Gielen等人(1984)EMBO J 3835以及下列等等)或其功能等同物的序列。特别适合的终止子序列是OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。
调控序列能进一步理解为那些使得同源重组或插入宿主生物体基因组或从基因组中移除成为可能的序列。方法如cre/lox技术允许组织特异性地、可能可诱导地从宿主生物体基因组中移除重组表达盒(Sauer B(1998)Methods，14(4)381-92)。在这里，某些侧翼序列被添加至目标序列(lox序列)，使得通过cre重组酶方法在较后的时间点移除成为可能。
重组表达盒和由它其衍生的重组载体可包含其它的功能元件。功能元件这个术语要从广义上理解，它指所有那些对本发明的重组表达盒、载体或转基因生物体的产生、复制或功能有影响的元件。可以提到但不仅限于此的例子是a)对代谢抑制剂例如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(WO 98/45456)、抗生素、或杀生物剂，优选除草剂，例如卡那霉素、G 418、博莱霉素、潮霉素、膦丝菌素等赋予抗性的选择性标记。特别优选的选择性标记是那些赋予除草剂抗性的选择性标记。可以举例方式提及的例子为编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)并灭活谷氨酰胺合酶抑制剂的DNA序列(bar和pat基因)、赋予草甘膦(N-(膦酰基甲基)甘氨酸)抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSP合酶基因)、编码草甘膦降解酶(草甘膦氧化还原酶)的gox基因、deh基因(编码灭活茅草枯的脱卤素酶)、磺酰脲类-和咪唑啉酮灭活的乙酰乳酸合成酶、和编码降解溴苯腈的腈水解酶的bxn基因、赋予抗生素apectinomycin抗性的aasa基因、允许抗链霉素的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、赋予卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPII)基因、赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、赋予磺酰脲类除草剂抗性的乙酰乳酸合酶基因ALS)(例如突变的ALS变体，其具有例如S4和/或Hra突变)。
b)易于编码可定量蛋白质并允许通过其颜色或酶活性评估转化效率或表达位点或表达时间的报告基因。本文中非常特别优选的是例如“绿色荧光蛋白”(GFP)(Sheen等人(1995)Plant Journal 8(5)777-784)；Haseloff等人(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94(6)2122-2127；Reichel等人(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(12)5888-5893；Tian等人(1997)PlantCell Rep 16267-271；WO 97/41228；Chui WL等人(1996)Curr Biol6325-330；Leffel SM等人(1997)Biotechniques.23(5)912-8)、氯霉素转移酶、虫萤光素酶(Ow等人(1986)Science 234856-859；Millar等人(1992)Plant Mol Biol Rep 10324-414)、水母发光蛋白基因(Prasher等人(1985)Biochem Biophys Res Commun 126(3)1259-1268)、β-半乳糖苷酶、R基因座基因(编码的蛋白调节植物组织中的花青苷色素(显红色)，因而使得可直接分析启动子活性而不需要额外辅助设备或发色底物；Dellaporta等人，在Chromosome Structure and FunctionImpact of New Concepts，18thStadler Genetics Symposium，11263-282，1998)、β-葡糖苷酸酶(Jefferson等人(1987)EMBO J 63901-3907)的报告蛋白(Schenborn E，GroskreutzD.Mol Biotechnol.1999；13(1)29-44)。
c)允许本发明的重组表达盒或载体在例如大肠杆菌中复制的复制起点。可以提到的例子是ORI(DNA复制的起点)、pBR322 ori或P15A ori(Sambrook等人Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
d)农杆菌介导的植物转化所需要的元件，例如，T-DNA的右边界或左边界、vir区。
要选择已经成功经历同源重组的细胞或已经被成功转化的细胞，通常需要额外导入能赋予杀生物剂(例如除草剂)、代谢抑制剂例如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(WO 98/45456)或抗生素抗性的选择标记至已经成功经历重组的细胞中(McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 581-84)。
通过举例的方式，但不仅限于此，本发明的重组表达盒可具有下列结构
a)5’-植物特异性启动子/去饱和酶/终止子-3’本发明的重组表达盒优选地具有下列结构a)5’-35S启动子/去饱和酶/OCS/终止子3’，或b)5’-豆球蛋白B启动子/去饱和酶/NOS终止子3’用多于上述示例a)或b)之一的重组表达盒共同转化可能有利于本发明优势的CLA生物合成方法。而且用一种或多种载体转化，每种载体包含上面提到的重组表达盒的组合，可能有优势。
此外，所述重组表达盒可包含这样的核酸序列，所述核酸序列的重组表达导致脂肪酸生物合成增加(在下文中称为proOIL)。这个被额外重组表达的proOIL核酸序列能够选自下例但不并不限于编码脂酰辅酶A羧化酶(ACCase)、甘油-3-磷酸盐酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)、甘油二酯酰基转移酶(DAGAT)和磷脂甘油二酯-酰基转移酶(PDAT)的核酸。
proOIL核酸序列也包含这样的核酸序列，所述核酸序列的重组表达产生能引起脂肪酸产量增加的反义-RNA或双链RNA。
优选的例子包括含有如下重组表达盒的载体a)5’-35S启动子/去饱和酶/OCS终止子/豆球蛋白B启动子/proOIL/NOS终止子3’；b)5’-35S启动子/前-去饱和酶或共轭酶/OCS终止子/豆球蛋白B启动子/proOIL/NOS终止子3’；构建体a)和b)允许用去饱和酶和能增加脂肪酸生物合成的proOIL序列同时转化植物。
应用上面引用的重组和克隆技术，本发明的去饱和酶或proOIL核酸或重组表达盒能被克隆到适合的载体中，这些载体允许它们在例如大肠杆菌中增殖。适合的克隆载体尤其为pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。特别合适的是在大肠杆菌和农杆菌中都能复制的二元载体。
本发明的去饱和酶或proOIL核酸或重组表达盒优选地插入合适的转化载体中。合适的载体特别地在“植物分子生物学和生物技术方法”(CRCPress)，6/7章，71-119页(1993)中描述。转化实例和转化方法如下文所述。
本发明进一步涉及用至少一种本发明重组表达盒或本发明载体转化的转基因生物体、植物生物体的细胞、细胞培养物、组织、植物部分—例如叶、根等，或来自于这些生物体的繁殖材料。
生物体、起始生物体或宿主生物体这些术语理解为原核或真核生物体，例如，微生物或植物生物体。
优选的微生物为细菌、酵母、藻类或真菌。
优选的细菌是来自埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostrridium)、丙酸杆菌属(Proionibacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、真杆菌属(Eubacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、伊文氏杆菌属(Erwinia)、农杆菌属、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、Phaeodactylum、豆形虫属(Colpidium)、被孢霉属(Mortierella)、虫霉属(Entomophthora)、毛霉属(Mucor)、隐甲藻属(Crypthecodinium)或蓝细菌，例如集胞藻(Synechocystis)。
特别优选地是能感染植物因而能转移本发明构建体的微生物。优选的微生物是农杆菌属，特别是根瘤农杆菌种的微生物。
优选的酵母是假丝酵母属(Candida)、酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属。特别优选的酵母是那些脂肪酸/脂肪酸衍生物占细胞干物质至少20％，优选40％，特别优选60％的酵母，特别是例如弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)(Ratledge(1989)油和脂肪的生物技术，在Microbiol lipids Vol.2，Academic Press，伦敦，567-668页)。
优选的真菌为曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、阿舒囊霉属(Ashbya)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀霉属(Fusarium)、白僵菌属(Beauveria)、致病疫霉(Phytophthora infestans)或在IndianChem Engr.B部分，第37卷，No 1，2(1995)，15页，表6中描述的其它真菌。特别优选地是那些脂肪/脂肪酸衍生物占细胞干物质至少10％，优选20％的真菌，特别是卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和高山被孢霉(Mortierella alpina)(Wynn等人(2001)Microbiology 1472857-2864)优选的转基因生物体特别是植物生物体。“植物生物体”这个术语包含任何能够进行光合成作用的生物体和来自该生物体的细胞、组织、部分繁殖材料(如种子和果实)。所有植物界高等和低等植物属种都包括在本发明的目的中。一年生的、多年生的、单子叶植物和双子叶植物和裸子植物是优选的。包括在内的有成熟植物、种子、幼枝和幼苗，以及来自于它们的部分、繁殖材料(例如块茎、种子或果实)、植物器官、组织、原生质体、愈伤培养物和其它培养物，例如细胞培养物。“成熟植物”指在任何超过幼苗发育阶段的植物。幼苗这个词指处在早期发育阶段的幼小不成熟植物。
“植物”包含所有一年生和多年生单子叶和双子叶植物，包括下例，但不限于。南瓜属、玫瑰属(Rosa)、葡萄属、胡桃属、草莓属、莲属、苜蓿属、驴喜豆属(Onobrychis)、三叶草属、葫芦巴属、豇豆属、柑桔属、亚麻属、天竺葵属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜、芥子属、颠茄属、辣椒属、曼陀铃属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、牵牛花属、毛地黄属、马约兰(Majorana)、菊苣、向日葵属、莴苣属、Bromus、天门冬属、金鱼草属、Hemericallis、龙面花属、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、蛾蝶花属、瓜类、Browaalia、威氏大豆(Glycine)、豌豆、菜豆属、黑麦草属、稻、玉米、燕麦、大麦属、黑麦、小麦属、高梁属、云杉属和杨属。
优选的植物来自以下植物科苋科、菊科(Asteraceae)、芸苔、石竹科、藜科、菊科(Compositae)、十字花科、葫芦科、唇形科、豆科、凤蝶科、百合科、亚麻科、锦葵科、蔷薇科、茜草科、虎耳草科、玄参科、茄科、梧桐科、番杏科、茶科、伞形科。
优选的单子叶植物特别选自单子叶作物植物，例如，禾本科，如苜蓿、稻、玉米、小麦或其它禾谷类如大麦、黍和高梁、黑麦、黑小麦或燕麦，和甘蔗，和所有草本类。
本发明十分特别优选地应用于双子叶植物生物体。优选的双子叶植物特别选自双子叶作物植物，例如，-菊科(Asteraceae)，如向日葵属、万寿菊属、金盏花属等，-菊科(Compositae)，特别是莴苣属，特别是莴苣等，-十字花科，特别是芸苔属，十分特别地是油菜、甜菜、甘蓝、花椰菜、和青花柳菜、和其它甘蓝；和拟南芥属，十分特别地是拟南芥菜，和独行菜或canola等。
-葫芦科，例如甜瓜、南瓜或西葫芦等。
-豆科，特别地是大豆属，十分特别地是毛豆、黄豆和紫花苜蓿、豌豆、扁豆或花生等。
-茜草科，优选地是海胫天牛亚科(Lamiidae)，例如小果咖啡(Coffeaarabica)或大果咖啡(Coffea liberica)等。
-茄科，特别地是番茄属，十分特别地是番茄，茄属，十分特别地是马铃薯，和茄子和烟草或辣椒等。
-梧桐科，特别地是五桠果亚纲，例如可可属等。
-茶科，特别地是五桠果亚纲，例如山茶属、茶属或等。
-伞形科，特别地是胡萝卜属(十分特别地是胡萝卜)和芹属(十分特别地是芹菜(graveolens dulce)等；和辣椒属，十分特别地是胡椒属等，以及亚麻子、大豆、棉花、大麻、亚麻、黄瓜、菠菜、胡萝卜、甜菜和各种树、坚果和葡萄种，特别是香蕉和中华猕猴桃。
也包含在内的是观赏性植物、有用或观赏性树、花、切花、灌木或草皮。通过举例，但不仅限于此的植物是被子植物、苔藓植物，例如苔纲(Hepaticae)和藓纲(Musci)；蕨类植物，例如蕨类、木贼和石松；裸子植物，例如松柏类、苏铁类、银杏和买麻藤纲；蔷薇科，例如蔷薇属，杜鹃花科，例如杜鹃花属(rhododendron)和杜鹃花属(azalea)，大戟科(Euphorbiaceae)，例如猩猩木属(poinsettias)和巴豆属(croton)，石竹科(Caryophyllaceae)，例如石竹类(pinks)，茄科(Solanaceae)，例如矮牵牛花属(petunias)，苦苣苔科(Gesneriaceae)，例如非洲紫罗兰属(African violet)，凤仙花科(Balsaminaceae)，例如凤仙花属(touch-me-not)、兰科(Orchidaceae)，例如兰花属(orchids)，鸢尾科(Iridaceae)，例如唐菖蒲属(gladioli)、鸢尾属(iris)、小苍兰属(freesia)、番红花属(crocus)，菊科，例如金盏花属，牻牛儿苗科(Geraniaceae)，例如天竺葵属，百合科，例如龙血树属(dracena)，桑科(Moraceae)，例如无花果属(ficus)，天南星科(Araceae)，例如喜林芋属(philodendron)和许多其它类。
此外，适于本发明目的植物生物体更进一步是能有光合活性的生物体，例如，藻类、蓝细菌和藓类。优选的藻类是绿藻，例如红球藻属(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、团藻(Volvox)或杜氏藻属(Dunaliella)。
更优选的是适合油类生产的植物，例如油菜、向日葵、芝麻、红花(Carthamus tinctorius)、橄榄树、大豆、亚麻子、花生、蓖麻、油棕、玉米、小麦、可可或各种坚果类植物，例如胡桃、椰子或杏。最优选的是此外拟南芥属、棉花、亚麻和亚麻子。
优选的藻类是绿藻，例如，红球藻属、三角褐指藻、团藻或杜氏藻属。其它作为被优选的可以提到的是原生动物，例如腰鞭毛虫类。
上面提到的生物体中优选的特别，是那些能天然合成相当量油类的生物体，例如真菌类，举例来说是卷枝毛霉、高山被孢霉、诡谲腐霉(Pythiuminsidiosum)，酵母类，例如酿酒酵母或弯曲隐球酵母，或植物，例如，大豆、亚麻子、油菜、椰子、油棕、红花、蓖麻、花生、可可树或向日葵，特别优选的是大豆、油菜、向日葵、卷枝毛霉、高山被孢霉菌、诡谲腐霉、弯曲隐球酵母或酿酒酵母。
更宽范围贮油生物体的例子可以在Kyle和Ratledge(1992)Industrial applications of Single Cell Oils，American Oil Chemists’Society，Champaign，Illinois一书中找到。
视宿主生物体而定，用于本方法的生物体以技术人员了解的方式进行生长或培养。通常，微生物生长在液体培养基中，培养基包含碳源、氮源、痕量元素并且根据需要还含维生素，其中碳源通常为糖的形式，氮源通常为有机氮源形式(例如酵母提取物)或盐类(例如硫酸铵)，痕量元素例如铁盐、锰盐、镁盐，培养温度在0℃到100℃之间，优选地在10℃和60℃之间，并通以氧气。在这个过程中，液体营养培养基的pH值可保持稳定，也就是可在培养过程中进行调整或不进行调整。分批、半分批或连续培养都是可行的。营养物可以在发酵开始时供应或半连续或连续地提供。
通过使用其中存在重组表达盒的载体，本发明的重组表达盒可有利地导入生物体或其细胞、组织、器官、部分或种子中(优选地导入植物或植物细胞、组织、器官、部分或种子中)。重组表达盒能通过合适的限制性切割位点导入载体(例如质粒)中。得到的质粒首先导入大肠杆菌中。正确转化的大肠杆菌被选择、生长，重组质粒可通过技术人员熟悉的方法获得。限制性分析和测序可用于确认克隆步骤。
使用载体可将本发明的表达盒有利地导入细胞、优选植物细胞中。载体的例子为质粒、粘粒、噬菌体、病毒或农杆菌。在一个优选的实施方案中，表达盒通过质粒载体导入。优选的载体是那些使得表达盒稳定地整合进宿主基因组成为可能的载体。
产生转化生物体(或转化细胞或组织)需要将所讨论的DNA、RNA或蛋白质导入所讨论的宿主细胞。针对被称为转化(或转导或转染)(Keown等(1990)酶学方法185527-537)的过程，有多种方法可用。因此，例如，可以通过显微注射方式或通过包裹有DNA的微粒轰击的方法将DNA或RNA直接导入。此外，细胞可以被化学渗透，例如用聚乙二醇，这样DNA能通过扩散进入细胞。DNA还可以通过与其它含有DNA的单位例如微细胞、细胞、溶酶体或脂质体进行原生质融合而导入。另一合适的导入DNA的方法是电穿孔法，通过电脉冲使细胞被可逆地穿透。这些方法在(Bilang等人(1991)Gene 100247-250；Scheid等人(1991)Mol Gen Genet228104-112；Guerche等人(1987)Plant Science 52111-116；Neuhause等人(1987)Theor Appl Genet 7530-36；Klein等人(1987)Nature 32770-73；Howell等人(1980)Science 2081265；Horsch等人(1985)Science2271229-1231；DeBlock等人(1989)Plant Physiology 91694-701；植物分子生物学方法(Weissbach和Weissbach编辑)Academic Press Inc.(1988)；和植物分子生物学方法(Schuler和Zielinski编辑)Academic Press Inc.(1989))中有所描述。
可使用去饱和酶或共轭酶对大量的生物体优选对植物进行重组修饰，这样生物体成为一种或多种衍生自脂的产物例如两种CLA异构体的从头生产者。通常，植物起始再生发生在转化步骤和相继的培养或生长之后。
用于纤毛虫类和藻类的克隆载体和基因操作技术为技术人员所熟悉(WO 98/01572；Falciatore等人(1999)Marine Biotechnology 1(3)239-251；Dunahay等人(1995)J Phycol 3110004-1012)。
用于将基因导入植物基因组中和用于从植物组织或植物细胞再生植物体的多种方法和载体已知(植物分子生物学和生物技术(CRC Press，BocaRaton，Florida)，6/7章，71-119(1993)；White FF(1993)用于高等植物基因转移的载体；在Transgenic Plants，Bd.1，Engineering and Utilization，Hrsgb.Kung und R.Wu，Academic Press，15-38；Jenes B等人(1993)基因转移技术，在Transgenic Plants，Bd.1，Engineering and Utilization，Hrsgb.Kung und R.Wu，Academic Press，S.128-143；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42205-225；Halford NG，Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1)62-73)。它们包括例如上面提到的那些。在植物中，已描述的用于从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法被用于瞬时或稳定转化。合适的方法特别是通过聚乙二醇诱导DNA摄取的原生质体转化、用基因枪的生物弹道射击法(也称为粒子轰击法)、电穿孔、干胚在DNA溶液中的孵育和显微注射。在这些“直接”转化方法中，所用的质粒不需要满足任何特别要求。可用简单质粒，例如那些来自pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等。如果欲从转化的细胞再生完整的植物，质粒必须包含额外的选择性标记基因。
除这些“直接”转化技术之外，转化也可能通过根瘤农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的细菌感染方法实现。这些菌株包含能随着农杆菌感染而转移进植物中的质粒(分别是Ti和Ri)。所述质粒的一部分为转移DNA(T-DNA)，被整合入植物细胞基因组中。作为替代方案，农杆菌也能转移二元载体(小Ti质粒)进入植物中，然后这些载体整合进植物基因组中。农杆菌介导的转化是最适合双子叶的二倍体植物细胞，而直接转化技术适用于任何细胞类型。农杆菌介导的转化方法被例如Horsch RB等人(1985)Science 2251229f描述。如果用到农杆菌，表达盒被整合进特定的质粒中，即或者整合入穿梭载体(中间载体)或者整合入二元载体。如果Ti或Ri质粒用于转化，Ti或Ri质粒T-DNA的至少右边界，但在此情况下右和左边界作为侧翼区连接至欲插入的表达盒。
二元载体优选地用于使用农杆菌的转化。二元载体在大肠杆菌和农杆菌中都能复制。通常，它们包含选择性标记基因和位于右和左T-DNA边界序列旁侧的接头或多接头。它们能直接转化入农杆菌(Holsters等人(1978)Mol Gen Genet 163181-187)。选择性标记基因是例如赋予卡那霉素抗性的nptII基因，其允许对已转化的农杆菌进行选择。在此情况下，作为宿主生物体的农杆菌应该已经包含带有vir区的质粒。后者对于转移T-DNA进入植物细胞是必须的。以这种方式转化的农杆菌能用于转化植物细胞。对用于转化植物细胞的T-DNA的用途已经进行了深入研究和描述(EP 120 516；Hoekema，在二元植物载体体系，Offsetdrukkerij KantersB.V.，Alblasserdam，V章；An等人(1985)EMBO J 4277-287)。已知多种二元载体，其中的一些已经有市售，例如pBI101.2或pBIN19(ClontechLaboratories，InC.USA；Bevan等人(1984)Nucl Acids Res 128711)、pBinAr、pPZP200或pPTV。
已经用此类载体转化的农杆菌于是可以以已知的方式用于转化植物，特别是作物植物例如油菜籽，例如通过将割下的叶或叶片浸浴在农杆菌溶液中，随后在合适的培养基中培养。用农杆菌转化植物在(White FF，高等植物基因转移载体；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，15-38页；Jenes B等人(1993)基因转移技术，在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol42205-225)。含有本发明上述去饱和酶或共轭酶、去饱和酶原或共轭酶原或proOIL核酸或重组表达盒或载体的转基因植物可以从割下叶或叶片的转化细胞以已知的方式再生。
当选择性标记是插入DNA的一部分时，稳定转化的细胞，即那些包含整合进宿主细胞DNA的插入DNA的细胞，能从非转化细胞中选择出来。例如，能赋予抗生素或除草剂(例如卡那霉素、G 418、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素等)抗性的任何基因能作为标记(见上)。表达这种标记基因的转化细胞能在存在杀死非转化野生型的抗生素或除草剂浓度下存活。例子已在上面提到，优选地包括赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(RathoreKS等人(1993)Plant Mol Biol 21(5)871-884)、赋予卡那霉素抗性的nptII基因、赋予潮霉素抗性的hpt基因、或赋予除草剂草甘膦抗性的EPSP基因。选择性标记使得可将转化细胞从非转化细胞选择出来(McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 581-84)。获得的植物可以以通常的方式培育和杂交。优选培育2代或多代以便确保基因组整合稳定并可遗传。
当转化的植物细胞已经产生，完整的植物就能用技术人员熟悉的方式获得。愈伤组织培养物是起始材料的一个例子。嫩枝和根的发育能在这个至今未分化的细胞生物质中以已知的方式诱导产生。获得的幼苗可以在外种植和生长。合适的方法在(Fennell等人(1992)Plant Cell Rep.11567-570；Stoeger等人(1995)Plant Cell Rep.14273-278；Jahne等(1994)Theor ApplGenet 89525-533)中有描述。
重组表达的核酸的表达效果能例如使用其中一种上述的选择方法，在体外通过幼苗分生组织繁殖而确定。而且，去饱和酶或proOIL核酸序列的性质和表达水平的变化和它们对CLA和/或脂肪酸生物合成速率的影响能在温室中用测试植物测试。
和未转化野生型相比具有提高的CLA产量的那些转基因生物体被优先选择。提高的CLA产量意味着为了本发明目的，例如，和未经遗传修饰的起始生物体相比，在转基因生物体中人工获得提高了CLA、其脂例如辅酶A酯或甘油酯中至少一种化合物的生物合成速率的能力。在本文中，和未经遗传修饰的生物体相比，CLA在转基因生物体中的产量优选地提高了10％，特别优选地提高了50％，非常特别优选地提高了100％。提高也指有利地改变了CLA混合物的质量组成，即与起始生物体相比，在(9Z，11E)-CLA和/或(10E，12Z)-CLA含量上的提高。
在为转基因植物生物体的情况下，也和本发明一致的是其细胞、细胞培养物、部分-例如根、叶等，以及来自于上述转基因生物体的转基因繁殖材料例如种子或果实。
本发明进一步涉及本发明上述的转基因生物体的用途，并在为转基因植物生物体的情况下涉及其细胞、其细胞培养物、其部分-例如根、叶等-和来自于它们的转基因繁殖材料例如种子或果实，用于食物或饲料、化妆品或精细化学品例如游离脂肪酸特别是CLA的生产。特别优选地是用于含CLA的脂，优选甘油三酯的生产用途。
能被人类和动物消费的本发明经遗传修饰的植物也可例如直接地或按照本身已知的加工法用作食物和饲料。
在生物体被培养后，脂类以常规方式获得。为此目的，生物体可首先在收集后消化或直接使用。脂类用合适的溶剂例如非极性溶剂，例如己烷或乙醇、异丙醇或下列混合物例如己烷/异丙醇、酚/氯仿/异戊醇，在0℃和80℃之间，优选地在20℃和50℃之间有利地提取。通常生物量用过量的溶剂提取，例如相对于生物量用1∶4过量的溶剂提取。溶剂随后被移除，例如通过蒸馏。用超临界的CO2提取也可完成提取。提取之后，生物量的残留物被移除，例如通过过滤。
以这种方式得到的原油能接着进一步纯化，例如用极性溶剂例如丙酮或氯仿处理，随后过滤或离心以除去混浊。也可过柱子进一步纯化。
为了从甘油三酯中获得游离脂肪酸，将甘油三酯以通常的方式水解。
本发明进一步涉及这样的植物油、脂肪酸混合物和/或甘油三酯混合物，其中具有增加的不饱和脂肪酸优选CLA含量，并且其通过上面提到的本发明方法生产，还涉及它们在食品、动物饲料、化妆品或医药品生产上的用途。为此目的，将它们以习惯的量加入到食品、动物饲料、化妆品或医药品中。
序列1.SEQ ID NO1编码来自苹果浅褐卷蛾的脂酰辅酶A E11-去饱和酶的核酸序列。
2.SEQ ID NO2编码来自苹果浅褐卷蛾的脂酰辅酶A E11-去饱和酶的蛋白质序列。
3.SEQ ID NO3编码来自欧洲玉米螟的脂酰辅酶A Z/E11-去饱和酶的核酸序列。
4.SEQ ID NO4编码来自欧洲玉米螟的脂酰辅酶A Z/E11-去饱和酶的蛋白质序列。
5.SEQ ID NO5编码来自亚洲玉米螟的脂酰辅酶A Z/E11-去饱和酶的核酸序列6.SEQ ID NO6编码来自亚洲玉米螟的脂酰辅酶A Z/E11-去饱和酶的蛋白质序列。
7.SEQ ID NO7编码来自玉米夜蛾的脂酰辅酶AΔ11-去饱和酶的核酸序列。
8.SEQ ID NO8编码来自玉米夜蛾的脂酰辅酶AΔ11-去饱和酶的蛋白质序列。
9.SEQ ID NO9编码来自粉纹夜蛾的的脂酰辅酶AΔ11-去饱和酶的核酸序列。
10.SEQ ID NO10编码来自粉纹夜蛾的的脂酰辅酶AΔ11-去饱和酶的蛋白质序列。
11.SEQ ID NO11编码来自红带卷蛾的脂酰辅酶AΔ11-去饱和酶的核酸序列。
12.SEQ ID NO12编码来自红带卷蛾的脂酰辅酶AΔ11-去饱和酶的蛋白质序列。
13.SEQ ID NO13编码来自绿头卷蛾的脂酰辅酶A Z10-去饱和酶的核酸序列。
14.SEQ ID NO14编码来自绿头卷蛾的脂酰辅酶A Z10-去饱和酶的蛋白质序列。
15.SEQ ID NO155‘-ATYACHGCCGGKKMYCAYMG-3‘16.SEQ ID NO165‘-GGRAABDYGTGRTGGWAGTT-3‘17.SEQ ID NO175‘-CCCCAYCRNCTSTGGWCNCA-3’18.SEQ ID NO185‘-CCCTCTAGARTGRRWARTTRTGRWA-3’19.SEQ ID NO195‘-TAATACGACTCACTATAG-3‘20.SEQ ID NO205‘-ACATAACTAATTACATGAT-3‘21.SEQ ID NO21编码来自棉花红铃虫的脂酰辅酶A Z/E11-去饱和酶的核酸序列。
22.SEQ ID NO22编码来自棉花红铃虫的脂酰辅酶A Z/E11-去饱和酶的氨基酸序列。
实施例本发明用随后的参照附图的用途实施例进行详细阐述。用到的缩写具有下列意义通用方法为本发明目的所实施的克隆步骤，例如，限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段纯化、将核酸转移到硝酸纤维素膜和尼龙膜、DNA片段连接、大肠杆菌细胞转化、细菌培养和重组DNA序列分析如Sambrook等人(1989)冷泉港实验室出版社；ISBN 0-87969-309-6中所描述的进行。寡核苷酸可以化学合成，例如以已知的方式用磷酰亚胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press，纽约，896-897页)。在本发明内实施的克隆步骤，例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段纯化、将核酸转移到硝酸纤维素膜和尼龙膜、DNA片段连接、大肠杆菌细胞转化、细菌培养、噬菌体繁殖、重组DNA序列分析如Sambrook等人(1989)冷泉港实验室出版社；ISBN0-87969-309-6中所述进行。重组DNA分子用来自Licor的激光荧光DNA测序仪(MWG Biotech销售，Ebersbach)用Sanger法(Sanger等人(1977)Proc Natl Acad Sci USA 745463-5467)测序。
实施例1鳞翅目类昆虫的饲养昆虫保养在容器中合适的宿主植物上。生长条件是27℃，日-夜节律14小时光照，10小时黑暗。昆虫和幼虫每星期两次转移至新鲜的植物。收集蛹(Puppae)，雄性和雌性在饲养容器中保持分离直到成年昆虫孵化。昆虫孵化后大约1到2天，可分离信息素腺。
实施例2通过简并引物分离去饱和酶或共轭酶cDNA信息素腺体从成年蛾的腹部分离出来，冷冻于液氮中直至进行RNA分离，例如通过TRIzol(Gibco/BRL)法，根据厂商的使用说明分离RNA。经验表明约60到80μg的总RNA能从约30mg新鲜组织中分离出来。约5μg总RNA用于产生第一链cDNA，其间使用寡聚(dT)引物。这可以例如用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)根据厂商的使用说明进行。第一链cDNA作为PCR模板，在PCR中去饱和酶/共轭酶cDNA的重要区域被扩增。设计了两条简并引物，以使它们能扩增来自鳞翅目的去饱和酶/共轭酶的重要保守区域，然后用于下面的PCR操作中5μl 稀释的第一链cDNA0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP0.5μM 5’引物(SEQ ID NO8)0.5μM 3’引物(SEQ ID NO9)10μl 5X Advantage 2反应缓冲液(Clontech)1μl 50X Advantage 2 DNA聚合酶混合物(Clontech)加水到50μl
作为可选择方案，将SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的简并引物用作引物对，扩增去饱和酶重要区域。
PCR在以下循环条件下进行94℃(5分钟)；94℃(30秒)，56℃(30秒)，72℃(3分钟)进行35个循环；72℃(10分钟)；4℃放置PCR产物直接连接到例如到线性化的TOPO TA PCR 2.1载体(Invitrogen)，随后转化入感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)中。再扩增阳性菌落，纯化质粒DNA(Qiagen Plasmid Mini Kit)，随后测序。
基于所获得的序列信息，能够推导出基因特异性引物，并用来扩增5’和3’区(SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech))。再次将这些PCR产物连接到TOPO TA PCR 2.1载体中，随后转化入感受态TOP 10细胞(Invitrogen)中。再扩增阳性菌落，纯化质粒DNA(Qiagen Plasmid MiniKit)，随后测序。
从以这种方法产生的片段开始，去饱和酶/共轭酶的全部序列能够通过标准克隆技术连接起来，为了描述目的例如转移到pYES2载体(Invitrogen)中，以便在酵母中表达。酵母INVSc1(Invitrogen)用相应的pYES2表达载体通过改进的PEG/醋酸锂法(Ausubel等人(1996)Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley和Sons，New York)转化。在含有2％葡萄糖的CMdum琼脂平板上的选择后，选择4个pYES2DESAT转化子(pYES2DESATa-d)和一个pYES2转化子用于进一步培养和功能表达。
实施例3去饱和酶/共轭酶在酵母中的功能表达预培养在追加2％(w/v)棉子糖的20ml CMdum液体培养基中接种转基因酵母克隆(pYES2DESATa-d，pYES2)，在30℃、200转/分条件下培养3天，直到600nm(OD600)处的光密度达到1.5-2。
主培养为了表达，追加了2％棉子糖、1％(v/v)Tergitol NP-40的20ml CMdum液体培养基用相应的底物例如硬脂酸、棕榈油酸或肉豆蔻酸调制达到0.003％(w/v)的最终浓度。培养基上接种预培养物，使OD600达到0.05。在OD600为0.2时，使用2％(w/v)半乳糖诱导表达16小时，其后培养物OD600达到0.8到1.2。
脂肪酸分析从酵母培养物中提取全部脂肪酸，并通过气相色谱法分析。为此目的，将5ml细胞培养物通过离心(1000×g，10分钟，4℃)，为了去除脂肪酸和培养基残余物，用100mM pH值为8.0的NaHCO3洗一次。为制备脂肪酸甲酯(FAMES)，细胞沉淀物在液氮中迅速冷冻，然后于30℃N2气下冷冻干燥。沉淀物在含1％甲醇钠的甲醇中匀浆化，然后此匀浆物于室温孵育20分钟。随后加入等体积的1M NaCl和正庚烷，混合样品，将混合液转移到GC管内。样品在配有火焰离子检测器的HewlettPackard 6890气相色谱仪的DB-wax毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm；Agilent J&W)中分离。炉温度设定以20℃/分钟的速率从60℃(保持5分钟)上升到200℃(保持20分钟)，最后以20℃/分钟的速率上升到250℃(保持30分钟)。使用的载气是氮气(1.6ml/分钟)。脂肪酸通过与FAME标准品(SIGMA)的保留时间比较而鉴定。为此目的，以下脂肪酸优选地作为标准品使用c9-16:1，t9-16:1，18:0，c9-18:1，t9-18:1，c11-18:1，t11-18:1，c9，c12-18:2，t9，t12-18:2，c9，t11-18:2，t10，c12-18:2。(标准品的命名法对应于脂肪酸的传统命名法，且首先指出双键的构型(c＝顺式，t＝反式)和位置或脂肪酸链长)。
进一步地用其它不同的脂肪酸(例如月桂酸、反式异油酸、顺式异油酸、E10-十八碳烯酸或Z10-十八碳烯酸)进行补料实验，以用于所述去饱和酶/共轭酶底物选择性的深入验证。
实施例4来自鳞翅目的去饱和酶/共轭酶在酿酒酵母中的克隆表达。
a)cDNA文库的产生从成熟蛾的腹部分离出信息素腺，在液氮中冰冻直到进行总RNA分离，例如通过按照生产商使用说明使用TRIzol(Gibco/BRL)法分离。经验表明约60到80μg总RNA能从约30mg新鲜组织中分离。约5μg总RNA用来产生cDNA文库。这可以通过例如使用SMART cDNA LibraryConstruction Kit(Clontech)实现。分离的双链cDNA最后连接到线性化pYES2(Invitrogen)酵母表达载体中。为此目的，首先将pTriplEx2载体(Clontech)多克隆位点插入到pYES2。双链cDNA用SfiIA和SfiIB消化，然后以直接的方式克隆入经修饰的载体。
b)酵母转化按照生产商使用说明书，用酿酒酵母EASY COMP转化试剂盒(Invitrogen)将约1.5μg质粒DNA转化入INVSc1(Invitrogen)中。两批50μl涂布到大的正方形平皿(245×245mm)中的选择培养基并在30℃温育3天。
c)微量滴定板中的酵母培养使用Pick Roboter把单菌落转移到微量滴定板(MTP)中。预培养在200μl培养基[1×CSM-Ura；无氨基酸和糖的1×YNB；0.5％棉子糖；5％甘油；40mg/l硫酸腺嘌呤；0.5％硫酸铵]中于30℃进行72小时，每分钟250转。在主培养中通过添加平均量预培养物调整到OD600为0.2。主培养在1ml培养基[1×CSM-Ura；无氨基酸和糖的1×YNB；0.5％棉子糖；2％半乳糖；0.2％Tergitol NP-40；40mg/l硫酸腺嘌呤；0.5％硫酸铵；0.3mM脂肪酸底物]中16℃进行2到3星期，每分钟250转，直到达到OD600为3到4。
d)脂肪酸分析沉淀酵母细胞(1000g，10分钟，4℃)，在-80℃保存，直到进一步处理。为了制备脂肪酸甲酯(FAMES)，细胞沉淀物在液氮中迅速冷冻，并于30℃的N2气体下冻干。沉淀物在含1％甲醇钠的甲醇中匀浆化并在室温下孵育20分钟。加入等体积的1M NaCl和正庚烷，混合样品，上清液转移到GC管内。样品在配有火焰离子检测器的Hewlett Packard 6890气相色谱仪的DB-wax毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm；Agilent J&W)中分离。炉温度设定以20℃/分钟的速率从60℃(保持5分钟)上升到200℃(保持20分钟)，最后以20℃/分钟的速率上升到250℃(保持30分钟)。使用的载气是氮气(1.6ml/分钟)。脂肪酸通过与FAME标准品(SIGMA)的保留时间比较鉴定。使用在实施例3中列出的同样的标准品。进一步地用其它不同脂肪酸(例如月桂酸、反式异油酸、顺式异油酸、E10-十八碳烯酸或Z10-十八碳烯酸)进行补料实验，以用于所述饱和酶/共轭酶底物选择性的深入验证。
e)阳性酵母质粒制备已经检验为阳性的单菌落再一次在10ml的极限培养基[1×CSM-Ura；1×YNB w/o AA，糖；2％葡萄糖；40mg/l硫酸腺嘌呤]中培养24小时，温度为28℃，当OD600超过3时，通过离心沉淀。酵母沉淀物在400μl的SCE缓冲液[1.2M山梨醇；0.1M柠檬酸钠，pH 7.0；10mM EDTA；1mg/ml Lytikase]中37℃温育20分钟。然后，加入400μl的STE缓冲液[2％SDS；50mM Tris/HCl，pH 8.0；10mM EDTA]到细胞裂解液中，其混合液在常温下孵育10分钟。为了沉淀细胞蛋白质，加入200μl 5M醋酸钠，其混合物在冰上搁置30分钟。离心后，转移上清液并用2.5倍体积的乙醇沉淀。沉淀用70％乙醇洗，最后溶于无菌水中。根据需要，去饱和酶/共轭酶的序列可以用载体特异性引物(SEQ ID NO12和13)通过测序确定。
实施例5植物脂肪酸生物合成的操作a)用于在转基因植物中表达来自鳞翅目的去饱和酶/共轭酶的DNA构建体的产生为了产生嵌合DNA构建体，用于产生表达来自鳞翅目的去饱和酶/共轭酶的转基因拟南芥或欧洲油菜(B.napus)植物，使用了pBinAR载体(Hfgen和Willmitzer(1990)Plant Sci 66221-230)。此载体包含CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子(Franck等人(1980)Cell 21(1)285-294)和章鱼碱合酶基因的终止信号(Gielen等人(1984)EMBO J 3835-846)。在去饱和酶/共轭酶克隆入该载体后，产生了转基因拟南芥和欧洲油菜植物。
b)转基因拟南芥植物的产生野生型拟南芥植物(哥伦比亚型)用根瘤农杆菌菌株(GV3101[pMP90])转化，基于改良真空渗入方法(Clough S和Bent A(1998)Plant J 16(6)735-43；Bechtold N等人(1993)通过浸润成熟的拟南芥植物进行植物的农杆菌介导的基因转移，CRAcad Sci Paris 1144(2)204-212)。所用的根瘤农杆菌细胞事先用质粒转化。初级转化子的种子可基于它们对抗生素的抗性进行选择。对抗生素有抗性的幼苗种植到土壤中，将充分发育后的植物用于生化分析。
c)转基因欧洲油菜植物的产生转基因油菜籽植物依据Bade JB和Damm B(在Gene Transfer toPlants一书中，Potrykus I和Spangenberg G(编辑)Springer Lab Manual，Springer Verlag，1995，30-38)所述方法产生，其中也描述了使用的培养基和缓冲液的组成。
用根瘤农杆菌菌株GV3101[pMP90]实施转化。pBinAR-TkTP/VitE-AT质粒用于转化。欧洲油菜变种Westar的种子用70％乙醇(v/v)表面灭菌，在55℃水中洗10分钟，在浓度为1％的次氯酸盐溶液(25％v/v Teepol，0.1％v/v Tween 20)中孵育20分钟，在每种情况下用无菌水洗六次。种子在滤纸上干燥3天，10到15粒种子在装有15ml发芽培养基的玻璃烧瓶中让其发芽。除掉几株幼苗(大小约10cm)的根和顶芽，将剩下的下胚轴切成约6mm长的块。这样得到的约600外植体用50ml基础培养基洗30分钟，并转移至300ml烧瓶。在加入100ml的愈伤组织诱导培养基后，培养物于100转/分钟孵育24小时。
农杆菌菌株的过夜培养物在29℃下产生于添加有卡那霉素(20mg/l)的Luria培养液，将2ml的上述培养物在50ml无卡那霉素的Luria培养液于29℃孵育4小时，直到OD600达到0.4到0.5。培养物于2000转/分钟沉淀25分钟后，将细胞沉淀在25ml基础培养基中重悬。在溶液中的细菌浓缩物通过加入更多的基础培养基使其OD600为0.3。
用无菌吸管从油菜籽外植体中移除愈伤组织诱导培养基，加入50ml农杆菌溶液，小心混合培养物，孵育20分钟。移除农杆菌悬浮液，用50ml的愈伤组织诱导培养基洗油菜籽外植体1分钟，随后加入100ml的愈伤组织诱导培养基。在定轨摇床上以100转/分钟共培养24小时。通过回收愈伤组织诱导培养基停止共培养，在100转/每分钟下，外植体用25ml清洗培养基洗两次，每次一分钟，然后清洗两次60分钟，每次100ml清洗培养基。清洗培养基和外植体一起转移到15cm平皿中，然后用无菌移液管移除培养基。
为了再生，将以20到30为一批的外植体转移到90mm的容纳有25ml添加了卡那霉素的枝条诱导培养基的平皿中。平皿装有2层Leukopor，在25℃和2000勒克斯，16小时光照/8小时无光条件下培育。每隔12天，发育中的愈伤组织被转移到新鲜的装有枝条诱导培养基的平皿中。用以再生完整植物体的所有进一步的步骤都是如Bade，J.B和Damm，B.(在Gene Transfer to Plants，Potrykus I和Spangenberg G(编辑)Springer LabManual，Springer Verlag，1995，30-38)所述进行。
d)转基因植物中脂肪酸形式的分析转基因植物的种子在甲醇钠含量为1％的甲醇溶液中匀浆，将匀浆物在常温下孵育20分钟。随后加入等体积的1M NaCl和正庚烷，混合样品，上清液转移到GC管中。这些样品在配有火焰离子检测器的HewlettPackard 6890气相色谱仪的DB-wax毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm；Agilent J&W)中分离。炉温度设定以20℃/分钟的速率从60℃(保持5分钟)上升到200℃(保持20分钟)，最后以20℃/分钟的速率上升到250℃(保持30分钟)。使用的载气是氮气(1.6ml/分钟)。脂肪酸通过与FAME标准品(SIGMA)的保留时间比较而确定。使用在实施例3中所述的同样标准品。
实施例6，来自鳞翅目棉花红铃虫去饱和酶在酵母中的功能性表达从棉花红铃虫(SEQ ID NO21和22)腺体中分离的去饱和酶借助于BamHI和EcoRI克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen)。由此产生的构建体被命名为pYES2::DesPgos。pYES2::DesPgos和对照pYES2都使用S.c.Easy Comp转化试剂盒(Invitrogen)转化入酵母细胞(酿酒酵母INVSc1[MAT，his3-1，leu2，trp1-289，ura3-52]；Invitrogen)。这些酵母细胞还另外包含了构建体pESC::ACS，以用于表达欧洲油菜脂酰辅酶A合酶。pYES2::DesPgos和对照pYES2的单菌落从选择培养基上分离并且在50毫升预培养基(1*CSM-Leu/-Ura；1*YNB w/o AA；0.5％棉子糖；5％甘油和0.5％硫酸铵)中在30℃每分钟200转培养2天以产生预培养物。从这些预培养物中，将用pYES2::DesPgos的酵母以吸光度为OD0.06，用pYES2的酵母以吸光度为OD0.1接种于主培养基中，每种接种3瓶，同时培养于16℃和30℃。主培养基(1*CSM-Leu/-Ura；1*YNB w/o AA；0.5％棉子糖；2％半乳糖；0.2％Tergitol NP-40和0.5％硫酸铵)用0.3mM硬脂酸处理。16℃下培养4天，30℃下培养2天后，主培养物的吸光度调整到OD1.2，10毫升培养物在室温下以17500g离心30分钟。沉淀物用水悬浮，在90℃下加热10分钟后以同样条件离心。沉淀物用水洗，沉淀后，用液氮快速冷冻，随后在氮气下冻干。为了提取脂类并制备脂肪酸甲酯，沉淀在300μl1％甲醇钠的甲醇溶液中匀浆并且在室温中孵育20分钟。在各种情况下，随后加入300μl 1M氯化钠和正庚烷，混合样品并将上清转移到GC管中。样品在配有火焰离子检测器的Hewlett Packard 6890气相色谱仪的DB-wax毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm；Agilent J&W)中分离。炉温度设定以20℃/分钟的速率从60℃(保持5分钟)上升到200℃(保持20分钟)，最后以20℃/分钟的速率上升到250℃(保持30分钟)。使用的载气是氮气(1.6ml/分钟)。脂肪酸通过与FAME标准品(SIGMA)的保留时间比较而鉴定。
表1显示在16℃时来源于pYES2::DesPgos的脂类的FAME与对照pYES2相比的相对分布。可见棉花红铃虫去饱和酶的表达导致以下单不饱和脂肪酸的积累C16:1D11，C18:1D11和C18:1D13。并且棉花红铃虫去饱和酶的异源表达导致(9Z，11E)-CLA的形成。
表2显示在30℃时来源于pYES2::DesPgos的脂类的FAME与对照pYES2相比的相对分布。在30℃时的表达结果与在16℃时相符在酵母中棉花红铃虫去饱和酶的表达导致单不饱和脂肪酸C16:1D11，C18:1D11和C18:1D13的积累。并且棉花红铃虫去饱和酶的异源表达导致(9Z，11E)-CLA的形成。
表116℃时在酿酒酵母中棉花红铃虫去饱和酶的异源表达数值代表单一脂肪酸在全部脂肪酸谱中的相对量
表230℃时在酿酒酵母中棉花红铃虫去饱和酶的异源表达数值代表单一脂肪酸在全部脂肪酸谱中的相对量
序列表<110>巴斯福植物科学有限公司<120>用于产生不饱和脂肪酸的方法<130>AE20030075-PCT<140>
<141>
<160>22<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>999<212>DNA<213>苹果浅褐卷蛾(Epiphyas postvittana)<220>
<221>CDS<222>(1)..(996)<223>脂酰辅酶A E11去饱和酶<400>1atg gct cca aac gta gaa gaa att gaa act gat tta aca gaa act gaa48Met Ala Pro Asn Val Glu Glu Ile Glu Thr Asp Leu Thr Glu Thr Glu1 5 10 15gag aaa tgg gaa aaa tta gtt gca ccc cag gct gct ccc aga aag cat96Glu Lys Trp Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys His20 25 30gaa ata tta tac acg aac ctg cta atc ttc ggc tac ggg cat ctc gct144Glu Ile Leu Tyr Thr Asn Leu Leu Ile Phe Gly Tyr Gly His Leu Ala35 40 45gga ctg tac ggt tta tac ctg tgc ttc act tct gct cga ttg caa act192Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Arg Leu Gln Thr50 55 60att ata ctt gct ttc atc ctt cac gca atg gca atc ttg ggc ata aca240Ile Ile Leu Ala Phe Ile Leu His Ala Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr65 70 75 80gcc ggc gct cac aga ctc tgg aca cac aga agc tac aaa gcg aca atg288Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Arg Ser Tyr Lys Ala Thr Met85 90 95cct ctt caa atc atc ctt ata att ttc aac tcg ctg tca ttc caa aac336Pro Leu Gln Ile Ile Leu Ile Ile Phe Asn Ser Leu Ser Phe Gln Asn100 105 110agt gcc att aat tgg gtc aga gac cac cga tcg cac cac aag tat tgt384Ser Ala Ile Asn Trp Val Arg Asp His Arg Ser His His Lys Tyr Cys115 120 125
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<400>2Met Ala Pro Asn Val Glu Glu Ile Glu Thr Asp Leu Thr Glu Thr Glu1 5 10 15Glu Lys Trp Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys His20 25 30Glu Ile Leu Tyr Thr Asn Leu Leu Ile Phe Gly Tyr Gly His Leu Ala35 40 45Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Arg Leu Gln Thr50 55 60Ile Ile Leu Ala Phe Ile Leu His Ala Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr65 70 75 80Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Arg Ser Tyr Lys Ala Thr Met85 90 95Pro Leu Gln Ile Ile Leu Ile Ile Phe Asn Ser Leu Ser Phe Gln Asn100 105 110Ser Ala Ile Asn Trp Val Arg Asp His Arg Ser His His Lys Tyr Cys115 120 125Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ala Arg Gly Leu Phe Tyr Ser130 135 140His Ile Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Lys Arg145 150 155 160Gly Lys Met Thr Asp Met Ser Asp Val Tyr Arg Asn Pro Val Leu Arg165 170 175Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Val Pro Phe Ile Gly Thr Ile Cys Phe Val180 185 190Leu Pro Thr Ile Ile Pro Met Tyr Phe Trp Gly Glu Ser Leu Asn Asn195 200 205Ala Trp His Ile Thr Leu Leu Arg Tyr Ile Phe Ser Met His Thr Ile210 215 220Phe Leu Val Asn Ser Val Ala His Leu Trp Gly Asn Arg Pro Tyr Asp225 230 235 240Lys Asn Ile Leu Pro Ala Asp Asn Arg Thr Leu Ser Ile Ala Thr Leu245 250 255Gly Glu Ala Ser His Asn Tyr His His Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Arg260 265 270Ser Thr Glu Leu Gly Tyr Leu Pro Thr Asn Phe Thr Thr Asn Phe Ile275 280 285Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Thr Ser290 295 300
Gly Glu Ile Ile Asn Ser Arg Ile Gln Arg Thr Gly Asp Gly Thr His305 310 315 320Ser Arg Ser Lys Lys Asn Ile Ser Thr Gln Asp Glu325 330<210>3<211>990<212>DNA<213>欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(987)<223>脂酰辅酶A E/Z11去饱和酶<400>3atg gtt cca tac gct acc aca gca gat gga cat cca gaa aaa gat gag48Met Val Pro Tyr Ala Thr Thr Ala Asp Gly His Pro Glu Lys Asp Glu1 5 10 15tgc ttt gaa gat aat gaa atc aaa tcg aat tcc ttg ccg aaa ctg gaa96Cys Phe Glu Asp Asn Glu Ile Lys Ser Asn Ser Leu Pro Lys Leu Glu20 25 30ata cta tac ttc aac gtt atg aca ttc acg ttc tta cat cta tct gcg144Ile Leu Tyr Phe Asn Val Met Thr Phe Thr Phe Leu His Leu Ser Ala35 40 45ctt tat ggg ctg tat ttg gga ttt aca tca gtt aaa tgg gca act ata192Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Gly Phe Thr Ser Val Lys Trp Ala Thr Ile50 55 60gga ctt gga att ata ttt tat ttt ttt gct gag att gga atc act gct240Gly Leu Gly Ile Ile Phe Tyr Phe Phe Ala Glu Ile Gly Ile Thr Ala65 70 75 80ggt gcc cat aga tta tgg agc cac aga agc tac aaa gcg aaa ctc ccc288Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Lys Ala Lys Leu Pro85 90 95ctg gaa ata ctt ctc atg gtg ttt aac agc atg gca ttt caa aat act336Leu Glu Ile Leu Leu Met Val Phe Asn Ser Met Ala Phe Gln Asn Thr100 105 110gcg ctc tcg tgg gcc aga gac cat cgt gtg cac cat aaa tgt cct gac384Ala Leu Ser Trp Ala Arg Asp His Arg Val His His Lys Cys Pro Asp115 120 125acc aat ggt gat cct cac aat gcg aat cga gga ttc ttc tat tca cat432Thr Asn Gly Asp Pro His Asn Ala Asn Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His130 135 140gta gga tgg cta atg acc aaa aaa tct gat gaa gtc atc aaa cag gga480Val Gly Trp Leu Met Thr Lys Lys Ser Asp Glu Val Ile Lys Gln Gly145 150 155 160
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<210>5<211>990<212>DNA<213>亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(987)<223>脂酰辅酶A E/Z11去饱和酶<400>5atg gtt cca tac gct acc aca gca gat gga cat cca gaa aaa gat gag48Met Val Pro Tyr Ala Thr Thr Ala Asp Gly His Pro Glu Lys Asp Glu1 5 10 15tgc ttt gaa gat aat gaa atc aaa tcg aat tcc ttg ccg aaa ctg gaa96Cys Phe Glu Asp Asn Glu Ile Lys Ser Asn Ser Leu Pro Lys Leu Glu20 25 30ata cta tac ttc aac gtt atg aca ttc acg ttc tta cat cta tct gcg144Ile Leu Tyr Phe Asn Val Met Thr Phe Thr Phe Leu His Leu Ser Ala35 40 45ctt tat ggg ctg tat ttg gga ttt aca tca gtt aaa tgg gca act ata192Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Gly Phe Thr Ser Val Lys Trp Ala Thr Ile50 55 60gga ctt gga att ata ttt tat ttt ttt gct gag att gga atc act gct240Gly Leu Gly Ile Ile Phe Tyr Phe Phe Ala Glu Ile Gly Ile Thr Ala65 70 75 80ggt gcc cat aga cta tgg agc cac aga agc tac aaa gcg aaa ctc ccc288Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Lys Ala Lys Leu Pro85 90 95ctg gaa ata ctt ctc atg gtg ttt aac agc atg gca ttt caa aat act336Leu Glu Ile Leu Leu Met Val Phe Asn Ser Met Ala Phe Gln Asn Thr100 105 110gcg ctc tcg tgg gcc aga gac cat cgt gtg cac cat aaa tgt cct gac384Ala Leu Ser Trp Ala Arg Asp His Arg Val His His Lys Cys Pro Asp115 120 125acc aat ggt gat cct cac aat gcg aat cga gga ttc ttc tat tcg cac432Thr Asn Gly Asp Pro His Asn Ala Asn Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His130 135 140gta gga tgg cta atg acc aag aaa tct gat gaa gtc atc aaa cag gga480Val Gly Trp Leu Met Thr Lys Lys Ser Asp Glu Val Ile Lys Gln Gly145 150 155 160aaa ttg tgt gat gtg gct gat tta tac agt aac cct gtg tta cgt ttc528Lys Leu Cys Asp Val Ala Asp Leu Tyr Ser Asn Pro Val Leu Arg Phe165 170 175cag aaa aaa tac gca gtg ccg ttt att gga acg ctt tgt ttc gtt ctc576Gln Lys Lys Tyr Ala Val Pro Phe Ile Gly Thr Leu Cys Phe Val Leu180 185 190
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<221>CDS
<222>(1)..(1014)<223>脂酰辅酶AΔ-11去饱和酶<400>7atg gcc caa agc tat caa tca act acg gtt ttg agt gag gag aaa gaa48Met Ala Gln Ser Tyr Gln Ser Thr Thr Val Leu Ser Glu Glu Lys Glu1 5 10 15cta aca ctg caa cat ttg gtg ccc caa gca tcg ccc agg aag tat caa96Leu Thr Leu Gln His Leu Val Pro Gln Ala Ser Pro Arg Lys Tyr Gln20 25 30ata gtg tat ccg aac ctc att acg ttt ggt tac tgg cac ata gcc gga144Ile Val Tyr Pro Asn Leu Ile Thr Phe Gly Tyr Trp His Ile Ala Gly35 40 45ctt tat ggc ctt tac ttg tgc ttc act tct gct aaa tgg gct acg att192Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Ala Thr Ile50 55 60tta ttc agc tac atc ctc ttc gtg tta gca gaa ata gga atc acg gct240Leu Phe Ser Tyr Ile Leu Phe Val Leu Ala Glu Ile Gly Ile Thr Ala65 70 75 80ggc gct cac aga ctc tgg gcc cac aaa act tac aaa gcg aaa cta cca288Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Leu Pro85 90 95tta gaa ata ctc tta atg gta ttc aac tcc atc gct ttt caa aac tca336Leu Glu Ile Leu Leu Met Val Phe Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asn Ser100 105 110gcc att gac tgg gtg agg gac cac cga ctc cac cat aag tat agc gat384Ala Ile Asp Trp Val Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser Asp115 120 125aca gat gct gat ccc cac aat gcc agc cga ggg ttc ttt tat tcc cat432Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His130 135 140gta gga tgg cta ctt gtg aga aaa cat cct gaa gtc aaa aag cga ggg480Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Glu Val Lys Lys Arg Gly145 150 155 160aaa gaa ctc aat atg tcc gat att tac aac aat cct gtc ctg cgg ttt528Lys Glu Leu Asn Met Ser Asp Ile Tyr Asn Asn Pro Val Leu Arg Phe165 170 175cag aaa aaa tac gcc ata ccc ttc att ggg gct gtt tgt ttc gcc tta576Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Ala Val Cys Phe Ala Leu180 185 190cct aca atg ata cct gtt tac ttc tgg gga gaa acc tgg tcc aat gct624Pro Thr Met Ile Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Trp Ser Asn Ala195 200 205tgg cat atc acc atg ctt cgc tac atc atg aac ctc aat gtc acc ttt672Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Ile Met Asn Leu Asn Val Thr Phe
210 215 220ttg gta aac agc gct gct cat ata tgg gga aac aag cct tat gac gca720Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Asn Lys Pro Tyr Asp Ala225 230 235 240aaa ata tta cct gca caa aat gta gct gtg tcg gtc gcc act ggt gga768Lys Ile Leu Pro Ala Gln Asn Val Ala Val Ser Val Ala Thr Gly Gly245 250 255gaa ggt ttc cat aat tac cac cat gtc ttc ccc tgg gat tat cga gca816Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala260 265 270gcg gaa ctc ggt aac aat agc ctc aat ctg acg act aaa ttc ata gat864Ala Glu Leu Gly Asn Asn Ser Leu Asn Leu Thr Thr Lys Phe Ile Asp275 280 285tta ttc gca gca atc gga tgg gca tat gat ctg aag acg gtt tcg gag912Leu Phe Ala Ala Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Glu290 295 300gat atg ata aaa caa agg att aaa cgc act gga gat gga acg gat ctt960Asp Met Ile Lys Gln Arg Ile Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp Leu305 310 315 320tgg gga cac gaa caa aac tgt gat gaa gtg tgg gat gta aaa gat aaa1008Trp Gly His Glu Gln Asn Cys Asp Glu Val Trp Asp Val Lys Asp Lys325 330 335tca agt taa1017Ser Ser<210>8<211>338<212>PRT<213>玉米夜蛾<400>8Met Ala Gln Ser Tyr Gln Ser Thr Thr Val Leu Ser Glu Glu Lys Glu1 5 10 15Leu Thr Leu Gln His Leu Val Pro Gln Ala Ser Pro Arg Lys Tyr Gln20 25 30Ile Val Tyr Pro Asn Leu Ile Thr Phe Gly Tyr Trp His Ile Ala Gly35 40 45Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Ala Thr Ile50 55 60Leu Phe Ser Tyr Ile Leu Phe Val Leu Ala Glu Ile Gly Ile Thr Ala65 70 75 80Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Leu Pro85 90 95
Leu Glu Ile Leu Leu Met Val Phe Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asn Ser100 105 110Ala Ile Asp Trp Val Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser Asp115 120 125Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His130 135 140Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Glu Val Lys Lys Arg Gly145 150 155 160Lys Glu Leu Asn Met Ser Asp Ile Tyr Asn Asn Pro Val Leu Arg Phe165 170 175Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Ala Val Cys Phe Ala Leu180 185 190Pro Thr Met Ile Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Trp Ser Asn Ala195 200 205Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Ile Met Asn Leu Asn Val Thr Phe210 215 220Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Asn Lys Pro Tyr Asp Ala225 230 235 240Lys Ile Leu Pro Ala Gln Asn Val Ala Val Ser Val Ala Thr Gly Gly245 250 255Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala260 265 270Ala Glu Leu Gly Asn Asn Ser Leu Asn Leu Thr Thr Lys Phe Ile Asp275 280 285Leu Phe Ala Ala Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Glu290 295 300Asp Met Ile Lys Gln Arg Ile Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp Leu305 310 315 320Trp Gly His Glu Gln Asn Cys Asp Glu Val Trp Asp Val Lys Asp Lys325 330 335Ser Ser<210>9<211>1050<212>DNA<213>粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1047)
<223>脂酰辅酶AΔ11去饱和酶<400>9atg gct gtg atg gct caa aca gta caa gaa acg gct aca gtg ttg gaa48Met Ala Val Met Ala Gln Thr Val Gln Glu Thr Ala Thr Val Leu Glu1 5 10 15gag gaa gct cgc aca gtg act ctt gtg gct cca aag aca acg cca agg96Glu Glu Ala Arg Thr Val Thr Leu Val Ala Pro Lys Thr Thr Pro Arg20 25 30aaa tat aaa tat ata tac acc aac ttt ctt aca ttt tca tat gcg cat144Lys Tyr Lys Tyr Ile Tyr Thr Asn Phe Leu Thr Phe Ser Tyr Ala His35 40 45tta gct gca tta tac gga ctt tat ttg tgc ttc acc tct gcg aaa tgg192Leu Ala Ala Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp50 55 60gaa aca ttg cta ttc tct ttc gta ctc ttc cac atg tca aat ata ggc240Glu Thr Leu Leu Phe Ser Phe Val Leu Phe His Met Ser Asn Ile Gly65 70 75 80atc acc gca ggg gct cac cga ctc tgg act cac aag act ttc aaa gcc288Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Lys Thr Phe Lys Ala85 90 95aaa ttg cct ttg gaa att gtc ctc atg ata ttc aac tct tta gcc ttt336Lys Leu Pro Leu Glu Ile Val Leu Met Ile Phe Asn Ser Leu Ala Phe100 105 110caa aac acg gct att aca tgg gct aga gaa cat cgg cta cat cac aaa384Gln Asn Thr Ala Ile Thr Trp Ala Arg Glu His Arg Leu His His Lys115 120 125tac agc gat act gat gct gat ccc cac aat gcg tca aga ggg ttc ttc432Tyr Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe130 135 140tac tcg cat gtt ggc tgg cta tta gta aaa aaa cat ccc gat gtc ctg480Tyr Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Asp Val Leu145 150 155 160aaa tat gga aaa act ata gac atg tcg gat gta tac aat aat cct gtg528Lys Tyr Gly Lys Thr Ile Asp Met Ser Asp Val Tyr Asn Asn Pro Val165 170 175tta aaa ttt cag aaa aag tac gca gta ccc tta att gga aca gtt tgt576Leu Lys Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Val Pro Leu Ile Gly Thr Val Cys180 185 190ttt gct ctt cca act ttg att cca gtc tac tgt tgg ggc gaa tcg tgg624Phe Ala Leu Pro Thr Leu Ile Pro Val Tyr Cys Trp Gly Glu Ser Trp195 200 205aac aac gct tgg cac ata gcc tta ttt cga tac ata ttc aat ctt aac672Asn Asn Ala Trp His Ile Ala Leu Phe Arg Tyr Ile Phe Asn Leu Asn210 215 220
gtg act ttc cta gtc aac agt gct gcg cat atc tgg ggg aat aag cct720Val Thr Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Asn Lys Pro225 230 235 240tat gat aaa agc atc ttg ccc gct caa aac ctg ctg gtt tcc ttc cta768Tyr Asp Lys Ser Ile Leu Pro Ala Gln Asn Leu Leu Val Ser Phe Leu245 250 255gca agt gga gaa ggc ttc cat aat tac cat cac gtc ttt cca tgg gat816Ala Ser Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp260 265 270tac cgc aca gca gaa tta ggg aat aac ttc ctg aat ttg acg acg ctg864Tyr Arg Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn Phe Leu Asn Leu Thr Thr Leu275 280 285ttc att gat ttt tgt gcc tgg ttt gga tgg gct tat gac ttg aag tct912Phe Ile Asp Phe Cys Ala Trp Phe Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser290 295 300gta tca gag gat att ata aaa cag aga gct aaa cga aca ggt gac ggt960Val Ser Glu Asp Ile Ile Lys Gln Arg Ala Lys Arg Thr Gly Asp Gly305 310 315 320tct tca ggg gtc att tgg gga tgg gac gac aaa gac atg gac cgc gat1008Ser Ser Gly Val Ile Trp Gly Trp Asp Asp Lys Asp Met Asp Arg Asp325 330 335ata aaa tct aaa gct aac att ttt tat gct aaa aag gaa tga1050Ile Lys Ser Lys Ala Asn Ile Phe Tyr Ala Lys Lys Glu340 345<210>10<211>349<212>PRT<213>粉纹夜蛾<400>10Met Ala Val Met Ala Gln Thr Val Gln Glu Thr Ala Thr Val Leu Glu1 5 10 15Glu Glu Ala Arg Thr Val Thr Leu Val Ala Pro Lys Thr Thr Pro Arg20 25 30Lys Tyr Lys Tyr Ile Tyr Thr Asn Phe Leu Thr Phe Ser Tyr Ala His35 40 45Leu Ala Ala Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp50 55 60Glu Thr Leu Leu Phe Ser Phe Val Leu Phe His Met Ser Asn Ile Gly65 70 75 80Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Lys Thr Phe Lys Ala85 90 95
Lys Leu Pro Leu Glu Ile Val Leu Met Ile Phe Asn Ser Leu Ala Phe100 105 110Gln Asn Thr Ala Ile Thr Trp Ala Arg Glu His Arg Leu His His Lys115 120 125Tyr Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe130 135 140Tyr Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Asp Val Leu145 150 155 160Lys Tyr Gly Lys Thr Ile Asp Met Ser Asp Val Tyr Asn Asn Pro Val165 170 175Leu Lys Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Val Pro Leu Ile Gly Thr Val Cys180 185 190Phe Ala Leu Pro Thr Leu Ile Pro Val Tyr Cys Trp G1y Glu Ser Trp195 200 205Asn Asn Ala Trp His Ile Ala Leu Phe Arg Tyr Ile Phe Asn Leu Asn210 215 220Val Thr Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly Asn Lys Pro225 230 235 240Tyr Asp Lys Ser Ile Leu Pro Ala Gln Asn Leu Leu Val Ser Phe Leu245 250 255Ala Ser Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp260 265 270Tyr Arg Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn Phe Leu Asn Leu Thr Thr Leu275 280 285Phe Ile Asp Phe Cys Ala Trp Phe Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser290 295 300Val Ser Glu Asp Ile Ile Lys Gln Arg Ala Lys Arg Thr Gly Asp Gly305 310 315 320Ser Ser Gly Val Ile Trp Gly Trp Asp Asp Lys Asp Met Asp Arg Asp325 330 335Ile Lys Ser Lys Ala Asn Ile Phe Tyr Ala Lys Lys Glu340 345<210>11<211>990<212>DNA<213>红带卷蛾(Argyrotaenia velutinana)<220>
<221>CDS<222>(1)..(987)
<223>脂酰辅酶AΔ11去饱和酶<400>11atg gct cca aat gcg gaa gat att gaa acg aat atg cca gaa act gaa48Met Ala Pro Asn Ala Glu Asp Ile Glu Thr Asn Met Pro Glu Thr Glu1 5 10 15gag aac tgg gaa aca tta gta gca cct caa gca gcg cct aga aaa tat96Glu Asn Trp Glu Thr Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys Tyr20 25 30caa att gtg tat aaa agc ctc tta act ttt ggc tac gga cac ctc gct144Gln Ile Val Tyr Lys Ser Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Gly His Leu Ala35 40 45ggt cta tat ggt tta tat ttg tgc ttt act tcc gct aaa tgg caa act192Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr50 55 60att gga ctt gct atc atc ctc cac gcg atg gca atc ttg ggc atc aca240Ile Gly Leu Ala Ile Ile Leu His Ala Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr65 70 75 80gca ggc gct cac cga ctc tgg aca cac aga gca tac aaa gcg acg gtg288Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Arg Ala Tyr Lys Ala Thr Val85 90 95ccc ctc caa atc atc ctc ata atc ttc aac tcc ctg tcg ttc caa aac336Pro Leu Gln Ile Ile Leu Ile Ile Phe Asn Ser Leu Ser Phe Gln Asn100 105 110agc gcc ttt act tgg atc aga gac cac aga ctc cac cac aag tat agt384Ser Ala Phe Thr Trp Ile Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser115 120 125gac aca gac ggg gat ccc cac aat gca acc aga ggg ttc ttt tac tct432Asp Thr Asp Gly Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser130 135 140cat atc gga tgg ctg ttg gtg agg aaa cac cct gaa gtc atg aag agg480His Ile Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Glu Val Met Lys Arg145 150 155 160gga aga atg acc gag atg tcg gat att tac agc aat cct atc ata atg528Gly Arg Met Thr Glu Met Ser Asp Ile Tyr Ser Asn Pro Ile Ile Met165 170 175ttt caa aaa aac tac gct ata cct ttc ata ggc acg gtg tgt ttc gta576Phe Gln Lys Asn Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Thr Val Cys Phe Val180 185 190ctt ccc aca ata ata ccc atg tac ttc tgg gga gag acg ttg aac aac624Leu Pro Thr Ile Ile Pro Met Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Leu Asn Asn195 200 205gct tgg cat ata acg gtg ctg cgc tac att ttt agc ctc aac tgc ata672Ala Trp His Ile Thr Val Leu Arg Tyr Ile Phe Ser Leu Asn Cys Ile210 215 220
ttc ctc gtg aac agc gca gcc cat tta tac ggc tac aag cca tac gac720Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Tyr Gly Tyr Lys Pro Tyr Asp225 230 235 240aag aac att ttg cca gcg gaa aac aaa gca gct tca atc gca tct ttt768Lys Asn Ile Leu Pro Ala Glu Asn Lys Ala Ala Ser Ile Ala Ser Phe245 250 255gga gaa gcc ttc cat aac tat cat cat gtg ttt cct tgg gac tac aga816Gly Glu Ala Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg260 265 270gct tct gaa cta ggt aat ata aca atg aat tgg aca ata tat ttc att864Ala Ser Glu Leu Gly Asn Ile Thr Met Asn Trp Thr Ile Tyr Phe Ile275 280 285gat ttc ttc gct tgg atc ggc tgg gct tac gac ttg aaa act gca tcg912Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser290 295 300gat gag act att aaa agc aga ata aaa aga act ggc gat ggt act gac960Asp Glu Thr Ile Lys Ser Arg Ile Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp305 310 315 320ttc tcg ggc cag caa ata tac gca aga tga990Phe Ser Gly Gln Gln Ile Tyr Ala Arg325<210>12<211>329<212>PRT<213>红带卷蛾<400>12Met Ala Pro Asn Ala Glu Asp Ile Glu Thr Asn Met Pro Glu Thr Glu1 5 10 15Glu Asn Trp Glu Thr Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys Tyr20 25 30Gln Ile Val Tyr Lys Ser Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Gly His Leu Ala35 40 45Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr50 55 60Ile Gly Leu Ala Ile Ile Leu His Ala Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr65 70 75 80Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Arg Ala Tyr Lys Ala Thr Val85 90 95Pro Leu Gln Ile Ile Leu Ile Ile Phe Asn Ser Leu Ser Phe Gln Asn100 105 110Ser Ala Phe Thr Trp Ile Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser
115 120 125Asp Thr Asp Gly Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser130 135 140His Ile Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Glu Val Met Lys Arg145 150 155 160Gly Arg Met Thr Glu Met Ser Asp Ile Tyr Ser Asn Pro Ile Ile Met165 170 175Phe Gln Lys Asn Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Thr Val Cys Phe Val180 185 190Leu Pro Thr Ile Ile Pro Met Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Leu Asn Asn195 200 205Ala Trp His Ile Thr Val Leu Arg Tyr Ile Phe Ser Leu Asn Cys Ile210 215 220Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Tyr Gly Tyr Lys Pro Tyr Asp225 230 235 240Lys Asn Ile Leu Pro Ala Glu Asn Lys Ala Ala Ser Ile Ala Ser Phe245 250 255Gly Glu Ala Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg260 265 270Ala Ser Glu Leu Gly Asn Ile Thr Met Asn Trp Thr Ile Tyr Phe Ile275 280 285Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser290 295 300Asp Glu Thr Ile Lys Ser Arg Ile Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp305 310 315 320Phe Ser Gly Gln Gln Ile Tyr Ala Arg325<210>13<211>1071<212>DNA<213>绿头卷蛾(Planotortrix octo)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1068)<223>脂酰辅酶A Z10去饱和酶<400>13atg cca cca aat tca gag gaa aca gtg cta tgt gaa aag gaa gac cac48Met Pro Pro Asn Ser Glu Glu Thr Val Leu Cys Glu Lys Glu Asp His1 5 10 15
gag aag ctg gtg gcg cca caa gcg gct acc agg aaa cat gag ctg gca96Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Thr Arg Lys His Glu Leu Ala20 25 30ata gtg ccc atc tca ctc ttc act tac tgg cac gtc gct ggc ttg tac144Ile Val Pro Ile Ser Leu Phe Thr Tyr Trp His Val Ala Gly Leu Tyr35 40 45ggg ctg tat ctc atc ttt gct gaa gcg aaa tgg cag acc gta gtg ttc192Gly Leu Tyr Leu Ile Phe Ala Glu Ala Lys Trp Gln Thr Val Val Phe50 55 60act ctc ttc acc tac aac gcc ggc att ctg ggc atc act gca ggg tcc240Thr Leu Phe Thr Tyr Asn Ala Gly Ile Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ser65 70 75 80cac cgc ctc tgg gcc cac aag aca tac aag gcc aag aga ccc cta gaa288His Arg Leu Trp Ala His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Arg Pro Leu Glu85 90 95acc ctg ctc atg gta ttc cat agt ctg acg agc cag aac acc gtg cgg336Thr Leu Leu Met Val Phe His Ser Leu Thr Ser Gln Asn Thr Val Arg100 105 110cac tgg gca agg gac cat cgg ttc cat cac aag tac agc gac aca gac384His Trp Ala Arg Asp His Arg Phe His His Lys Tyr Ser Asp Thr Asp115 120 125gcc gac ccg cac aat gcg act cga ggt ttc ttc tac tcc cac gta ggc432Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His Val Gly130 135 140tgg ctg ctg gtc aag aaa cac ccc gag gtc ctc aga cgg tcg aag acc480Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Leu Arg Arg Ser Lys Thr145 150 155 160atc gac atg tcc gac att tac aac aat cca gtg ttg cgg ttc cag aaa528Ile Asp Met Ser Asp Ile Tyr Asn Asn Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys165 170 175aac tac ggc ctc cca gtg ata aca tta ttc gcc tac gtc ctc cca gct576Asn Tyr Gly Leu Pro Val Ile Thr Leu Phe Ala Tyr Val Leu Pro Ala180 185 190ctc ata cca atg tac tgc tgg gaa gaa acc ctg aac aac gcc tgg cat624Leu Ile Pro Met Tyr Cys Trp Glu Glu Thr Leu Asn Asn Ala Trp His195 200 205ata aac cta ctg cga atc ata gcc aac ctc cac gct tcc tgt ctt gtc672Ile Asn Leu Leu Arg Ile Ile Ala Asn Leu His Ala Ser Cys Leu Val210 215 220aac agc gca gca cac gcc ttc ggt aac aaa ccg tac gac aag cac ata720Asn Ser Ala Ala His Ala Phe Gly Asn Lys Pro Tyr Asp Lys His Ile225 230 235 240gca gcc acg caa atc tcc acc cta tcc ttc ata act tta ggg gag tgt768Ala Ala Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ser Phe Ile Thr Leu Gly Glu Cys245 250 255
ttc cat aac tac cac cac gtc ttc ccc tgg gat tat agg acg gcg gag816Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Thr Ala Glu260 265 270ctg ggg aat aat tgg ttg aac atg acg acg ctg ttc att gat ttt ttc864Leu Gly Asn Asn Trp Leu Asn Met Thr Thr Leu Phe Ile Asp Phe Phe275 280 285gcg tgg gtc ggc tgg gcg tat gat ttg aag act gct tct gat ggg atg912Ala Trp Val Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser Asp Gly Met290 295 300gtc gaa gct agg gct aaa agg acg ggg gat ggc acg aat ctg tgg ggg960Val Glu Ala Arg Ala Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asn Leu Trp Gly305 310 315 320tgg ggg gat gag gat ctg ggg agg gag gag ggg ggt gag gaa gtg ttt1008Trp Gly Asp Glu Asp Leu Gly Arg Glu Glu Gly Gly Glu Glu Val Phe325 330 335tac ggg tgg gga gat aga gat atg aag gat acc agt ggg gtt aga gtt1056Tyr Gly Trp Gly Asp Arg Asp Met Lys Asp Thr Ser Gly Val Arg Val340 345 350tat tca caa gag taa1071Tyr Ser Gln Glu355<210>14<211>356<212>PRT<213>绿头卷蛾<400>14Met Pro Pro Asn Ser Glu Glu Thr Val Leu Cys Glu Lys Glu Asp His1 5 10 15Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Thr Arg Lys His Glu Leu Ala20 25 30Ile Val Pro Ile Ser Leu Phe Thr Tyr Trp His Val Ala Gly Leu Tyr35 40 45Gly Leu Tyr Leu Ile Phe Ala Glu Ala Lys Trp Gln Thr Val Val Phe50 55 60Thr Leu Phe Thr Tyr Asn Ala Gly Ile Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ser65 70 75 80His Arg Leu Trp Ala His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Arg Pro Leu Glu85 90 95Thr Leu Leu Met Val Phe His Ser Leu Thr Ser Gln Asn Thr Val Arg100 105 110His Trp Ala Arg Asp His Arg Phe His His Lys Tyr Ser Asp Thr Asp
115 120 125Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His Val Gly130 135 140Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Leu Arg Arg Ser Lys Thr145 150 155 160Ile Asp Met Ser Asp Ile Tyr Asn Asn Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys165 170 175Asn Tyr Gly Leu Pro Val Ile Thr Leu Phe Ala Tyr Val Leu Pro Ala180 185 190Leu Ile Pro Met Tyr Cys Trp Glu Glu Thr Leu Asn Asn Ala Trp His195 200 205Ile Asn Leu Leu Arg Ile Ile Ala Asn Leu His Ala Ser Cys Leu Val210 215 220Asn Ser Ala Ala His Ala Phe Gly Asn Lys Pro Tyr Asp Lys His Ile225 230 235 240Ala Ala Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ser Phe Ile Thr Leu Gly Glu Cys245 250 255Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Thr Ala Glu260 265 270Leu Gly Asn Asn Trp Leu Asn Met Thr Thr Leu Phe Ile Asp Phe Phe275 280 285Ala Trp Val Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser Asp Gly Met290 295 300Val Glu Ala Arg Ala Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asn Leu Trp Gly305 310 315 320Trp Gly Asp Glu Asp Leu Gly Arg Glu Glu Gly Gly Glu Glu Val Phe325 330 335Tyr Gly Trp Gly Asp Arg Asp Met Lys Asp Thr Ser Gly Val Arg Val340 345 350Tyr Ser Gln Glu355<210>15<211>20<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列的描述寡核苷酸引物<400>15
atyachgccg gkkmycaymg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列的描述寡核苷酸引物<400>16ggraabdygt grtggwagtt 20<210>17<211>20<212>DNA<213>合成序列<220>
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<223>合成序列的描述寡核苷酸引物<400>20acataactaa ttacatgat19<210>21<211>996<212>DNA<213>棉花红铃虫(Pectinophora gossypiella)<220>
<221>CDS<222>(1)..(993)<223>编码Δ-11-去饱和酶<400>21atg gcc cct tac tta aag gag ggt aac gca att ttg gaa aaa tac gaa48Met Ala Pro Tyr Leu Lys Glu Gly Asn Ala Ile Leu Glu Lys Tyr Glu1 5 10 15acc cta aaa gcg cct cag gcg gga cca aga aaa tat caa ata att tat96Thr Leu Lys Ala Pro Gln Ala Gly Pro Arg Lys Tyr Gln Ile Ile Tyr20 25 30ccg aat tta ata acg ttt gga tat gga cac atc gcg gca ttg tat gga144Pro Asn Leu Ile Thr Phe Gly Tyr Gly His Ile Ala Ala Leu Tyr Gly35 40 45cta tac ctg tgc ttc acc tcg gct aaa tgg gct act att ctt ctt gga192Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Ala Thr Ile Leu Leu Gly50 55 60tac atg ttg ttc atc gta agt gaa ctc ggc atc aca gcg ggc gct cac240Tyr Met Leu Phe Ile Val Ser Glu Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His65 70 75 80aga ctg tgg gca cac aag act tac aaa gcc aag ctg cct ctg gaa att288Arg Leu Trp Ala His Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Glu Ile85 90 95ctc cta atg gtg ttc aac tca att gcc ttt caa aac act gcc gtc acc336Leu Leu Met Val Phe Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asn Thr Ala Val Thr100 105 110tgg gtg aag gac cac cgc gct cac cac aag tac agc gac acc gat gca384Trp Val Lys Asp His Arg Ala His His Lys Tyr Ser Asp Thr Asp Ala115 120 125gac cct cac aac gcc acg aga gga ctc ttc tac tca cac atc ggg tgg432Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Leu Phe Tyr Ser His Ile Gly Trp130 135 140cta cta gtc aag aaa cac ccc gaa gtc att aaa cgc gga aaa caa atc480Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Ile Lys Arg Gly Lys Gln Ile145 150 155 160gat tac agc gat ata tgt aac aat cct gta ctg agg ttc cag aaa aag528
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权利要求
1.用于产生包含不饱和脂肪酸的甘油三酯的方法，其包括在选自植物、酵母、真菌和藻类的生物体中，重组表达至少一种来自鳞翅目昆虫的脂肪酸去饱和酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中脂肪酸去饱和酶可在脂肪酸、脂肪酸辅酶A酯或其它脂肪酸衍生物的C8、C9、C10、C11或C12位置产生双键。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中脂肪酸去饱和酶特异性地在具有16或者18个碳原子的脂肪酸链长的脂肪酸、脂肪酸辅酶A酯或其它脂肪酸衍生物中产生顺式或反式双键。
4.如权利要求1到3中任意一项所述的方法，其中脂肪酸去饱和酶与SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或22所述的脂肪酸去饱和酶之一具有至少65％的同源性。
5.如权利要求1到4中任意一项所述的方法，其中脂肪酸去饱和酶的核酸序列a)在其有义链中包含SEQ ID NO15或17所述的序列基序，或b)在其反义链中包含SEQ ID NO16或18所述的序列基序。
6.如权利要求1到5中任意一项所述的方法，其中不饱和脂肪酸包含共轭亚油酸。
7.如权利要求1到6中任意一项所述的方法，其中生物体选自卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、诡谲腐霉(Pythium insidiosum)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、亚麻子、大豆、油菜籽、椰子、油棕、红花、蓖麻油植物、花生、可可树和向日葵。
8.通过如权利要求1到7中任意一项所述方法产生的甘油三酯。
9.如权利要求8所述的甘油三酯的用途，用于制备食品、饲料、化妆品或精细化学品。
10.具有E11-去饱和酶活性的多肽，所述多肽优先转化C16和/或C18脂酰辅酶A脂肪酸并且包含至少一个选自以下的序列a)如SEQ ID NO2、4、6和22所示的氨基酸序列，和b)与SEQ ID NO2、4、6或22所示的其中一种氨基酸序列具有至少65％同源性的氨基酸序列，和c)包含如SEQ ID NO2、4、6或22所示序列中的至少20个连续氨基酸残基片段的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的多肽，其以SEQ ID NO22所示的氨基酸序列描述。
12.编码如权利要求11所述多肽的核酸序列。
13.重组表达盒，其包含在植物、植物生物体、藻类、酵母或真菌中起作用的启动子调控下的至少一个编码来自鳞翅目昆虫的脂肪酸去饱和酶的核酸序列。
14.如权利要求13所述的重组表达盒，其中启动子在选自卷枝毛霉、高山被孢霉、诡谲腐霉、弯曲隐球酵母、大豆、亚麻子、油菜籽、椰子、油棕、红花、蓖麻油植物、花生、可可豆和向日葵的至少一种生物体中起作用。
15.如权利要求13或14所述的重组表达盒，其中脂肪酸去饱和酶以包含至少一个选自以下序列的多肽描述a)如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或22中所示的氨基酸序列，和b)与SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或22中所示的氨基酸序列之一具有至少65％同源性的氨基酸序列，和c)包含如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或22中所示序列的至少20个连续氨基酸残基片段的氨基酸序列。
16.如权利要求13到15中任意一项所述的重组表达盒，其中脂肪酸去饱和酶以SEQ ID NO22中所示的氨基酸序列描述。
17.重组表达载体，其包含至少一个如权利要求13到16中任意一项所述的表达盒。
18.转基因生物体，其包含至少一个如权利要求13到16中任意一项所述的重组表达盒或者如权利要求17中所述的重组表达载体。
19.如权利要求18所述的转基因生物体，其为植物生物体。
20.如权利要求18或19所述的转基因生物体，其选自卷枝毛霉、高山被孢霉、诡谲腐霉、弯曲隐球酵母、大豆、亚麻子、油菜籽、椰子、油棕、红花、蓖麻油植物、花生、可可树和向日葵。
全文摘要
本发明涉及通过重组表达来自鳞翅目昆虫的去饱和酶产生不饱和脂肪酸优选地产生共轭多不饱和脂肪酸如共轭亚油酸(CLA)的方法。表达优选地在选自植物生物体、酵母、真菌和藻类的生物体中进行。此外，本发明也涉及用于重组表达来自鳞翅目昆虫去饱和酶的重组表达盒以及用它们转化的转基因生物体。
文档编号C12N15/82GK1656226SQ03805062
公开日2005年8月17日 申请日期2003年2月27日 优先权日2002年3月1日
发明者A·伦茨, M·吉普曼斯, I·福伊斯纳, C－L·罗森菲尔德, D·C·克尼普尔 申请人:巴斯福植物科学有限公司