专利名称：Redk基因的破坏的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有被破坏的REDK基因的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞。
背景技术：
贫血是血液的氧运输能力降低的一种病症，它由例如血红细胞浓度降低引起。贫血可导致身体活动受损，器官衰竭，和最终死亡。
调节性红细胞激酶(Regulator erythroid kinase)(REDK)看来在红细胞生成中起作用。在体外集落试验中，已经证明在人CD34+造血干细胞中反义寡核苷酸对REDK的抑制可以增加红细胞爆裂型集落生成单位(BFU-E)和红细胞集落生成单位(CFU-E)的频率。Lord等(2000)。这些结果提示REDK参与多能干细胞向红细胞系的定向。备选地，REDK可以作为红细胞生成的抑制剂。
REDK属于哺乳动物DYRK激酶家族。如同DYRK家族的其它成员，据信REDK是催化在丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化和在酪氨酸残基自磷酸化的双特异性激酶(见Lord等(2000)；和Kentrup，Heiner等(1996))。
Genbank登记号Y12735，AF186773和AF186774中公开了人REDK的cDNA序列。GenBank登记号BC006704公开了小鼠REDK cDNA序列。
调节REDK功能的疗法可以为红细胞生成相关病症，如贫血提供治疗手段。具有破坏的REDK基因的遗传修饰的哺乳动物和细胞可能对定义REDK的生理作用和理解与REDK活性之调节相关的治疗含义具有价值。
发明概述本发明的一个方面提供了遗传修饰的非人哺乳动物或其哺乳动物后代，其中所述修饰包括破坏的REDK基因。
在一个优选实施方案中，所述哺乳动物或其哺乳动物后代是啮齿动物，优选小鼠。在另一个优选实施方案中，对于所述修饰，所述哺乳动物或其哺乳动物后代是纯合的。
本发明的另一方面涉及遗传修饰的动物细胞或其子代细胞，其中所述修饰包括破坏的REDK基因。
在一个优选实施方案中，所述动物细胞或其子代细胞是胚胎干(ES)细胞或ES样细胞。在另一个优选实施方案中，所述细胞或其子代细胞分离自遗传修饰的非人哺乳动物或其后代哺乳动物，这些动物含有导致REDK基因破坏的修饰。在再一个优选实施方案中，所述细胞或其子代细胞是造血细胞或睾丸细胞。在另外的实施方案中，所述细胞或其子代细胞是哺乳动物细胞，优选是鼠或人来源的。在另一优选的实施方案中，所述细胞或其子代细胞在所述修饰方面是纯合的。
在另一方面，本发明涉及鉴定与REDK活性降低或消除相关的生物学特征的方法。该方法包括将包含破坏的REDK基因的遗传修饰的非人哺乳动物或动物细胞的生物学特征与适当野生型对照的特征进行比较。优选，生物学特征选自形态学、组织学、代谢、发育或行为特征。
本发明的另一方面提供了鉴定基因的方法，该基因由于动物细胞中REDK活性的降低而显示出表达改变，所述方法包括将至少一个不是REDK的基因在本发明细胞中的表达与在野生型动物细胞中的表达进行比较。在一个优选实施方案中，使用微阵列生成所述表达谱。
本发明的另一个方面涉及鉴定蛋白的方法，该蛋白由于动物细胞中REDK活性的降低而显示出水平或翻译后加工的改变，所述方法包括将本发明细胞的蛋白质组谱与野生型动物细胞的进行比较。
本领域技术人员将完全理解说明书和所附权利要求书中使用的用于描述本发明的术语。尽管如此，除非这里另行指出，下列术语如紧接下面描述的那样。
“破坏的REDK基因”是指被遗传修饰的REDK基因，所述修饰使得在正常表达野生型REDK基因的细胞中该破坏的基因编码的REDK多肽的细胞活性降低或优选地消除。当遗传修饰有效消除了细胞中的所有野生型REDK基因拷贝(如，遗传修饰的非人哺乳动物或动物细胞在REDK基因破坏方面是纯合的或最初存在的唯一野生型REDK基因拷贝现在被破坏)时，与表达野生型REDK基因的对照细胞相比，该遗传修饰导致REDK多肽活性降低。REDK多肽活性的这种降低可以由REDK基因表达降低(即REDK mRNA水平有效降低导致REDK多肽水平降低)引起和/或由该破坏的REDK基因编码与野生型REDK多肽相比功能改变(如降低)的突变多肽引起。优选，在遗传修饰的非人哺乳动物或动物细胞中，REDK多肽的活性降低至野生型水平的50％或更低，更优选地降低至25％或更低，和甚至更优选地降至野生型水平的10％或更低。最优选，该REDK基因破坏导致不能检测到REDK活性。
含有破坏的REDK基因的“遗传修饰的非人哺乳动物”是指由基因工程创造的含有破坏的REDK基因的非人哺乳动物，以及继承了该破坏的REDK基因的这种非人哺乳动物的后代。可以通过例如创建携带此期望的遗传修饰的胚泡或胚胎并接着将该胚泡或胚胎植入代孕母体进行宫内发育而产生遗传修饰的非人哺乳动物。在小鼠的情况下，可以通过将遗传修饰的胚胎干(ES)细胞植入小鼠胚泡或通过将ES细胞与四倍体胚胎聚集在一起来制备遗传修饰的胚泡或胚胎。可供选择地，可以通过核转移获得各种物种的遗传修饰的胚胎。在核转移的情况下，供体细胞是体细胞或多能干细胞，并且它被工程改造而含有破坏了REDK基因的期望遗传修饰。这个细胞的细胞核接着被转移到去核的受精或单性生殖卵母细胞中；生成的胚胎经重建并发育为胚泡。之后可以根据本领域技术人员熟知的标准方法将任一上面方法产生的遗传修饰的胚泡接着植入代孕母体中。“遗传修饰的非人哺乳动物”包括利用上述方法产生的非人哺乳动物的所有后代，只要该后代继承了至少一个拷贝的破坏REDK基因的遗传修饰。优选遗传修饰的非人哺乳动物的所有体细胞和生殖系细胞均含有该修饰。被遗传修饰而含有破坏的REDK基因的优选的非人哺乳动物，包括啮齿类动物，如小鼠和大鼠，猫，狗，兔，豚鼠，仓鼠，绵羊，猪和雪貂。
含有破坏的REDK基因的“遗传修饰的动物细胞”是指由基因工程改造产生的含有破坏的REDK基因的动物细胞(优选哺乳动物细胞)，包括人细胞，以及继承了破坏的REDK基因的子代细胞。这些细胞可以根据本领域已知的任何标准方法在培养中被遗传修饰。作为遗传修饰培养细胞的一种替代方案，非人哺乳动物细胞也可以分离自含有破坏的REDK基因的遗传修饰的非人哺乳动物。本发明的动物细胞可以从原代细胞或组织制品以及适应培养的(culture-adapted)、致瘤的或转化的细胞系获得。这些细胞和细胞系来自例如内皮细胞、上皮细胞、胰岛(islet)、神经元和其它神经组织来源的细胞、间皮细胞、骨细胞、淋巴细胞、软骨细胞、造血细胞、免疫细胞、主要腺体或器官(如睾丸、肝、肺、心脏、胃、胰腺、肾和皮肤)的细胞、肌细胞(包括来自骨骼肌、平滑肌和心肌的细胞)、外分泌或内分泌细胞、成纤维细胞，和胚胎干细胞和其它全能或多能干细胞(如ES细胞、ES样细胞、胚胎生殖系细胞和其它干细胞，如祖先细胞和组织来源的干细胞)。优选的遗传修饰细胞是ES细胞，更优选，小鼠或大鼠ES细胞，最优选人ES细胞。
“遗传修饰”的非人哺乳动物或动物细胞就通过基因工程导入非人哺乳动物或动物细胞或导入祖先非人哺乳动物或动物细胞的修饰而言是杂合或纯合的。现有的用于导入修饰的基因工程标准方法包括同源重组、病毒载体基因捕获、辐射、化学诱变和编码反义RNA的核苷酸序列单独或与催化性核酶联合的转基因表达。优选的用于破坏基因的遗传修饰方法是通过将“外来核酸序列”插入基因座位，如通过同源重组或病毒载体基因捕获来修饰内源基因的那些方法。“外来核酸序列”是基因中非天然存在的外源序列。外来DNA的这种插入可以发生在REDK基因的任何区域，如在增强子、启动子、调节区域、非编码区、编码区、内含子或外显子中。用于基因破坏的最优选基因工程方法是同源重组，其中外来核酸序列以定向方式单纯地插入或插入时伴随部分内源基因序列的缺失。
“纯合”，当指非人哺乳动物或动物细胞中的REDK基因破坏时，是指全部REDK等位基因被破坏的非人哺乳动物或动物细胞。然而，这些等位基因的每一个的REDK序列并无需相同。例如，非人哺乳动物的REDK破坏可以是纯合的，其中一个REDK等位基因由于一个区域的基因序列缺失被破坏，而另一个等位基因由于另一个区域的基因序列缺失被破坏。
“ES细胞”或“ES样细胞”是指来自胚胎、来自原始生殖细胞、或来自畸胎瘤的多能干细胞，它能够无限地自我更新以及分化出代表全部三个胚层的细胞类型。
“微阵列”是指不同的多核苷酸在基质上的排列，参见本文更充分的描述。
“REDK活性降低”是指由于REDK基因的遗传操作引起细胞中功能性REDK多肽的水平降低而造成的REDK酶活性降低，或由于给予抑制REDK活性的药物抑制剂而造成的REDK酶活性降低。
“野生型”，当指非人哺乳动物或动物细胞时，是指视具体情况而定不包含破坏的REDK基因的非人哺乳动物或动物细胞。例如，在本发明非人哺乳动物的特定特征与野生型哺乳动物的相应特征进行比较时，该术语野生型是指不包括破坏的REDK基因的非人哺乳动物(即REDK基因是野生型的哺乳动物)。优选，野生型非人哺乳动物基本上类似于，且更优选地基本上等同于本发明的非人哺乳动物，除了两者的REDK基因分别是未被破坏的或被破坏的。同样，例如，在本发明的动物细胞的特定特征与野生型哺乳动物细胞的相应特征进行比较时，该术语野生型是指不包括破坏的REDK基因的动物细胞(即REDK基因是野生型的细胞)。优选，野生型动物细胞基本上类似于，且更优选地基本上等同于本发明的动物细胞，除了两者的REDK基因分别是未被破坏的或被破坏的。“野生型”也可以指没有被破坏的REDK等位基因，例如在具有一个破坏的REDK等位基因和一个野生型REDK等位基因(即REDK破坏是杂合的)的动物细胞或非人哺乳动物中。
从下列详细说明和权利要求书，本发明的其它特征和优点将是明显的。当结合具体实施方案描述本发明时，应该理解可以实践的其它改变或修改也是本发明的一部分并且也包括在所附权利要求的范围内。本申请意欲覆盖一般地遵循本发明原则的本发明的任何等同方案、变化、应用或适应性改变，包括在本领域已知或惯用实践内无需过度实验可确定的自本发明公开内容的偏离。在分子生物学、蛋白质科学和免疫学的标准教科书中可以找到关于制备和使用核酸和多肽的另外指导(如见Davis等(1986)；Hames等(1985)；Sambrook，J.等(1989)；Ausubel，F.M.等(2001)；Dracopoli，等(1994)；Coligan，John E.，等(2002)；和Coligan，John E.，等(1994))。这里提及的所有出版物，包括公开的专利申请和颁发的专利的全部内容并入作为参考。
缩写词这里使用下列缩写词“BFU-E”是指红细胞爆裂型集落生成单位“cDNA”是指互补DNA“CFU-E”是指红细胞集落生成单位“DMEM”是指Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基“DNA”是指脱氧核糖核酸“IRES”非依赖型核糖体进入位点“LIF”白血病抑制因子“MEM”是指改良的Eagle氏培养基“nm”是指纳米“nM”是指纳摩尔“PCR”是指聚合酶链式反应“PEF”是指原代胚胎成纤维细胞“REDK”是指调节性红细胞激酶“RFLP”是指限制性片段长度多态性“RNA”是指核糖核酸
“mRNA”是指信使RNA。
附图简述
图1A是描述主链载体pJNS2的图。图1B描述了本发明的基因寻靶载体。
图2A和2B显示了在内源小鼠REDK基因中载体同源重组的位置。
图3是REDK(+/-)和REDK(-/-)小鼠基于PCR的基因分型的Southern印迹。
图4比较了REDK破坏的ES细胞和野生型ES细胞的红细胞集落形成水平。
发明详述本发明的遗传修饰的非人哺乳动物和遗传修饰的动物细胞，包括人细胞，在破坏REDK基因的修饰方面是杂合或纯合的。该动物细胞可以由基因工程改造培养的细胞得到，或在非人哺乳动物细胞的情况下，该细胞可以分离自遗传修饰的非人哺乳动物。
REDK基因的破坏为了产生本发明的遗传修饰的非人哺乳动物和哺乳动物细胞，可以使用本领域已知的遗传修饰技术，包括化学诱变(Rinchik(1991)；Russell(1994))、辐射(Russell，(1994))、REDK基因反义RNA的转基因表达(单独或与催化性RNA核酶序列一起)(Luyckx等(1999)；Sokol等，(1996)；Efrat等，(1994)；Larsson等(1994))和如下进一步讨论的将外来核酸序列插入REDK基因座位而破坏REDK基因的方式来破坏REDK基因座位。优选，通过插入外来核酸序列，更优选依靠同源重组或通过插入病毒载体来破坏REDK基因。甚至更优选地，REDK基因破坏方法是同源重组并包括缺失一部分内源REDK基因序列。
外源序列的整合通过一种或多种下列机制破坏REDK基因通过干扰REDK基因转录或翻译过程(如通过干扰启动子识别，或通过将转录终止位点或翻译终止密码子导入REDK基因)；通过扭曲REDK基因编码序列，使得它不再编码具有正常功能的REDK多肽(如通过将外来编码序列插入REDK基因编码序列，通过导入移框突变或氨基酸置换；或，在双交换事件情况下，通过删除一部分对于表达功能性REDK蛋白所必需的REDK基因编码序列)。
为了将外来序列插入细胞基因组中的REDK基因座位而产生本发明的遗传修饰的非人哺乳动物和哺乳动物细胞，根据本领域已知标准方法将外来DNA序列导入细胞，如电穿孔、磷酸钙沉淀、逆转录病毒感染、显微注射、生物轰击(biolistics)、脂质体转染、DEAE-葡聚糖转染或转移感染(transferrinfection)(见如Neumann等(1982)；Potter等(1984)；Chu等(1987)；Thomas和Capecchi(1987)；Baum等(1994)；Biewenga等，(1997)；Zhang等，(1993)；Ray和Gage(1992)；Lo(1983)；Nickoloff等(1998)；Linney等(1999)；Zimmer和Gruss，(1989)；和Robertson等，(1986))。实施本发明用于将外来DNA导入细胞的优选方法是电穿孔。
1.同源重组同源重组方法通过将REDK基因寻靶载体导入含REDK基因的细胞中来定向对REDK基因进行破坏。该载体使用载体中与REDK基因同源的核苷酸序列靶向REDK基因。这个同源区域促进载体和内源REDK基因序列之间的杂交。一旦杂交，寻靶载体和基因组序列之间的交换事件的可能性将大大增加。这种交换事件导致载体序列整合进入REDK基因座位及可能的REDK基因功能破坏。
Bradley等(1992)综述了关于用于寻靶的载体的构建的一般原则。可以用于通过同源重组插入DNA的两种类型载体是插入载体和置换载体。用于通过同源重组产生本发明的遗传修饰的非人哺乳动物和哺乳动物细胞的优选载体是置换载体。
插入载体是具有双链断裂的包括REDK基因同源区域的环状DNA分子。同源区域和内源REDK基因之间杂交后，双链断裂处的单交换事件导致全部载体序列在交换部位插入到内源基因中。
置换载体是共线性的而不是环状的。置换载体整合进入REDK基因需要双交换事件，即在寻靶载体和REDK基因之间的两个杂交位点发生交换。这个双交换事件导致夹在两个交换位点之间的载体序列整合进入REDK基因而起初位于两个交换位点之间的相应内源REDK基因序列发生缺失(见例如Thomas和Capecchi(1987)；Mansour等(1988)；Mansour等(1990)；和Mansour(1990))。
用于产生本发明的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞的寻靶载体中的同源区域长度通常至少100个核苷酸。最优选，同源区域长度至少1-5千个碱基(kb)。尽管尚未阐明同源区域所需的最小长度和最小相关程度，但是同源重组的寻靶效率通常与长度和寻靶载体与REDK基因座位之间的相关程度相应。在使用置换载体，且同源重组后一部分内源REDK基因缺失的情况下，另一要考虑的是内源REDK基因的缺失部分的长度。如果内源REDK基因的这个部分长度大于1kb，那么推荐具有长于1kb的同源区域的寻靶盒来增加重组效率。基于本说明书，关于有效进行同源重组的序列选择和序列使用的更多指导在文献中描述(见例如Deng和Capecchi(1992)；Bollag等(1989)；和Waldman和Liskay(1988))。
基于本发明，本领域技术人员将认识到，各种克隆载体均可以用作本发明REDK基因寻靶载体构建中的载体主链，包括pBluescript相关质粒(如Bluescript KS+11)，pQE70，pQE60，pQE-9，pBS，pD10，phagescript，phix174，pBK Phagemid，pNH8A，pNH16a，pNH18Z，pNH46A，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，和pRIT5 PWLNEO，pSV2CAT，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，PBPV，PMSG，和pSVL，pBR322和基于pBR322的载体，pMB9，pBR325，pKH47，pBR328，pHC79，phage Charon28，pKB11，pKSV-10，pK19相关质粒，pUC质粒，和pGEM系列质粒。这些载体可从各种商业来源获得。(如Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN；Qiagen，Valencia，CA；Stratagene，La Jolla，CA；Promega，Madison，WI；和New England Biolabs，Beverly，MA)。然而，任何其它载体，如质粒、病毒，或其部分，都可以使用，只要它们在期望的宿主中可复制和可存活。载体也可以包含使其能够在基因组待修饰的宿主中复制的序列。这种载体的使用可扩大重组发生过程中相互作用的时间，增加打靶效率(见Ausubel等，(2001)，Unit 9.16，Fig.9.16.1)。
扩增本发明寻靶载体所采用的具体宿主并不关键。实例包括大肠杆菌K12 RR1(Bolivar等，(1977))，大肠杆菌K12 HB101(ATCC No.33694)，大肠杆菌MM21(ATCC No.336780)，大肠杆菌DH1(ATCC No.33849)，大肠杆菌菌株DH5a和大肠杆菌STBL2。可供选择地，可以使用宿主如C.cerevisiae或枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)。商业上(如Stratagene，La Jolla，CA；和Life Technologies，Rockville，MD)可获得上面提及的宿主。
为了产生寻靶载体，将REDK基因寻靶构建体添加到载体主链上，例如上述载体主链。本发明的REDK基因寻靶构建体具有至少一个REDK基因同源区域。
优选，本发明的寻靶构建体也包括编码阳性标记蛋白的外源核苷酸序列。载体整合后阳性标记的稳定表达赋予细胞可鉴定的特征，理想地，且不损害细胞活力。因此，在置换载体的情况下，将该标记基因置于两个侧翼同源区域之间，使其可以在双交换事件之后整合进入REDK基因而该标记基因处于整合后可以表达的位置。
优选该阳性标记蛋白提供可选择表型特征，例如，增加细胞在否则会致死的条件下的存活的特征。因此，通过施加选择条件，可以基于生存力将稳定表达编码该阳性选择标记的载体序列的细胞与未成功整合该载体序列的其它细胞分离开来。阳性选择标记蛋白(和它们的选择试剂)的实例包括neo(G418或卡那霉素)，hyg(潮霉素)，hisD(组氨醇)，gpt(黄嘌呤)，ble(博莱霉素)，和hprt(次黄嘌呤)(见例如，美国专利5,464,764，和Capecchi(1989))。也可以用作选择标记的备选的其它阳性标记包括报道基因如β-半乳糖苷酶，萤火虫萤光素酶或GFP(见例如Robinson，J.Paul(1997)，Unit9.5，和Ausubel，F.M.等(2001)，Unit 9.6)。
上述阳性选择步骤不能区分通过定向同源重组在REDK基因座位整合了载体的细胞和在任何染色体位置随机非同源整合了载体序列的细胞。因此，当使用置换载体进行同源重组产生本发明的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞时，还优选包括编码阴性选择标记蛋白的核苷酸序列。当细胞接触某些试剂时，阴性选择标记的表达引起表达该标记的细胞丧失生活力(即在某些选择条件下，该标记蛋白对细胞是致死的)。阴性选择标记(和它们的致死试剂)的实例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(丙氧鸟苷(gancyclovir)或1，2-脱氧-2-氟-α-d-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶)，Hprt(6-硫代鸟嘌呤或6-硫代黄嘌呤)，和白喉毒素，蓖麻毒素，和胞嘧啶脱氨酶(5-氟胞嘧啶)。
将编码该阴性选择标记的核苷酸序列置于置换载体的两个同源区域的外部。给定这个位置，如果随机、非同源重组进行整合，则细胞将仅整合和稳定表达该阴性选择标记；而REDK基因和寻靶构建体中两个同源区域之间的同源重组将编码该阴性选择标记的序列排除在整合之外。因此，通过施加阴性条件，已经通过随机、非同源重组整合了寻靶载体的细胞将丧失生活力。
优选上述阳性和阴性选择标记组合存在于用于产生本发明的遗传修饰的非人哺乳动物和哺乳动物细胞的寻靶构建体中，因为可以通过设计一系列阳性和阴性选择步骤更有效地仅选择出通过同源重组经历载体整合并由此具有潜在破坏的REDK基因的那些细胞。在例如美国专利5,464,764，WO94/06908(对应于美国专利5,859,312)和Valancius和Smithies(1991)中描述了阳性-阴性选择方案、选择标记和寻靶构建体的其它实例。
为了载体整合时标记蛋白稳定表达，可以设计寻靶载体使得载体整合时，编码该标记的序列可操作连接内源REDK基因启动子。然后在正常表达REDK基因的细胞中REDK基因启动子驱动该标记的表达。可供选择地，载体的寻靶构建体中的每个标记都可以含有不依赖REDK基因启动子而驱动表达的其自身启动子。这后一方案具有允许标记在典型不表达REDK基因的细胞中表达的优点(Smith和Berg(1984)；Sedivy和Sharp(1989)；Thomas和Capecchi(1987))。
可用于驱动标记基因表达的外源启动子包括细胞特异性或阶段特异性启动子、组成型启动子和诱导型或调节型启动子。这些启动子的非限制性实例包括单纯疱疹胸苷激酶启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子，SV40启动子，PGK启动子，PMC1-neo，金属硫蛋白启动子，腺病毒晚期启动子，痘苗病毒7.5K启动子，鸟β珠蛋白启动子，组蛋白启动子(如小鼠组蛋白H3-614)，β肌动蛋白启动子，神经元特异性烯醇化酶启动子，肌肉肌动蛋白启动子和花椰菜花叶病毒35S启动子(通常见Sambrook等(1989)，和Ausubel，F.M.等(2001)；Stratagene，La Jolla，CA)。
为了证实产生本发明遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞的同时，细胞是否已经将载体序列整合到靶REDK基因座位，可以使用对期望的载体整合事件是特异性的引物或基因组探针与PCR或Southern印迹分析组合来鉴定REDK基因座位中期望的载体整合的存在(Erlich等(1991)；Zimmer和Gruss(1989)；Mouellic等(1990)；和Shesely，等(1991)。
2.基因捕获基于本说明书，使外来核酸序列插入REDK基因座位来破坏REDK基因的另一可利用方法是基因捕获。这个方法利用所有哺乳动物细胞中存在的剪接外显子成mRNA的细胞机器将基因捕获载体编码序列以随机方式插入基因。一旦插入，该基因捕获载体产生可以破坏该捕获的REDK基因的突变。与同源重组相比，这个诱变系统产生了大量随机的突变。因此，为了获得含有破坏的REDK基因的遗传修饰细胞，必须鉴定含此特定突变的细胞并将其从在各种基因中含随机突变的细胞库中选择出来。
已经描述了基因捕获系统和载体用于遗传修饰小鼠细胞和其它细胞类型(见例如Allen等(1988)；Bellen等(1989)；Bier等(1989)；Bonnerot等(1992)；Brenner等(1989)；Chang等(1993)；Friedrich和Soriano(1993)；Friedrich和Soriano(1991)；Goff(1987)；Gossler等(1989)；Hope(1991)；Kerr等(1989)；Reddy等(1991)；Reddy等(1992)；Skarnes等(1992)；von Melchner和Ruley(1989)；和Yoshida等(1995)。
启动子捕获载体(或5’载体)，从5’至3’，含有剪接受体序列，之后是外显子，其典型特征是翻译起始密码子和开放阅读框架和/或内部核糖体进入位点。通常，这些启动子捕获载体不含有启动子和可操作连接的剪接供体序列。所以，整合到宿主细胞的细胞基因组之后，启动子捕获载体序列将拦截上游基因的正常剪接并成为末端外显子。载体编码序列的表达依赖于载体以正确阅读框架整合到被破坏的基因的内含子中。在这种情况下，细胞剪接机器将来自所捕获的基因的外显子拼接到载体编码序列上游(如WO 99/50426和美国专利6,080,576)。
产生类似于上述启动子捕获载体的效果的可供选择方法是在启动子捕获载体的剪接受体和翻译起始密码子或聚腺苷酸化序列之间的区域中存在或经工程改造加入了一组嵌套终止密码子的载体。该编码序列也可以经工程改造而含有独立的核糖体进入位点(IRES)，这使得该编码序列可以以很大程度上不依赖于宿主细胞基因组内的整合位点的方式表达。典型但不是必须的，IRES与一组嵌套终止密码子联合使用。
另一类型的基因捕获方案使用3’基因捕获载体。这类型载体可操作地组合含有介导相邻编码序列表达的启动子区域、编码序列和限定编码序列外显子3’末端的剪接供体序列。在整合到宿主细胞基因组中后，从载体启动子表达的转录物与来自捕获基因(位于整合的基因捕获载体序列下游)的剪接受体序列拼接。因此，载体整合导致融合转录物表达，此转录物包括3’基因捕获盒的编码序列和任何下游细胞外显子，包括末端外显子及其聚腺苷酸化信号。当这种载体整合到基因中，细胞剪接机器将载体编码序列拼接到所捕获的基因的3’外显子上游。这种载体的一个优点是3’基因捕获载体的表达是由基因捕获盒内的启动子驱动的因此不需要整合到正常在宿主细胞中表达的基因中(WO 99/50426和美国专利6,080,576)。可以加入到3’基因捕获载体中的转录启动子和增强子的实例包括上面涉及寻靶载体时讨论的那些。
用作启动子或3’基因捕获载体的结构成分的病毒载体主链可以从可插入到靶细胞基因组的广泛载体中选择。合适的主链载体包括但不限于单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、假狂犬病病毒、α疱疹病毒载体等等。Caplitt和Loewy(1995)中可找到病毒载体的全面综述，尤其是适用于修饰非复制性细胞的病毒载体和如何与外源多核苷酸序列的表达联合来使用这种载体的方法。
优选，逆转录病毒载体用于基因捕获。这些载体可以与逆转录病毒包装细胞系如美国专利5,449,614中描述的那些联合使用。当非小鼠哺乳动物细胞用作遗传修饰的靶细胞时，兼嗜性或泛嗜性包装细胞系可用于包装合适的载体(见例如Ory等1996)。例如美国专利5,521,076中描述了可适应性修改而产生刚才描述的3’基因捕获载体的代表性逆转录病毒载体。
基因捕获载体可以含有在上面用于同源重组的寻靶载体中讨论的一个或多个阳性标记基因。类似于它们在寻靶载体中的应用，这些阳性标记用于基因捕获载体来鉴定和选择已经将载体整合到细胞基因组中的细胞。该标记基因可以经工程改造含有IRES，这使得该标记可以很大程度上不依赖于载体整合到靶细胞基因组中的位置来进行表达。
如果基因捕获载体以相当随机的方式整合到被感染的宿主细胞的基因组中，则必须从经历随机载体整合的细胞群中鉴定具有破坏的REDK基因的遗传修饰细胞。优选，细胞群中的遗传修饰具有足够的随机性和频率，这样该群体在细胞基因组的基本上每个基因中都表现出突变，从而使得具有破坏的REDK基因的细胞可能从该群体中被鉴定出来(见WO 99/50426；WO98/14614和美国专利6,080,576)。
可以使用例如反转录和PCR鉴定REDK基因序列中的突变，从而鉴定突变细胞群中含有破坏的REDK基因的各个突变细胞系。这个方法可以通过合并克隆来简化。例如，为了找到含有破坏的REDK基因的单克隆，使用锚定于基因捕获载体中的一个引物和位于REDK基因序列中的另一个引物实施RT-PCR。阳性RT-PCR结果表明载体序列编码在REDK基因转录物中，表明REDK基因已经被基因捕获整合事件破坏(如见WO98/14614，美国专利6,080,576)。
3.时间、空间和诱导型REDK基因破坏在本发明的某些实施方案中，内源REDK基因的功能性破坏发生在特殊发育或细胞周期阶段(时间破坏)或发生在特殊细胞类型(空间破坏)。在其它实施方案中，当某些条件存在时，REDK基因破坏是可诱导的。重组酶切除系统，如Cre-Lox系统，可以用于在特定发育阶段，在特定组织或细胞类型，或在特定环境条件下活化或灭活REDK基因。通常，如Torres和Kuhn(1997)所述实施利用Cre-Lox技术的方法。类似于Cre-Lox系统的方法学也可以利用FLP-FRT系统实施。例如美国专利5,626,159，美国专利5,527,695，美国专利5,434,066，WO 98/29533，美国专利6,228,639，Orban等(1992)；O′Gorman等(1991)；Sauer等(1989)；Barinaga(1994)；和Akagi等(1997)中提供了关于使用重组酶切除系统通过同源重组或病毒插入有条件地破坏基因的更多指导。可以使用一个以上重组酶系统遗传修饰本发明的非人哺乳动物或哺乳动物细胞。
当使用重组酶系统如Cre-Lox系统通过同源重组以时间、空间或诱导方式破坏REDK基因时，一部分REDK基因编码区被包含侧接loxP位点的REDK基因编码区的寻靶构建体置换。携带这个遗传修饰的非人哺乳动物和哺乳动物细胞含有侧接loxP的功能性REDK基因。REDK基因的时间、空间或诱导破坏由非人哺乳动物或哺乳动物细胞中分别处于期望的空间调节性、时间调节性或诱导型启动子控制下表达的另一转基因——Cre重组酶转基因的表达模式引起。Cre重组酶对准loxP重组位点。因此当Cre表达被活化时，LoxP位点发生重组切除夹在中间的REDK基因编码序列，导致REDK基因的功能性破坏(见例如Rajewski等(1996)；St.-Onge等(1996)；Agah等(1997)；Brocard等(1997)；Feil等(1996)；和khn等(1995))。
通过标准转基因技术，或在遗传修饰的非人哺乳动物的情况下，通过遗传修饰的非人哺乳动物的杂交(其中一个亲本含有侧接loxP的REDK基因而另一个含有在期望启动子控制下的Cre重组酶转基因)，可产生同时含有Cre重组酶转基因和侧接loxP的REDK基因的细胞。在例如Sauer等(1993)，Gu等(1994)，Araki等(1997)，Dymecki(1996)，和Meyers等(1998)中可找到关于使用重组酶系统和特殊启动子进行时间、空间或有条件地破坏REDK基因的更多指导。
使用四环素效应二元系统也可完成REDK基因的诱导型破坏(Gossen和Bujard(1992))。这个系统涉及遗传修饰细胞，将Tet启动子导入内源REDK基因调节元件和表达可受到四环素控制的阻遏物(TetR)的转基因。在这种细胞中，给予四环素将活化TetR，它又抑制REDK基因表达并因此破坏REDK基因(见例如St.-Onge等(1996)和美国专利5,922,927)。
如WO 98/29533和美国专利6,288,639所述，当使用基因捕获作为遗传修饰方法时，也可以采用对REDK基因进行时间、空间和诱导型破坏的上述系统来产生本发明的遗传修饰的非人哺乳动物和哺乳动物细胞。
遗传修饰的哺乳动物细胞的制备上述遗传修饰方法可用于破坏来自动物(优选哺乳动物)的实质上任何类型的体细胞或干细胞中的REDK基因，产生本发明的遗传修饰的动物细胞。本发明的遗传修饰动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞，包括人细胞和鸟类细胞。这些细胞可以通过遗传修饰任何哺乳动物细胞系，如适应培养的、致瘤的或转化的细胞系产生，或它们可以分离自携带期望的REDK基因修饰的遗传修饰的非人哺乳动物。
该细胞可以是杂合或纯合的REDK基因被破坏的细胞。为了获得纯合的REDK基因被破坏的细胞(-/-)，可对两个等位基因进行直接相继打靶。重复使用阳性选择标记可以利于这个过程。根据这个方案，使用Cre-LoxP系统在破坏一个等位基因后可以去除编码阳性选择标记的核苷酸序列。这样，在定向破坏第二个REDK等位基因的随后循环中可使用相同的载体(Abuin和Bradley(1996)；Sedivy等(1999)；Cruz等(1991)；Mortensen等(1991)；te Riele等(1990))。
获得REDK(-/-)的ES细胞的可供选择策略为Mortensen等(1992)中描述的方法。在这个方法中，以很高药物浓度选择表达选择性耐药标记的REDK(+/-)靶克隆；这种选择有利于表达两个拷贝的耐药标记编码序列并由此REDK基因破坏是纯合的细胞。此外，遗传修饰的哺乳动物细胞可由生殖系细胞是REDK(+/-)的非人哺乳动物交配产生的遗传修饰的REDK(-/-)非人哺乳动物得到，如下详细讨论。
期望的细胞或细胞系的遗传修饰之后，可以根据本领域已知的标准PCR(用PCR分析)或Southern印迹方法，证实REDK基因座位是修饰部位(见例如美国专利4,683,202；和Erlich等(1991))。如果正常表达REDK基因的细胞中，REDK基因信使RNA(mRNA)水平和/或REDK多肽水平降低，也可以进一步证实REDK基因的功能性破坏。使用反转录酶介导的聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹分析或原位杂交可获得REDK基因mRNA水平的测定结果。用例如本领域已知的标准免疫试验方法可进行细胞产生的REDK多肽水平的定量。这种免疫试验包括但不限于竞争性和非竞争性试验系统，其使用技术如RIAs(放射免疫试验)、ELISAs(酶联免疫吸附试验)、“夹心”免疫试验、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散实验、原位免疫试验(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、Western印迹、2-二维凝胶分析、沉淀反应、免疫荧光试验、蛋白A试验和免疫电泳试验。
本发明优选的遗传修饰哺乳动物细胞是ES细胞和ES样细胞。这些细胞源自各物种，例如小鼠(见例如Evans等(1981)；Martin(1981)、猪和绵羊(见例如Notanianni等(1991)；Campbell等(1996))和灵长类动物，包括人(见例如美国专利5,843,780和Thomson et al(1995))的植入前胚胎和胚泡。
这些类型的细胞是多能的，也就是说，在适当条件下，它们能分化成来自所有三个胚层外胚层、中胚层和内胚层的各种细胞类型。依赖于培养条件，ES细胞样品可如同干细胞一样进行无限培养，允许在单一样品内分化出各种不同细胞类型，或定向分化为特定细胞类型，如巨噬细胞样细胞、神经元细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、角质细胞和造血细胞如嗜酸性细胞、肥大细胞、红细胞祖先细胞或巨核细胞。可以通过在培养条件中包括特殊生长因子或基质成分完成定向分化，参见例如Keller等(1995)，Li等(1998)，Klug等(1996)，Lieschke等(1995)，Yamane等(1997)，和Hirashima等(1999)的进一步描述。
用于遗传修饰的具体ES细胞系并不关键。例如，对于本发明使用小鼠ES细胞系的那些实施方案，这种细胞可以包括AB-1(McMahon和Bradley(1990))，E14(Hooper等(1987))，D3(Doetsehman等(1985))，CCE(Robertson等(1986))，RW4(Genome Systems，St.Louis，MO)和DBA/1lacJ(Roach等(1995))。
遗传修饰的非人哺乳动物的制备本发明的遗传修饰哺乳动物细胞可以用于产生本发明遗传修饰的非人哺乳动物。在一个实施方案中，根据公开的步骤(见例如Robertson(1987)，71-112页；Zjilstra等(1989)；和Schwartzberg，等(1989))，本发明遗传修饰的ES细胞可以用于产生遗传修饰的非人哺乳动物。
在优选实施方案中，所述ES细胞是小鼠ES细胞并且所述遗传修饰的非人哺乳动物是小鼠。例如，在产生这种遗传修饰的小鼠时，使用含有期望的功能性破坏的REDK基因的小鼠ES细胞。首先证实待使用的小鼠ES细胞含有期望的功能性破坏的REDK基因，如上所述。
根据本领域已知方法，REDK破坏的ES细胞接着可以用于产生嵌合小鼠(见例如Capecchi(1989))。例如，该REDK破坏的ES细胞可以注射到合适的胚泡宿主中。实施本发明所采用的具体小鼠胚泡并不关键。根据本说明书，本领域技术人员将知晓这种胚泡的实例，包括来自C57BL6小鼠、C57BL6白化小鼠、Swiss远交系小鼠、CFLP小鼠和MFI小鼠的胚泡。可供选择地，ES细胞可以在聚集孔中夹在四倍体胚胎之间(参见Nagy等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908424-8428)。
含遗传修饰的ES细胞的胚泡或胚胎接着被植入代孕雌性小鼠并允许在子宫中发育(见例如Hogan，等(1988)；和E.J.Robertson(1987))。可以筛选代孕母体所生的后代以鉴定REDK基因被破坏的嵌合后代。通常，这种后代含有来自遗传修饰的供体ES细胞的一些细胞以及来自最初胚泡的其它细胞。在这种情况下，在已经利用皮毛颜色选择策略时，最初可以以马赛克皮毛颜色筛选后代，以区分来自供体ES的细胞与来自胚泡的其它细胞。可供选择地，来自后代尾组织的DNA可用于鉴定含有遗传修饰细胞的小鼠。
可以通过生殖系细胞中含有REDK基因破坏的嵌合小鼠的交配，产生所有生殖系细胞和体细胞均具有REDK基因破坏的后代。REDK基因破坏的杂合小鼠接着可杂交产生纯合体(见例如美国专利5,557,032，和美国专利5,532,158)。
作为上述ES细胞技术的一个替代方案，可以使用核转移将来自一个细胞的遗传修饰转移给整个动物。可采用这个方法产生除小鼠之外的其它遗传修饰的非人哺乳动物，例如绵羊(见例如McCreath等(2000)；Campbell等(1996)；和Schnieke等(1997))和小牛(Cibelli等(1998))。简言之，选择体细胞(如成纤维细胞)或多能干细胞(如ES样细胞)作为核供体并遗传修饰使其含有功能性破坏的REDK基因。当将DNA载体插入体细胞使REDK基因突变时，优选载体中使用无启动子的标记，这样该载体整合到REDK基因中将导致该标记在REDK基因启动子控制下表达(Sedivy等(1999)；McCreath等(2000))。具有适当被破坏的REDK基因的来自供体细胞的核接着转移到去核的受精或单性生殖卵母细胞中(Campbell等(1996)；Wilmut等(1997))。胚胎被重建，培养发育至桑葚胚/胚泡阶段，然后转移到代孕母体中在子宫中进行足月发育。
本发明也包括遗传修饰的非人哺乳动物和遗传修饰的哺乳动物细胞的后代。无论后代在破坏REDK基因的遗传修饰方面是杂合的或纯合的，由于传代过程中可能发生的除了最初的REDK基因遗传破坏外的突变或环境影响，它们在遗传上可能不等同于亲代非人哺乳动物和哺乳动物细胞。
使用本领域技术人员已知的技术，可从组织或器官分离非人遗传修饰动物的细胞。在一个实施方案中，本发明遗传修饰的细胞被无限增殖化。根据这个实施方案，可以通过基因工程将端粒酶基因、癌基因，如mos或v-src，或细胞凋亡抑制基因、如bcl-2基因引入细胞，使细胞无限增殖化。可供选择地，可以利用本领域技术人员已知的技术，通过与杂交伙伴融合使细胞无限增殖。
本发明含有破坏的内源REDK基因的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞可进一步修饰而表达人REDK序列(这里称作“人源化”)。人源化细胞的优选方法包括通过同源重组用编码人REDK序列的核苷酸序列(见例如，Jakobsson等(1999))取代内源REDK序列。该载体在5’和3’同源臂和阳性/阴性选择方案上类似于传统用作寻靶载体的那些载体。然而，该载体还包括重组后能以人REDK编码序列置换内源序列或能实现改变内源序列使其编码人REDK的碱基对改变、外显子置换或密码子置换的序列。一旦鉴定到同源重组体，可以使用Cre或Flp介导的定点重组(Dymecki(1996))切除任何选择序列(如neo)。
当用人REDK序列置换内源序列时，优选将此改变导入内源翻译起始位点的直接下游。此定位可以保存REDK基因的内源时间和空间表达模式。人序列可以是为了正确加工而在3’末端连接polyA尾巴的全长人cDNA序列或整个基因组序列(见例如Shiao等(1999))。在例如Sullivan等(1997)，Reaume等(1996)和美国专利5,777,194中提供了关于如何遗传修饰细胞和非人哺乳动物以将内源基因表达置换为其人对应物的这些方法的更多指导。
本领域已知的用于产生这种“人源化”生物的另一种方法是两步法，包括破坏内源基因，随后通过原核显微注射将编码人序列的转基因导入剔除胚胎中。
遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞的用途通过调查本发明REDK(-/-)非人哺乳动物和动物细胞的表型特征，可以进一步说明REDK基因的功能和治疗相关性。例如，遗传修饰的REDK(-/-)非人哺乳动物和哺乳动物细胞可用于确定REDK是否对某些疾病(如贫血)模型中出现的症状或表型有引起或预防的作用。如果REDK(-/-)非人哺乳动物或动物细胞与野生型(REDK+/+)或REDK(+/-)非人哺乳动物或动物细胞相比，症状或表型不同，那么REDK多肽在调节与该症状或表型相关的功能方面起作用。
通过比较REDK破坏的ES细胞或REDK(-/-)小鼠与野生型ES细胞或小鼠的生物学特征可以调查REDK功能，所述特征如形态学、组织学、代谢、发育或行为特征(如适用的话)。可以用于研究REDK功能的REDK(-/-)ES细胞的示例性生物学特征是REDK破坏对红细胞分化的影响。例如，通过从培养基中除去白血病抑制因子(LIF)，本发明的REDK(-/-)ES细胞和野生型细胞可以用于制备胚状体。接着在红细胞生成素存在下培养此胚状体的细胞，通过评估红色的红细胞集落的形成，可以比较REDK(-/-)和野生型细胞中红细胞分化的水平。如图4所示，与野生型细胞相比，REDK(-/-)ES细胞中红细胞分化的水平实质上增加。
此外，在一种试剂被鉴定为REDK激动剂或拮抗剂(如，当将该试剂施用于REDK(+/+)或REDK(+/-)非人哺乳动物或动物细胞时，该试剂显著改变一种或多种REDK多肽活性)的情况下，本发明的遗传修饰的REDK(-/-)非人哺乳动物和动物细胞可用于表征由该试剂引起的(除了已知由REDK拮抗作用造成的作用以外的)任何其它作用(即非人哺乳动物和动物细胞可以用作阴性对照)。例如，如果施用该试剂对REDK(+/+)非人哺乳动物或动物细胞引起了未知是否与REDK多肽活性相关的作用时，那么通过将该试剂给予相应的REDK(-/-)非人哺乳动物或动物细胞，可以确定该试剂是否唯一或主要通过调节REDK来发挥此作用。如果在REDK(-/-)非人哺乳动物或动物细胞中，这个作用缺乏或明显降低，那么该作用至少部分受REDK介导。然而，如果REDK(-/-)非人哺乳动物或动物细胞表现出可以与REDK(+/+)或REDK(+/-)非人哺乳动物或动物细胞相比较程度的效应，那么该作用由不涉及REDK信号传导的途径来介导。
此外，如果一种试剂被怀疑可能主要通过REDK途径发挥作用，那么REDK(-/-)非人哺乳动物和哺乳动物细胞可用作阴性对照来检验这个假说。如果该试剂确实通过REDK起作用，那么施用该试剂后，试剂在REDK(-/-)非人哺乳动物和哺乳动物细胞中应该不表现出在REDK(+/+)非人哺乳动物或哺乳动物细胞中观察到的相同作用。
本发明遗传修饰的非人哺乳动物和哺乳动物细胞也可以用于鉴定在REDK(+/-)或REDK(-/-)非人哺乳动物或哺乳动物细胞中相对于在其野生型对照中表达被差异调节的基因。基于本发明说明书，本领域技术人员已知的技术可用于鉴定这种基因。例如，微阵列可用于鉴定在REDK(+/-)或REDK(-/-)小鼠中表达被差异调节以补偿REDK表达缺陷的基因。使用本领域已知方法可以制备、使用本领域技术人员已知的微阵列和进行结果分析(见例如Aigner，等(2001)；美国专利5,965,352；Schena，等(1995-A)；DeRisi，等(1996)；Shalon，等(1996)；和Schena，等(1995-B)；美国专利5,474,796；Schena，M.，等(1996)；WO 95/251116；WO 95/35505；Heller，R.A.等(1997)；和美国专利5,605,662)。
化学偶联法和喷墨装置可以用于在基质表面上合成阵列元件(见如Baldeschweiler，前述引文)。使用热、UV、化学或机械结合法，类似于点或狭缝印迹的阵列也可以用于在基质表面排列和连接元件。典型的阵列可以手工或使用现有方法及机器来制备，其可以含有任何适当数量的元件。杂交后，除去未杂交的探针，扫描仪用于确定荧光的水平和模式。与微阵列上元件杂交的每个探针的互补性程度和相对丰度可以通过扫描图像的分析来估计。
全长cDNA、已表达序列标志(EST)或其片段可以构成微阵列的元件。可以使用本领域已知的软件如LASERGENE软件(DNASTAR)选择适于杂交的片段。将对应于本发明核苷酸序列之一的或从本发明相关cDNA文库中随机选择的全长cDNA、已表达序列标志(ESTs)或其片段排列在适当的基质，如玻片上。使用如紫外线交联，之后热和化学处理和随后干燥(见如Schena，M.等(1995-A)；Shalon，等(1996))将cDNA固定到玻片上。制备荧光探针并用于与基质上的元件杂交。通过本领域熟知方法，例如通过扫描和分析微阵列图像来分析该基质。
此外，本发明遗传修饰的非人哺乳动物和哺乳动物细胞可以用于鉴定在REDK(+/-)或REDK(-/-)非人哺乳动物或哺乳动物细胞中相对在于其各自的野生型对照中，表达或翻译后修饰发生改变的蛋白。基于本说明书，本领域技术人员已知的技术可以用于鉴定这种蛋白。例如，蛋白质组阵列可以用于鉴定在REDK(+/-)或REDK(-/-)小鼠中表达谱或翻译后修饰发生改变以补偿REDK表达缺陷的蛋白质。蛋白质组试验是本领域技术人员已知的(见例如Conrads等(2002)；Dongre，等(2001)；Van Eyk(2001)；Cole，等(2000)；Araki，等(2000))。
实施例实施例1REDK寻靶载体的制备含有小鼠REDK cDNA序列(Genbank BC006704)第1121-2092位碱基对的1Kb小鼠REDK基因组片段用作探针鉴定来自129/SvJ基因组λ噬菌体文库(Stratagene)的基因组克隆。分离了含有重叠的12kb和17kb片段的两个阳性λ克隆。
用EcoRI切割含有12kb片段的克隆得到待用作寻靶载体5’同源臂的5.4Kb片段。接着该5.4Kb片段插入主链载体pJNS2frt的EcoRI位点(图1)。使用Nsil切割含有17kb片段的克隆得到8kb片段。该8kb片段插入pBluescriptllSK+(Stratagene)的Pst位点。用Notl/XhoI限制性酶切此pBluescriptllSK+克隆得到8kb片段，它接着作为3’同源臂插入已经含有5’同源臂5.4kb片段的pJNS2frt主链载体的NotI/XhoI位点。如图2A和2B所示，选择标记与同源臂处于相反方向。
所得寻靶载体用于制备REDK被破坏的ES细胞，见如下实施例2所述，其中，用新霉素基因PGK-NEO置换大约3kb基因组座位(对应于小鼠REDK肽序列(GenBank登记号BC006704)的氨基酸64-586位)。这导致天然蛋白中从64位异亮氨酸至586位丝氨酸的缺失。
实施例2REDK被破坏的ES细胞的制备步骤A——培养条件。得自129svJ纯系小鼠的多能RW4 ES细胞在培养中维持在含Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)(#10829-018，Invitrogen Life Technologies，Inc.，Carlsbad，CA)的干细胞培养基(SCML)中丝裂霉素C处理的原代胚胎成纤维细胞(PEF)饲养层上，该培养基补充了15％合乎ES细胞的胎牛血清(#10439-024，InvitrogenLife Technologies)、0.1mM 2-巯基乙醇(#M-7522，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、0.2mM L-谷氨酰胺(#25030-081，Invitrogen LifeTechnologies)、0.1mM改良的Eagle氏培养基(MEM)非必需氨基酸(#11140-050，Invitrogen Life Technologies)、1000u/ml重组小鼠白血病抑制因子(LIF)(ESGRO#ESG-1107，Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)和50μg/ml庆大霉素(#15710-064，Invitrogen Life Technologies)。
步骤B-REDK(+/-)ES细胞的制备。实施例1的REDK寻靶载体(25μg)被线性化并使用BTX Electro Cell操作器600(BTX，Inc.，San Diego，CA)以260V电压、50μF电容和360欧姆电阻在1×107个RW4 ES细胞和400μl SCML中进行电穿孔。电穿孔后，细胞铺在四个100mm组织培养皿的SCML中于丝裂霉素C处理的PEF上。电穿孔后二十四小时，向SCML中添加200μg/ml G418(#10131-035，Invitrogen Life Technologies)和2μM丙氧鸟苷开始阳性/阴性选择。选择7-9天后，用拉制的微量吸管将G418抗性菌落挑取到24孔组织培养皿的各个孔中并扩增为克隆ES细胞系。
步骤C-REDK(-/-)ES细胞的制备。融解本实施例步骤B的REDK(+/-)ES细胞并在200μg/ml G418/SCML中于PEF上维持2天。接着G418(#11811-031，Invitrogen Life Technologies)的浓度增加到2.5mg/ml。7-10天后，分离存活的ES细胞集落，将2-5×105细胞/ml铺到2.5mg/mlG418/SCML中的新PEF上。4-7天后，用拉制的微量吸管挑取抗性集落并转移到24孔组织培养皿的各个孔中并扩增为克隆ES细胞系。
步骤D-基因寻靶的证实。
使用来自8.0kb同源臂下游区域的1.0kb长的探针，通过SpeI消化的ES细胞DNA的Southern分析，在存活的ES细胞克隆中确定通过同源重组发生的基因寻靶。内源野生型等位基因产生大约17kb杂交条带，而被打靶的(破坏的)等位基因由于导入了来自REDK寻靶载体的新SpeI位点而给出10kb预期的限制性片段长度多态性(RFLP)。在5’侧通过用来自6.0kb同源臂上游区域的650bp长探针探测BamHl/Notl双消化的ES细胞DNA来证实通过同源重组进行的基因寻靶。这种消化对于野生型等位基因产生了17kb条带而在破坏的等位基因中产生了10kb条带。使用NEO探针的Southern分析证实了发生同源寻靶的ES细胞克隆中无一含有多个插入。核型分析证实了无染色体异常发生。
实施例3REDK被破坏的小鼠的产生将实施例2的REDK(+/-)ES细胞显微注射到根据Hogan等(1988)从超排卵雌性小鼠(Charles River Laboratories，Inc.，Wilmington，MA)制备的2.5日龄的C57BL/6胚泡中。所得嵌合小鼠与C57BL/6配偶回交以鉴定种系传递。REDK(-/-)小鼠来源于REDK(+/-)雄性和雌性小鼠的杂交。根据Pfizer Institutional Animal Care and Use Committee批准的方案实施所有动物工作。使用根据上面实施例2的Southern分析，以及通过组合两个PCR反应完成第二代(F2)REDK小鼠的基因分型，其中，一个PCR反应对寻靶载体具特异性，用于扩增500bp片段(接合处PCR正向引物5′-GCCAGCTCATTCCTCCACTCA-3′(引物A)(SEQ ID NO1)，反向引物5′-ATTTCTTTGAGACAGAGACTGC-3′(引物B)(SEQ ID NO2))；第二PCR反应对所破坏的区域具特异性，用于扩增700bp片段(破坏的区域的PCR正向引物5′-AGGTCATCGACTTTGGCTCC-3′(引物C)(SEQ ID NO3)，反向引物5′-CACTAGCTAATCAGCTTTGGC-3′(引物D)(SEQ ID NO4))。两个反应的循环条件都是30个循环的94℃30秒、65℃30秒和72℃1分钟，使用标准PCR反应方案。结果示于图3中。REDK(-/-)小鼠有生活力并且总的观察显示无明显表型。
实施例4REDK被破坏的和野生型的哺乳动物细胞的表型比较——分化为红细胞来自129svJ的野生型RW4 ES细胞和根据实施例2制备的REDK(-/-)ES细胞如实施例2的步骤A所述进行培养。从它们各自的PEF饲养层取出野生型和REDK(-/-)ES细胞并在组织培养皿中于补充了15％合乎ES细胞的胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇(#M-7522，Sigma-Aldrich)、0.2mM L-谷氨酰胺(#25030-081，Invitrogen Life Technologies)、0.1mM MEM非必需氨基酸(#11140-050，Invitrogen Life Technologies)、1000u/ml重组小鼠LIF(ESGRO#ESG-1107，Chemicon International)和50μg/ml庆大霉素(#15710-064，Invitrogen Life Technologies)的Iscove氏改良的Dulbeccoo氏培养基(IMDM)(#31980-030，Invitrogen Life Technologies)中生长两天。接着分离细胞并在补充了15％合乎ES细胞的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、300μg转铁蛋白(#13008-016，Invitrogen Life Technologies)、50μg/ml L-抗坏血酸(#A-4403，Sigma-Aldrich)、5％PFHM-II(#12040-093，Invitrogen Life Technologies)、4×10-4M一硫代甘油(MTG)和50μg/ml庆大霉素(#15710-064，Invitrogen Life Technologies)的IMDM中悬浮培养生长。细胞在悬液中生长六天(第0天开始)形成细胞聚集的胚样体(EB)。在第5，6，7和8天用0.05％胰蛋白酶EDTA分离EB并以1×105细胞/35mm皿铺在IMDM和1％甲基纤维素的培养基(StemCell Technologies，British Columbia，Canada)中，其中培养基补充了10％合乎ES细胞的胎牛血清、5％无蛋白的杂交瘤培养基(PFHM-II)(#12040-093，Invitrogen Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺、5u/ml Epogen(Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA)、100ng/ml干细胞因子(StemCell Technologies)和50μg/ml庆大霉素(#15710-064，Invitrogen LifeTechnologies)。在分化第12-15天计数红色的红细胞集落。图4比较了野生型和REDK(-/-)ES细胞中的红细胞分化。
参考文献Abuin和Bradley(1996)Mol.Cell.Biol.161851-56.
Agah等(1997)J.Clin.Invest.100169-79.
Aigner，等(2001)Arthritis and Rheumatism 442777-89.
Allen等(1988)Nature 333852-55.
Akagi等(1997)Nucleic Acids Res.251766-73.
Araki等(1997)J.Biochem.122977-82.
Araki，等(2000)Electrophoresis 21180-1889.
Ausubel，F.M.等(2001)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY.
Barinaga(1994)Science 26526-28.
Baum等(1994)Biotechniques 171058-62.
Bellen等(1989)Genes Dev.31288-1300.
Bier等(1989)Genes Dev.31273-1287.
Biewenga等(1997)J.Neuroscience Methods 7167-75.
Bolivar等(1977)Gene 295.
Bollag等(1989)Annu.Rev.Genet.23199-225.
Bonnerot等(1992)J.Virol.664982-91.
Bradley等(1992)Biotechnol.10534.
Brenner等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 865517-21.
Brocard等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9414559-63.
Campbell，等(1996)Nature 38064-68.
Capecchi(1989)Science 2441288-92.
Capecchi(1989)Trends Genet.570.
Caplitt和Loewy(1995)Viral VectorsGene Therapy andNeuroscience Applications，Academic Press，San Diego.
Chang等(1993)Virology 193737-47.
Chu等(1987)Nucleic Acids Res.151311-26.
Cibelli，等(1998)Science 2801256-58.
Cole，等(2000)Electrophoresis 211772-1781.
Coligan，John E.，等(1994)Current Protocols in Immunology，JohnWiley & Sons，New York，NY.
Coligan，John E.，等(2002)Current Protocols in Protein ProteinScience，John Wiley & Sons，New York，NY.
Conrads等(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.290896-890.
Cruz等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)887170-74.
Davis等(1986)Basic Methods in Molecular Biology，ElsevirSciences Publishing，Inc.，New York，NY.
Deng和Capecchi(1992)Mol.Cell.Biol.123365-3371.
DeRisi，等(1996)Nature Genetics 14457-460.
Doetschman，等(1985)J.Embryol.Exp.Morph.8727-45.
Dongre，等(2001)Bioploymers 60206-211.
Dracopoli，等(1994)Current Protocols in Human Genetics，JohnWiley & Sons，New York，NY.
Dymecki(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.936191-96.
Efrat等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912051-55.
Evans等(1981)Nature 129154-156.
Erlich等(1991)Science 2521643-51.
Feil等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9310887-90.
Friedrich和Soriano(1991)Genes Dev.51513-23.
Friedrich和Soriano(1993)Methods Enzymol.225681-701.
Goff(1987)Methods Enzymol.152469-81.
Gossen和Bujard(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547-51.
Gossler等(1989)Science 244463-65.
Gu等(1994)Science 265103-06.
Hames等(1985)Nucleic Acid Hybridization，IL Press.
Heller，R.A.等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942150-2155.
Hirashima等(1999)Blood 931253-63.
Hogan，等(1988)Manipulating the Mouse EmbryoA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.
Hooper，等(1987)Nature 326292-95.
Hope(1991)Develop.113399-408.
Jakobsson，等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 967220-25.
Keller等(1995)Curr.Opin.Ceu Biol.7862-69.
Kentrup，Heiner，等(1996)J.Biol.Chem.271，3488-3495.
Kerr等(1989)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.2767-776.
Klug等(1996)J.Clin.Invest.98216-24.
Kühn等(1995)Science 2691427-29.
Larsson等(1994)Nucleic Acids Research 222242-48.
Li，等(1998)Curr.Biol.8971.
Lieschke等(1995)Exp.Hematol.23328-34.
Linney等(1999)Dev.Biol.(Orlando)213207-16.
Lo(1983)Mol.Cell.Biol.31803-14.
Lord，Kenneth A.，等(2000)Blood 95(9)，2838-2846.
Luyckx等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.9612174-79.
Mansour(1990)GATA 7219-227.
Mansour等(1988)Nature 336348-52.
Mansour等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 877688-7692.
Mattila，等(1991)Nucleic Acids Res.194967.
Martin(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，787634-7638.
Meyers等(1998)Nature Genetics 18136-41.
McCreath，等(2000)Nature 291066-69.
McMahon和Bradley(1990)Cell 621073-85.
Mortensen等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)887036-40.
Mortensen，等(1992)Mol.Cell.Biol.122391-95Mouellic等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)874712.
Nagy等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908424-8428.
Neumann等(1982)EMBO J.1841-845.
Nickoloff等(1998)Mol.Biotech.1093-101.
Notanianni，等(1991)J.Reprod.Fert.Suppl.，43255-260.
O′Gorman等(1991)Science 2511351-55.
Orban等(1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 896861-65.
Ory等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 9311400-11406.
Potter等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci USA 817161-65.
Rajewski等(1996)J.Clin.Invest.98600-03.
Ray和Gage，Biotechniques 13598-603，1992.
Reaume，等1996)J.Biol.Chem.27123380-88.
Reddy等(1991)J.Virol.651507-1515.
Reddy等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.896721-25.
Rinchik(1991)Trends in Genetics 715-21.
Roach等(1995)Exp.Cell Res.221520-25.
Robertson，E.J.(1987)Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellA Practical Approach，OxfordIRL Press，Washington，D.C..
Robertson等(1986)Nature 323445-48.
Robinson，J.Paul(1997)Current Protocols in Cytometry，John Wiley& Sons，New York，NY.
Russell(1994)，Environmental & Molecular Mutagenesis 23(Suppl.24)23-29.
Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY.
Sauer(1993)Meth.Enz.225890-900.
Sauer等(1989)Nucleic Acids Research 17147-61.
Schena等(1995-A)Science 270467-470.
Schena，等(1995-B)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)9310539-11286.
Schena，M.，等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，10614-10619.
Schnieke，等(1997)Science 2782130-33.
Schwartzberg，等(1989)Science 246799-803.
Sedivy和Sharp(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86227.
Sedivy等(1999)T.I.G.1588-90.
Shalon，等(1996)Genome Res.6639-645.
Shesely，等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)884294).
Shiao等(1999)Transgenic Res.8295-302.
Skarnes等(1992)Genes Dev.6903-918.
Smith和Berg(1984)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.49171.
Sokol等(1996)Transgenic Research 5363-71.
St.-Onge等(1996)Nucleic Acids Res.243875-77.
Sullivan，等(1997)J.Biol.Chem.27217972-80.
te Riele等(1990)Nature 348649-651.
Thomas和Capecchi(1987)Cell 51503-12.
Thomson等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844-7848.
Torres和Kuhn(1997)Laboratory Protocols for Conditional GeneTargeting，Oxford University Press.
Valancius和Smithies(1991)Mol.Cell.Biol.111402.
Van Eyk(2001)Curr Opin Mol Ther 3546-553.
vonMelchner和Ruley(1989)J.Virol.633227-3233.
Waldman和Liskay(1988)Mol.Cell.Biol.85350-5357.
Wilmut，等(1997)Nature 385810.
Yamane等(1997)Blood 903516-23.
Yoshida等(1995)Transgen.Res.4277-87).
Zhang等，Biotechniques 15868-72，1993.
Zimmer和Gruss(1989)Nature 338150-153.
Zjilstra等(1989)Nature 342435-438.
序列表<110>辉瑞产品公司(PFIZER PRODUCTS INC)<120>REDK基因的破坏<130>PC23222A<150>US 60/368,810<151>2002-03-30<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>小鼠<400>1gccagctcat tcctccactc a 21<210>2<211>22<212>DNA<213>小鼠<400>2atttctttga gacagagact gc 22<210>3<211>20<212>DNA<213>小鼠<400>3aggtcatcga ctttggctcc20<210>4<211>21<212>DNA<213>小鼠<400>4cactagctaa tcagctttgg c 2权利要求
1.遗传修饰的非人哺乳动物，其中该修饰包括破坏的REDK基因。
2.权利要求1的哺乳动物，其中所述哺乳动物是小鼠。
3.遗传修饰的动物细胞，其中该修饰包括破坏的REDK基因。
4.权利要求3的动物细胞，其中所述细胞是ES细胞或ES样细胞。
5.权利要求3的动物细胞，其中所述细胞分离自权利要求1的遗传修饰的非人哺乳动物。
6.权利要求3的动物细胞，其中所述细胞是造血细胞或睾丸细胞。
7.权利要求3的动物细胞，其中所述细胞是小鼠或人的。
8.鉴定与REDK活性降低或消除相关的生物学特征的方法，包括将权利要求1的遗传修饰的非人哺乳动物的生物学特征，或权利要求3的遗传修饰的动物细胞的生物学特征，与适当野生型非人哺乳动物或动物细胞对照的生物学特征进行比较。
9.鉴定由于REDK活性降低或消除而显示出表达改变的基因的方法，包括将权利要求3的动物细胞中至少一个不是REDK的基因的表达水平与适当野生型动物细胞对照中的该基因表达进行比较。
10.鉴定由于动物细胞中REDK活性降低而显示出水平改变或翻译后加工改变的蛋白质的方法，包括将权利要求3的动物细胞中该蛋白质的水平或翻译后特征与适当野生型动物细胞对照中该蛋白质的水平或翻译后特征进行比较。
全文摘要
本发明涉及含有定向破坏的REDK基因的非人哺乳动物和动物细胞。
文档编号C12N5/08GK1646906SQ03807632
公开日2005年7月27日 申请日期2003年3月17日 优先权日2002年3月30日
发明者W·H·布里塞特, K·S·纽特, J·E·汗伯, M·R·爱伦, M·L·罗奇 申请人:辉瑞产品公司