防止或降低饮料混浊的改进方法

专利名称：防止或降低饮料混浊的改进方法
技术领域：
本发明涉及通过添加内切蛋白酶而防止或降低饮料混浊(haze)的方法，以及根据本发明方法获得的新饮料。本发明也涉及新的内切蛋白酶。
混浊是饮料工业中的公知现象。混浊例如可存在于啤酒、葡萄酒和果汁中。混浊形成可以出现在酿造过程中的不同阶段。在T.Nagodawithana和G.Reed编辑的“Enzymes in foodprocessing″，第三版，Academic press Inc.，San Diego，Chapter V，p.448-449中，已经建议啤酒中的混浊是啤酒蛋白质和多酚原矢车菊素(polyphenolic procyanidins)相互作用的结果。它解释道，在啤酒中混浊经常在啤酒的冷却过程中形成。啤酒经常在冷却的条件下发酵和熟化。为了获得澄清效果，啤酒经常在冷却条件下过滤。尽管存在这一过滤步骤，啤酒在包装并卖给消费者饮用前再次冷却，从而变成雾状。最终，即使啤酒没有或不再冷却时，也会形成混浊，并出现沉淀物。混浊形成是不想要的，因为由混浊形成所导致的雾状与由微生物污染所导致的雾状是类似的，而后者是不想要的，特别是对于清啤酒(brightbeers)来说。
在″Industrial Enzymology″，第2版，Chapter 2.6，p.124-125中，描述了啤酒中的混浊是由麦芽中的高分子量大麦醇溶蛋白组分交联引起的，所述大麦醇溶蛋白组分含有高比例的疏水性氨基酸，其与主要由原花色素和儿茶素(类黄酮)组成的多酚类结合。据描述，少量的糖类和痕量的矿物离子也参与了混浊形成以及氧化，其中氧化在多酚类的聚合产生不可逆混浊中扮演了重要角色。它建议，冷却时，多酚类缓慢地与蛋白质结合形成冷混浊，但在加热时又重新溶解。然而，最终，随着多酚类的聚合和尺寸的增加，它们在室温下变成不溶，进而形成不可逆的或永久的混浊。
在一些其它的出版物中，已经建议混浊在例如啤酒、葡萄酒和果汁、咖啡和茶中的形成是蛋白质和多酚之间相互作用的结果。(K.J.Siebert等人，J.Agric.Food Chem.44(1996)1997-2005和K.J.Siebert等人，J.Agric.Food Chem.44(1996)80-85，K.J.Siebert，J.Agric.Food Chem.47(1999)353-362).自从L.Wallerstein在1911年的发现以来，已经知道减少啤酒中冷却混浊形成(chill haze formation)的一个方法是向啤酒中添加木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶是番木瓜果的提取物，具有蛋白水解活性。在T.Nagodawithana和G.Reed编辑的″Enzymes in foodprocessing″，第三版，Academic press Inc.，San Diego，Chapter V，p.448-449中，木瓜蛋白酶被描述为远比任何其它酶更能有效防止啤酒的冷混浊。但是，木瓜蛋白酶发挥作用的确切机制还没有确定(″Enzymes in food processing″，由T.Nagodawithana和G.Reed编辑，第三版，Academic press Inc.，San Diego，Chapter V，p.448-449).
但是，使用木瓜蛋白酶的一个不利之处在于它对泡沫具有不利的影响。蛋白质是啤酒中形成泡沫所必需的。但是，木瓜蛋白酶通过其蛋白水解活性，不利地影响了酒头泡沫(head foam)的稳定性。
葡萄酒中混浊的形成在例如T.Nagodawithana和G.Reed编辑的″Enzymes in food processing″，第三版，Academic pressInc.，San Diego，Chapter 16，p.425中进行了讨论，其中描述道在葡萄酒储藏过程中葡萄蛋白质导致了混浊的形成。如果葡萄酒在装瓶之后形成沉淀，则该葡萄酒对消费者将缺少吸引力，这将影响销售。为了防止沉淀，使用了例如皂土。尽管皂土和其它吸附剂能够成功地除去蛋白质，但其是非选择性的，也会从葡萄酒中除去其它所需的化合物，这常常影响葡萄酒的感官特性。此外，使用皂土会导致葡萄酒的大量损失，并且使得除去含有皂土的废物比较困难。
尽管其机制还未很好了解，但是假设木瓜蛋白酶的加入水解了啤酒中的蛋白质，从而使蛋白质-多酚混浊不形成，或者形成的程度变小。皂土在葡萄酒中的使用也是基于类似的原因通过吸收蛋白质，其防止了蛋白质-多酚混浊和沉淀的形成。但是，除了除去蛋白质外，也可以通过除去多酚来减少或防止混浊形成。用于从饮料中除去多酚的典型例子是聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)。最近认识到多酚是重要的抗氧化剂。
由于抗氧化剂所带来的所有有益效果，从饮料中除去多酚的选择并不是防止混浊形成的最吸引人的方法。
由于所有已知的用于防止或除去混浊的方法都具有缺陷，因此仍然需要一种新的方法来防止或降低饮料的混浊。
本发明的目的是提供一种防止或降低饮料混浊的方法。
出乎意料地，已经发现这一目的可以通过提供一种防止或降低饮料混浊的方法来实现，在该方法中，将具有酸性pH最佳值的内切蛋白酶加入到饮料中。优选地，该内切蛋白酶是具有脯氨酰特异性内切蛋白酶活性和/或羟脯氨酰特异性活性和/或丙氨酸特异性活性的分离的内切蛋白酶。
在本发明框架中，术语“饮料”包括处于所有制备阶段的饮料。因此，饮料并不仅仅指即可用于消费的饮料，而且也指用于制备该饮料的任何组合物。例如，在啤酒制备中所用的麦芽汁也包含在此处所用的术语“饮料”中。此外，在饮料制备过程中向不是或不完全是液体的组合物中添加脯氨酰特异性内切蛋白酶也落在本发明方法的范围中。在啤酒酿造开始时加入到醪液中的脯氨酰特异性内切蛋白酶是此类组合物的一个例子。
脯氨酰特异性内切蛋白酶(Endo-Pro)是这样一种优选纯化的内切蛋白酶，其在蛋白质或肽在其链中含有脯氨酰残基之处或其附近切割该蛋白质或肽。优选地，在本发明方法中，使用在蛋白质或肽中含有脯氨酰残基之处切割该蛋白质或肽的内切蛋白酶。
术语Endo-Pro、脯氨酰特异性内切蛋白酶、脯氨酸特异性内切蛋白酶、脯氨酸特异性内肽酶和具有脯氨酰特异性活性的肽或者类似表达方式都是可以互换使用的。
羟脯氨酰特异性内切蛋白酶(Endo-Hydroxy-Pro)是这样一种优选纯化的内切蛋白酶，其在蛋白质或肽在其链中含有羟脯氨酰残基之处或其附近切割该蛋白质或肽。优选地，在本发明方法中，使用在蛋白质或肽中含有羟脯氨酰残基之处切割该蛋白质或肽的羟脯氨酰特异性内切蛋白酶。
丙氨酸特异性内切蛋白酶(Endo-Ala)被定义为这样一种优选纯化的内切蛋白酶，其在蛋白质或肽在其链中含有丙氨酸残基之处或其附近切割该蛋白质或肽。优选地，在根据本发明的方法中，使用在蛋白质或肽含有丙氨酸残基之处切割该蛋白质或肽的丙氨酸特异性内切蛋白酶。
具有脯氨酰特异性活性的内切蛋白酶是已知的(E.C.3.4.21.26).但是在饮料中使用脯氨酰特异性内切蛋白酶或者甚至羟脯氨酰特异性内切蛋白酶或丙氨酸特异性内切蛋白酶来防止或降低混浊则还从来未被描述或建议过。
术语肽和蛋白质在此处可互换使用。同样，术语″混浊″和″雾状″也可互换使用。
在本发明更优选的方法中，使用了在脯氨酰残基C-末端切割的脯氨酰特异性内切蛋白酶。在脯氨酰残基NH2-末端切割的脯氨酰特异性内切蛋白酶描述于例如出版物Nature，15 January 1998，Vol.391，p.301-304。
通过用脯氨酰特异性和/或羟脯氨酰特异性和/或丙氨酸特异性内切蛋白酶联合辅助酶(auxiliary enzyme)进行处理，可以在饮料中进一步降低混浊。
在某些条件下和在某些饮料中，在单独用Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro和/或Endo-Ala处理所降低的混浊程度基础上，需要进一步降低混浊。在这种情况下，在Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro和/或Endo-Ala处理之前、之中或之后加入辅助蛋白水解酶是有益的。这类辅助酶可以是内切蛋白酶或外切蛋白酶，例如三肽酶(tripeptidylpeptidase)和/或羧肽酶和/或肽基二肽酶(peptidyl-dipeptidase)。
这一附加处理的目的是增加Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro和/或Endo-Ala处理后残留肽的溶解性和/或进一步降低残留多肽与多酚的相互作用。
该目的通过以下方式实现向该饮料中加入能除去Endo-Pro处理后所残留肽的羧基末端脯氨酸残基的外切蛋白酶，例如三肽酶和/或羧肽酶和/或肽基二肽酶。或者，用内切蛋白酶与此类外切蛋白酶联用，可以使Endo-Pro处理后所残留肽进一步溶解。特别适用于该目的的是那些能够切割在甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺残基的N-或C-末端肽键的酶。
对合成的显色肽FA-Pro或FA Pro-Pro具有活性的羧肽酶作为辅助酶是特别有用的。
具有上述特异性的辅助性内切蛋白水解酶可以商购获得，或者用本领域已知的方法筛选，例如借助于合成的显色肽，如Z-A-A-A-pNA，其中pNA＝对硝基苯胺，Z＝苄氧基羰基，A＝氨基酸甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
对合成的显色肽例如FA-Leu-Pro或FA-Phe-Pro(其中FA＝呋喃基丙烯酰)具有活性的辅助性肽基二肽酶特别有用。
用辅助酶的处理优选不应对饮料的味道、质地或口感产生不利影响。优选地，这些辅助酶具有酸性pH最佳值，或者在酸性条件下具有活性，优选低于、等于pH6.0、5.0、4.5或4.0，或者在其附近，甚至更优选低于、等于pH3.0或者在其附近。
在大多数啤酒的生产中，在加入(辅助性)蛋白水解酶时需要特别小心，不要破坏啤酒形成泡沫的能力。
在传统的啤酒酿造过程中，谷类被磨碎和捣碎，将所得的醪液过滤得到麦芽汁。该麦芽汁接着被蒸煮，使所有残余酶活性失活，接着用于支持酵母生长。在酵母生长和过滤后，啤酒得到扩增(lagered)。据描述，在该扩增阶段，可以向饮料中加入木瓜蛋白酶(collupuline)以防止混浊形成。但是，木瓜蛋白酶破坏了啤酒的泡沫形成能力。
负责啤酒泡沫的是一种称为LTP1(Lipid Transfer Protein)的蛋白质，其是一种10kDa的大麦蛋白质，具有非常坚固的三维结构，以致于在醪液形成阶段中通常存在的蛋白酶不能水解该分子。但是，在麦芽汁蒸煮阶段，LTP1去折叠，从而使得它对酶切割敏感。为了在泡沫形成中具有活性，LTP1需要具有某一特定最小尺寸。现在认为在扩增期间(即麦芽汁蒸煮后)与Collupuline的孵育破坏了LTP1，进而破坏了啤酒的泡沫形成能力。
在醪液形成阶段或扩增阶段中使用酸性内切蛋白酶，特别是Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro和/或Endo-Ala降低了混浊形成，但是没有破坏或严重影响LTP1，因此此类酶的使用不会对泡沫形成产生不利影响。
而且，Endo-Pro消化产生的肽的羧基末端脯氨酸残基的去除进一步降低了啤酒的混浊。在这方面，当联合使用分离自黄单胞菌属的脯氨酸特异性羧肽酶和Endo-Pro时，获得了特别好的结果。此外，肽基二肽酶A(EC 3.4.15.1)也可成功地获得该效果。
乳汁凝结酶例如Fromase也特别适合作为辅助酶与Endo-Pro联用以防止或降低混浊。Fromase非常适合于此目的，因为它不影响LPT1，因此保留了啤酒的泡沫形成能力。
Fromase是获自Rhizomucor miehei的商业产品(DSM FoodSpecialities)，用于干酪生产。Fromase是所谓的天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)。这些酶的特征在于具有非常低的pH最佳值，并且非常明显地偏向于切割大体积、疏水性氨基酸残基例如Phe-Phe、Phe-Tyr和Leu-Tyr之间的肽键。其它天冬氨酸蛋白酶是胃蛋白酶、组织蛋白酶和各种来自不同真菌的酸性蛋白酶。
通过用辅助酶联合Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro或Endo-Ala水解的附加处理也可以在葡萄酒中进一步降低混浊。
一种称为几丁质酶的蛋白质已知是葡萄酒中产生混浊的主要原因。该几丁质酶源于葡萄，并且富含甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基。由于葡萄酒具有非常低的pH，我们试图用酸性内切蛋白酶的复杂混合物来水解该几丁质酶。加入高浓度的称为AP 50.000的产品(来自Shin Nihon，Japan)对葡萄酒中的混浊形成没有影响。这一发现与Ferreira等人的结论相符(Trends in FoodScience & Technology 12(2002)230-239)，Ferreira等人认为基于蛋白水解葡萄酒蛋白质的所有策略在实践中被证明都是不成功的，并且可能是无效的。
在实施例7中描述了葡萄酒(白的和红的)与本发明酶制剂的孵育。通过使用辅助酶，例如除去羧基末端脯氨酸残基的外肽酶和/或特异于甘氨酸的内切蛋白酶可以进一步降低葡萄酒的混浊。
在葡萄酒中(或任何其它具有低pH值的饮料)使用Endo-Pro的另一个优点在于实施例7的实验中所用的Endo-Pro也能够在酸性条件下切割丙氨酸残基后面的肽键以及在羟脯氨酸残基处切割。(实施例13).
为了对饮料中的混浊进行定量，经常使用浊度计。在浊度计中，测量了相对于入射光方向以预定角度散射的光的数量。浊度测量非常适合于测量蛋白质-多酚相互作用所形成的混浊。
多酚被定义为具有如下化学结构的化合物，即该化学结构具有至少两个被至少一个羟基基团取代的芳香环，或具有至少一个被至少两个羟基基团取代的芳香环。
多酚的例子是单宁酸和类黄酮，包括例如儿茶酚、黄酮醇和花青素。
脯氨酰特异性内切蛋白酶的活性依赖于pH值，这一点对于酶活性来说是典型的。在本发明方法的优选实施方案中，将内切蛋白酶加入到饮料中，其中该内切蛋白酶在与其所加入的饮料pH相应的pH处具有最大脯氨酰特异性活性。优选的饮料是含有蛋白质的饮料。在另一优选的实施方案中，该饮料含有蛋白质和多酚。优选的饮料是pH值低于7的饮料。
本发明方法有利地应用于啤酒、葡萄酒和果汁。它也可有利地应用于啤酒和葡萄酒之外的酒精饮料。
此处所用的术语“啤酒”至少包括从未发芽的谷类制备的醪液、发芽的谷类制备的所有醪液以及从发芽和未发芽谷类混合物制备的所有醪液制备的啤酒。术语“啤酒”也包括具有添加剂的啤酒以及具有任何可能的醇含量的啤酒。
果汁可以是获自例如红莓、草莓、苹果、梨、西红柿、柑橘、蔬菜等的果汁。
在本发明方法中，加入到饮料中的脯氨酸特异性内切蛋白酶的量可以变化较大。在本发明方法的一个优选实施方案中，按照饮料中每克蛋白质加入至少150毫单位的脯氨酸特异性内切蛋白酶活性，该活性是通过用Z-Gly-Pro-pNA作为底物的活性测量方法确定的。
更优选地，向饮料中加入至少500毫单位的脯氨酸特异性内切蛋白酶，最优选地，加入至少1单位的脯氨酸特异性内切蛋白酶。
所加入脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的最大数量是无法具体描述的。该最大数量例如依赖于混浊防止或降低的程度、饮料的组成、饮料的pH值以及内切蛋白酶具有最大活性时的pH值。
在饮料的制备过程中，可以在不同阶段加入脯氨酰特异性内切蛋白酶。
在啤酒的制备过程中，脯氨酰特异性内切蛋白酶有利地加至醪液中。在另一个实施方案中，将脯氨酰特异性内切蛋白酶Endo-Pro加至发酵后的啤酒中。在啤酒制备过程中，脯氨酰特异性内切蛋白酶可以有利地在醪液形成或熟化步骤中加入。最优选的是，在蒸煮步骤之后将酶加入到麦芽汁中。
在葡萄酒的制备过程中，脯氨酰特异性内切蛋白酶优选加入到发酵后的葡萄酒中。在葡萄酒生产过程中，脯氨酰特异性内切蛋白酶也可以有利的在醇发酵或苹果乳酸发酵后加入。但是，酶也可以加至澄清地葡萄汁中，即在醇发酵步骤之前加入。
在制备果汁的过程中，脯氨酰特异性内切蛋白酶优选在浸渍或脱胶过程中加入。
由于混浊通常在酸性饮料例如啤酒、葡萄酒和果汁中形成，因此优选使用在低于7的pH值处具有脯氨酰特异性活性的脯氨酰特异性内切蛋白酶。更优选地，在本发明方法中使用在低于pH7.0或6.0处具有脯氨酰特异性最大活性的脯氨酰特异性内切蛋白酶。最优选的是最佳pH为pH5.0或以下的内切蛋白酶。
本发明提供了最佳pH为大约pH5.0或在4.0和5.0之间的具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的肽。
本发明进一步提供了具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的分离多肽，其选自下列(a)其氨基酸序列与SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7具有至少40％的总氨基酸序列同一性的多肽或其片段；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与下列杂交(i)核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDD NO3或SEQ IDNO6，或者其在60优选100个核苷酸上具有至少80％或90％同一性的片段，更优选在200个核苷酸上具有至少90％同一性的片段，或者(ii)与(i)的核酸序列互补的核酸序列。
也提供了编码脯氨酰特异性内切蛋白酶Endo-Pro的核酸分子。
本发明也涉及具有脯氨酰特异性内切蛋白酶活性的纯化或分离的多肽。优选的是在pH值低于7处具有最大活性的纯化的脯氨酰特异性内切蛋白酶。
本发明提供了分离的多肽，其具有根据SEQ ID NO4、SEQ IDNO5或SEQ ID NO7的氨基酸序列，或者具有通过在合适的宿主中表达多核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3或SEQ ID NO6而可获得的氨基酸序列。此外，包含上述多肽的功能等价物的肽或多肽也在本发明范围中。上述多肽一同包含于术语“本发明的多肽”中。
术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(这一点是公认的)，当上下文需要表示具有至少两个肽键连接的氨基酸的链时，这两个术语可以互换使用。单词“多肽”在此处用于指含有超过七个氨基酸残基的链。所有寡肽和多肽公式或序列在此处都是从左至右并且从氨基末端至羧基末端的方向书写。此处所用的氨基酸的单字母编号是本领域中公知的，并且可参见Sambrook等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd，ed.ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
“分离的”或“纯化的”多肽或蛋白质是与其天然环境分开的多肽或蛋白质。例如，为本发明目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽或蛋白质被认为是分离的，另外，通过任何合适的技术已经基本纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的，所述合适的技术例如为将酶从细胞物质中分离的简单超滤步骤或者Smith和Johnson，Gene 6731-40(1988)中所公开的一步纯化方法。
本发明的多肽可以通过公知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述公知方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。最优选地，使用高效液相色谱(″HPLC″)进行纯化。
本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成程序的产物和通过重组方法从原核或真核宿主中产生的产物，该宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。依赖于在重组生产程序中所用的宿主，本发明多肽可以糖基化，也可以不糖基化。
此外，本发明的多肽也可以包含经修饰的起始甲硫氨酸残基，在某些情况下，这是宿主介导的过程造成的结果。
本发明的有利实施方案涉及具有Endo-Pro活性的纯化或分离的多肽。这种纯化或分离的多肽可以从发酵培养基中获得，在该培养基中培养了根据本发明的生物，例如携带本发明多核苷酸的黑曲霉菌株。本领域技术人员知道如何从此类培养基的上清液中获得至少部分纯化的酶。在最基本的方法中，生产细胞通过离心从发酵培养基中分离。接着用滤器对所得液体进行过滤，然后进行超滤，从而获得每毫升含有1-50个酶单位的酶溶液。在理想条件下，所述酶可以就这样使用，即无需进一步纯化。如果需要，可以通过喷雾干燥或通过降低酶溶液的水活性(如添加多元醇或防腐剂)来稳定酶，进而改进酶的储存稳定性。
特别有利的纯化方法如下。在将细胞培养于合适的发酵培养基中后，通过离心使细胞与培养上清液分离。上清液看起来是混浊的。留在上清液中的较大颗粒接着用0，5％Dicalite或者优选1.0％Dicalite过滤除去，以防止堵塞下一步骤中所用的滤器。接着使用微生物减少过滤法(germ reduction filtration)以减少溶液中的微生物量。但是，滤液仍不是澄清的。接着使用分子量截止值为10kD的Millipore滤器以进一步降低溶液中水、盐和糖含量。在滤器上施加1巴的压力。所获得的典型产率是50-92％，基于发酵培养基中存在的单位相对于纯化的超滤液中获得的单位。超滤液中酶的典型浓度导致脯氨酰特异性内切蛋白酶活性介于4-10U/ml。
通过下列任一方法获得了进一步纯化使用Akta Explorer在24ml Q-sepharose FF柱(床高12cm/直径1.6cm)进行实验室规模的纯化。10ml UF-浓缩液在缓冲液A中稀释10倍，并施加于柱上。以20 CV中0-50％B的梯度洗脱蛋白质。缓冲液A为20mM NaAc pH5.1。缓冲液B为20mM NaAc+1M NaCl pH5.1。流速为5ml/min.
根据操作说明W-0894.A使用Akta纯化器在500mlQ-sepharose FF柱(床高23.5cm/直径5cm)上进行纯化。200ml UF-浓缩液在缓冲液A中稀释10倍，并施加于柱上。以20CV中0-40％B的梯度洗脱蛋白质。缓冲液A为20mM NaAc pH5.1。缓冲液B为20mM NaAc+1M NaCl pH5.1。流速为10ml/min。人工收集级分。
所获得的产物在HPSEC上显示单一峰，并且在SDS PAGE和IEF中显示为单一条带。因此可以得出结论，脯氨酰特异性内切蛋白酶可以使用Q-sepharose FF而纯化至均一状态。估计的纯度超过90％，并且对Z-gly-Pro-pNA的特异性活性至少为0.094U/mg。
本发明的多肽可以是分离形式。应理解的是，所述多肽可以与不干扰多肽预定目的的载体或稀释剂混合，但仍被认为是分离的。
本发明的多肽也可以以更加基本上纯化的形式存在，在该情况下，它通常在制剂中包含该多肽，其中，该制剂中的超过70％的蛋白质，例如超过80％、90％、95％、98％或99％的蛋白质是本发明的多肽。
本发明的多肽也可以以脱离它们的天然细胞环境的形式提供。因此，它们可以如上所述被基本分离或纯化，或者位于它们天然不出现的细胞中，例如其它真菌物种、动物、植物或细菌的细胞。
有利地，在本发明方法中使用分离或纯化的脯氨酰特异性内切蛋白酶。
根据本发明，分离或纯化的脯氨酸特异性内切蛋白酶优选在每克蛋白质材料中具有至少10单位的脯氨酸特异性内切蛋白酶活性。这些单位应该按照“方法部分”所述用合成肽Z-Gly-Pro-pNA在37℃和pH5进行测量。
脯氨酸特异性内切蛋白酶广泛发现于动物和植物中，但它们在微生物中的存在似乎是有限的。至今，已经在曲霉属(EP 0 522428)、产黄菌属(EP 0 967 285)和气单胞菌属(J.Biochem.113，790-796)、黄单胞菌属和类细菌物种中鉴定了脯氨酸特异性内切蛋白酶。与来自绝大多数这些生物的脯氨酸特异性酶(在pH8附近具有活性)相反，本发明的酶在酸性pH具有最佳活性，一些甚至在pH5附近或以下具有最佳pH。本发明的脯氨酸特异性内切蛋白酶可以从上述任一微生物物种中分离，特别是从曲霉属物种。优选地，酸性脯氨酸特异性内切蛋白酶Endo-Pro从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株分离。更优选地，脯氨酸特异性内切蛋白酶从经过改造而过度表达编码脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因的黑曲霉宿主中分离，尽管其它宿主例如大肠杆菌也是合适的表达载体。例如，在大肠杆菌(除了其它的)中克隆和过表达来自产黄菌属的脯氨酸特异内切蛋白酶已经使得某些脯氨酸特异性内切蛋白酶可以以纯的形式获得。这种过度生产型构建体的例子在World Journal of Microbiology & Biotechnology，Vol 11，pp 209-212中提供。黑曲霉宿主优选用于产生非重组型自身构建体，该构建体使用黑曲霉启动子来驱动编码黑曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因表达。
在第一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其氨基酸序列与氨基酸SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7(即所述多肽)具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约65％、优选至少约70％、更优选至少约80％、甚至更优选至少约90％、更加优选至少约95％并且最优选至少约97％的氨基酸序列同一性总程度，并且该多肽具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性。
为了本发明的目的，两个或多个氨基酸序列之间的同一性程度通过BLAST P蛋白质数据库搜索程序(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Research 253389-3402)来确定，并且使用矩阵Blosum 62，预期阈值为10。
本发明的多肽可以包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQIDNO7中所列的氨基酸序列，或者基本同源的序列，或者上述任一序列的具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的片段。通常，SEQ IDNO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所示的天然出现的氨基酸序列是优选的。
本发明的多肽也可以包含多肽SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的天然出现的变体或物种同源物。
变体是天然出现于例如真菌、细菌、酵母或植物细胞中的多肽，变体具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性以及与SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7基本类似的序列。术语“变体”指与SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的脯氨酸特异性内切蛋白酶具有相同的基本特征或基本生物学功能的多肽，并且包括等位基因变体。优选地，变体多肽与SEQ ID NO4、SEQID NO5或SEQ ID NO7的多肽至少具有相同的脯氨酸特异性内切蛋白酶活性水平。变体包括与SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEO ID NO7多肽来自于同一菌株或者同一属或物种的不同菌株的等位基因变体。
类似地，本发明蛋白质的物种同源物是具有相似序列的等价蛋白，其是脯氨酸特异性内切蛋白酶，并且天然出现于另一曲霉属物种中。
使用此处描述的用于分离SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7多肽的程序，并且对合适的细胞源(如细菌、酵母、真菌或植物细胞)进行这些程序可以分离变体和物种同源物。也可以使用本发明的探针筛选从酵母、细菌、真菌或植物细胞制备的文库，以获得表达多肽SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ IDNO7的变体或物种同源物的克隆。这些克隆可以通过传统的技术操作而产生本发明的多肽，接着用本身已知的重组或合成技术进行生产。
也可以对多肽SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7和变体及物种同源物的序列进行修饰以提供本发明的多肽。也可以进行例如1、2或3到10、20或30个取代的氨基酸取代。也可以进行同样数目的缺失或插入。这些改变可以在对多肽功能至关重要的区域外进行，因为这样修饰的多肽将保留其脯氨酸特异性内切蛋白酶活性。
本发明多肽包括上述全长多肽和其变体的片段，包括SEQ IDNO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7所示序列的片段。此类片段通常会保留脯氨酸特异性内切蛋白酶活性。片段长度可以是至少5O、100或200个氨基酸，或者可以是比SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所示全长氨基酸序列短所述数目的氨基酸。
如果需要，本发明的多肽可以通过合成方法生产，尽管通常它们将按如下所述的重组方法生产。
可以对合成多肽进行修饰，例如添加组氨酸残基或T7标签以利于它们的鉴定或纯化，或者添加信号序列以促进它们分泌至细胞外。
因此，变体序列可以包含那些来自于曲霉属中除分离出多肽SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的菌株之外的其它菌株的序列。通过寻找脯氨酸特异性内切蛋白酶活性并如上所述进行克隆和测序而从其它曲霉属菌株中鉴定变体。变体可以在蛋白质序列中缺失、修饰或添加单个氨基酸或者氨基酸组，只要该肽保留SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的脯氨酸特异性内切蛋白酶的基本生物学功能。
例如，可以进行1、2或3至10、20或30个取代的氨基酸取代。经修饰的多肽通常将保留脯氨酸特异性内切蛋白酶活性。可以进行保守取代；这样的取代在本领域中是公知的。优选地，取代不影响多肽的折叠或活性。
更短的多肽序列在本发明范围内。例如，长度至少为50个氨基酸或至多为60、70、80、100、150或200个氨基酸的肽也被认为在本发明的范围中，只要它显示SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的脯氨酸特异性内切蛋白酶的基本生物学功能。具体地，但不是排他性地，本发明的这一方面包括所述蛋白质是全长蛋白质序列的片段的情况。
在第二个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性，并且被在低严谨性条件下、更优选中等严谨性条件下和最优选高严谨性条件下与下列序列杂交或能够杂交的多核苷酸编码(I)核酸序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6，或者至少包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的C-末端部分但不包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ IDNO6全部序列或具有与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3或SEQ ID NO6不同碱基的核酸片段；或者(ii)与SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6互补的核酸片段。
术语“能够杂交”意思是本发明的目标多肽能与用作探针的核酸(例如，SEQ.ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ IDNO6所示的序列，或其片段，或SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的互补序列)以显著高于背景的水平进行杂交。本发明也包括编码本发明脯氨酸特异性内切蛋白酶的多核苷酸，以及与其互补的核苷酸序列。所述核苷酸序列可以是RNA或DNA，包括基因组DNA、合成DNA或cDNA。优选地，该核苷酸序列为DNA，最优选为基因组DNA序列。典型地，本发明的多核苷酸包含连续的核苷酸序列，所述连续的核苷酸序列能够在选择性条件下与SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的编码序列或该编码序列的互补序列杂交。此类核苷酸可以按照本领域熟知的方法合成。
本发明的多核苷酸能够以显著高于背景的水平与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEO ID NO6的编码序列或该编码序列的互补序列杂交。例如由于其它cDNA存在于cDNA文库中，因此可能出现背景杂交。由本发明多肽与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的编码序列或该编码序列的互补序列之间的相互作用产生的信号强度一般是其它多核苷酸和SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQID NO6的编码序列之间相互作用的至少10倍、优选至少20倍、更优选至少50倍和甚至更优选至少100倍。相互作用的强度例如可以通过放射性标记探针(如用32p)来测量。使用低严谨性条件(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，大约40℃)、中等严谨性条件(例如，0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，大约50℃)或高严谨性条件(例如，0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，大约60℃)一般可以获得选择性杂交。
修饰本发明的多核苷酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链。它们也可以是在它们中包含合成或修饰的核苷酸的多核苷酸(包括肽核酸)。对多核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域中已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架以及在分子的3′和/或5′末端添加丫啶或聚赖氨酸链。为了本发明的目的，应理解的是此处所述的多核苷酸可以用任何本领域中的方法进行修饰。
应理解的是，技术人员可以使用常规技术进行核苷酸取代，而不影响由本发明多核苷酸编码的多肽序列，从而反映本发明多肽想要在其中表达的任何特定宿主生物的密码子利用情况。
可以对SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQID NO6的编码序列进行核苷酸取代，例如1、2、或3至10、25、50或100个取代。SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的核苷酸可以替换性地或附加性地修饰如下一个或多个插入和/或缺失和/或在一个或两个末端延伸。经修饰的多核苷酸通常编码具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的多肽。也可以进行简并性取代，和/或进行如下取代当经修饰的序列被翻译后(例如参照对下面多肽的讨论)，该取代产生保守性氨基酸取代。
同源物能与DNA编码序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的互补序列选择性杂交的核苷酸序列也在本发明范围中，并且在SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的至少60个连续核苷酸区域，优选至少100个，更优选至少200个，或最优选在全长区域中通常与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6编码序列具有至少50％或60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。类似地，编码活性脯氨酸特异性内切蛋白酶并且能与DNA编码序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的互补序列的片段进行选择性杂交的核苷酸也在本发明范围中。本发明也包括核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的C-末端片段，其在60个核苷酸，优选100个核苷酸上具有至少80％或90％的同一性，更优选在200个核苷酸上具有至少90％的同一性。
上述同一性程度和最小尺寸的任何组合可以用来定义本发明的多核苷酸，其中更严格的组合(即在更长的长度上具有更高的同一性)是优选的。因此，例如在60个核苷酸，优选100个核苷酸上具有至少80％或90％同一性的多核苷酸形成了本发明的一个方面，正如在200个核苷酸上具有至少90％同一性的多核苷酸一样。
UWGCG Package提供了用于计算同一性的BESTFIT程序(例如以其默认设置使用)。
PILEUP和BLASTN算法也可以用于计算序列同一性或比对序列(例如用它们的默认设置来鉴定等价或相应序列)。
用于进行BLAST分析的软件可以通过National Center forBiotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)而公共地获得。该算法包括通过在查询序列中鉴定长度为W的短字串而首先鉴定高分值序列对(HSPs)，其中所述长度为W的短字串当与数据库中序列的相同长度的字串比对时，满足一些正的阈值T或与其匹配。T是指相邻字串阈值。这些起始相邻字串结果作为种子开始搜索，以寻找包含它们的HSPs。这些字串结果沿着每一序列在两个方向延伸，只要累计比对值是增加的。当下列情况出现时，所述字串结果在每一方向的延伸停止累积比对值从其所获得的最大值降低了数量X；由于一个或多个负值残基比对的累积，累积分值变成零或零以下；或者到达了任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下列作为默认值字串长度(W)为11、BLOSUM62分值矩阵比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝4，以及双链比对。
BLAST算法对两条序列之间的相似性进行统计分析。由BLAST算法所提供的一种相似性量度为最小概率总和(the smallest sumprobability)(P(N))，它提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间随机匹配的概率指标。例如，一条序列被认为与另一条序列是相似的，如果第一条序列和第二条序列对比的最小概率总和小于大约1、优选小于大约0.1、更优选小于大约0.01、最优选小于大约0.001。
引物和探针本发明的多核苷酸包括引物，并且可以用作引物，例如作为聚合酶链式反应(PCR)的引物，作为交替扩增反应(alternativeamplification reaction)的引物，或者作为探针，例如通过传统方法用放射性或非放射性标记标记的显示标记，或者该多核苷酸可以克隆入载体中。此类引物、探针和其它片段的长度至少为15个核苷酸，例如至少20、25、30或40个核苷酸。它们的长度一般至多为40、50、60、70、100、150、200或300个核苷酸，或者进一步至多为仅比编码序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3或SEQ ID NO6短几个核苷酸(例如5或10个核苷酸)。
通常，引物将通过合成方法生产，包括所需核酸序列一次一个核苷酸的逐步制备法。使用自动化方案完成这些的技术在本领域中是很容易获得的。更长的多核苷酸一般通过重组方法生产，例如用PCR克隆技术。这将包括制备引物对(一般为大约15-30个核苷酸)以扩增所要克隆的脯氨酸特异性内切蛋白酶的所需区域；使引物与获自酵母、细菌、植物、原核或真菌细胞(优选曲霉属菌株)的mRNA、cDNA或基因组DNA接触；在适合扩增所需区域的条件下进行聚合酶链式反应；分离所扩增的片段(例如在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)和回收所扩增的DNA。引物可以设计成含有合适的限制性酶识别位点，从而所扩增DNA可以克隆入合适的克隆载体。
这种技术可以用来获得此处所述的编码脯氨酸特异性内切蛋白酶的多核苷酸的全长或部分。内含子、启动子和尾随区域也在本发明范围中，并且可以用相似方法从真菌、酵母、细菌、植物或原核细胞的基因组DNA起始而获得(例如，通过重组方法、PCR或克隆技术)。
多核苷酸或引物可以带有显示标记(revealing label).合适的标记包括放射性同位素例如32P或35S、酶标记或其它蛋白标记例如生物素。此类标记可以添加到本发明的多核苷酸或引物上，并且可以用本领域技术人员已知的技术检测。
标记或未标记的多核苷酸或引物(或其片段)可以用于基于核酸的测试法中，以在真菌样品中检测或测序脯氨酸特异性内切蛋白酶或其变体。此类测试法通常包括使被怀疑含有目的DNA的真菌样品和含有本发明多核苷酸或引物的探针在杂交条件下接触，以及检测样品中探针和核酸所形成的任何双链。可以使用例如PCR之类的技术来完成检测，或者将探针固定在固体支持体上，除去样品中未与探针杂交的任何核酸，接着检测与探针杂交的任何核酸，从而完成检测。或者，样品核酸可以固定于固体支持体上，使探针杂交，然后检测除去任何未结合探针之后结合到这种支持体上的探针的量。
本发明的探针可以以测试试剂盒的形式包装在容器中。在这种试剂盒中，探针可以结合在固体支持体上，当该试剂盒所用的检测形式需要这种结合时。
该试剂盒也可以含有用于处理所要检测的样品和使探针与样品中核酸杂交的合适试剂、对照试剂、说明书等。本发明探针和多核苷酸也可以用于微检测法(microassay)中。
优选地，本发明多核苷酸和多肽获自同一生物，例如真菌，特别是曲霉属真菌。
本发明也包括序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的变体，其编码具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的多肽。变体可以通过添加、取代和/或缺失来形成。编码序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的此类变体因此可以编码能在脯氨酸的羧基末端侧消化多肽链的多肽。
生产多核苷酸与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6不具有100％同一性但落在本发明范围内的多核苷酸可以用很多方法获得。因此，此处所述的脯氨酸特异性内切蛋白酶序列的变体可以通过例如探测基因组DNA文库而获得，其中所述文库从大量生物中制备，例如那些已讨论作为本发明多肽来源的生物。此外，也可以获得脯氨酸特异性内切蛋白酶的其它真菌、植物或原核同源物，并且此类同源物或其片段通常能与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6杂交。此类序列可以通过检测来自其它物种的cDNA文库或基因组DNA文库，并且通过在低、中等至高严谨性条件(如前面所述)下用包含SEQ ID.1全长或部分的探针检测这样的文库而获得。可以用包含SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的全长或部分的核酸探针探测来自其它物种的cDNA或基因组文库，例如那些已描述作为本发明多肽来源的生物。
也可以使用简并PCR来获得物种同源物，其中使用了针对在变体和同源物中编码保守氨基酸序列的目标序列的引物。该引物可以含有一个或多个简并位置，并且在严谨性条件下使用，所述严谨性条件低于那些用针对已知序列的单序列引物克隆序列的严谨性条件。
或者，可以通过对脯氨酸特异性内切蛋白酶序列或其变体进行定点诱变来获得此类多核苷酸。当例如需要对序列进行沉默密码子改变，以根据所述多核苷酸序列需要在其中表达的特定宿主细胞来优化密码子偏好时，这可能是有用的。也可以进行其它序列改变，以引入限制性酶识别位点，或改变该多核苷酸所编码多肽的特性或功能。
本发明包括双链多核苷酸，其含有本发明多核苷酸以及其互补序列。
本发明也提供编码上述本发明多肽的多核苷酸。由于此类多核苷酸可以用作重组生产本发明多肽的序列，因此不需要它们能够与序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ IDNO6杂交，尽管能够杂交通常更好。或者，如果需要可以按如上所述对此类多核苷酸进行标记、使用和制造。
重组多核苷酸本发明也提供了包含本发明多核苷酸的载体，包括克隆和表达载体，在另一方面提供了在合适的宿主细胞中生长、转化或转染此类载体的方法，例如在能够表达本发明多肽或由本发明序列编码的多肽的条件下。也提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞，其中多核苷酸相对于该宿主细胞基因组是异源的。通常相对于宿主细胞而言的术语“异源的”是指该多核苷酸在该宿主细胞基因组中不是天然出现的，或者该多肽不是由该细胞天然生产的。优选地，该宿主细胞是酵母细胞，例如克鲁维氏酵母属或糖酵母属的酵母细胞，或者丝状真菌细胞，例如曲霉属的。
本发明多核苷酸可以整合入复制型重组载体中，例如克隆或表达载体。该载体可以用于在兼容的宿主细胞中表达核酸。因此，在进一步的实施方案中，本发明提供了通过下列方法制备本发明多核苷酸的方法将本发明多核苷酸引入复制型载体中，将该载体引入兼容的宿主细胞中，以及在使载体复制的条件下生长该宿主细胞。可以从该宿主细胞中回收该载体。合适的宿主细胞与表达载体描述如下。
载体插入了本发明表达盒的载体可以是任何能方便地进行重组DNA程序的载体，并且载体的选择经常取决于它所要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制型载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒。或者，载体可以是这样的，当其导入宿主细胞后，被整合入宿主细胞基因组中，并与它已经整合入的染色体一起复制。
优选地，当本发明多核苷酸位于载体中时，其有效地连接于能够使宿主表达该编码序列的调控序列上，即该载体是表达载体。术语“有效地连接”是指一种并列方式，其中所述组分之间的相互关系允许它们以预定方式发挥作用。与编码序列有效地连接的调控序列例如启动子、增强子或其它表达调节信号是这样定位的，从而使得在与所述控制序列兼容的条件下能表达该编码序列。
例如在质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体的情况下，所述载体可以具有复制起点，可选地具有用于表达该多核苷酸的启动子以及可选择地该启动子的增强子和/或调节子。也可以存在终止子序列，例如聚腺苷酸化序列。该载体也可以含有一个或多个选择性标记基因，例如在细菌质粒的情况下为氨苄青霉素抗性基因，或者在哺乳动物载体的情况下为新霉素抗性基因。载体也可以在体外使用，例如用于生产RNA，或者也可以用于转化或转染宿主细胞。
编码多肽的DNA序列优选作为表达构建体的一部分导入合适的宿主中，在所述表达构建体中，该DNA序列有效地连接于能够指导DNA序列在宿主细胞中表达的表达信号上。对于用表达构建体转化合适的宿主，存在本领域技术人员熟知的转化方法。该表达构建体可以作为带有选择性标记的载体的一部分转化该宿主，或者该表达载体作为分离的分子与带有选择性标记的分子共转化。该载体可以含有一个或多个选择性标记基因。
优选的选择性标记包括但不限于那些能够弥补宿主细胞的缺陷或提供对药物抗性的标记。它们包括例如能够用于转化大多数丝状真菌和酵母的通用标记基因，例如乙酰胺酶基因或cDNA(amdS、niaD、facA基因或来自构巢曲霉、米曲霉或黑曲霉的cDNAs)，或者提供对抗生素抗性的基因，例如G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、phleomycin或苯菌灵(benA)抗性。或者也可以使用特异性选择标记，例如需要相应突变宿主菌株的营养缺陷型标记，例如URA3(来自啤酒糖酵母或来自其它酵母的类似基因)、pyrG或pyrA(来自构巢曲霉或黑曲霉)、argB(来自构巢曲霉或黑曲霉)或trpC。在优选的实施方案中，在导入表达构建体后将选择标记从转化的宿主细胞中删除，以获得能够生产不具有选择标记基因的多肽的转化宿主细胞。
其它标记包括ATP合成酶亚基9(oliC)、乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶(pvrA)、细菌G418抗性基因(在酵母中有用，但在丝状真菌中无用)、氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌)、新霉素抗性基因(芽孢杆菌)和大肠杆菌uidA基因——编码葡糖苷酸酶(GUS)。也可以在体外使用载体，例如用于生产RNA，或用于转染或转化宿主细胞。
对于大多数丝状真菌和酵母，优选将表达构建体整合入宿主细胞的基因组中以获得稳定的转化体。然而，对于某些酵母，也可以使用合适的染色体外载体系统，其中可以整合表达构建体以获得稳定和高水平的表达。它们的例子包括分别来自糖酵母属和克鲁维氏酵母属的2um、CEN和pKD1质粒的载体，或者含有AMA序列(例如来自曲霉属的AMA1)的载体。当表达构建体整合入宿主细胞基因组时，该构建体或者随机整合入基因组的座位中，或者用同源重组整合入预定的目标座位，在后一种情况下，目标座位优选含有高度表达的基因。高度表达的基因是这样的基因，其mRNA可以占总细胞mRNA的至少0.01％(w/w)，例如在诱导条件下，或者是这样的基因，其基因产物可以占总细胞蛋白质的至少0.2％(w/w)，或者在分泌型基因产物的情况下，其可以以至少0.05g/l的水平分泌。
用于给定宿主细胞的表达构建体通常含有下列元件，它们相对于编码第一方面的多肽的序列的编码链从5′-末端到3′-末端互相有效地顺次连接(1)能够指导编码多肽的DNA序列在给定宿主细胞中转录的启动子序列；(2)优选地，5′-非翻译区(前导序列)；(3)可选择地，能够指导多肽从给定宿主细胞分泌至培养基的信号序列；(4)编码成熟形式以及优选活性形式多肽的DNA序列；以及优选(5)在编码多肽的DNA下游能够终止转录的转录终止区域(终止子)。
在编码多肽的DNA序列的下游，表达构建体优选含有3′非翻译区，该非翻译区含有一个或多个称为终止子的转录终止位点。终止子的起始点是较不重要的。例如该终止子可以是编码多肽的DNA序列天然具有的。但是，优选在酵母宿主细胞中使用酵母终止子，在丝状真菌宿主细胞中使用丝状真菌终止子。更优选地，该终止子相对于编码多肽的DNA序列在其中表达的宿主细胞是内源的。
可以通过选择异源调控区域(例如启动子、信号序列和中止子区域)来增强编码本发明多肽的多核苷酸的表达，其中所述调控区域用于使目的蛋白在所选择的表达宿主中增强表达和分泌水平(如果需要)，和/或提供对本发明多肽表达的可诱导的控制。
除了本发明多肽的编码基因天然所具有的启动子外，也可以使用其它启动子来指导本发明多肽的表达。可以根据在所需表达宿主中指导本发明多肽表达的效率来选择启动子。
可以选择与表达载体设计时所针对的宿主细胞兼容的启动子/增强子和其它表达调节信号。例如可以使用原核启动子，特别是适合用于大肠杆菌菌株的那些。当在哺乳动物细胞中表达本发明多肽时，也可以使用哺乳动物启动子。也可以使用组织特异性启动子，例如肝细胞特异性启动子。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠类白血病毒长末端重复序列(MMLV LTR)、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人类巨细胞病毒(CMV)IE启动子、单纯疱疹病毒启动子或腺病毒启动子。
合适的酵母启动子包括啤酒糖酵母GAL4和ADH启动子，以及S.pombe nmt1和adh启动子。哺乳动物启动子包括金属硫蛋白启动子，其能应激于重金属如镉而被诱导。也可以使用病毒启动子，例如SV40大T抗原启动子或腺病毒启动子。所有这些启动子在本领域中都是很容易就能得到的。
也可以使用哺乳动物启动子，例如β-肌动蛋白启动子。组织特异性启动子，特别是内皮或神经元细胞特异性启动子(例如DDAHI和DDAHII启动子)是特别优选的。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠类白血病毒长末端重复序列(MMLV LTR)、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人类巨细胞病毒(CMV)IE启动子、腺病毒、HSV启动子(例如HSV IE启动子)或HPV启动子，特别是HPV上游调控区(URR)。病毒启动子在本领域中是很容易获得的。
可以使用大量能在本发明宿主中指导转录的启动子。优选地，启动子序列源自前面所定义的高度表达的基因。启动子优选所源自的和/或包含于优选的预定目标座位以整合表达构建体的优选高度表达的基因例子包括但不限于编码糖酵解酶例如磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脱氢酶(ADH)的基因，以及编码淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、cellobiohydrolases、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白的基因。合适的高度表达的基因的具体例子包括例如来自克鲁维氏酵母属物种的LAC4基因、分别来自汉逊氏酵母和毕赤氏酵母的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)、来自黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)基因、米曲霉TAKA-淀粉酶基因、构巢曲霉gpdA基因和T.reesei的cellobiohydrolase基因。
优选用于真菌表达宿主中的强组成型和/或诱导型启动子例子是那些从下列真菌基因获得的木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶亚基9(oliC)、磷酸丙糖异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、淀粉酶(amy)、淀粉葡萄苷酶(来自glaA基因的AG)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子。
可以使用的强酵母启动子例子包括那些可以从醇脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油激酶和磷酸丙酮异构酶的基因获得的启动子。
可以使用的强细菌启动子包括淀粉酶和SPo2启动子以及来自胞外蛋白酶基因的启动子。
可以使用的适合植物细胞的启动子包括napaline合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)、甘露碱合酶(mas)、核酮糖小亚基(rubiscossu)、组蛋白、水稻肌动蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花叶病毒(CMV)35S和19S以及circovirus启动子。该载体也可以进一步包含位于所述多核苷酸侧翼的序列，从而产生含有同源于真核基因组序列优选哺乳动物基因组序列或病毒基因组序列的RNA。这将允许通过同源重组将本发明多核苷酸导入真核细胞或病毒的基因组中。特别的，包含表达盒(侧翼为病毒序列)的质粒载体可以用于制备适合将本发明多核苷酸送递入哺乳动物细胞的病毒载体。其它合适的病毒载体的例子包括单纯疱疹病毒载体和逆转录病毒载体，包括慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒和HPV病毒(例如HPV-16或HPV-18)。使用这些病毒的基因转移技术是本领域已知的。例如逆转录病毒可以用于将产生反义RNA的多核苷酸稳定整合入宿主基因组中。相反，复制缺陷型腺病毒载体保留在染色体外，因此允许瞬时表达。
该载体可以含有反义方向的本发明多核苷酸，以生产反义RNA。如果需要，这可以用于降低多肽表达水平。
宿主细胞和表达在进一步的方面中，本发明提供了制备本发明多肽的方法，包括在适合于由载体表达多肽编码序列的条件下培养被如上所述表达载体转化或转染的宿主细胞，以及回收所表达的多肽。本发明多核苷酸可以整合入复制型重组载体中，例如表达载体。该载体可以用于在兼容的宿主细胞中复制核酸。因此，在进一步的实施方案中，本发明提供了如下制备本发明多核苷酸的方法将本发明的多核苷酸导入复制型载体，将该载体导入兼容的宿主细胞，以及在使载体复制的条件下生长该宿主细胞。也可以从该宿主细胞中回收该载体。合适的宿主细胞包括细菌例如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系和其它真核细胞系，例如昆虫细胞如Sf9细胞和(例如丝状)真菌细胞。
优选地，多肽以分泌蛋白的形式生产，在这种情况下，在表达构建体中编码成熟形式多肽的DNA序列有效地连接于编码信号序列的DNA序列上。当编码分泌蛋白的基因在野生型菌株中具有信号序列时，优选所使用的信号序列是编码多肽的DNA序列天然所具有的(与其同源)。或者，该信号序列相对于编码多肽的DNA序列是外来的(异源的)，在这种情况下，该信号序列优选内源于该DNA序列所要在其中表达的宿主细胞。适合于酵母细胞的合适信号序列的例子为来自酵母MFalpha基因的信号序列。类似地，适合于丝状真菌宿主细胞的合适信号序列是例如来自丝状真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(例如黑曲霉glaA基因)的信号序列。该信号序列可以与淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶)本身组合使用，以及与其它启动子组合使用。在本发明中也可以使用杂合信号序列。
优选的异源分泌前导序列是那些源自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24个氨基酸的形式，例如来自曲霉属)、MFa1pha基因(酵母，例如糖酵母和克鲁维氏酵母)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)的前导序列。
载体可以转化或转染如上所述的合适宿主细胞，以提供本发明多肽的表达。
该方法可以包括在适合表达多肽的条件下培养被如上所述表达载体转化的宿主细胞，以及可选择地回收所表达的多肽。
本发明的另一方面因此提供了含有本发明多核苷酸或载体或者被其转化或转染的宿主细胞。优选地，该多核苷酸携带于允许该多核苷酸复制和表达的载体中。选择与所述载体兼容的细胞，例如可以是原核(如细菌)或真核真菌、酵母或植物细胞。
本发明包括通过重组表达编码多肽的DNA序列来生产本发明多肽的方法。为了该目的，本发明DNA序列可以用于基因扩增和/或表达信号(如启动子、分泌信号序列)交换，以允许在合适的同源或异源宿主细胞中经济地生产多肽。在此处，同源宿主细胞被定义为与所述DNA序列所源自的物种属于同一物种或者为同一物种的变体的宿主细胞。
合适的宿主细胞优选为原核微生物例如细菌，或更优选为真核生物，例如真菌，如酵母或丝状真菌，或者植物细胞。通常，酵母细胞比丝状真菌细胞更优选，因为它们更易于操作。但是，一些蛋白或者不容易从酵母中分泌，或者在某些情况下不能被正确加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况下，应该选择丝状真菌宿主生物。
来自芽孢杆菌属的细菌十分适合作为异源宿主，因为它们能够将蛋白质分泌到培养基中。其它适合作为宿主的细菌是那些来自链霉菌属和假单胞菌属的。用于表达编码多肽的DNA序列的优选酵母宿主细胞是糖酵母属、克鲁维氏酵母属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、Yarrowia或裂殖糖酵母属之一的。更优选地，酵母宿主细胞选自物种啤酒糖酵母、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)(也称为Kluyveromyces marxianus var.lactis)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastors)、Yarrowia lipolytica和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
但是，用于表达编码多肽的DNA序列的最优选的宿主是丝状真菌宿主细胞。优选的丝状真菌细胞选自曲霉属、木霉属、镰孢属、Disporotrichum、青霉属、支顶孢属、链孢霉属、热子囊菌属、Myceliophtora、孢子丝菌属、草根霉属和踝节菌属。更优选地，丝状真菌宿主细胞是物种Aspergillus oyzae、酱油曲霉(Aspergillus sojae)或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或者是来自黑曲霉组的物种(由Raper和Fennel定义，The GenusAspergillus，The Williams & Wilkins Company，Baltimore，pp293-344，1965)。这些包括但不限于黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、构巢曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉和无花果曲霉(Aspergillus ficuum)以及物种Trichoderma reesei、和谷镰孢(Fusarium graminearum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、Acremonium alabamense、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、Myceliophtora thermophilum、Sporotrichum cellulophilum、Disporotrichum dimorphosporum和Thielavia terrestris。
本发明范围内的优选表达宿主的例子是真菌，例如曲霉属物种(特别是描述于EP-A-184,438和EP-A-284,603中的那些)和木霉属物种；细菌，例如芽孢杆菌属物种(特别是描述于EP-A-134,048和EP-A-253,455中的那些)，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，假单胞菌属物种；和酵母，例如克鲁维氏酵母属物种(特别是描述于EP-A-096,430中的那些，例如乳克鲁维氏酵母，以及描述于EP-A-301,670中的)和糖酵母属物种，例如啤酒糖酵母。
本发明的宿主细胞包括植物细胞，因此本发明延伸至转基因生物，例如含有一个或多个本发明细胞的植物或其部分。该细胞可以异源地表达本发明多肽，或异源地含有一个或多个本发明的多核苷酸。转基因(或基因修饰的)植物因此可以在其基因组中插入(通常为稳定的)编码本发明多肽的序列。植物细胞的转化可以使用已知的技术完成，例如使用来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti或Ri质粒。该质粒(或载体)因此可以含有感染植物所必需的序列，并且也可以使用Ti和/或Ri质粒的衍生物。
该宿主细胞可以过表达该多肽，并且操纵过表达的技术是已知的，并可以用在本发明中。宿主因此可以具有两个或多个拷贝的多核苷酸。
或者，也可以直接感染植物的部分，例如叶、根或茎。在该技术中，可以在待感染的植物上制造伤口，例如用刀片切割植物、用针刺植物或用研磨剂摩擦植物。然后该伤口用农杆菌接种。该植物或植物部分接着可以生长在合适的培养基中，并发育成成熟植株。可以使用已知的技术使转化细胞再生成基因修饰的植物，例如通过用抗生素筛选转化的根，并将该根亚培养于含有合适营养物、植物激素等的培养基中。
培养宿主细胞以及重组生产本发明也包括已经修饰以表达脯氨酸特异性内切蛋白酶或其变体的细胞。此类细胞包括瞬时或优选稳定修饰的高等真核细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，低等真核细胞，例如酵母和丝状真菌细胞或原核细胞例如细菌细胞。
也可以使本发明多肽瞬时表达于细胞系中或膜上，例如在杆状病毒表达系统中。经过修饰以表达本发明蛋白质的此类系统也在本发明范围中。
根据本发明，可以在传统营养发酵培养基中培养已经转化了一种或多种本发明多核苷酸的微生物表达宿主，从而实现本发明多肽的生产。
可以使用本领域已知的程序来培养根据本发明的重组宿主细胞。对于每一启动子和宿主细胞组合，能够表达编码多肽的DNA序列的培养条件是可以获得的。在达到所需的细胞密度或多肽效价后，停止培养，并用已知程序回收多肽。
发酵培养基可以包含已知的培养基，所述已知的培养基含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等)、氮源(例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等)、有机氮源(例如酵母提取物、麦芽膏、蛋白胨等)和无机营养源(例如磷酸、镁、钾、锌、铁等)。可选择地，可以包括诱导物(取决于所用的表达构建体)，或在随后加入。
合适培养基的选择可以基于表达宿主的选择和/或基于表达构建体的调控需要。合适的培养基是本领域技术人员熟知的。如果需要，该培养基可以含有附加组分，所述附加组分更有利于转化的表达宿主(相对于其它潜在的污染微生物)。
发酵可以进行0.5-30天。发酵可以是分批式、连续式或分批补料式，在0-45℃的合适温度以及例如2-10的pH值下进行。优选的发酵条件包括20-37℃的温度和/或3-9的pH值。通常基于所选表达宿主和待表达蛋白质来选择合适的条件。
如果需要，在发酵后，可以用离心或过滤方法从发酵培养基中除去细胞。在发酵停止后或细胞除去后，可以回收本发明多肽，如果需要，用传统方法纯化和分离。本发明脯氨酸特异性内切蛋白酶可以从真菌菌丝体中纯化，或者从该脯氨酸特异性内切蛋白酶被培养的真菌细胞所释放到的培养基中回收。
在优选的实施方式中，多肽从真菌、优选从曲霉属、最优选从黑曲霉中获得。
修饰本发明多肽可以进行化学修饰，例如翻译后修饰。例如，它们可以糖基化(一次或多次)或者含有修饰的氨基酸残基。它们也可以修饰如下添加组氨酸残基以帮助它们的纯化或者添加信号序列以促进从细胞分泌。该多肽也可以含有氨基末端或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基、至多约20-25个残基的小的连接肽、 或促进纯化的小的延伸，例如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合结构域。
本发明多肽可以用显示标记来标记。该显示标记可以是任何允许检测多肽的合适标记。合适的标记包括放射性同位素，例如125I、35S，酶、抗体、多核苷酸和连接体如生物素。
可以对多肽进行修饰以包含非天然氨基酸或增加多肽稳定性。当通过合成方法生产蛋白质或肽时，此类氨基酸可以在生产过程中引入。也可以在合成或重组生产以后修饰蛋白质或肽。
也可以用D-氨基酸来生产本发明多肽。在这种情况下，氨基酸将以C至N的方向连接成反向序列。这样生产此类蛋白质或肽在本领域中是常规的。
许多侧链修饰是本领域中已知的，并且可以在本发明蛋白质或肽的侧链上进行。此类修饰包括，例如与醛反应，接着用NaBH4还原，从而通过还原性烷基化而对氨基酸进行修饰，或用甲基乙酰亚氨酸(methylacetimidate)进行脒化(amidination)，或用乙酸酐进行酰化。
本发明提供的序列也可以用作起始材料以构建“第二代”酶。“第二代”脯氨酸特异性蛋白酶是用诱变技术(例如定点诱变)经过改变的脯氨酸特异性蛋白酶，其具有不同于野生型脯氨酸特异性蛋白酶或重组型脯氨酸特异性蛋白酶(如本发明生产的那些)的特性。例如可以对它们的温度或pH最佳值、特异性活性、底物亲和性或热稳定性进行改变，以更好地适用于特定方法。
可以根据本领域已知的程序(如定点诱变或丙氨酸扫描诱变)鉴定对脯氨酸特异性内切蛋白酶活性至关重要并因此优选进行取代的氨基酸。在丙氨酸扫描诱变技术中，在分子的每个残基处引入突变，并对所得分子的生物活性(例如脯氨酸特异性内切蛋白酶活性)进行检测，以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。也可以通过分析晶体结构来确定酶-底物相互作用位点，其中所述晶体结构是用核磁共振、结晶学或光-亲和标记之类的技术测定的。
使用酵母和丝状真菌宿主细胞预期能提供这样的翻译后修饰(例如蛋白水解加工、肉豆蔻基化(myristilation)、糖基化、截短以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，它们对于赋予本发明的重组表达产物最优的生物活性可能是必需的。
制剂本发明多肽可以是分离形式。应理解的是该多肽也可以与不干扰多肽预定目的的载体或稀释剂混合，而仍被认为是分离的。
本发明多肽也可以是基本纯化的形式，在这种情况下，通常在制剂中含有多肽，并且在该制剂中超过70％，例如超过80％、90％、95％、98％或99％的蛋白质是本发明多肽。
本发明多肽也可以以在它们天然细胞环境外的形式提供。因此，它们可以是如上所述基本分离或纯化的，或者位于它们天然情况下不出现的细胞中，例如其它真菌物种、动物、植物或细菌的细胞中。而且，本发明多肽也可以以固定化的形式使用，从而可以处理大量含蛋白质的液体。
选择合适支持体材料的方法和合适的固定化方法已经大量描述于文献中，例如″Immobilization of Enzymes and Cells″(ed.Gordon F.Bickerstaff；ISBN 0-89603-386-4)。
本发明也涉及使用脯氨酰特异性内切蛋白酶制备饮料。脯氨酰特异性内切蛋白酶优选用于制备啤酒、葡萄酒或果汁。根据本发明方法通过添加本发明脯氨酰特异性内切蛋白酶，降低或防止了混浊。通过添加这些脯氨酰特异性内切蛋白酶，得到了新的饮料。因此，本发明也涉及用本发明方法获得的饮料。这些饮料包括例如用本发明方法获得的啤酒、葡萄酒和果汁。
用本发明方法获得的饮料的优点在于这些饮料具有高含量的抗氧化剂。多酚是抗氧化剂。啤酒一般用除去多酚的物质进行处理以防止混浊形成，结果所获得的啤酒具有低的抗氧化剂活性。用除去多酚的物质处理的其它饮料也是如此。用本发明方法获得的啤酒具有更高的内源抗氧化剂活性。由于抗氧化剂是促进健康的成分，因此用本发明方法获得的饮料将被认为比用除去多酚的物质(如PVPP)处理而制备的同一类型的饮料更健康。
本发明方法另一个优点是它防止了发酵和高浓啤酒调节过程中的疏水多肽的损失。在啤酒生产的醪液形成阶段中疏水多肽提取的改进因此导致了更高的产率和改进的啤酒头稳定性。(Brey等人；Journal of the Institute of Brewing，Vol.108，No.4，424-433，2002)。已知脯氨酸特异性内切蛋白酶可以降低肽的疏水性，从而改进它们的水溶性并减少它们的涩味(WO02/45523)。事实上，我们在实施例15中证明了使用Endo-Pro酶后获得了更高的蛋白质水平和改进的啤酒头稳定性。脯氨酸特异性内切蛋白酶可选择地与本发明所述的辅助性蛋白酶组合使用因此是有利的。
根据本发明方法的另一个优点在于用本发明方法获得的果汁不退色或比除去多酚后获得的果汁不易退色。根据本发明方法获得的葡萄酒和果汁相比于用皂土或类似化合物的方法获得的饮料具有改进的香味和滋味，这是因为皂土不仅除去了蛋白质，也除去了产生香味和/或滋味的组分。
实施例实施例1材料脯氨酸特异性内切蛋白酶(Endo-Pro′s)黑曲霉G306于2001年9月10日保藏于CBS(CBS109712)。黑曲霉G306含有编码本发明脯氨酰特异性内切蛋白酶的基因。可获自该生物的基因或cDNA可以用已知的方法在任何黑曲霉宿主中克隆和表达。
使用了下列样品1)在对啤酒的实验中使用了″Endo-ProA″，其为脯氨酸特异性内切蛋白酶。该样品是超滤浓缩液，在超滤发酵培养基后获得，所述发酵培养基在发酵含有脯氨酸特异性内切蛋白酶编码基因的黑曲霉菌株后获得。Endo-ProA样品的脯氨酰特异性活性为5.06U/ml，按照方法部分所述测定。基于纯度大于90％的脯氨酰特异性内切蛋白酶样品的特异性活性，估计所述蛋白质浓度为50g/l。
2)在对葡萄酒的实验中使用了″Endo-Pro B″，其为脯氨酸特异性内切蛋白酶。该样品在柱纯化后获得，具有的活性为6.0U/ml。
木瓜蛋白酶在用木瓜蛋白酶的实验中使用了Collupulin，其为可商购获自DSM的液体木瓜蛋白酶制剂。活性为5280NF/mg。一个单位的NF定义为在pH6.0每小时催化酪蛋白水解生成1微克当量可溶酪氨酸所需的木瓜蛋白酶活性的数量。测量木瓜蛋白酶样品中蛋白浓度为119g/l(Lowry)。
聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)所用的PVPP是可商购获得的非水溶性PVPP，名称为′Polyclar AT″。
啤酒在对啤酒进行的所有实验中使用了来自″Les TroisBrasseurs″(Lille，法国)的麦芽啤酒(pilsener型)。该啤酒的醇百分比为5.2％(v/v)，pH为4.4。之所以选择这一特定的啤酒是因为在冷却时，该啤酒相对于其它商购获得的啤酒具有更大数量的混浊。用Lowry氏方法测定该啤酒的蛋白浓度为0.9g/l。
白葡萄酒不经过任何蛋白质除去处理，而使用从白色Sauvignon葡萄制备的白葡萄酒。用所选择的来自Lallemand的酵母VL3在葡萄酒制备过程中进行醇发酵。该葡萄酒的酒学分析得出下列结果
实施例2方法测定酶活性的分光光度法为了测量脯氨酸特异性内切蛋白酶的活性，使用了在0.1M柠檬酸/0.2M磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0，含有40％二噁烷)中制备的2mM N-苄酯基-甘氨酸-脯氨酸-对硝基苯胺(Z-Gly-Pro-pNA；分子量426.43；Bachem，Switserland)溶液的底物溶液。
向1mL的缓冲液(pH5.0)中加入250ul底物溶液，接着加入100ul的酶溶液(较大或较小体积量的酶溶液应该用缓冲液补偿)。反应混合物在37℃下孵育，通过在410nm测量吸收增加来监控pNA的释放。
一个单位被定义为在上述反应条件下在1分钟内从Z-Gly-Pro-pNA中释放1umol pNA所需的酶活性，其中使用了8,800M-1的摩尔消光系数(E)。
使用上述程序在pH5.0和37℃下在合成生色底物Z-Gly-Gly-pNA上测量分离自Flavourzyme 1000 L(NOVO，Denmark)的甘氨酸特异性内切蛋白酶的活性。一个单位的甘氨酸特异性内切蛋白酶被定义为pH5.0和37℃下在1分钟内从Z-Gly-Gly-pNA释放1微摩尔pNA所需的酶的数量。
使用氨基酸分析仪通过测量从合成肽Z-Pro-Pro(Bachem，Switserland)释放的脯氨酸残基数量来测量来自黄单胞菌属物种的脯氨酸特异性羧肽酶活性。一个单位被定义为pH7.0和37℃下在1小时内从Z-Pro-Pro释放1微摩尔脯氨酸所需的酶的数量。
冷却混浊测量(根据Lucien Chapon的醇/低温测试)根据操作说明书，用浊度计(″Tannometer″，Pfeuffer Gmbh，Kitzingen，Germany)测量混浊。在冷的啤酒中，可以出现不可逆的混浊，这是由沉淀的多酚-蛋白复合体造成的。添加多余的醇加速了这些混浊的形成。在″冷却混浊测试″中，该现象被用于定量所存在的多酚-蛋白复合体。为了对Tannometer进行校正，按照描述的制备了formazine标准溶液(Jean de Clerk，″Coursde Brasseries″2nd Edition，Vol 2，1963，pp.595-596，Universitéde Louvain，Belgium)。所用的啤酒混浊单位是ECB，其是European Brewery Convention所推荐的浊度单位。所述对啤酒的冷却混浊测试也可以用不含醇的啤酒或麦芽汁(改进自the Operating Instruction Guide of the Tannometer)进行。在这些情况下，也将乙醇添加到样品中，其所添加的量足以在样品中达到10％(v/v)的醇含量。将乙醇添加到所有麦芽汁样品中以达到10％(v/v)，接着每一样品在30分钟内冷却至-8℃。接着在浊度计中快速测量所形成的混浊(浊度，单位为EBC)，其中该浊度计的测量室的温度也为-8℃。
根据European Brewery Convention的″热混浊″测量法所述″热混浊测量法″是European Brewery Convention在序号9.30下推荐的啤酒混浊测量方案。已经证明，在升高的温度下啤酒储存相对短的时间将会产生混浊，其混浊程度类似于同一啤酒在室温下长期储存所产生的混浊。该″热混浊″测试如下进行在0℃的冷却浴中将啤酒冷却过夜，并在早上读取初始浊度，接着将啤酒放在60℃的浴中48小时(不搅拌)，将啤酒冷却并保持在0℃过夜，最后在0℃测量浊度。
对于葡萄酒和果汁进行加热混浊测试如K.J.Siebert所述(K.J.Siebert等人，J.Agric.FoodChem.44(1996))，饮料如葡萄酒或果汁中的混浊可以通过加热测试来诱导。所形成的混浊量主要是饮料中混浊-活性蛋白和多酚含量的函数。在加热测试中，在80℃加热30分钟之前和之后用浊度计测量样品(例如葡萄酒或果汁)的浊度。在测量浊度之前，在冷水中将加热的样品冷却下来，直至达到22-25℃的温度。在葡萄酒实验中(见实施例7)，用NTU-formazine标准溶液校正浊度计，对于果汁实验(见实施例8)，NTU浊度标准溶液购自Reagecon，Ireland。NTU＝浊度单位。
对照实验1.进行了空白实验，其中在孵育过程中未加入外源蛋白。
2.进行了这样的实验，其中使用了在孵育前用大量PVPP(1000g/hl)处理过的啤酒。该实验允许确定由冷却混浊测试诱导并归因于多酚-蛋白沉淀的平均混浊量，因为PVPP从啤酒中除去了多酚，因此干扰了混浊形成。
3.进行了这样的实验，其中将外源蛋白(分别为脯氨酰特异性内切蛋白酶或木瓜蛋白酶)加至于40℃孵育1小时后冷却至0℃的啤酒中。在混浊测量之前，在0℃孵育15分钟。由于所述酶和木瓜蛋白酶在0℃没有活性或基本没有活性，因此这些实验允许区分酶活性效果和非酶蛋白质的效果。
LC/MS分析用HPLC表征三个合成肽，其中所述HPLC使用P4000泵(ThermoquestTM，Breda，the Netherlands)，并装备有LCQ离子阱质谱仪(ThermoquestTM，Breda，the Netherlands)，所述三个肽用150*1mm PEPMAP C18 300A(LC Packings，Amsterdam，The Netherlands)柱分离，其中用0.1％溶于Milli Q水的甲酸(Millipore，Bedford，MA，USA；溶液A)和0.1％溶于乙腈的甲酸(溶液B)梯度洗脱。使用″scan dependent″MS/MS算法获得单个肽的详细信息，其中所述算法是离子阱质谱仪的特征性算法。通过将用MS/MS获得的不同肽的实验肽序列与理论序列信息进行比较，检查了针对羟脯氨酸和丙氨酸的内切蛋白酶特异性。
实施例3添加脯氨酰特异性内切蛋白酶对啤酒中混浊形成的影响向蛋白含量为0.9g/l除去碳酸的麦芽啤酒(Les TroisBrasseurs)中加入各种数量的脯氨酰特异性内切蛋白酶(″Endo-Pro A″，见材料部分)。进行了两个系列的混浊测量。在第一个系列中，在冷却混浊测试前，啤酒-Endo-Pro A组合物在40℃孵育1小时。在40℃孵育后，并且即将进行冷却混浊测试前，将乙醇加入该啤酒-Endo-Pro A组合物中，其所加入的量足以使醇含量增加至6％(V/V)。在第二个系列中，将不含Endo-Pro A的啤酒在40℃孵育1小时，接着冷却到0℃。在0℃下，加入Endo-ProA，所得组合物在0℃孵育15分钟。即将进行冷却混浊测试前，将乙醇加入该啤酒-Endo-Pro A组合物中，其所加入的量足以使醇含量增加至6％(v/v)。
表1显示了加入的Endo-Pro A量，以及相对于不加Endo-ProA时所测得的混浊的混浊减少百分比。所加Endo-Pro A的量变化范围很大，从小于1％的所加外源蛋白到大于10％(相对于啤酒中存在的蛋白量)。
表1.向啤酒中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶对在40℃孵育1小时后混浊量的影响
*″所加外源酶的百分比″反映了所加的Endo-Pro A″-酶量，以加入该酶前啤酒中所存在总蛋白量的百分比来表示。
表2.向啤酒中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶对在0℃孵育15分钟后混浊量的影响
表1清楚地表明在冷却前于蛋白酶具有活性的温度下向啤酒中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶后，冷却时所形成的混浊量减少。表2表明当脯氨酰特异性内切蛋白酶在较低温度下(在该温度下，该蛋白酶不具有活性或基本不具有活性)加入至啤酒中后，会有一些效果，但该效果相对于在蛋白酶具有活性的温度下加入蛋白酶所得到的效果来说是非常小的。
实施例4添加木瓜蛋白酶对啤酒中混浊形成的影响向蛋白含量为0.9g/l的除去碳酸的麦芽啤酒(Les TroisBrasseur)中加入各种数量的木瓜蛋白酶(0到100g/hl)。进行了两个系列的冷却混浊测量。对于第一个系列，在冷却混浊测试前，啤酒-木瓜蛋白酶组合物在40℃孵育1小时。在进行冷却混浊测试前，将乙醇加入所孵育的样品中以达到6％醇(v/v/)。在第二个系列中，将啤酒样品在40℃孵育1小时，接着冷却到0℃。接着加入木瓜蛋白酶，该样品在0℃孵育15分钟。表3显示了加入的木瓜蛋白酶量，以及相对于不加木瓜蛋白酶时所测得的混浊的混浊减少百分比。
表3木瓜蛋白酶对在40℃孵育1小时后啤酒中形成的混浊量的影响
(1)3g/hl是所推荐的最大剂量。
表4.木瓜蛋白酶对在0℃孵育15分钟后混浊量的影响
表3的结果表明了木瓜蛋白酶对冷却时啤酒中形成的混浊量的影响。清楚的是，当木瓜蛋白酶加入的量为3g/hl和更高时，木瓜蛋白酶对混浊的影响趋于平稳。很明显，用木瓜蛋白酶不可能获得与用脯氨酰特异性内切蛋白酶获得的同样的混浊减少量。
实施例5加入PVPP对啤酒中混浊形成的影响在啤酒-脯氨酰特异性内切蛋白酶实验和啤酒-蛋白酶实验两者中，都通过在孵育前向啤酒中加入大量PVPP(1000g/hl)而进行了对照实验。在混合15分钟后，过滤除去PVPP(没有加入脯氨酰特异性内切蛋白酶或木瓜蛋白酶)。在两个对照中，冷却混浊测试中几乎没有形成混浊。由于已知PVPP从饮料中除去多酚，因此这些对照实验表明多酚参与了啤酒的混浊形成。为了测量PVPP对啤酒混浊稳定性的影响，向除去碳酸的啤酒中加入不同量的PVPP，并且在混合15分钟后过滤除去。在加入PVPP前，啤酒在40℃孵育1小时。
表5显示了加入不同量的PVPP对冷却时啤酒中存在的混浊数量的影响。没有加入Endo-Pro A或木瓜蛋白酶。
表5.PVPP对冷却时啤酒中存在的混浊量的影响
在酿酒厂中使用的最大剂量为30g/hl。
表3表明在40℃下孵育1小时后加入3g木瓜蛋白酶/hl啤酒(啤酒工业中所推荐的最大剂量)诱导混浊减少了几乎36％。在加入脯氨酰特异性内切蛋白酶的情况下，在40℃孵育1小时后加入1％(相对于啤酒中存在的蛋白质量)脯氨酰特异性内切蛋白酶诱导啤酒冷混浊减少了38％(见表1)。在酿酒厂中，PVPP的加入量通常不会超过30g/hl。由于PVPP以所述量加入时减少了大约2o％的混浊，因此可以得出结论，木瓜蛋白酶和脯氨酰特异性内切蛋白酶是比PVPP更好的混浊抑制剂。
实施例6在100％麦芽醪液中加入Endo-Pro A以及100％麦芽汁中混浊的减少目的是要确定向100％麦芽醪液中加入Endo-Pro A是否会导致最终麦芽汁中混浊减少。
每一醪液形成实验都以25g磨碎的麦芽和100ml水混合开始。接着将醪液加热到50℃，在加入一定量的″Endo-Pro A″后，根据逐步加热程序将醪液加热至四个逐次增高的温度。表6显示了醪液形成温度情况。在醪液形成整个过程中，醪液在200rpm下搅拌。在醪液形成末期，醪液保持在室温，并加入水以补充蒸发掉的水。接着，醪液在纸上过滤，以将麦芽汁(液体)和固体分离。
表6.醪液浆形成时的温度情况
分别向醪液中加入0、200和500ul的Endo-Pro A。进行了对照实验，其中使用了在90℃加热15分钟而失活的500ul的Endo-Pro A。于冷却混浊测试之后在室温下测量麦芽汁的混浊。根据Chapon的醇/低温测试(冷却混浊测试-Pfeuffer Operatinginstructions)进行了麦芽汁冷却测试，其中如Chapon对不含醇的啤酒所推荐的，加入乙醇至样品中达到10％(v/v)。
表7在100％麦芽醪液中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶对产生的100％麦芽汁中混浊形成量的影响(冷却混浊测试后)
EBCEuropean Brewery Convention推荐的浊度单位。
表7的结果清楚地表明，当脯氨酰特异性内切蛋白酶加入至麦芽醪液中时，所得的麦芽汁在冷却时比不加脯氨酰特异性内切蛋白酶所制备的麦芽汁产生更少的混浊。
为了研究Endo-Pro A的影响，在麦芽汁上进行了冷却混浊测试。发现加入脯氨酰特异性内切蛋白酶减少了麦芽汁的冷却混浊。即使在加入少量的脯氨酰特异性内切蛋白酶后，也能观察到冷却混浊测试中形成的混浊减少了。当酶在加入至醪液之前失活时，其稳定效果完全消失，即所形成的混浊量不再减少。通过加入脯氨酰特异性酶诱导的混浊减少是非常重要的。在实施例中，获得了最多82％的混浊减少量。
为了比较在麦芽汁(malt worts)和大麦麦芽汁(barleyworts)加入脯氨酰特异性内切蛋白酶的效果，进行了如下实验，其中将不同量的Endo-Pro A加入到大麦醪液中。pH值在麦芽汁中为5.6，在大麦麦芽汁中为6.1。用大麦麦芽汁混浊测试获得的结果表明，如同前面对麦芽汁所观察到的，用脯氨酰特异性内切蛋白酶处理大麦麦芽汁诱导了重要的大麦麦芽汁冷却混浊减少。用脯氨酰特异性内切蛋白酶处理麦芽醪液和大麦醪液都产生了高度稳定的麦芽汁，但是在麦芽汁中的效果强于在大麦麦芽汁中的效果。事实上，在醪液中加入200ul的Endo-Pro A在大麦麦芽汁中诱导了大约59％的混浊减少，而在麦芽汁中诱导了超过70％的混浊减少。用500ul Endo-Pro A进行了实验，在麦芽汁中进一步减少了混浊，减少量直至82％，而在大麦麦芽汁中相对于200ulEndo-Pro A没有进一步减少混浊。出乎意料地，向大麦醪液中加入Endo-Pro A产生了澄清地过滤后麦芽汁，而未用Endo-Pro处理的醪液产生了雾状的过滤后麦芽汁(大麦醪液过滤在室温下进行，麦芽汁的浊度在室温下测定，其中不加乙醇)。无论在大麦醪液中加多少脯氨酰特异性内切蛋白酶，都能够观察到该效果。
实施例7葡萄酒中的混浊减少向含有590ml白葡萄酒(“材料”部分下所述的葡萄酒)的烧瓶中加入不同剂量的(0、30、60、150ul)具有6.0U/ml特异活性的脯氨酰特异性内切蛋白酶(Endo-Pro B)，并于室温(22-25℃)下在氮气中孵育19天。在0、6、8、12和19天后，用“方法”部分下所述的加热测试法测量葡萄酒混浊稳定性。
该实验结果示于表8。在表8中，葡萄酒混浊以浊度单位(NTU)表示。ΔNTU＝加热后葡萄酒样品中测得的NTU表示的浊度-加热前葡萄酒样品中测得的NTU表示的浊度。根据公式(1.48×ΔNTU)+2，计算稳定葡萄酒中的蛋白质所需的皂土量。如已知的，当葡萄酒不易于形成混浊时，只需较少的皂土即可防止混浊形成。
表8.向白葡萄酒中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶对加热葡萄酒后形成混浊的数量的影响
表8的结果显示，在加热前向白葡萄酒中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶减少了加热后葡萄酒中形成的混浊。在室温孵育6天后，观察到了该效果。事实上，加入150ul的Endo-Pro B使混浊减少达到了39％，而加入30ul或60ul的Endo-Pro B，达到大约12％。12天后，不管使用多少量的脯氨酰特异性内切蛋白酶，混浊减少达到了46％，并在19天后超过了70％。因此，很清楚，脯氨酰特异性内切蛋白酶可以用来避免或减少稳定葡萄酒以防止混浊形成所需的皂土数量。
实施例8草莓汁中的混浊减少如下制备草莓果汁使草莓解冻并压碎，接着在90℃下漂白(加热)以破坏所有内源酶，例如多酚氧化酶，并使蛋白质变性。将压碎的草莓冷却至50℃，在50℃下用600g/t的Rapidase BEsuper(DSM的商业酶产品，France)浸泡30分钟，并在气体加压机中加压。为了除去变性蛋白质，所得混合物在8000rpm下离心，并过滤。收集草莓汁。酸化的醇测试是阴性的，这证实该草莓汁不含胶质。该草莓汁的pH值为3.3。
Endo-Pro A/草莓汁孵育向100ml草莓汁中加入不同体积(0、5、10、20ul)的Endo-Pro A(5.06U/ml)，在50℃下孵育60分钟。进行了两个对照实验(i)一个加入20ul失活的Endo-Pro A(在80℃下孵育30分钟)；和(ii)在第二个对照中，向20ml预先在50℃孵育1小时的草莓汁中加入200mg的PVPP。在室温下混合15分钟后，离心除去PVPP。
果汁加热测试在将果汁在80℃下加热30分钟之前以及之后，测量果汁的混浊。在测量混浊之前，将加热的果汁用冷水冷却下来。
在预先用Reagecon(Ireland)的NTU浊度标准校正的浊度计中测量浊度。
-油墨组的制备-实施例11中，除了把实施例1、6、7、8的各记录用油墨的表面活性剂改成含氟表面活性剂(FT-110(ネオス公司制)以外，其他与实施例11同样地制备实施例12的油墨组。
对制得的实施例10～12及比较例7～8的各油墨组进行以下的评价。把结果示于表3。
<图像品质(色边界渗色)评价>
使用前述喷墨(IJ)打印机IPSiO Jet 300(株式会社リコ-制)，作为评价用纸使用普通纸。打印文字图像，按以下标准对其文字渗色、色边界渗色进行评价。◎…没有观察到渗色的状态○…基本上没有观察到渗色的状态△…观察到有若干渗色的状态×…观察到渗色明显的状态表3
由表3的结果看出，不含表面活性剂及浸透剂的至少任何一种的比较例7～8的油墨组，对纸的浸透性差，即使浓度高也易渗色，尤其是高速进行印字的场合，由于渗色故图像品质降低。
相反，实施例10～12的油墨组，尤其是实施例10及11的油墨组，不产生文字渗色及色边界渗色，表明具有高品位的图像品质。
以下，对实施例4、5、8的各记录用油墨，及实施例12的油墨组中的蓝油墨进行以下的评价。把结果示于表4。
<喷出稳定性评价(连续喷出稳定性)>
从黄单胞菌中分离所需的羧肽酶被证明是一项困难的任务，因为US 5,693,503所述的纯化方法在我们手中是不成功的，因此必须开发一种全新的纯化方案。在许多测试的方案中，下面的方案产生了基本纯化的酶。
从1升培养液开始，离心收集细胞，用水洗涤一次，接着通过0℃的超声处理破碎细胞。
在20000rpm下离心20分钟除去细胞碎片，在同样条件下再次离心所得的上清液。接着向上清液中加入硫酸铵达到40％饱和度。低速离心后，收集上清液，再加入硫酸铵达到80％饱和度。用低速离心收集新形成的沉淀，在pH7.0和4℃下，充分透析，加样至用0.05摩尔/升tris-HCl(pH8.0)平衡的杆菌肽-Sepharose柱上(J.Appl.Biochem.，1983 pp420-428)。用补充了1摩尔/升NaCl和10％(v/v)异丙醇的平衡缓冲液洗脱结合在柱上的材料。如材料和方法部分所述，通过与合成底物Z-Pro-Pro孵育来鉴定含有所需酶活性的级分。含有活性的级分接着加样至用0.025摩尔/升Tris-HCl(pH8.5)平衡的MonoQ柱上。在这些条件下，酶结合到柱上，并用NaCl浓度梯度洗脱。收集活性级分，透析，并如上所述在Mono Q柱上再次进行层析。在37℃下于Z-Pro-Pro上测量最终浓缩物的活性，pH7.0时为0.5单位/ml，pH5.5时为0.09单位/ml。在50℃和pH5.5下孵育2-3小时后，该酶保留了大约50％的活性。该制剂用于实施例11所述的测试中。
只有从Xanthomonas campestris pv campestris中分离的酶在酸性条件下显示活性。从X.rubrilineans分离的类似羧肽酶在pH5.5不显示活性，因此较不适合于所预期的用途。
实施例10从米曲霉中分离甘氨酸切割型内切蛋白酶已经在番木瓜提取物中鉴定了能切割富含甘氨酸残基的蛋白质的内切蛋白酶(甘氨酰内肽酶，EC 3.4.22.25)。但是，该酶对于所预期的应用具有几个不利之处，因为其具有相对高的(近中性)pH最佳值，并且如果以纯化形式生产则成本较高。因此在潜在食品级微生物中鉴定酸稳定的、甘氨酸特异性内切蛋白酶能提供许多优点。为了该目的，我们已经筛选了大量商业可获得的食品级酶制剂。
如上所述，该筛选用合成生色肽Z-Gly-Gly-pNA在pH4.0下进行。检测了六种不同的酶制剂，只有Flavourzyme 1000L(来自米曲霉的HPN 00011；NOVO，Denmark)显示出一些针对所使用合成底物的活性。为了分离具有这一活性的酶，必须测试大量不同的纯化方案。下面方案被证明是成功的。
首先，通过充分透析除去了Flavourzyme材料中存在的多余的低分子量成分。在透析过程中，甘氨酸特异性活性降低至其初始值的约50％。所得透析过的液体进一步洗涤，并用Amicon PM-10超滤装置浓缩。向所得液体浓缩液中加入硫酸铵至50％，离心后向上清液中加入更多的硫酸铵以达到饱和水平的75％。然后用低速离心收集获得的沉淀，透析，使用PM-10装置再次浓缩所得的液体。将浓缩液加样于Sephadex G-100凝胶过滤柱中，收集活性级分。如材料和方法部分所述，在pH4.0下用Z-Gly-Gly-pNA测定每一级分中的活性。所收集的级分然后进行离子交换层析，在用0.05摩尔/升乙酸钠(pH5.0)平衡的HITrap Q上进行，并用含有1M NaCl的相同缓冲液洗脱。如上所述，通过在pH5.0下与Z-Gly-Gly-pNA孵育来鉴定活性级分，合并级分，并用PM-10装置浓缩。如果在pH5.0下测量，最终浓缩液含有0.008单位/ml。该溶液用于进行实施例11所述的实验。
实施例11用所选择的辅助蛋白酶处理后100％麦芽汁的混浊稳定性改进了本实施例证明了Endo-ProA处理结合所选择的辅助蛋白酶处理可以进一步改进Endo-ProA的抗混浊效果。它用实例证明了当与Endo-ProA组合使用时，来自野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)的脯氨酸特异性羧肽酶(″CarboxyPro″)或来自米曲霉的甘氨酸切割型内切蛋白酶(″EndoGly″)进一步显著降低了混浊形成。本实施例着眼于100％麦芽汁中的混浊减少效果。
为了制备麦芽汁，将50g磨碎的麦芽与200ml水混合，并加热到50℃。加入0或150ul的Endo-Pro酶浓缩液，醪液经历表10中所述的逐步加热方案。在这一过程中，醪液在200rpm下搅拌。最后，将醪液冷却到室温，加入水以补充任何蒸发的水。最后，在纸上过滤醪液，以将固体和麦芽汁(液体)分离。如此获得的麦芽汁被用于测试辅助酶的效果，其中用PVPP的效果作为参照。
表10.醪液形成温度方案
由于PVPP对多酚具有高的亲和力，因此在工业中广泛用于除去多酚-蛋白质凝聚造成的啤酒混浊。为了确定CarboxyPro或EndoGly是否和PVPP一样也具有混浊降低效果，将未用Endo-Pro处理的麦芽汁在50℃下与100ul CarboxyPro或20ul EndoGly孵育120分钟，接着根据材料和方法部分所述的程序测量形成的混浊的稳定性。作为参照，未用Endo-Pro处理的醪液在过滤之前与PVPP在室温孵育15分钟，接着进行测量。所得结果示于表11中。
表11PVPP、CarboxyPro和EndoGly对未用Endo-Pro处理的100％麦芽汁的冷却混浊的影响
EBCEuropean Brewery Convention推荐的浊度单位根据表11所示的结果，与CarboxyPro和EndoGly孵育都产生了冷却时具有较少混浊的麦芽汁。但是，该结果也清楚显示加入PVPP的效果更好。
进行了后续的实验，其中使用了在醪液形成阶段用Endo-Pro预处理的麦芽汁。在该实验中，向该麦芽汁中加入辅助蛋白酶，即每10毫升麦芽汁加入0、100或500微升的EndoGly或0、20或100微升的CarboxyPro。在50℃下所有样品孵育120分钟，接着进行冷却混浊测试。结果示于表12中。
表12用Endo-Pro A处理100％麦芽汁，接着与各种量的CarboxyPro或EndoGly孵育所获得的麦芽汁冷却混浊结果
EBCEuropean Brewery Convention推荐的浊度单位根据表12中所示的结果，Endo-Pro预处理与CarboxyPro或EndoGly处理的组合对麦芽汁的混浊稳定性具有显著效果。依赖于所加辅助蛋白酶的浓度，其获得的结果优于用PVPP在未用Endo-Pro处理的麦芽汁中所得的结果(表11)。
最后进行了实验以测试所观察到的酶效果是否是非酶促假相或特异性蛋白水解作用造成的结果。为了该目的，向Endo-Pro处理过的麦芽汁中加入100ul CarboxyPro或20ul EndoGly。为了防止所有辅助酶的酶活性，在测量所形成的麦芽汁冷却混浊之前，将含有这些酶的麦芽汁在0℃保持15分钟(即与PVPP的孵育时间可比)。将用各种量PVPP处理并接着过滤的麦芽汁用作参照。
表13Endo-Pro处理的100％麦芽汁在0℃下与CarboxyPro或EndoGly孵育或者在室温与PVPP孵育的效果
EBCEuropean Brewery Convention推荐的浊度单位表13中的数据显示如果在0℃下孵育，CarboxyPro和EndoGly都没有效果，这提示它们的蛋白水解活性是表11和12中所观察到的混浊稳定性的直接原因。PVPP只有有限的效果(混浊减少仅为17.3％，而在表11的条件下混浊减少为46.8％)。这一观察结果再次证实Endo-Pro孵育对所存在的可沉淀多酚-蛋白质总量的影响通过防止多酚-蛋白质凝聚的形成，使用PVPP已几乎成为多余的。
实施例12Endo-Pro A也具有Endo-Hydroxy-Pro和Endo-Ala活性研究了Endo-Pro A对羟脯氨酸和丙氨酸是否也具有内切蛋白酶特异性。因此合成了三个覆盖αs1-酪蛋白B的合成肽，并具有一些修饰。所述肽为·0139-59，SEKTTMPLW，原始αsl-酪蛋白C末端，M＝1091.5·0139-60，SEKTTMJLW，J为羟脯氨酸，M＝1107.5·0139-61，SEKTTMALW，用丙氨酸取代脯氨酸，M＝1065.5为了分析此类复杂的肽，使用了称为扫描依赖性MS/MS的混合物。在该方法中，每一扫描由三个部分组成，定义如下1完全扫描分析，2放大扫描分析以确定在完全扫描质量范围中最强离子的电荷状态，3对完全扫描质量范围中最强离子进行MS/MS获得氨基酸序列信息。
所有三个肽以75-100ug/l的浓度溶于0.1％甲酸中，并用梯度洗脱在LC/MS和LC/MS/MS模式中检查它们的纯度。通过氨基酸序列的总覆盖，所有三个肽在LC/MS模式和LC/MS/MS模式中可以通过它们质子化或双重质子化的分子来鉴定。
在分析前，用Endo-ProA处理的合成肽稀释50倍。对于处理后形成的肽的LC/MS分析，梯度必须稍加调整。如果Endo-ProA确实具有羟脯氨酸特异性，则该肽应该被切割成下列部分SEKTTMP和LW，各自在m/z 793.4和318.1具有质子化的分子。SEKTTMJ和LW，各自在m/z 809.4和318.1具有质子化的分子。
在Endo-Pro处理的肽的离子色谱中确实观察到了这两个所预测的肽质量，在LC/MS/MS模式中检查表明具有正确的氨基酸序列。
通过在离子色谱中观察到m/z 767.4的SEKTTMA和m/z 318.1的LW，表明第三个合成肽也具有相同的模式。Endo-Pro优先在P、J和A的C末端切割，但是短1、2或3个氨基酸的肽也能观察到，并能用LC/MS/MS清楚地鉴定。但是这些百分比都低于6％。表14中给出了对上述的总结。
表14用Endo-Pro A处理后所有三个合成肽所形成的肽。通过它们的质子化分子和MS/MS特征检查了氨基酸序列。
结论除了优先切割脯氨酸外，Endo-Pro A确实还能在羟脯氨酸和丙氨酸的羧基末端侧切割它们。
实施例13Endo-Pro的pH最佳值将根据SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的DNA序列表达于黑曲霉iso 502。这分别产生根据SEQ ID NO5和SEQ ID NO4的多肽。这些多肽将分别称为Endo-Pro RUS和Endo-Pro GAM。两种酶非常相似，但在一些生物学方面不同。Endo-Pro RUS具有更高的特异活性，并且在除去啤酒混浊方面更有活性。
1)Endo-Pro的pH最佳值用试卤灵标记的酪蛋白和Roche的指导(″Universal ProteaseSubstrate″；Cat.No 1 080 733)测量了Endo-Pro的蛋白水解活性。通过用蛋白酶处理，试卤灵标记的肽被释放，其不能与三氯乙酸形成形成沉淀。因此Endo-Pro酶在给定温度或pH值下的活性越大，则在574nm的光吸收越高。pH范围为pH4.5-4.8-5.0-5.5-6.0-7.0-8.0。对pH7和8使用了0.1MTris/HCl缓冲液。对更低pH值，使用了0.1M Hac缓冲液。所述缓冲液含有0.02M CaCl2。
反应在37℃下进行30分钟，获得的数据提供于表15中。将Endo-ProRUS(6U/mL)和Endo-ProGAM(大约4U/mL)稀释至0.5U/mL。在孵育混合物中加10uL样品，并用孵育缓冲液补足体积。
根据表15中所示的结果，所述酶的pH最佳值为约pH5.5。但是，后来很清楚的是，在低于pH5.5的pH值处，试卤灵标记的酪蛋白开始沉淀，因此在低于这一pH值处，获得了不可靠的结果。为了对此进行校正，在所述的各种pH条件下重复实验，但是使用Z-Gly-Pro-pNA而不是试卤灵标记的酪蛋白作为生色底物。用Z-Gly-Pro-pNA和410nm处的光吸收获得的数据(cf实施例2)清楚显示两种Endo-Pro酶在pH4.5附近都具有活性峰。
2)Endo-Pro酶的温度稳定性通过将两种Endo-Pro酶在pH5.0下加热至40-50-55和60℃之一，测量了这两种酶的温度稳定性。在0.5-1-2-5和20小时后取样品，并将Endo-ProRUS和Endo-ProGAM活性稀释至大约0.5U/mL。然后在含有Z-Gly-Pro-pNA(cf实施例2)的孵育混合物中加入10uL样品，如实施例2所述测量残余酶活性。在参照中，用孵育缓冲液补足10微升体积。未经热处理的酶的Z-Gly-Pro-pNA切割活性作为值100％。
从表16的结果可以清楚地看出两种Endo-Pro酶都具有优良的温度稳定性。
表15Endo-Pro酶的pH最佳值
表16 Endo-Pro酶的温度稳定性
实施例14在啤酒发酵和扩增条件下的混浊减少在前面的实施例中，我们已经证明了在室温(cf实施例7)和升高的温度下，酶促防止混浊作用的效果。在本实施例中我们证明了该酶促Endo-Pro方法的通用性，这是通过证明该脯氨酸特异性内切蛋白酶在远离其最优条件的情况下也能有效防止混浊形成来表明的。为了该目的，我们已经测试了在啤酒发酵前(因此该酶可以在12℃作用12天)或在啤酒扩增前(因此该酶可以在4℃下作用10天)加入Endo-Pro酶后，该酶是否能防止啤酒中混浊形成。
为了测试啤酒发酵过程中的该酶促混浊防止效果，我们已经使用了新制备的含有约4％乙醇的100％麦芽啤酒，所述啤酒经过了膜过滤，但没有经过任何旨在除去混浊形成成分的处理。这一“未稳定化的”啤酒被除去碳酸，接着加入各种浓度的Endo-Pro酶(见表17)。该混合物接着在12℃孵育10天以尽可能地模拟工业啤酒发酵。
为了测试扩增条件下的酶促混浊防止效果，使用了完全相同的起始材料和相同浓度的Endo-Pro酶，但是这一次混合物在4℃下孵育10天。
在两个实验中，在每百公升啤酒中使用了20、30和50g剂量的PVPP((Polyclar AT/水不溶)作为参照(在纸过滤前于室温搅拌15分钟)。
在两个实验中，于每百公升中加入了1、2和3克剂量的木瓜蛋白酶(液态DSM Collupulin；批次号010604，最终活性为5480NFU/mg)。
根据实施例2所述，测量所有样品中的混浊形成。
表17发酵过程中的酶促混浊防止作用
表18扩增过程中的酶促混浊防止作用
从所得数据可以清楚地看出，在该方法的发酵和扩增阶段都可以实现酶促混浊清除。相当令人惊奇的是，酶促Endo-Pro方法比木瓜蛋白酶或PVPP能更好地抑制啤酒冷却混浊，并与在对抗热混浊形成中每百公升加入30克PVPP的效果一样好。
实施例15酶促混浊减少及其对啤酒泡沫稳定性和多酚(抗氧化剂)水平的影响用蛋白水解酶来减少啤酒中混浊形成的一个缺点是它们对啤酒泡沫稳定性的消极影响。由于过度的蛋白水解降解，谷类蛋白不能形成稳定的泡沫。在本实施例中，我们证明了，可能由于Endo-Pro具有高的选择性，Endo-Pro酶对啤酒泡沫稳定性没有不利影响。Endo-Pro孵育的一个重要副作用是所得啤酒具有增高的多酚水平，因此对氧化具有增高的、天然的保护作用。
在本实施例中，在四个都使用100％麦芽的不同先导实验中生产了啤酒。在两个先导实验中，于醪液形成阶段加入了2个浓度的Endo-Pro酶。在另两个先导实验中，没有加入酶，但这些啤酒用PVPP处理以模拟除去形成混浊的化合物的传统方法。
用下面的方案来生产啤酒。对于每一测试进行一次酿造(6kg麦芽，18升水)。醪液形成在50℃下进行20分钟，50℃-64℃下进行10分钟，64℃下进行20分钟，64℃-74℃下进行8分钟，最后在74℃下进行30分钟。使用醪液滤器进行过滤，接着用热水洗涤。煮沸90分钟，接着加入啤酒花。在第一次发酵中使用干的迟延酵母(Dry lager yeast)(每毫升麦芽汁用7.5 106个细胞)，在12℃进行发酵。发酵时间依赖于浓度的降低，但持续大约10天。于0℃至少7天内，啤酒熟化。最后将啤酒用膜过滤并装瓶。
表19啤酒泡沫稳定性和多酚水平
初始、真正和表观提取物EBC 9-4方法；表观稀薄化；醇EBC9-4方法；头保留值Ross & Clark方法；总蛋白Kjeldahl方法；多酚EBC 9-11方法。
所得结果清楚地表明，本发明的酶促混浊减少方法对啤酒泡沫绝对没有负作用，并且与用PVPP稳定的啤酒相比增加了啤酒中总的多酚含量。后一观察结果强烈表明用Endo-Pro酶处理的啤酒具有增强的天然抗氧化剂能力。
按照布达佩斯条约为专利程序目的而进行的微生物保藏INTERNATIONAL FORM 1 Wbere Rule 6.4(d) applies，such date is the date on which the status of Lnternationaldaocsitarv authority was acquired.
序列表<110>DSM NV<120>防止或降低饮料混浊的改进方法<130>
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<141>
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<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1581<212>DNA<2l3>黑曲霉<400>1atgcgtgcct tctccgctgt cgctgctgcg gccctggcgc tctcttgggc gtctctggct 60caggctgctc gcccccgtct tgtgcccaag cctgtctctc ggccagcctc gagtaaatcg 120gctgcgacca cgggcgaggc ttactttgag cagctgctgg accatcataa tccggagaag 180ggcacctttt cccagaggta ctggtggagt actgaatact ggggtggtcc tgggtcaccg 240gtcgtcctct ttactcctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaat 300gggactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgagcac 360cgctactggg gtgattcttc tccttatgag gtgctcaatg ccgaaactct tcagtacctc 420acactggacc aagccattct ggacatgacc tacttcgccg agacggtgaa gctgcaattc 480gataacagca cccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggatcatac 540agtggtgcct tgacggcttg gaccgaatct gtcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat 600gccactagtg ctcctgtgga ggctatctac gactattggc aatactttta ccccatccag 660caaggtatgg cacagaactg cagcaaggac gtgtctctgg tagccgagta tgtcgacaag 720attggaaaga acggaactgc caaggagcag caggcactca aggaattgtt tggtctggga 780gctgttgagc attttgatga ctttgccgct gtcctcccca acggaccgta cctctggcaa 840gacaacgact ttgccacggg atactcttcc ttcttccagt tctgtgacgc cgtcgagggt 900gtcgaagccg gcgcggcagt aacccccggc cccgagggtg tcggcctcga aaaggccctg 960gccaactacg caaactggtt caattcaacc attctccctg attactgcgc aagctacggc 1020tactggaccg acgaatggag cgtcgcctgc ttcgacagct acaacgcctc gagccccatc 1080tacaccgata cctccgtagg caatgccgtc gaccgccaat gggaatggtt cctctgcaac 1140
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Leu Val Ser Ala Ser Tyr Trp Gln Arg Gln Cys Pro Leu Tyr Phe Pro405 410 415Glu Thr Asn Gly Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Lys Gly Lys Asn Ala Ala420 425 430Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Met Thr Arg Asn Thr Thr435 440 445Arg Leu Ile Trp Thr Asn Gly Gln Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ser Gly450 455 460Val Ser Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gly Pro Leu Ala Ser Thr Ala Asn465 470 475 480Glu Pro Val Gln Ile Ile Pro Gly Gly Phe His Cys Ser Asp Leu Tyr485 490 495Met Ala Asp Tyr Tyr Ala Asn Glu Gly Val Lys Lys Val Val Asp Asn500 505 510Glu Val Lys Gln Ile Lys Glu Trp Val Glu Glu Tyr Tyr Ala515 520 525<210>6<211>1551<212>DNA<213>黑曲霉<400>6atgcgttcct tctccgttgt cgctgccgcg tcactggcgc tctcttgggc gtctctggcc 60caggctgctc gcccccgtct tgtgcccaag cctatctctc ggccagcttc gagtaagtcg 120gctgcgacta cgggtgaggc ttattttgag cagctgctgg accatcacaa cccggagaag 180ggaacgtttt cccagcggta ctggtggagt actgaatact ggggtggacc tgggtcaccg 240gtggtcctct ttaaccctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaac 300gatactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgaacac 360cgctactggg gcgactcttc gccttatgag gtgctcaatg ccgaaacact tcagtatctc 420acactggatc agtccattct ggacatgacc tacttcgccg agacggtaaa gctgcagttc 480gataatagca gccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggctcatac 540agcggtgcct tgacggcttg gaccgagtct atcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat 600gccaccagtg cgcctgtgga ggctatctat gactttcaag gtatggcaca gaactgcagc 660aaggatgtgt ctctggtagc cgagtatgtc gacaaaattg ggaagaatgg aactgccaag 720gaacagcagg agctcaaaga attgtttggt ctgggagctg ttgagcatta cgatgacttt 780gccgctgtcc tgcccaacgg accgtacctc tggcaagaca acgactttgt cacaggatac 840tcttccttct tccagttctg tgatgctgtc gagggtgtcg aagccggcgc ggcagtgacc 900cccggccccg agggcgtcgg acttgaaaag gccctggcca actacgcaaa ctggttcaat 960
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1.一种防止或降低饮料中的混浊的方法，其中向该饮料中加入脯氨酸特异性和/或羟脯氨酰特异性和/或丙氨酸特异性内切蛋白酶。
2.权利要求1的方法，其中所述内切蛋白酶是基本分离的形式。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所加的内切蛋白酶在与其所加至的饮料的pH值相应的pH值处具有最大的特异活性。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述饮料含有蛋白质。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述饮料含有多酚。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述饮料的pH值处于或低于7.0、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或3.0。
7.权利要求4-6中任一项的方法，其中对于饮料中的每克蛋白质向饮料中加入至少150毫单位的特异性内切蛋白酶活性，所述活性通过用Z-Gly-Pro-pNA、Z-Gly-hydroxy-pro-pNA或Z-Gly-Ala-pNA作为底物的活性测量法来确定。
8.权利要求4-6中任一项的方法，其中对于饮料中的每克蛋白质向饮料中加入至少500毫单位的特异性内切蛋白酶活性，所述活性通过用Z-Gly-Pro-pNA、Z-Gly-hydroxy-pro-pNA或Z-Gly-Ala-pNA作为底物的活性测量法来确定。
9.权利要求4-6中任一项的方法，其中对于饮料中的每克蛋白质向饮料中加入至少1单位的特异性内切蛋白酶活性，所述活性通过用Z-Gly-Pro-pNA、Z-Gly-hydroxy-pro-pNA或Z-Gly-Ala-pNA作为底物的活性测量法来确定。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述饮料是用于啤酒生产的液体。
11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述饮料是用于葡萄酒生产的液体。
12.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述饮料是用于果汁生产的液体。
13.权利要求10的方法，其中向醪液中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶。
14.权利要求10的方法，其中在混浊形成前向啤酒中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶。
15.权利要求10的方法，其中在混浊形成后向已发酵的啤酒中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶。
16.权利要求11的方法，其中向已发酵的葡萄酒中加入脯氨酰特异性内切蛋白酶。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中向所述饮料中加入辅助酶以进一步降低或防止混浊形成。
18.权利要求17的方法，其中所述辅助蛋白质是纯化的外切蛋白酶或内切蛋白酶。
19.权利要求17或18的方法，其中所述外切蛋白酶是脯氨酸特异性羧肽酶。
20.权利要求19的方法，其中所述脯氨酸特异性羧肽酶可从黄单胞菌属中获得。
21.权利要求17或18的方法，其中所述辅助性内切蛋白酶是甘氨酸特异性内切蛋白酶和/或天冬氨酸蛋白酶。
22.权利要求21的方法，其中所述天冬氨酸蛋白酶是Fromase。
23.一种分离的多肽，其具有脯氨酰特异性和/或羟脯氨酰特异性和/或丙氨酸特异性内切蛋白酶活性，并具有酸性pH最佳值。
24.权利要求23的多肽，其中所述pH最佳值在pH5.5或pH5.5附近。
25.权利要求23或24的特异性内切蛋白酶在制备饮料中的用途。
26.纯化的脯氨酰特异性和/或羟脯氨酰特异性和/或丙氨酸特异性内切蛋白酶在制备啤酒、葡萄酒或果汁中的用途。
27.通过权利要求1-22和/或25-26中任一项的方法可获得的饮料。
28.用权利要求10的方法可获得的啤酒。
29.用权利要求11的方法可获得的葡萄酒。
30.用权利要求12的方法可获得的果汁。
全文摘要
本发明涉及通过添加脯氨酰特异性和/或丙氨酸特异性内切蛋白酶来防止或降低饮料混浊的方法，以及根据本发明方法获得的新饮料。本发明也涉及新的内切蛋白酶。本发明也涉及上述方法，其中辅助酶与所述特异性内切蛋白酶联合使用。提供了基因组DNA、cDNA和蛋白序列的序列信息。
文档编号C12N9/48GK1659271SQ03813228
公开日2005年8月24日 申请日期2003年5月14日 优先权日2002年6月7日
发明者L·伊登斯, M·洛普兹 申请人:Dsm Ip资产有限公司