植物胸苷激酶及其用途的制作方法

专利名称：植物胸苷激酶及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的植物胸苷激酶及其在基因治疗中的用途。更特别发明涉及来自番茄、松树、水稻或阿拉伯芥的新的胸苷激酶。
本发明进一步的方面提供了编码植物胸苷激酶的新的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体构建体、携带该多核苷酸或载体的宿主细胞、使细胞对药物前体敏感的方法、抑制恒温动物中致病物质的方法、植物的生物控制方法、合成一磷酸酯的方法和包含本发明的植物胸苷激酶药物组合物。
本发明的优选实施方案中提供了植物胸苷激酶和核苷类似物AZT的独特组合以治疗异常细胞生长。
背景技术：
DNA由四个脱氧核苷三磷酸组成，由从头和补救途径合成。从头途径的关键酶是核糖核苷酸还原酶，它催化核苷二磷酸的2’-OH基还原，而关键的补救酶是脱氧核苷激酶，它将脱氧核苷磷酸化成相应的脱氧核苷一磷酸。
来自各种生物的脱氧核苷激酶在其底物特异性、基因表达调节和细胞定位方面不同。在哺乳动物细胞中，有四种酶具有重叠特异性，胸苷激酶1(TKI)和2(TK2)、脱氧胞苷激酶(dCK)和脱氧鸟苷激酶(dGK)、它们将嘌呤和嘧啶脱氧核苷磷酸化。TK1和TK2是嘧啶特异性的并将脱氧尿苷(dUrd)和胸苷(dThd)磷酸化，TK2也磷酸化脱氧胞苷(dCyd)。dCK将dCyd、脱氧腺苷(dAdo)和脱氧尿苷(dGuo)磷酸化，但不能将dThd磷酸化。dGK将dGuo和dAdo磷酸化。TK1和dCK位于细胞质，TK2和dGK位于线粒体，尽管近来报道表明TK2也定位在细胞质。
基于与来自粘液瘤病毒的胸苷激酶的同源性，已经提出了一种来自水稻的编码胸苷激酶的基因[Hemayet Ullah，Dominique Robertson，and Roger C.FitesA Gene for Thymidine Kinase in Plants(登记号AF066050；植物基因登记PGR99-048)Plant Physiol.1999 1191567]。然而，仅分离到部分序列，该序列不足以表达活性蛋白。
来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组的两个片段已经在GenBankTM中注释为推定的胸苷激酶(登记号AAF13097和BAB09824)。然而，迄今为止，尚未完成针对植物激酶表征、性能、定位、用途或生物功能的实验工作。
AZT(3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷，叠氮胸苷，Retrovir)是用于治疗HIV感染的核苷类似物。它在人细胞中活化的限速步骤是AZT-一磷酸酯(AZTMP)活化为AZT-二磷酸酯。
已经提示使用具有内源性胸苷激酶活性的人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)用于治疗HIV感染的基因治疗。HSV1-TK与人TK2有种系发生相关性，但是与人TK1无关。也已经提示了HSV1-TK提高叠氮胸苷抗病毒活性的用途，已经表明HSV1-TK与叠氮胸苷联合使用能够杀灭转化的大肠杆菌。然而，因为据信AZTMP的磷酸化是人AZT活化的限速步骤，所以尚未完成针对AZT和胸苷激酶有效联合用于治疗人癌症或其它人异常细胞生长相关疾病的实验工作。
发明概述本发明的一个目的是提供有效将核苷类似物转变成毒性物质，和有效将核苷类似物转变成相应的一磷酸酯及进一步转变成相应的二磷酸酯的新的植物胸苷激酶。分离的植物胸苷激酶基因可以用于选择性杀灭含有该基因(和接触至少一种核苷类似物)的细胞的基因治疗，并且本发明提供的分离的胸苷激酶可以用于核苷和/或核苷类似物磷酸化的重要工业方法。分离的胸苷激酶也可以用于杀灭细胞，通过将该酶注入细胞并使该细胞接受至少一种核苷类似物。提及核苷类似物和/或其一磷酸酯时，应理解为优选这种核苷类似物是脱氧核苷类似物，更优选脱氧核糖核苷，和更优选AZT。
更特别地，本发明提供了植物胸苷激酶和核苷类似物AZT的独特联合以治疗异常细胞生长。
因此，在其第一个方面，本发明提供了编码来自松树(Pinustaeda)、水稻(Oryza sativa)或番茄(Lycopersicum esculentum)的植物胸苷激酶的分离的多核苷酸。已经证明这些植物胸苷激酶在AZT磷酸化中特别有效并具有预料不到的高内源性一磷酸激酶活性，特别是对核苷类似物一磷酸酯如AZTMP。
本发明的另一个方面提供了编码来自植物的胸苷激酶的分离的多核苷酸，当与人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)比较并且导入真核或细菌细胞时，该胸苷激酶使至少一种核苷类似物的IC50降低至少四(4)倍。以前尚未报道任何植物胸苷激酶的这种低IC50。优选这个核苷类似物是AZT。
本发明的第三个方面提供了编码来自植物的胸苷激酶的多核苷酸，该胸苷激酶能够以比胸苷一磷酸酯更高的程度使至少一种核苷类似物一磷酸酯磷酸化。优选该类似物一磷酸酯是AZT一磷酸酯。更优选所述激酶基本上不能使胸苷一磷酸酯磷酸化。以前尚未报道植物胸苷激酶的内源性一磷酸酯激酶活性。具有这个活性使得该酶成为医疗用途，如治疗癌症和自杀系统的好候选物。因此，对AZT一磷酸酯比对胸苷一磷酸酯具有更高的底物特异性，AZT一磷酸酯转变成二磷酸酯速度更快。
本发明的第四个方面提供了编码来自植物的胸苷激酶的多核苷酸，该胸苷激酶的[kcat/Km(Thd)]I[kcat/Km(AZT)]比率低于二(2)。具有这种低比率的胸苷激酶磷酸化AZT与磷酸化Thd的效率比例比已知胸苷激酶更高。
本发明的第五个方面提供了编码来自植物的胸苷激酶的多核苷酸，当该胸苷激酶表达并与人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)相比时，[kcat/Km(Thd)]I[kcat/Km(至少一种核苷类似物)]的比率至少降低了五(5)倍，其中该类似物是任何核苷类似物。这种来自植物的胸苷激酶治疗癌症或其它哺乳动物异常细胞生长相关疾病或自杀系统比人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶更有效，后者是现有技术中用于这种目的的最有前景的酶。
本发明的第六个方面提供了编码来自植物的胸苷激酶的分离的突变和/或截短的多核苷酸，该胸苷激酶变异体，当与人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)相比并导入真核或细菌细胞时，降低至少一种核苷类似物的IC50至少四(4)倍。该突变和/或截短的胸苷激酶对核苷类似物的底物特异性提高和/或稳定性提高。
本发明的第七个方面提供了由本发明多核苷酸表达的胸苷激酶，或本发明突变(和/或截短)的多核苷酸表达的胸苷激酶。
本发明的第八个方面提供了来自阿拉伯芥(Arabidopsisthaliana)、松树(Pinus taeda)、番茄(Lycopersicum escuientum)或水稻(Oryza satiVa)的植物胸苷激酶。
本发明的第九个方面提供了包含本发明多核苷酸和与该多核苷酸可操作连接的启动子的载体构建体。
本发明的第十个方面提供了能够产生包含本发明载体的感染性病毒粒体的包装细胞系。
本发明的第十一个方面提供了包含本发明多核苷酸或本发明表达载体的宿主细胞。
本发明的第十二个方面提供了药物组合物，其包含本发明的植物胸苷激酶，本发明的多核苷酸，或本发明的包装细胞系，和药物可接受载体或稀释剂。
本发明的第十三个方面提供了使细胞对药物前体敏感的方法，该方法包括步骤(i)用促进所述药物前体转变成(细胞毒性)药物的植物胸苷激酶的编码多核苷酸序列转染或转导细胞，或将该植物胸苷激酶传递给细胞；和(ii)将药物前体传递给所述细胞；其中细胞对(细胞毒性)药物比对药物前体更敏感。
本发明的第十四个方面提供了抑制恒温动物的致病物质的方法，该方法包括给这种动物施用本发明的多核苷酸或本发明的载体。
本发明的第十五个方面涉及本发明的植物胸苷激酶在核苷或核苷类似物磷酸化中的应用。
本发明的第十六个方面提供了使核苷或核苷类似物磷酸化的方法，该方法包括步骤(i)使核苷或核苷类似物接受本发明的植物胸苷激酶的作用，和(ii)回收磷酸化的核苷或其核苷类似物。
本发明的第十七个方面涉及控制或改变植物生长的方法，其中植物包括包含编码本发明的植物胸苷激酶的多核苷酸的植物细胞，该方法包括使植物或植物细胞接触核苷或核苷类似物的步骤。
本发明更进一步的方面涉及含有核苷类似物和根据本发明的来自植物的胸苷激酶或编码所述来自植物的胸苷激酶的基因，或包含编码所述来自植物的胸苷激酶的所述基因的载体的产品，作为同时、分开或连续给药的治疗癌症的联合。
本发明更进一步的方面涉及本发明的胸苷激酶，编码所述胸苷激酶的基因和载体和表达所述胸苷激酶的宿主细胞的医疗用途。此外本发明涉及所述酶、基因、载体和细胞在制备治疗人类的异常细胞生长相关疾病的药物中的应用，尤其是其中所述疾病是癌症时的应用。
通过下列的详细说明和实施例，本发明的其它方面对于本领域技术人员来说将很明显。
发明详述植物胸苷激酶在其第一个方面，本发明提供了具有胸苷激酶(TK)酶活性的新蛋白，并且该蛋白来自植物。更特别地，该新的植物胸苷激酶来种子植物(Spermatophyta)，尤其是松树(Pinus taeda)、番茄(Lycopersicum esculentum)、水稻(Oryza sativa)，和/或阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)。
也惊奇地发现可以从拟南芥中分离到两种不同的胸苷激酶，这里记做AT-TK1a和AT-TK1b。
在本发明的上下文中，胸苷激酶是使用实施例3、表5所述试验能够将胸苷磷酸化但不能将嘌呤核苷磷酸化的酶。胸苷激酶可以是或可以不磷酸化脱氧胞苷。
本发明的胸苷激酶特别用于通过活化核苷类似物，尤其是ATZ来治疗异常细胞生长。
基于Clustal W(1.82)对番茄、松树和水稻胸苷激酶的多种氨基酸序列的比对，鉴定了三个基序和几个保守、半保守和较不保守残基，如下表1所示。在表1中，从水稻TK1第65个氨基酸残基开始比对，因为前64个氨基酸与其它胸苷激酶不能比对。
表1Clustal W(1.82)多氨基酸序列比对15 Rice-TK1---------- ---------- ---------- ---------- -MEAQPSYP- ---------- (008)Tomato-TK1 ---------- ---------- ---------- ---------- -MAFSSSARN PVDLRNGSKN (019)AT-TK1a ---------- ---------- ---------- ---------- -MATLKASFL IKTLDSDVTG (019)Pine-TK1---------- ---------- ---------- ---------- -MDDSGIYT- ---------- (008)AT-TK1b MRTLISPSLA PFSLHLHKPS LFSTALRFSF SINNITPTNS PPSTISTRKL QTKATRVTSS (060)20Rice-TK1---------- -GEIHVIVGP MFAGKTTALL RRVQVEAGTG RNVALIKSDK DNRYGLDSVV (057)Tomato-TK1 SFC------P VGEIHVIVGP MFAGKTTALL RRVNLESNDG RNVVLIKSSK DARYAVDAVV (073)AT-TK1a DFLSDLERRG SGAVHVIMGP MFSGKSTSLL RRIKSEISDG RSVAMLKSSK DTRYAKDSVV (079)Pine-TK1---------- SGEIHLILGP MFAGKTTALI RKMRAEIQMG RRVVLVKSDK DTRYGLNSVV (058)25 AT-TK1b SSSQPLSSSS PGEIHVVVGP MFSGKTTTLL RRILAERETG KRIAIIKSNK DTRYCTESIV (120)* :*:::** **:**:*:*: *:: * * : :.::**.* * ** :::*Rice-TK1THDGTKMPCW ALPELSSFQD KLGTEAYD-K VDVIGIDEAQ FFDDLHDFCC KAADRDGKIV (116)Tomato-TK1 THDGTRFPCW SLPDLSSFKQ RFGKDAYE-K VDVIGIDEAQ FFGDLYEFCC NAADFDGKII (132)30 AT-TK1a THDGIGFPCW ALPDLMSFPE KFGLDAYN-K LDVIGIDEAQ FFGDLYEFCC KVADDDGKIV (138)Pine-TK1SHDGAKMPCW AVADLASFKG KLGEEAYK-Q VDVIGIDEAQ FFKDLYSFCQ VAADRDGKIV (117)AT-TK1b THDGEKYPCW SLPDLSSFKE RFGFDDYENR LDVIGIDEAQ FFGDLYEFCR EAADKEGKTV (180):*** *** ::.:* ** ::* : *. : :********* ** **:.** .** :** :
-------- --35 Motif IRice-TK1VVAGLDGDYK RNKFGSVLDI IPLADSVTKL TARCELCGRR AFFTLRKTRE TKTELIGGAD (176)Tomato-TK1 VVAGLDGDYL RKSFGSVLDI IPLADTVTKL TARCELCNRR AFFTFRKTNE TETELIGGAD (192)AT-TK1a IVAGLDGDYL RRSFGAVLDI IPIADSVTKL TARCEVCGHK AFFTLRKNCD TRTELIGGAD (198)40 Pine-TK1IVAGLDGDYL RKSFGSALEL IPIADSVVKL KSRCELCGKA ASFTFRKTGE RKTEVVGGAD (177)AT-TK1b IVAGLDGDFM RRRFGSVLDL IPIADTVTKL TSRCEVCGKR ALFTMRKTEE KETELIGGAE (240):*******: *. **:.*:: **:**:*.** .:***:*.: * **:**. : .**::***:
------- ---- -------Motif IILid region45Rice-TK1VYMPVCRQHY LDGQIVIEAT RIVLD-LEKS KVIHAFK--- --- (212)Tomato-TK1 IYMPVCRQHY VNGQSVNESA KMVLE-SHKV SNELILESPL VDP (234)AT-TK1a VYMPVCRKHY ITNHIVIKAS KKVLEDSDKA RAESCVAATI --- (238)Pine-TK1IYMPVCRRHY VNGQIVIDTT RAVLE-SPEV QYDACAQATT TSG (219)50 AT-TK1b VYMPVCRSHY VCGQNVLETA RAVLD---SS NNHSVVASSL --- (277):****** ** : .: * .:: : **: .
-------Motif III-指基序(基序I、基序II和基序III)*指保守残基:指半保守残基.指较不保守残基因此，在优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶包含下列三个基序中的一个和多个Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe(基序I)Val Ala Gly Leu Asp Gly(基序II)Tyr Met Pro Val Cys Akg(基序III)在另一个优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶包含盖子(Lid)区域Val A1 Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4(盖子区域)，其中A1选自Thr和Val，A2选自Thr和Lys，A3选自Ala和Ser，和A4选自Leu和Val。
在更优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶包含表1中鉴定的所有保守残基。
多核苷酸的鉴定在另一个优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶包含SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11或SEQ ID NO13表示的氨基酸序列，或当测定时与全长SEQ ID具有至少30％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，仍更优选至少90％，还更优选至少95％同一性，最优选至少98％同一性的氨基酸序列。
在本发明的上下文中，“同一性”是氨基酸序列同源性程度的尺度。为了描述同一性，对目的序列进行比对，以获得最高级同源性(匹配)。基于这些一般原则，使用BLASTP算法[Tatiana A.Tatusova，ThomasL MaddenBlast 2 sequences-一种比较蛋白和核苷酸序列的新工具；FEMS Microbiol.Lett.1999 174 247-250]确定两个氨基酸序列的“同一性百分比”，它从国际生物技术信息中心(NCBI)网址可获得，并使用这里建议的缺省设置(即Matrix＝Blosum62；Open gap＝11；Extension gap＝1；Penalties gab x-dropoff＝50；Expect＝10；Word size＝3；Filter on)。BLAST算法确定两个比对序列之间重叠范围内的序列同一性百分比。为了本发明的目的，在至少50个氨基酸重叠范围内计算序列同一性百分比，更优选至少75个氨基酸，更优选至少100个氨基酸，该范围在缺省设置下由BLASTP计算。
表2提供了这个BLASTP比较结果。
表2不同植物来源的胸苷激酶的蛋白序列的BLASTP比较

被比较片段的同一性(％)/阳性(％)/长度松树(Pinus taeda)胸苷激酶番茄(Lycopersicum esculentum)胸苷激酶水稻(Oryza sativa)胸苷激酶阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)胸苷激酶(a)和(b)在优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶来自松树，并与SEQ IDNO2表示的序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的序列同一性。
在另一个优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶来自番茄，并与SEQ ID NO4或5表示的序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的序列同一性。
在第三个优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶来自水稻，并与SEQ ID NO7表示的序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的序列同一性。
在第四个优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶来自拟南芥，并与SEQ ID NO9或11表示的序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的序列同一性。
在第五个优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶来自拟南芥，并与SEQ ID NO13表示的序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的序列同一性。
多核苷酸变异体在最优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11或SEQ ID NO13表示的氨基酸序列，或其功能类似物。
在本发明的上下文中，术语“功能类似物”指具有胸苷激酶活性并且具有在一个或多个氨基酸位置与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11或SEQ ID NO13表示的序列不同的氨基酸序列的多肽(或蛋白)。这种类似物多肽包括包含保守取代、剪接变异体、同工型、来自其它物种的同源物的多肽，和多态性。
如这里定义，术语“保守取代”指一个氨基酸残基被另一个生物学类似的残基取代。保守取代的实例包括(i)非极性或疏水残基，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸彼此取代，尤其是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或脯氨酸彼此取代；或(ii)中性(不带电荷)的极性残基，如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或半胱氨酸彼此取代，尤其是精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺；或(iii)带正电荷残基，如赖氨酸、精氨酸或组氨酸彼此取代；或(iv)带负电荷残基，如天冬氨酸或谷氨酸彼此取代。
术语保守取代也包括使用取代的氨基酸残基代替亲本氨基酸残基，条件是对被取代多肽产生的抗体也与未取代多肽发生免疫反应。
这个初级氨基酸序列的修饰可以产生与未修饰副本多肽相比具有基本等同活性的蛋白，因此可以认为是亲本蛋白的功能类似物。这种修饰可以有意进行的，如通过定点诱导，或它们自发产生，并且包括剪接变异体、同工型、来自其它物种的同源物，和多态性。这种功能类似物也包括在本发明中。
C末端缺失本发明的另一个实施方案中提供了与亲本(野生型)酶相比，具有C末端缺失的植物胸苷激酶。这种截短的酶可以通过常规技术获得，如定点诱变，或如工作实施例所述。
根据本发明已经发现与野生型酶相比，C末端缺失产生了性能改善的酶，尤其是稳定性增加，和/或底物特异性增加。
在本发明的更优选实施方案中提供了具有大约1-60位氨基酸残基C末端缺失的胸苷激酶，优选1-50位氨基酸残基，更优选1-40位氨基酸残基，甚至更优选1-30位氨基酸残基，仍更优选1-26位氨基酸残基，最优选1-24位氨基酸残基。
在甚至更优选的实施方案中，本发明的植物胸苷激酶是来自番茄的胸苷激酶，具有26个氨基酸残基的C末端缺失。在最优选的实施方案中，本发明的植物胸苷激酶是具有SEQ ID NO5的氨基酸序列的胸苷激酶。
在仍更优选的实施方案中，本发明的植物胸苷激酶是来自拟南芥的胸苷激酶，具有24个氨基酸残基的C末端缺失。在最优选的实施方案中，本发明的植物胸苷激酶是具有SEQ ID NO11的氨基酸序列的胸苷激酶。
N末端缺失本发明也包括N末端缺失，尤其是AT-TK1b(SEQ ID NO13)N末端22个氨基酸的缺失和N末端45个氨基酸或N末端63个氨基酸的缺失。这些氨基酸组成了推定的细胞器信号肽。如实施例4(表8)所证明的，这些N末端氨基酸的缺失显著降低了AZT的LD100。
编码植物胸苷激酶的多核苷酸在另一个方面，本发明提供了编码来自松树、番茄、水稻或阿拉伯芥的植物胸苷激酶的分离的多核苷酸，优选上述那些植物胸苷激酶。
杂交方案在优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸能够与SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12表示的多核苷酸序列或其互补链杂交。
杂交应该在至少低严格条件下完成，但是优选在中等或高严格条件下。
确定核苷酸探针和同源的DNA或RNA序列分别在低、中或高严格条件下杂交的合适实验条件包括将含DNA片段或RNA的滤膜预先浸泡在5×SSC[氯化钠/柠檬酸钠；cf.Sambrook et al.；MolecularCloningA Laboratory Manual.2 Ed.，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY 1989]中杂交10分钟，并在5×SSC，5×Denhardt’s[cf.Sambrook et al.；Op cit.]，0.5％SDS和100μg/ml变性超声处理的鲑鱼精子DNA[cf.Sambrook et al.，；Op cit.]溶液中预杂交滤膜，随后在含10ng/ml浓度的随机引发的[Feinberg AP & Vogeisteln B；Anal.Biochem.1983 132 6-13]，32P-dCTP-标记的(特异活性＞1×109cpm/μg)探针的相同溶液中在大约45℃杂交12小时。
接着滤膜在2×SSC，0.5％SDS中，至少55℃的温度下(低严格条件)洗涤两次，更优选至少60℃(中等严格条件)，仍更优选至少65℃(中等/高严格条件)，甚至更优选至少70℃(高严格条件)，和仍更优选至少75℃(非常高严格条件)。
可以通过本领域已知的常规方法标记互补核酸或信号核酸来检测杂交的寡核苷酸的存在。检测最常用方法是使用如3H，125I，35S，14C，或32P-标记探针的放射自显影法，接着可以使用X线胶片检测探针。其它标记包括结合被标记抗体的配体、荧光团、化学发光剂、酶或抗体，它们接着可以用作被标记配体的特异性结合配对成员。
DNA序列的鉴定在另一个优选实施方案中，当由SEQ ID NO的全长序列确定时，本发明的分离的多核苷酸与SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、或SEQ ID NO12表示的多核苷酸序列具有至少73％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的同一性。为了本发明的目的，当BLASTN提供至少100个核苷酸的重叠范围时计算序列同一性百分比，该范围在缺省设置下确定。更优选重叠范围是至少150个核苷酸，更优选至少225个核苷酸，更优选至少300个核苷酸。
在本发明的上下文中，同一性是核苷酸序列同源程度的尺度。为了描述同一性，对目的序列进行比对，以获得最高级同一性(配对)。基于这些一般原则，使用BLASTN算法[Tatiana A.Tatusova，ThomasL MaddenBlast 2 sequences-一种比较蛋白和核苷酸序列的新工具；FEMS Microbiol.Lett.1999 174 247-250]确定两个氨基酸序列或两个核酸的“同一性百分比”，它从国际生物技术信息中心(NCBI)网址获得，并使用这里建议的缺省设置(即Reward for a match＝1；Penalty for a match＝-2；Strand option＝双链；Open gap＝5；Extension gap＝2；Penalties bap x_dropoff＝50；Expect＝10；Word size＝11；Filter on)。BLASTN算法确定两个比对核苷酸序列之间重叠范围内的序列同一性百分比。为了本发明的目的，在至少100个核苷酸的重叠范围内计算序列同一性百分比，该范围由缺省设置下BLASTN确定。更优选至少300个核苷酸的重叠范围。
表3提供了BLASTN比较结果。
表3不同植物来源的胸苷激酶的核苷酸序列的BLASTN比较

被比较片段的同一性(％)/长度*分成N和C末端片段◇没有显著相似性松树(Pinus taeda)胸苷激酶番茄(Lycopersicum esculentum)胸苷激酶水稻(Oryza sativa)胸苷激酶拟南芥胸苷激酶(a)和(b)类似的DNA序列在最优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10或SEQ ID NO12表示的多核苷酸序列或其功能类似物。
在本发明的上下文中，术语“功能类似物”覆盖保守修饰的多核苷酸，和编码功能等同的多肽的多核苷酸。
在本发明的上下文中，术语“保守修饰的多核苷酸”是指编码等同或基本等同的氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，指基本上等同的序列。
由于遗传密码子的简并性，很多功能等同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定为丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，它是一种保守修饰变异。这里编码多肽的每种核酸序列，也描述了该核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到核酸中每个密码子(除了AUG，通常仅是甲硫氨酸的密码子)可以被修饰而产生功能等同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异包括在每种所述序列中。
表达载体在第三个方面，本发明提供了包含本发明分离的多核苷酸和与该多核苷酸可操作连接的启动子的重组表达载体。
优选本发明的表达载体是适合在真核生物中进行表达的载体。
在更优选的实施方案中，本发明的表达载体是病毒载体，尤其是单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或牛痘病毒载体。
包装细胞系在第四个方面，本发明提供了能够产生传染性病毒粒体的包装细胞系，该细胞系包含本发明的载体。
包装细胞系是指含有产生感染性重组病毒所必需的而重组病毒载体中缺乏的那些元件的细胞，制备包装细胞系的方法是现有技术已知的。
宿主细胞在本发明的第五个方面提供了包含本发明分离的多核苷酸，或本发明的表达载体的分离的宿主细胞。
在优选实施方案中，本发明的宿主细胞是细菌细胞，优选真核细胞，尤其是哺乳动物细胞、人细胞、卵母细胞或酵母细胞。
在更优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是人细胞、狗细胞、猴细胞、大鼠细胞、猪细胞或小鼠细胞。
药物组合物本发明的第六个方面涉及新的药物组合物，包含治疗有效量的本发明的植物胸苷激酶，或本发明的宿主细胞，和药物可接受的载体或稀释剂。
为了治疗用途，本发明的植物胸苷激酶可以以任何方便形式给予。在优选实施方案中，本发明的植物胸苷激酶与一种或多种辅剂、赋形剂、载体和/或稀释剂一同制成药物组合物，并且使用本领域已知常规方法制备该药物组合物。
这种药物组合物可以包含本发明的植物胸苷激酶，或抗植物胸苷激酶的抗体。该组合物可以单独或与一种或多种其它试剂、药物或激素联合给予。
本发明的药物组合物可以通过任何合适途径给予，包括但不限于经口、静脉内、肌内、动脉内、骨髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、anteral、局部、舌下或直肠应用、口腔、阴道、眶内、脑内、颅内、脊柱内、心室内、脑池内、囊内、肺内、经粘膜或通过吸入。
可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences(MaackPublishing Co.，Easton，PA)的最近版本中找到制剂技术和给药的更多细节。
活性成分可以每天一次或几次剂量给予。目前认为的适当剂量在每次给药0.5ng至大约50μg/kg胸苷激酶/kg体重，和每天大约1.0ng/kg至大约100μg/kg。
给药剂量当然应该根据被治疗个体的年龄、体重和情况，以及给药途径、剂型和体质，和期望效果而小心调节，当然应该由医师确定确切剂量。
在进一步的实施方案中，本发明的植物胸苷激酶可以通过遗传传递而给予，使用如下在治疗方法中所述的细胞系和载体。
因此，在另一个优选实施方案中，本发明提供了药物组合物，包含本发明的多核苷酸，或本发明的载体，或本发明的包装细胞，或本发明的宿主细胞，和药物可接受载体或稀释剂。
为了产生这种治疗细胞系，本发明的多核苷酸可以插入表达载体，如质粒、病毒或其它表达载体，和可操作连接表达控制序列而使得在与表达控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
合适的表达控制序列包括启动子、增强子、翻译终止子、起始密码子、内含子的剪接信号，和终止密码子，它们全部包含在本发明多核苷酸的正确阅读框中，使得允许mRNA的正确翻译。表达控制序列也可以包括另外的成分，如引导序列和融合伙伴序列。
治疗方法本发明涉及的多核苷酸和蛋白、多肽、多肽片段或由它们产生的衍生物，以及直接针对这种蛋白、肽或衍生物的抗体可以用于治疗或减轻活体动物，包括人的病症或疾病，其中病症或疾病对细胞毒性试剂活性有反应。
该病症、或疾病尤其可以是癌症或病毒感染。
癌细胞是快速增生的细胞，具有侵犯和转移到邻近组织的能力并由此损害主要身体部分的功能而导致炎症病变和死亡。通常治疗是手术、放射和化疗，近来出现了新的治疗，即基因治疗。在基因指导的酶药物前体治疗(GDEPT)中，基因被传递给癌细胞，并在那里表达。相应的酶随后将给予的药物前体转变成活性形式，抑制细胞增生。GDEPT体系之一基于脱氧核苷激酶和不同的药物前体，核苷类似物。
本发明的多核苷酸尤其可以用作“自杀基因”，即药物易感基因。自杀基因转移给靶细胞使其对那些对正常细胞相对无毒的化合物或组合物敏感。
因此，在第七个方面，本发明提供了使靶细胞对药物前体敏感的方法，该方法包括步骤(i)用编码促进所述药物前体转变成(细胞毒性)药物的植物胸苷激酶的多核苷酸序列转染或转导靶细胞，或将该植物胸苷激酶传递给该细胞；和(ii)将所述药物前体传递给所述靶细胞；其中所述靶细胞对所述(细胞毒性)药物比对所述药物前体更敏感。
靶细胞可以是任何目的细胞，尤其是人细胞、狗细胞、猴细胞、大鼠细胞、猫细胞、猪细胞或小鼠细胞。优选靶细胞是人细胞。
在最宽泛方面，可以使用任何植物胸苷激酶。然而，在优选实施方案中，编码植物胸苷激酶的多核苷酸序列是本发明的多核苷酸序列。
在更优选实施方案中，药物前体是核苷类似物。
在本发明的上下文中，根据本发明使用的优选核苷类似物选自下组阿昔洛韦(9-[2-羟基-乙氧基-甲基-鸟苷]，布昔洛韦(9-(3，4-二羟基丁基)鸟嘌呤)，泛昔洛韦(2-[2-(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基]-1，3-丙二醇二乙酸酯)，更昔洛韦(9-[2-羟基-1-(羟基甲基)乙氧基-甲基]-鸟苷)，喷苷洛韦，valcidovir，三氟胸苷，AZT(3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷)，AIU(5′-碘-5′-氨基-2′，5′-二脱氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(阿糖胞苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖鸟嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖胸腺嘧啶，5-乙基-2′-脱氧尿苷，5-碘-5′-氨基-2，5′-双脱氧尿苷，1-[2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脱氧尿苷)，氟达拉滨(2-氟腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他滨，3′-脱氧腺苷(3-dA)，2′，3′-二脱氧肌苷(ddl)，2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)，2′，3′-双脱氧胸苷(ddT)，2′，3′-双脱氧腺苷(ddA)，2′，3′-双脱氧鸟苷(ddG)，2-氯-2′-脱氧腺苷(2CdA)，5-氟脱氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脱氧尿苷)，FIAU(1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2′-脱氧-3′-硫胞苷)，dFdC吉西他滨(2′，2′-双氟脱氧胞啶)，dFdG(2′，2′-双氟脱氧鸟苷)，5-氟脱氧尿苷(FdUrd)，d4T(2′，3′双脱氢-3′-脱氧胸苷)，ara-M.(6-甲氧基嘌呤阿拉伯核苷)，ludR(5-Jodo-2′脱氧尿苷)，CaFdA(2′-氯-2′-ara-氟-脱氧腺苷)，ara-U(1-β-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶)，FBVAU(E)-5-(2′-溴乙烯基)-1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖)尿嘧啶，FMAU1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖)-5-甲基尿嘧啶，FLT3′-氟-2′-脱氧胸苷，5-Br-dUrd 5-溴脱氧尿苷，5-C1-dUrd 5-氯脱氧尿苷或dFdU 2′，2′-双氟脱氧尿苷。
在优选的实施方案中，根据本发明应用的核苷类似物是AZT(3′-叠氮-3′-脱氧胸苷)。
本发明的胸苷激酶可以直接使用，通过如注射、植入或摄取药物组合物来治疗对胸苷激酶有反应的病理过程。
本发明的多核苷酸，包括其互补序列可以用于表达本发明的胸苷激酶。这个可以通过表达本发明的这种蛋白、肽或衍生物的细胞系，或通过编码本发明的这种蛋白、肽或衍生物的病毒载体，或通过表达这种蛋白、肽或衍生物的宿主细胞来完成。可以施用这些细胞、载体和组合物来治疗靶区域而影响对细胞毒性剂有反应的疾病过程。
合适的表达载体可以是来自单纯疱疹病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或痘病毒的病毒载体，或来自各种细菌产生的质粒，并可以用于将核苷酸序列体内传递给整个生物或靶器官、组织或细胞群。其它方法包括但不限于脂质体转染、电穿孔、用含核或其它定位信号的载体肽进行转染，和通过缓释系统的基因传递。通过使用细胞表面标记，如癌细胞特异性的标记来靶向具体细胞。使用细胞表面标记蛋白和载体构建体都可以靶向细胞。用只感染分裂细胞的逆转录病毒载体转导可以靶向分裂的细胞。
在本发明另一个方面，与本发明的核苷酸互补的“反义”核苷酸序列或其部分可以用于抑制或增强胸苷激酶表达。
另一个优选实施方案中，本发明提供了抑制恒温动物中的致病物质的方法，该方法包括将本发明的多核苷酸或本发明的表达载体给予所述动物的步骤。
在更优选的实施方案中，多核苷酸序列或表达载体体内施用。
在另一个优选实施方案中，致病物质是病毒、细菌或寄生虫，或甚至肿瘤细胞。
在另一个优选实施方案中，致病物质是自身反应性免疫细胞。
在甚至更优选实施方案中，该方法进一步包括将核苷类似物施用给所述恒温动物的步骤。
优选该核苷类似物选自上述的那些。
在最优选实施方案中，根据本发明使用的核苷类似物是AZT(3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷)。
自杀系统本发明编码胸苷激酶的基因的一个很重要用途是用于基于细胞和基因治疗的自杀系统。在哺乳动物的所有类型的细胞和基因治疗中，需要有能够不可逆杀灭移植细胞或通过基因治疗转导的细胞的系统。
主要有两种类型的基于细胞的治疗，它们都可受益于具有基于根据本发明的胸苷激酶的内部自杀系统。在替代细胞治疗中，裸细胞移植到受试者，替代已经不能在体内完成其功能的细胞，或取代死亡的细胞。一旦这些细胞被移植并完全整合到受试者体内，那么它们不容易通过手术方式除去。由于细胞具有内部自杀系统，其中本发明的胸苷激酶组成型或诱导型表达，通过给予个体治疗有效量的核苷类似物，如AZT可以杀灭所述细胞。如果移植的细胞开始以不受控制模式增生的话，可以施用核苷类似物。人们可能也希望终止治疗，仅仅因为不再需要替代细胞或因为通过一些其它途径做了进一步治疗。
其它类型的基于细胞的治疗包括治疗性细胞，该细胞移植到体内，在特定部位分泌如生长因子。通常这种治疗性细胞被胶囊包裹并可以相对容易地从体内再次除去，但是优选掺入自杀系统，因为可以不使用手术将细胞选择性杀灭，在体内基因治疗中，有与替代细胞治疗相同的考虑。自杀基因的掺入可以通过构建包含治疗基因和根据本发明的胸苷激酶的病毒载体来完成。在相同启动子的控制下优选插入治疗性基因和胸苷激酶，任选用IRES构建体分开它们。
在移植前移植细胞被条件性永生化的情况下，理论上存在移植后癌基因启动转录和因此移植细胞有致癌性的风险。控制这种情况的方法通过本发明可以得到。每当用诱导型启动子(如Tet开关系统，Mxl启动子等等)控制下的癌基因转导造成细胞永生时，胸苷激酶插入载体构建体，并处于相同启动子控制下(或使用IRES构建体)。这确保了每当癌基因转录时，胸苷激酶也被转录，并且通过给予核苷类似物如AZT可以选择性杀灭转导和致瘤细胞。
核苷磷酸化的方法可以发现本发明的胸苷激酶的不同应用，包括治疗和生物技术应用。
本发明第八个方面涉及本发明的植物胸苷激酶使核苷或核苷类似物磷酸化的用途。
在优选实施方案中，本发明提供了使核苷或核苷类似物磷酸化的方法，包括步骤i)使核苷或核苷类似物接受本发明的植物胸苷激酶的作用；和ii)回收磷酸化的核苷或核苷类似物。
尤其是，本发明的胸苷激酶可以用于将二脱氧鸟苷磷酸化。
遗传修饰的植物也可以发现本发明的胸苷激酶在改变或控制植物生长的方法中的应用。因此，在进一步的方面，本发明涉及控制或改变植物生长的方法，其中植物包含的植物细胞包含编码本发明的植物胸苷激酶的多核苷酸，该方法包括将植物或植物细胞接触核苷或核苷类似物，优选AZT的步骤。通过发现植物胸苷激酶迄今未知的性能，尤其是本发明描述的那些，发明人考虑使用核苷类似物作为除草剂。由于植物胸苷激酶以很高的速度将核苷类似物转变成毒性物质，因此核苷类似物可以用作一些植物的除草剂，这些植物天然或作为异源基因具有这些胸苷激酶。将本发明的胸苷激酶插入不含有具有这些性能的胸苷激酶的植物，提供了对核苷类似物易感的植物，尤其是对AZT易感的植物。
优选编码本发明植物胸苷激酶的多核苷酸是异源多核苷酸，并且优选接受本发明方法的植物是转基因植物。
因此，在进一步的方面，本发明提供了包含可表达的编码本发明植物胸苷激酶的异源核酸的转基因植物，其中异源核酸导入转基因植物，或该转基因植物的祖先。
转基因植物可以通过制备遗传修饰植物的已知技术获得，如通过将本发明的表达载体导入植物细胞。
任何植物胸苷激酶也可以被敲除和/或被其它胸苷激酶功能性取代，所述其它激酶不能转变某些核苷类似物(例如庄稼植物)。该核苷类似物接着可以用于杀灭这种遗传修饰的植物周围的杂草。
根据本发明获得的任何转化植物可以用在常规育种计划中或体外植物繁殖中以产生更多具有相同特征的转化植物和/或可以用于在其它各种相同或相关物种中导入相同特征。这种植物也是本发明的一部分。从转化的植物获得的种子含有相同的遗传特征并且也形成本发明的一部分。
附图简述参照附图进一步说明本发明，其中

图1显示了AT-TK1a(■)，AT-TKIb(●)和HSVI-TK( )分别在不同时间(0-120分钟)的dTMP激酶活性(CPM)；和图2显示了AT-TKIa(□)，AT-TKIb(○)和HSVI-TK(△)分别的AZT一磷酸激酶活性(CPM)(0-120分钟)。
实施例参照下列实施例进一步说明本发明，实施例不以任何方式限制权利要求所述的本发明的范围。
实施例1编码植物激酶的逆转录病毒载体的构建植物激酶的cDNA克隆进入基于Moloney小鼠白血病(MLV)病毒的逆转录病毒载体，产生含有TK1激酶的复制缺陷型重组逆转录病毒。
使用设计的侧翼带限制性酶切位点的引物，用Pfu聚合酶(Stratagene)扩增DNA片段。
用BamHI/XhoI切割基于AT-TKIa的拟南芥构建体，用BglII-XhoI切割番茄PCR片段，并克隆进入质粒载体pLCXSN的BglII-XhoI位点；pLCXSN是通过在多接头上游插入CMV启动子而衍生自pLXSN(Clontech，cat#K 1060-B)的逆转录病毒转移载体。
得到四个构建体AtTK1(PZG53)，AtTK1ΔC24(PZG56)，TomTKI(PZG69)和TomTKIΔC26(PZG59)。PLCXSN本身和含HSV1-TK的载体(克隆进BamHI/XhoI位点)用作对照。
使用Qiagen质粒试剂盒(QIAGEN)纯化质粒，DNA序列测定证实构建的质粒的DNA序列。
使用下列引物序列5′ccg ctc gag atg gcg act ctc aaa gct tcc ttt ttg 3′(ATTK1-正向；SEQ ID NO14)；5′cgc gga tcc tta gat tgt agc agc aac aca gga ttc 3′(ATTK1-反向；SEQ ID NO15)；5′cgc gga tcc tta aac aat atg att agt gat gta atg ctt g3′(AT TK1 DC；SEQ ID NO16)；5′gga aga tct tta gac aga ttg tcc att aac ata gtg ctg 3′(T TK1 DC；SEQ ID NO17)；5′gga aga tct tta tgg atc aac tag tgg tga ttc taa g 3′(TTK1-反向；SEQ ID NO18)；和5′ccg ctc gag atg gct ttt tca tca tct gct aga aac 3′(TTK1-正向；SEQ ID NO19)。
为了比较，也构建了人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)的表达载体。使用下列引物扩增人HSV1的胸苷激酶5′tat agg atc cgc cac cat ggc ttc gta ccc cgg c 3′(HSV1-TK-正向；SEQ ID NO20)；和5′tat act cga gga ggt cga ctc agt tag cc 3′(HSVI-TK-反向；SEQ ID NO21)；和使用Karreman[Karreman C Gene1998 218 57-62]所述的质粒pCMV-pacTK作为模板。
在OPTIMEM 1培养基(Life Technologies，Inc.)中于37℃培养293T包装细胞(ATTC CRL-11268)。使用LipofectAMlNE PLUS(LifeTechnology Inc.)，根据供应商提供的方案，使构建的pLCXSN质粒载体转染包装细胞。转染后48小时收集来自转染细胞的培养基，通过0.45mm滤器过滤，超速离心(50,000xg，90分钟，4℃)沉淀并溶于TEN缓冲液(100mM NaCI，10mM Tris pH7.5，1mM EDTA)。
含病毒的缓冲液随后用于转导MOI为5的癌细胞系。
细胞培养和逆转录病毒转导恶性胶质瘤U-87MG(ATCC HTB-14)，和恶性胶质瘤U-I18MG(ATCC HTB-15)细胞购自美国典型微生物保藏中心。所有细胞在含10％(v/v)澳大利亚来源的胎牛血清(Bio Whiftaker Cat.No.14-701)和1ml/l庆大霉素(Bio Whittaker Cat.No.17-518L)的必需培养基E-MEM M(Bio Whittaker Cat.No.12-611)中培养，细胞在含5％CO2气相的潮湿恒温箱中37℃生长。
用含混合了5μg/ml Polybrene的培养基的逆转录病毒转导细胞系，培养48小时，接着在200μg/ml geneticin(Life TechnologiesInc.)存在下持续培养3周。
细胞增生试验细胞以1500-2500个细胞/孔铺在聚L-赖氨酸包被的96孔板上。24小时后添加AZT(3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷；购自Sigma)，含该核苷类似物的培养基不变。
接触药物5天后，XTT试验(Roche)检测细胞存活。
每个试验实施四个平行测定。使用SigmaPlot(Dyrberg Trading，Karlslunde，DK)将检测化合物的IC50值计算为这些试验的平均值并根据表达式计算d1＝Max/(1+([I]/IC50))其中d1＝XTT试验确定的抑制剂浓度下的细胞生长；Max＝XTT试验确定的最大细胞生长；[I]＝抑制浓度；和IC50＝(50％生长抑制浓度)细胞生长被抑制50％的剂量。
对AZT敏感性增加的植物激酶的表达测定未转导细胞的敏感性，和单独用逆转录病毒或用含AZT的植物激酶的载体转导的细胞的敏感性。
接触药物5天后测定细胞毒性(IC50)。这个测定结果在表4中显示。
表4恶性胶质瘤细胞系对AZT(mM)的敏感性(IC50)显示了对于每个构建体和亲本细胞系引起50％致死率的浓度。敏感性增加的因素与亲本细胞系进行比较。

亲本细胞系和pLCXSN载体单独转导的细胞的敏感性差异小于1倍。表达植物激酶的两种恶性胶质瘤细胞系显示出对AZT的敏感性增加。测定表达番茄TK1的U-87MG细胞系的最高增加，与未转导细胞相比，IC50降低几乎240倍。
实施例2胸苷激酶的克隆这个实施例描述了如何鉴定本发明的番茄、松树、水稻和阿拉伯芥胸苷激酶的编码基因，和如何构建表达各种胸苷激酶的载体。
基于它们与人TK1的同源性，使用从NCBI网址获得的局域同源性检索工具(tBLASTn)和使用标准设置(即Filteron，Expect＝10，Wordsize＝3，Matrix＝Blosum62，Gap costs＝Existence 11 Extension1)鉴定了来自番茄的两个序列ACCN BE463259和ACCN BG129197(从Clemson University Genomics Institute获得，USA)，来自松树的序列ACCN AW755132(从Dr.Ross Whetten获得，North CarolinaState University，USA)和一个EST，与推定的水稻TK1(ACCNAF066050)具有同源性的ACCN D24903(从MAFF DNA Bank获得，1-2，2-chome，Kannondai，Tsukuba，Ibaraki 305-8602，日本)。
从来自质粒的引物开始，对插入物进行测序。随后基于最近获得的序列资料设计引物。
D24903中插入的序列与来自ACCN AU068889的序列信息组合预测了比AF066050中报道的蛋白长64个氨基酸的开放阅读框(ORF)。
番茄胸苷激酶使用下列引物用PCR扩增番茄胸苷激酶的ORF5′CGC GGA TCC ATG GCT TTT TCA TCA TCT GCT AGA AAC CCA GTTGAC CTG AG 3′(1MS TOTK1-B；SEQ ID NO22)；和5′CCG GAA TTC TTA TGG ATC AAC TAG TGG TGA TTC TAA G 3′(2MSTOTK1-E；SEQ ID NO23)；和使用含ACCN BG129197的质粒作为模板。
随后用EcoRI/BamHI切割PCR片段并连接进入也用EcoRI/BamHI切割的pGEX-2T载体(Amersham-Pharmacia)。所产生的质粒命名为pGEX-2T-TOM-TK1。
拟南芥胸苷激酶(AT-TK1 a)使用下列引物从cDNA文库(Stragene)扩增来自拟南芥(登录号AAF13097)的ORF5′CGC GGA TCC ATG GCG ACT CTC AAA GCT TCC TTT TTG ATC AAAACC C 3′(1msAtTK1-B；SEQ ID NO24)；和5′CCG GAA TTC TTA GAT TGT AGC AGC AAC ACA GGA TTC AGC 3′(2msAtTK1-E；SEQ ID NO25)。
随后EcoRI/BamHI切割PCR片段并连接进入也用EcoRI/BamHI切割的pGEX-2T载体(Amersham-Pharmacia)。所产生的质粒命名为pGEX-2T-AT-TK1a。
拟南芥胸苷激酶(AT-TK1 b)使用下列策略从cDNA文库(Stragene)扩增来自拟南芥(登录号BAB09824)的ORF，也产生了几个N末端缺失的AT-TK1b突变体。
使用下列引物从cDNA文库(Stratagene)扩增全长ORF(ACCNBAB09824)5′ATG AGA ACA TTA ATC TCA CCA TCT C 3′(1mtAtTK1L；SEQ IDNO26)；和5′CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC ACT ATG 3′(2mtAtTK1L；SEQID NO27)。
这个全长PCR产物用于扩增具有BamHI/EcoRI悬突的片段，使用引物5′CGC GGA TCC ATG AGA ACA TTA ATC TCA CCA TCT C 3′(1mtAtTK1L-B；SEQ ID NO28)；和
5′CCG GAA TTC CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC AC 3′(2mtAtTK1-E；SEQ ID NO29)。
随后用EcoRI/BamHI切割PCR片段并连接进入也用EcoRI/BamHI切割的pGEX-2T载体。所产生的质粒命名为pGEX-2T-AT-TK1 b(P661)。
进行类似的N末端缺失并连接进入pGEX-2T。使用下列引物完成22个氨基酸的N末端缺失，5′CGC GGA TCC TCC ACC GCT CTT CGC TTC TCC 3′(1mtAtTK1 I-B；SEQ ID NO30)；和2mtAtTK1-E(SEQ ID NO29)。所得质粒命名为pGEX-2T-AT-ΔN22TK1 b(P662)。
使用下列引物完成45个氨基酸的N末端缺失5′CGC GGA TCC TCC ACC AGA AAG CTA CAA ACG 3′(1mtAtTK1-B；SEQID NO31)；和2mtAtTK1-E(SEQ ID NO29)。所得质粒命名为pGEX-2T-AT-ΔN45TKI b(P663)。
使用下列引物完成63个氨基酸的N末端缺失5′CGC GGA TCC CAG CCG CTC TCC TCC TCA TC 3′(1mtATTK1S-B；SEQ ID NO32)；和2mtAtTK1-E(SEQ ID NO29)。
所得质粒命名为pGEX-2T-AT-ΔN63TK1 b(P664)。
水稻胸苷激酶使用引物5′CGG GAT CCG GCG GCG GCG GCG GAC AAG TCT CG 3′(losTK1s-B；SEQ ID NO33)；和5′CGG AAT TCT TAC TTG AAA GCATGG ATA ACC TTG G 3′(2osTK1-E；SEQ ID NO34)；和使用D24903作为模板扩增来自水稻的胸苷激酶。
随后用EcoRI/BamHI切割PCR片段并连接进入也用EcoRI/BamHI切割的pGEX-2T载体(购自Amersham-Pharmacia)。所产生的质粒命名为pGEX-2T-水稻-TK1。
HSV1胸苷激酶(用作对照)
使用引物5′CGC GGA TCC ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT C 3′(HSV1-正向A；SEQ ID NO35)；和5′CCG GAA TTC TTA GTT AGC CTC CCC CATCTC CCG 3′(HSV1-反向；SEQ ID NO36)；和使用Karreman[KarremanC；Gene 1998 218 57-62]所述的质粒pCMV-pacTK作为模板扩增来自HSV1的胸苷激酶。
随后EcoRI/BamHI切割PCR片段并连接进入也用EcoRI/BamHI切割的pGEX-2T载体(Amersham-Pharmacia)。所产生的质粒命名为pGEX-2T-HSV1-TK。
实施例3重组胸苷激酶的表达和纯化这个实施例描述了为了表达胸苷激酶，用根据实施例2获得的质粒转化KY895。
用常规技术，如Sambrook et al.[Sambrook et al.；MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，ColdSpring Harbor，NY 1989)所述用实施例2的表达质粒转化KY895细胞。
转化的KY895在LB/氨苄青霉素(100μg/ml)的培养基中37℃生长至0.5-0.6的OD600nm，添加IPTG至100μM诱导蛋白表达。细胞进一步在25℃生长4小时，随后离心收集。细胞沉淀在结合缓冲液A(20mM NaPO4pH7，3；150mM NaCI；10％甘油；和0.1％Triton X-100)中，于蛋白酶抑制剂混合物(来自Roche Dignostics完全不含EDTA)存在下接受超声处理。
测定提取物将100μM固定浓度的脱氧核苷的四种天然脱氧核苷磷酸化的能力。每个提取物的最高特异活性设置为100％。在(括号)给出了mU/mg表示的相对于100％的特异活性。
表5提供了这些评估的结果。
表5用0.1mM IPTG于25℃诱导4小时，KY895细胞提取物中脱氧核苷激酶活性

n.d.指“不能检测到”这个表中的数据表明所有酶是胸苷激酶。提取物10,000×g离心30分钟、过滤并填入柱中。其后两个1ml谷胱苷肽-Sepharose柱(购自Pharmacia)混合并在结合缓冲液A中平衡。加载样品后，用40ml结合缓冲液A洗涤柱。随后用含5ml 10mM ATP/MgCl2的A洗涤柱并在室温孵育1小时，接着4℃孵育30分钟。用10ml结合缓冲液A洗涤除去ATP/MgCl2。
通过凝血酶切割，根据制造商的方案(Pharmacia)在GST结合柱上从TK切割GST-tag蛋白。
如Munch-Petersen et al.[Munch-Petersen B，Knecht W，LenzC，S φ ndergaard L，Piskur JFunctional expression of amultisubstrate deoxy ribonucleoside kinase from Drosophilamelanogaster and its C-terminal deletion mutants；J.Biol.Chem.2000 275 6673-6679]所述确定纯化TK的动力学常数。
使用Michaelis-Menten等式v＝Vmax x[S]/(Km+[S])或Hill-等式v＝Vmax x[S]h/(K0.5h+[S]h)，如Knecht et al.[Knecht W，Berg]ohann U，Gonski S，Kirschbaum B & Lffler MFunctionalexpression of a fragment of human dihydroorotate dehydrogenaseby means of the baculovirus expression vector system and kineticinvestigation of the purified recombinant enzyme；Eur.J.Biochem.1996 240 292-301]所述，非线性回归分析估计动力学数据。Km是米氏常数，K0.5定义底物浓度[S]的值，此时v＝0.5Vmax和h是Hill系数[Cornish-Bowden AFundamentals of enzyme kinetics；Portland Press Ltd.，London，1995，pp.33；and Liebecg CIUBMBBiochemical nomenclature and related documents；Portland PressLtd.，London，1992]。
表6速度和底物浓度之间的关系Thd重组(r)植物激酶

*数据来自Le Breton CIn-vitro study of novel deoxy-ribonucleoside kinases for gene therapy；B.Sc.Report，2002，University of Paris VII/Technical University of Denmark。
*数据来自Kokoris M S和Black M ECharacterization ofHerpes Simplex Virus type I thymidine kinase mutants engineeredfor improved ganciclovir or acyclovir activity；Protein Science2002 11 2267-2272.。
表7速度和底物浓度之间的关系AZT重组植物激酶

表6和7证明了植物TK磷酸化AZT比对Thd更有效，它与rHSV1-TK形成对照，后者磷酸化Thd比对AZT更有效。番茄、拟南芥和HSV1-TK的[kcat/Km(Thd)]/[Kcat/Km(AZT)]比率如下rTOM-TK1 1.07rAT-ΔN45TK1b 0.06rAT-TK1a 0.08rHSV1-TK 72.7实施例4转化的大肠杆菌KY895在核苷类似物板上的生长这个实施例描述了用根据实施例2获得的质粒转化的宿主细胞能够在核苷类似物AZT(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷)存在的板上生长。
如Knecht et al.[Knecht，W.，Munch-Petersen，B. & Piskur，J.Identification of residues involved in the specificity andregulation of the highly efficient multisubstrate deoxy-ribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster，J.Mol.Biol.2000 301 827-837]所述实施该实验。
表8KY895细胞在AZT存在下的生长

pGEX-2T是载体并可从Amersham-Pharmacia获得；pGEX-2T-Dm-dNK是含有编码来自果蝇(Drosophila melanogaster)的多底物脱氧核苷激酶的基因的载体，如Munch-Petersen et al.[Munch-Petersen B，Knecht W，Lenz C，Sφndergaard L，Piskur JFunctional expression of a multisubstrate deoxyribonucleosidekinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletionmutants；J.Biol.Chem.2000 275 6673-6679]所述；pGEX-2T-Bm-dNK是含有编码来自蚕(Bombyx mori)的脱氧核苷激酶基因的载体，如Knecht et al.[Knecht W，Ebert Petersen G，Munch-Petersen B，Piskur Jdeoxyribonucleoside kinasesbelonging to the thymidine kinase 2(TK2)-like group varysignificantly in substrate specificity，kinetics and feed-backregulation；J.Mol.Biol.2002 315 529-540]所述；pGEX-2T-huTK1是含有编码人胸苷激酶(TK1)基因的载体，如Berenstein et al.[Berenstein D，Christensen J F，KristensenT，Hofbauer R，Munch-Petersen BValine，not methionine，isanvine acid 106 in human cytosolic thymidine kinase(TKI).Impact on oligomerization，stability，and kinetic properties；J.Biol.Chem.2000 275(41)32187-32192]所述。
表8表明当与核苷类似物AZT组合确定时，来自番茄的胸苷激酶是最有效的激酶。这个酶的活性大约是来自单纯疱疹的酶活性的30倍。
实施例5检测TK选择板上的TK活性这个实施例描述了使用实施例2描述的质粒转化的KY895细胞确定胸苷激酶活性。
如Knecht et al.[Knecht，W，Munch-Petersen，B.& Piskur，J.Identification of residues involved in the specificity andregulation of the highly efficient multisubstrate deoxy-ribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster，J.Mol.Biol.2000 301 827-837]所述实施胸苷激酶活性的检测。
pGEX-2T是从Amersham-Pharmacia获得的载体，用作对照。
来自果蝇Drosophila melanogaster(pGEX-2T-Dm-dNK)的多底物脱氧核苷激酶用作对照，其根据Munch-Petersen et al.[Munch-Petersen B，Knecht W，Lenz C，Sφndergaard L，PiSkur JFunctional expression of a multisubstrate deoxy-ribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and itsC-terminal deletion mutants；J.Biol.Chem.2000 275 6673-6679]获得的。
表9TK选择板上的生长

+生长-不生长n.d.未确定这个实施例证明了所有酶能够将胸苷磷酸化。
实施例6核苷一磷酸酯磷酸化成为核苷二磷酸酯通过确定胸苷激酶催化反应的产物检测一磷酸酯激酶活性，基本上如Munch-Petersen etal.；J.Biol.Chem.1998 273 7 3926-3931所述。
简言之，每分钟催化30nmol胸苷转变成胸苷一磷酸(30mU)的酶量在含50mM Tris-HCI，pH8.0(22℃)；2.5mM MgCI2；2.5mM ATP；10mM二硫苏糖醇；0.5mM CHAPS；3mg/ml牛血清白蛋白和100μM3H-标记的底物(1.8Ci/mmol)的100μl混合物中孵育。
5μl反应混合物的样品与5μl 5mM胸苷、TMP、TDP和TTP混合。5μl这种混合物铺在聚氮丙啶-纤维素板上，以0.5M LiCl2上升显影。在UV光下鉴定带有核苷和核苷酸的斑点并切割下来。
用含0.2M KCl的0.1M HCl提取斑点的放射性并用液体闪烁计数仪确定。1pmol放射性核苷/核苷酸计算850cpm。
如实施例3所述进行重组胸苷激酶的表达和纯化。
这个实验的结果在图1和2中表示。确定2.5μl反应混合物得到的TDP斑点在指定时间(分别15，30，60，90和120分钟)获得的cpm。如所期望的，HSV1-TK将两种底物都磷酸化，但是AZT-一磷酸酯底物磷酸化的程度比胸苷底物低10倍。然而令人惊奇的是，植物TK1酶能够将AZT-一磷酸磷酸化，尽管它们不能够磷酸化TMP。以前从未报道过胸苷激酶的这个新性质。
序列表<110>Knecht，WolfgangMunch-Petersen，BirgittePiskur，Jure<120>植物胸苷激酶及其用途<130>504-204-WO<150>DK PA 2002 00794<151>2002-05-23<150>DK PA 2003 00178<151>2003-02-07<160>36<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>660<212>DNA<213>火炬松(Pinus taeda)<220>
<221>CDS<222>(1)..(660)<223>
<400>1atg gat gac tcg ggt atc tac aca agt gga gaa att cat ctt atc ttg 48Met Asp Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Ser Gly Glu Ile His Leu Ile Leu1 5 10 15ggg cct atg ttc gcg ggc aag acg act gcc ctt att cgt aaa atg cga 96Gly Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Thr Ala Leu Ile Arg Lys Met Arg20 25 30gca gaa att caa atg ggc aga aga gtg gtg ctt gtg aaa tct gac aag 144Ala Glu Ile Gln Met Gly Arg Arg Val Val Leu Val Lys Ser Asp Lys35 40 45gat aca aga tat ggg ctg aac tca gtt gtg tct cat gat ggt gca aaa 192Asp Thr Arg Tyr Gly Leu Asn Ser Val Val Ser His Asp Gly Ala Lys50 55 60atg cct tgc tgg gct gtt gca gat ctt gca tct ttc aaa ggc aaa tta 240Met Pro Cys Trp Ala Val Ala Asp Leu Ala Ser Phe Lys Gly Lys Leu65 70 75 80gga gag gag gct tac aag cag gta gat gtg atc ggc att gat gaa gca 288Gly Glu Glu Ala Tyr Lys Gln Val Asp Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala85 90 95
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Asp Gly Lys Ile Val Ile Val Ala Gly Leu Asp Gly Asp Tyr Leu Arg115 120 125Lys Ser Phe Gly Ser Ala Leu Glu Leu Ile Pro Ile Ala Asp Ser Val130 135 140Val Lys Leu Lys Ser Arg Cys Glu Leu Cys Gly Lys Ala Ala Ser Phe145 150 155 160Thr Phe Arg Lys Thr Gly Glu Arg Lys Thr Glu Val Val Gly Gly Ala165 170 175Asp Ile Tyr Met Pro Val Cys Arg Arg His Tyr Val Asn Gly Gln Ile180 185 190Val Ile Asp Thr Thr Arg Ala Val Leu Glu Ser Pro Glu Val Gln Tyr195 200 205Asp Ala Cys Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ser Gly210 215<210>3<211>705<212>DNA<213>番茄(Lycoperiscon esculentum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(705)<223>
<400>3atg gct ttt tca tca tct gct aga aac cca gtt gac ctg aga aat gga 48Met Ala Phe Ser Ser Ser Ala Arg Asn Pro Val Asp Leu Arg Asn Gly1 5 10 15tcg aag aac agt ttt tgt ccg gtg ggt gaa ata cat gta att gtt ggt 96Ser Lys Asn Ser Phe Cys Pro Val Gly Glu Ile His Val Ile Val Gly20 25 30cct atg ttt gct gga aaa acc act gct ctt ctt cgc cgg gtc aat ttg 144Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Thr Ala Leu Leu Arg Arg Val Asn Leu35 40 45gaa tcc aac gat ggg aga aat gtg gta ctg att aag tca agt aaa gat 192Glu Ser Asn Asp Gly Arg Asn Val Val Leu Ile Lys Ser Ser Lys Asp50 55 60gca aga tat gct gta gat gca gtg gtg aca cat gat ggg aca aga ttt 240Ala Arg Tyr Ala Val Asp Ala Val Val Thr His Asp Gly Thr Arg Phe65 70 75 80cca tgt tgg tca ttg ccg gat ctt tca tct ttc aag cag aga ttt gga 288Pro Cys Trp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Ser Phe Lys Gln Arg Phe Gly85 90 95
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Ser Phe Gly Ser Val Leu Asp Ile Ile Pro Leu Ala Asp Thr Val Thr145 150 155 160Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Leu Cys Asn Arg Arg Ala Phe Phe Thr165 170 175Phe Arg Lys Thr Asn Glu Thr Glu Thr Glu Leu Ile Gly Gly Ala Asp180 185 190Ile Tyr Met Pro Val Cys Arg Gln His Tyr Val Asn Gly Gln Ser Val195 200 205<210>6<211>831<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220>
<221>CDS<222>(1)..(831)<223>
<400>6atg agc tcc att tgc gcc atg aga tcc ctc ctc gcc gcc tcc acc ttc 48Met Ser Ser Ile Cys Ala Met Arg Ser Leu Leu Ala Ala Ser Thr Phe1 5 10 15ctc cgc tcc ggc gct tcc cct ctg ctg cgg ccc ctt tcc cgt cct ctc 96Leu Arg Ser Gly Ala Ser Pro Leu Leu Arg Pro Leu Ser Arg Pro Leu20 25 30cct tcc cgc ctg aat ctt tcc cga ttc ggt ccg gtg agg ccg gtc tct 144Pro Ser Arg Leu Asn Leu Ser Arg Phe Gly Pro Val Arg Pro Val Ser35 40 45gcg gcg gcg gcg gcg gcg gac aag tct cga ggc gga ggc ggc tcc gcg 192Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala50 55 60atg gag gcc cag ccg tcg tat ccc ggt gag att cac gtc atc gtg ggc 240Met Glu Ala Gln Pro Ser Tyr Pro Gly Glu Ile His Val Ile Val Gly65 70 75 80ccc atg ttc gcc ggg aag acc act gcc ctt ctc cga cgc gtg cag gtc 288Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Thr Ala Leu Leu Arg Arg Val Gln Val85 90 95gag gcc ggc act ggc agg aac gtg gca ctc atc aag tct gac aag gac 336Glu Ala Gly Thr Gly Arg Asn Val Ala Leu Ile Lys Ser Asp Lys Asp100 105 110aat agg tat gga ttg gat tct gtc gta act cat gat ggc aca aag atg 384Asn Arg Tyr Gly Leu Asp Ser Val Val Thr His Asp Gly Thr Lys Met115 120 125
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<221>CDS<222>(1)..(717)<223>
<400>8atg gcg act ctc aaa gct tcc ttt ttg atc aaa acc ctc gac agt gac 48Met Ala Thr Leu Lys Ala Ser Phe Leu Ile Lys Thr Leu Asp Ser Asp1 5 10 15
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<400>9Met Ala Thr Leu Lys Ala Ser Phe Leu Ile Lys Thr Leu Asp Ser Asp1 5 10 15Val Thr Gly Asp Phe Leu Ser Asp Leu Glu Arg Arg Gly Ser Gly Ala20 25 30Val His Val Ile Met Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys Ser Thr Ser Leu35 40 45Leu Arg Arg Ile Lys Ser Glu Ile Ser Asp Gly Arg Ser Val Ala Met50 55 60Leu Lys Ser Ser Lys Asp Thr Arg Tyr Ala Lys Asp Ser Val Val Thr65 70 75 80His Asp Gly Ile Gly Phe Pro Cys Trp Ala Leu Pro Asp Leu Met Ser85 90 95Phe Pro Glu Lys Phe Gly Leu Asp Ala Tyr Asn Lys Leu Asp Val Ile100 105 110Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Cys115 120 125Lys Val Ala Asp Asp Asp Gly Lys Ile Val Ile Val Ala Gly Leu Asp130 135 140Gly Asp Tyr Leu Arg Arg Ser Phe Gly Ala Val Leu Asp Ile Ile Pro145 150 155 160Ile Ala Asp Ser Val Thr Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Val Cys Gly165 170 175His Lys Ala Phe Phe Thr Leu Arg Lys Asn Cys Asp Thr Arg Thr Glu180 185 190Leu Ile Gly Gly Ala Asp Val Tyr Met Pro Val Cys Arg Lys His Tyr195 200 205Ile Thr Asn His Ile Val Ile Lys Ala Ser Lys Lys Val Leu Glu Asp210 215 220Ser Asp Lys Ala Arg Ala Glu Ser Cys Val Ala Ala Thr Ile225 230 235<210>10<211>645<212>DNA<213>拟南芥<220>
<221>CDS<222>(1)..(645)<223>
<400>10atg gcg act ctc aaa gct tcc ttt ttg atc aaa acc ctc gac agt gac 48Met Ala Thr Leu Lys Ala Ser Phe Leu Ile Lys Thr Leu Asp Ser Asp1 5 10 15gtc acc gga gat ttt ctc tcc gat ctg gaa cgt cgt ggg tca ggt gct 96Val Thr Gly Asp Phe Leu Ser Asp Leu Glu Arg Arg Gly Ser Gly Ala20 25 30gtt cat gtt atc atg ggt cct atg ttt tct ggg aaa tcg acc tct ctc 144Val His Val Ile Met Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys Ser Thr Ser Leu35 40 45ctt cgc cga atc aag tca gag atc agc gac gga aga agt gtt gcg atg 192Leu Arg Arg Ile Lys Ser Glu Ile Ser Asp Gly Arg Ser Val Ala Met50 55 60ctg aaa tcg agt aag gat acg aga tac gca aaa gat tcg gtg gtg aca 240Leu Lys Ser Ser Lys Asp Thr Arg Tyr Ala Lys Asp Ser Val Val Thr65 70 75 80cat gat gga att gga ttc cct tgc tgg gct ctt cca gat ctc atg tca 288His Asp Gly Ile Gly Phe Pro Cys Trp Ala Leu Pro Asp Leu Met Ser85 90 95ttt cct gag aaa ttc gga cta gat gct tat aac aag ctt gat gtg att 336Phe Pro Glu Lys Phe Gly Leu Asp Ala Tyr Asn Lys Leu Asp Val Ile100 105 110ggt att gat gag gct cag ttc ttt gga gat ctt tat gag ttt tgc tgc 384Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Cys115 120 125aaa gtc gct gat gat gat ggt aaa att gtg atc gtt gct ggc cta gat 432Lys Val Ala Asp Asp Asp Gly Lys Ile Val Ile Val Ala Gly Leu Asp130 135 140ggt gac tat tta agg agg agt ttt ggg gct gta ctt gac att ata cca 480Gly Asp Tyr Leu Arg Arg Ser Phe Gly Ala Val Leu Asp Ile Ile Pro145 150 155 160ata gct gat tct gtg act aag cta act gca agg tgt gag gtc tgt gga 528Ile Ala Asp Ser Val Thr Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Val Cys Gly165 170 175cat aaa gct ttc ttc act tta aga aag aat tgt gac acc aga act gag 576His Lys Ala Phe Phe Thr Leu Arg Lys Asn Cys Asp Thr Arg Thr Glu180 185 190ctt att ggt gga gct gat gtc tat atg cct gtt tgt cgc aag cat tac 624Leu Ile Gly Gly Ala Asp Val Tyr Met Pro Val Cys Arg Lys His Tyr195 200 205atc act aat cat att gtt taa 645Ile Thr Asn His Ile Val210<210>11<211>214<212>PRT
<213>拟南芥<400>11Met Ala Thr Leu Lys Ala Ser Phe Leu Ile Lys Thr Leu Asp Ser Asp1 5 10 15Val Thr Gly Asp Phe Leu Ser Asp Leu Glu Arg Arg Gly Ser Gly Ala20 25 30Val His Val Ile Met Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys Ser Thr Ser Leu35 40 45Leu Arg Arg Ile Lys Ser Glu Ile Ser Asp Gly Arg Ser Val Ala Met50 55 60Leu Lys Ser Ser Lys Asp Thr Arg Tyr Ala Lys Asp Ser Val Val Thr65 70 75 80His Asp Gly Ile Gly Phe Pro Cys Trp Ala Leu Pro Asp Leu Met Ser85 90 95Phe Pro Glu Lys Phe Gly Leu Asp Ala Tyr Asn Lys Leu Asp Val Ile100 105 110Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Cys115 120 125Lys Val Ala Asp Asp Asp Gly Lys Ile Val Ile Val Ala Gly Leu Asp130 135 140Gly Asp Tyr Leu Arg Arg Ser Phe Gly Ala Val Leu Asp Ile Ile Pro145 150 155 160Ile Ala Asp Ser Val Thr Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Val Cys Gly165 170 175His Lys Ala Phe Phe Thr Leu Arg Lys Asn Cys Asp Thr Arg Thr Glu180 185 190Leu Ile Gly Gly Ala Asp Val Tyr Met Pro Val Cys Arg Lys His Tyr195 200 205Ile Thr Asn His Ile Val210<210>12<211>834<212>DNA<213>拟南芥<220>
<221>CDS<222>(1)..(834)<223>
<400>12atg aga aca tta atc tca cca tct ctt gct ccc ttc tct ctt cat ctc 48Met Arg Thr Leu Ile Ser Pro Ser Leu Ala Pro Phe Ser Leu His Leu1 5 10 15cat aaa ccc tct ctc ttc tcc acc gct ctt cgc ttc tcc ttc tca atc 96His Lys Pro Ser Leu Phe Ser Thr Ala Leu Arg Phe Ser Phe Ser Ile20 25 30aac aac ata acc ccc aca aat tca cct cct tcc acc att tcc acc aga 144Asn Asn Ile Thr Pro Thr Asn Ser Pro Pro Ser Thr Ile Ser Thr Arg35 40 45aag cta caa acg aaa gcg acg agg gta aca tca tca tca tca tct cag 192Lys Leu Gln Thr Lys Ala Thr Arg Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Gln50 55 60ccg ctc tcc tcc tca tct ccc ggc gaa atc cac gtc gta gtc ggt cca 240Pro Leu Ser Ser Ser Ser Pro Gly Glu Ile His Val Val Val Gly Pro65 70 75 80atg ttc tcc ggt aaa aca aca aca ctt ctc cgc cgt ata ctc gcc gaa 288Met Phe Ser Gly Lys Thr Thr Thr Leu Leu Arg Arg Ile Leu Ala Glu85 90 95aga gaa acc ggt aaa aga atc gca atc atc aaa tcc aac aaa gac aca 336Arg Glu Thr Gly Lys Arg Ile Ala Ile Ile Lys Ser Asn Lys Asp Thr100 105 110aga tac tgc acc gaa tca ata gtt act cac gac ggt gag aaa tac cct 384Arg Tyr Cys Thr Glu Ser Ile Val Thr His Asp Gly Glu Lys Tyr Pro115 120 125tgc tgg tca ctc ccc gat ctc tcg tcc ttc aaa gag aga ttc gga ttc 432Cys Trp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Phe Gly Phe130 135 140gac gac tac gag aat cga tta gat gtg att gga atc gac gaa gct caa 480Asp Asp Tyr Glu Asn Arg Leu Asp Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln145 150 155 160ttc ttc gga gat ctt tac gag ttt tgc cgt gaa gct gct gat aaa gag 528Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Arg Glu Ala Ala Asp Lys Glu165 170 175ggt aaa act gta att gtt gct gga ttg gat ggt gat ttt atg agg agg 576Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Gly Leu Asp Gly Asp Phe Met Arg Arg180 185 190agg ttt ggt tcg gtt ctt gat ttg att ccg att gcg gat acg gtt acg 624Arg Phe Gly Ser Val Leu Asp Leu Ile Pro Ile Ala Asp Thr Val Thr195 200 205aag ctg acg tca cgg tgt gag gtt tgt ggg aag aga gct ttg ttt acg 672Lys Leu Thr Ser Arg Cys Glu Val Cys Gly Lys Arg Ala Leu Phe Thr210 215 220atg agg aag acg gag gag aaa gag acg gag ttg atc ggt ggt gct gaa 720Met Arg Lys Thr Glu Glu Lys Glu Thr Glu Leu Ile Gly Gly Ala Glu225 230 235 240gtt tat atg cct gtg tgt agg agt cat tac gtt tgc ggt caa aac gtt 768Val Tyr Met Pro Val Cys Arg Ser His Tyr Val Cys Gly Gln Asn Val245 250 255
ttg gaa acc gct cgt gcc gtt ttg gat tca agc aat aat cat agt gtt 816Leu Glu Thr Ala Arg Ala Val Leu Asp Ser Ser Asn Asn His Ser Val260 265 270gta gca agt tca ctt tag 834Val Ala Ser Ser Leu275<210>13<211>277<212>PRT<213>拟南芥<400>13Met Arg Thr Leu Ile Ser Pro Ser Leu Ala Pro Phe Ser Leu His Leu1 5 10 15His Lys Pro Ser Leu Phe Ser Thr Ala Leu Arg Phe Ser Phe Ser Ile20 25 30Asn Asn Ile Thr Pro Thr Asn Ser Pro Pro Ser Thr Ile Ser Thr Arg35 40 45Lys Leu Gln Thr Lys Ala Thr Arg Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Gln50 55 60Pro Leu Ser Ser Ser Ser Pro Gly Glu Ile His Val Val Val Gly Pro65 70 75 80Met Phe Ser Gly Lys Thr Thr Thr Leu Leu Arg Arg Ile Leu Ala Glu85 90 95Arg Glu Thr Gly Lys Arg Ile Ala Ile Ile Lys Ser Asn Lys Asp Thr100 105 110Arg Tyr Cys Thr Glu Ser Ile Val Thr His Asp Gly Glu Lys Tyr Pro115 120 125Cys Trp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Phe Gly Phe130 135 140Asp Asp Tyr Glu Asn Arg Leu Asp Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln145 150 155 160Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Arg Glu Ala Ala Asp Lys Glu165 170 175Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Gly Leu Asp Gly Asp Phe Met Arg Arg180 185 190Arg Phe Gly Ser Val Leu Asp Leu Ile Pro Ile Ala Asp Thr Val Thr195 200 205Lys Leu Thr Ser Arg Cys Glu Val Cys Gly Lys Arg Ala Leu Phe Thr210 215 220Met Arg Lys Thr Glu Glu Lys Glu Thr Glu Leu Ile Gly Gly Ala Glu225 230 235 240
Val Tyr Met Pro Val Cys Arg Ser His Tyr Val Cys Gly Gln Asn Val245 250 255Leu Glu Thr Ala Arg Ala Val Leu Asp Ser Ser Asn Asn His Ser Val260 265 270Val Ala Ser Ser Leu275<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物<400>27ctaaagtgaa cttgctacaa cactatg27<210>28<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物
<400>28cgcggatcca tgagaacatt aatctcacca tctc34<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>29ccggaattcc taaagtgaac ttgctacaac ac 32<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>30cgcggatcct ccaccgctct tcgcttctcc 30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>PCR引物<400>32cgcggatccc agccgctctc ctcctcatc 29<210>33<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>33cgggatccgg cggcggcggc ggacaagtct cg 32<210>34<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>34cggaattctt acttgaaagc atggataacc ttgg34<210>35<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>35cgcggatcca tggcttcgta ccccggccat c 31<210>36<211>33<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>36ccggaattct tagttagcct cccccatctc ccg 3权利要求
1.种编码来自植物的植物胸苷激酶的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自下组i)编码来自松树(Pinus taeda)、水稻(Oryza sativa)或番茄(Lycopersicum esculentum)胸苷激酶的分离的多核苷酸，ii)编码来自植物的胸苷激酶的分离的多核苷酸，其中该胸苷激酶当与人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)比较并转导入真核细胞时，使至少一种核苷类似物的IC50降低至少四(4)倍，iii)编码来自植物的胸苷激酶的分离的多核苷酸，其中该胸苷激酶能够以比对胸苷一磷酸酯更高的程度磷酸化至少一种核苷类似物的一磷酸酯，iv)编码来自植物的胸苷激酶的分离的多核苷酸，其中该胸苷激酶具有小于二(2)的[kcat/Km(Thd)]/[kcat/Km(至少一种核苷类似物)]的比率，v)编码来自植物的胸苷激酶的分离的多核苷酸，其中该胸苷激酶，当被表达并与人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)相比时，[kcat/Km(Thd)]/[kcat/Km(至少一种核苷类似物)]的比率降低至少五(5)倍，其中该类似物是任何核苷类似物，和vi)编码来自植物的胸苷激酶变异体的分离的突变和/或截短的多核苷酸，其中该胸苷激酶变异体，当与人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)相比并转导入真核细胞时，使至少一种核苷类似物的IC50降低至少四(4)倍。
2.权利要求1的多核苷酸，其编码的胸苷激酶来自阿拉伯芥(拟南芥属)。
3.权利要求1的多核苷酸，其中至少一种核苷类似物一磷酸酯是AZT一磷酸酯和/或其中至少一种核苷类似物是AZT。
4.权利要求1的分离的多核苷酸，它能够在至少中等严格条件下与SEQ ID NO1、SEQ ID NO3，或SEQ ID NO6的多核苷酸序列或其互补链杂交。
5.权利要求4的分离的多核苷酸，其中当由其全长序列确定时，它与SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6表示的多核苷酸序列具有至少73％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的同一性。
6.权利要求1-5任一项的分离的多核苷酸，包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6表示的多核苷酸序列或其功能类似物。
7.一种选自下组的分离的植物胸苷激酶i)权利要求1-6任一项的多核苷酸编码的分离的胸苷激酶，ii)来自松树(Pinus taeda)、番茄(Lycopersicumesculentum)或水稻(Oryza sativa)的分离的植物胸苷激酶，iii)分离的植物胸苷激酶，其中该胸苷激酶当在真核细胞中与人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)比较时，使至少一种核苷类似物的IC50降低至少四(4)倍，iv)分离的胸苷激酶，来自植物，其中该胸苷激酶能够以比对胸苷一磷酸酯更高的程度磷酸化至少一种核苷类似物一磷酸酯，v)来自植物的分离的胸苷激酶，其中该胸苷激酶具有低于二(2)的[kcat/Km(Thd)]/[kcat/Km(至少一种核苷类似物)]的比率，vi)来自植物的分离的胸苷激酶，其中该胸苷激酶，当被表达并与人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)相比时，[kcat/Km(Thd)]/[kcat/Km(至少一种核苷类似物)]的比率降低至少五(5)倍，其中类似物是任何核苷类似物，和vii)来自植物的分离的突变和/或截短的胸苷激酶变异体，其中该胸苷激酶变异体，当与人单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)相比并转导入真核细胞时，使至少一种核苷类似物的IC50降低至少四(4)倍。
8.权利要求7的分离的胸苷激酶，其来自阿拉伯芥(拟南芥属)。
9.权利要求7的植物胸苷激酶，其中至少一种核苷类似物一磷酸酯是AZT一磷酸酯和/或其中至少一种核苷类似物是AZT。
10.权利要求7-9任一项的植物胸苷激酶，包含一种或多种下列三个基序/区域Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala GIn Phe Phe(基序I)Val Ala Gly Leu Asp Gly(基序II)Tyr Met Pro Val Cys Arg(基序III)Val Al Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4(盖子区域)，其中Al选自Thr和Val，A2选自Thr和Lys，A3选自Ala和Ser，和A4选自Leu和Val。
11.权利要求7-10任一项的植物胸苷激酶，包含表1鉴定的所有保守残基。
12.权利要求7-11任一项的植物胸苷激酶，包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ IDNO11或SEQ ID NO13的氨基酸序列，或当由其全长确定时，与这些序列中任何一条具有至少70％，优选至少80％，甚至更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％同一性的氨基酸序列。
13.权利要求7-12任一项的植物胸苷激酶，包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ IDNO11或SEQ ID NO13的氨基酸序列或其功能类似物。
14.权利要求7-13任一项的植物胸苷激酶，在大约第1-60位氨基酸残基具有C末端缺失，优选1-50位氨基酸残基，更优选1-40位氨基酸残基，甚至更优选1-30位氨基酸残基，仍更优选1-26位氨基酸残基，最优选1-24位氨基酸残基。
15.权利要求14的植物胸苷激酶，其为来自番茄的胸苷激酶并且具有26个氨基酸残基的C末端缺失(具有SEQ ID NO5的氨基酸序列)。
16.权利要求14的植物胸苷激酶，其为来自阿拉伯芥的胸苷激酶并且具有24个氨基酸残基的C末端缺失(具有SEQ ID NO11的氨基酸序列)。
17.权利要求7-16任一项的植物胸苷激酶，其来自松树，并且该酶显示与SEQ ID NO2表示的氨基酸序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的同一性。
18.权利要求7-16任一项的植物胸苷激酶，其来自番茄，并且该酶显示与SEQ ID NO4表示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的同一性。
19.权利要求7-16任一项的植物胸苷激酶，其来自水稻，并且该酶显示与SEQ ID NO7表示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的同一性。
20.权利要求7-16任一项的植物胸苷激酶，其来自阿拉伯芥，并且该酶显示与SEQ ID NO9表示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的同一性。
21.权利要求7-16任一项的植物胸苷激酶，其来自阿拉伯芥，并且该酶显示与SEQ ID NO11表示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的同一性。
22.权利要求7-16任一项的植物胸苷激酶，其来自阿拉伯芥，并且该酶显示与SEQ ID NO13表示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，仍更优选至少95％，最优选至少98％的同一性。
23.权利要求7-22任一项的植物胸苷激酶，其与来自人单纯疱疹病毒1型的胸苷激酶(HSV1-TK)的胸苷激酶的作用相比，使至少一种核苷类似物的致死量(LD100)降低至少三(3)倍。
24.种载体构建体，含有权利要求1-6任一项的多核苷酸和与该多核苷酸可操作地连接的启动子。
25.权利要求24的载体构建体，其为病毒载体，尤其是单纯疱疹病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，慢病毒载体，逆转录病毒载体或痘病毒载体。
26.能够产生感染性病毒粒体的包装细胞系，包含权利要求24-25之任一项的载体。
27.包含权利要求1-6任一项的多核苷酸或权利要求24-25之任一项的载体的宿主细胞。
28.权利要求27的宿主细胞，它是人细胞、狗细胞、猴细胞、大鼠细胞或小鼠细胞。
29.一种药物组合物，包含权利要求7-23任一项的植物胸苷激酶，和药物可接受的载体或稀释剂。
30.一种药物组合物，包含权利要求1-6任一项的多核苷酸，或权利要求24-25之任一项的载体，和药物可接受的载体或稀释剂。
31.一种药物组合物，包含权利要求26的包装细胞系，或权利要求27或28的宿主细胞，和药物可接受的载体或稀释剂。
32.一种使细胞对前提药物敏感的方法，该方法包括步骤i)用促进所述药物前体转变成(细胞毒性)药物的植物胸苷激酶的编码多核苷酸序列转染或转导所述细胞；和ii)将所述药物前体传递给所述细胞；其中所述细胞对所述(细胞毒性)药物比对所述药物前体更敏感。
33.权利要求32的方法，其中编码植物胸苷激酶的多核苷酸序列是权利要求1-6任一项的多核苷酸序列。
34.权利要求32-33之任一项的方法，其中药物前体是核苷类似物。
35.权利要求34的方法，其中核苷类似物是AZT(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷)。
36.一种抑制恒温动物中的致病物质的方法，该方法包括给所述动物施用权利要求1-6任一项的多核苷酸或权利要求24-25之任一项的载体。
37.权利要求36的方法，其中所述多核苷酸序列或所述载体体内施用。
38.权利要求36或37的方法，其中所述的致病物质是病毒、细菌或寄生虫。
39.权利要求36或37的方法，其中所述的致病物质是肿瘤细胞。
40.权利要求36或37的方法，其中所述的致病物质是自身反应性免疫细胞。
41.权利要求36-40中任一项的方法，进一步包括将核苷类似物给予所述恒温动物的步骤。
42.权利要求41的方法，其中所述核苷类似物是AZT(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷)。
43.权利要求7-23任一项的植物胸苷激酶使核苷或核苷类似物磷酸化的用途。
44.一种使核苷或核苷类似物磷酸化的方法，包括步骤i)使核苷或核苷类似物接受权利要求7-23任一项的植物胸苷激酶的作用，和ii)回收磷酸化的核苷或核苷类似物。
45.一种控制或改变植物生长的方法，其中植物包含其中包含编码权利要求7-23任一项的植物胸苷激酶的多核苷酸的植物细胞，该方法包括使该植物或植物细胞接触核苷或核苷类似物的步骤。
46.在癌症治疗中作为同时、分开或连续施用组合的产品，其含有核苷类似物和根据权利要求7-23的胸苷激酶，或编码所述来自植物的胸苷激酶的基因，或包含编码所述来自植物的胸苷激酶的所述基因的载体。
全文摘要
本发明涉及新的植物胸苷激酶及其在基因治疗中的应用。更特别地，本发明提供了来自番茄、松树、水稻或阿拉伯芥(thale cress)的新的胸苷激酶。在更多方面，本发明提供了编码植物胸苷激酶的新的多核苷酸，含有该多核苷酸的载体构建体，携带该多核苷酸或载体的宿主细胞，使细胞对药物前体敏感的方法，抑制恒温动物中的致病物质的方法，生物控制植物的方法，合成一磷酸酯的方法和包含本发明的植物胸苷激酶的药物组合物。在优选实施方案中，本发明提供了植物胸苷激酶和核苷类似物AZT独特组合以治疗异常细胞生长。
文档编号C12N9/12GK1662647SQ03813842
公开日2005年8月31日 申请日期2003年5月21日 优先权日2002年5月23日
发明者沃尔夫冈·克内希特, 比吉特·芒克－彼得森, 尤雷·皮斯克 申请人:沃尔夫冈·克内希特, 比吉特·芒克－彼得森, 尤雷·皮斯克