专利名称：半胱氨酸天冬氨酸酶9的激活及其应用的制作方法
技术领域：
本发明广义上涉及分子医学和药物筛选试验，并且更具体地涉及有关程序性细胞死亡调节中的相互作用以及鉴定改变这种相互作用的药物的方法。
背景技术：
在从C.elegans到人的多细胞机体中，细胞凋亡或程序性细胞死亡是细胞生命周期的关键性判定点。在正常的胚胎形成和发育、体内平衡维护、和免疫系统功能中，它是一个重要的生命历程。细胞凋亡的调节和启动是一个错综复杂的调节过程，这与该功能的多样性相一致。已经发现，死亡区域超家族是传导死亡信号所需的相互作用的主要介体。该超家族由死亡区域(DD)、死亡效应区域(DED)和半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)募集区域(CARD)家族组成。这些家族中的每一个成员均通过形成专有的CARD-CARD、DD-DD和DED-DED连接的同型互作方式而与其它蛋白相互作用。
半胱氨酸天冬氨酸酶，和效应物半胱氨酸天冬氨酸酶切割必需蛋白例如聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、和活化核酸内切酶例如CAD(由抑制剂ICAD裂解)一起，是细胞凋亡的主要执行者。上游半胱氨酸天冬氨酸酶，例如半胱氨酸天冬氨酸酶8和9，分别被诸如死亡诱导信号复合物(DISC)和细胞凋亡物(apoptosome)的信号复合物激活。半胱氨酸天冬氨酸酶通过CARD或DED区域结合到特异性衔接分子，导致半胱氨酸天冬氨酸酶自动激活。例如，由Apaf-1、半胱氨酸天冬氨酸酶9和细胞色素C组成细胞凋亡物，在该结构内，Apaf-1通过CARD-CARD互作而与半胱氨酸天冬氨酸酶9前体(procaspase 9)相互作用。结合于Apaf-1的细胞色素C激活该复合物，从而使半胱氨酸天冬氨酸酶9前体得到募集和自动激活。可能该复合物含有多个Apaf-1和半胱氨酸天冬氨酸酶9前体，因为该激活复合物具有700kDa的分子量。
细胞凋亡物(apoptosome)，还有Fas DISC和含有Pelle的复合物均是与细胞凋亡相关的大型调节复合物的实例。这些复合物中的蛋白由多个区域组成，例如蛋白-蛋白相互作用基元、激酶区域、蛋白分解区域、配体结合区域和膜结合区域。死亡区域总是提供分子内通讯手段中的一种。见C.H.Weber和C.Vincenz的综述，“The death domain superfamilya tale of two interfaces？”Trendsin Biochemical Sciences，Vol.26 No.8，2001。
半胱氨酸天冬氨酸酶9是蛋白酶中的天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(ASCP)家族的一员，其包括，例如，ICE，CPP32，Nedd2/Ich-1，Mch2，Mch3，Mch4，Mch5，TX(ICH-2，ICErel-II)，和ICErel-III。
半胱氨酸天冬氨酸酶9与几种ASCPs氨基酸序列同源，但是其催化部位QACGG与其它已知ACSPs中的相对保守的催化部位相比，在第四个残基处有所不同。美国专利号6,271,361，其公开了半胱氨酸天冬氨酸酶9的DNA和氨基酸序列，在此全文引入以供参考。
象许多ASCP一样，半胱氨酸天冬氨酸酶9以酶原的形式被合成，其能被诸如CPP32或粒酶B进行蛋白切割。切割后的半胱氨酸天冬氨酸酶9产生两个亚基，一个大亚基和一个小亚基，两者联合形成一个活性异二聚体复合物。具体的，CPP32可以把半胱氨酸天冬氨酸酶9前体切割为一个具有约37kDa(p37)分子量的大亚基和一个约10kDa(p10)分子量的小亚基。类似地，粒酶B可以把半胱氨酸天冬氨酸酶9前体切割为一个具有约35kDa(p35)分子量的大亚基和一个约12kDa(p12)分子量的小亚基。此外，该细胞凋亡途径的其它成份能把半胱氨酸天冬氨酸酶9加工为一个较大切割产物和一个较小切割产物。相应地，术语“大亚基”和“小亚基”分别指任何较大蛋白切割产物，例如p37或p35，和任何较小切割产物，例如p10或p12，这是很容易理解的。
象其它ASCP一样，该活性半胱氨酸天冬氨酸酶9复合物能够充当蛋白酶，并且需要在该底物结合部位的P1位置有一个Asp残基，和在P1′位置有一个小的优选为疏水的残基。
细胞凋亡在众多病理状况中扮演着重要角色，有的是抑制了程序性细胞死亡，从而增加了细胞存活时间，有的是促进了程序性细胞死亡，从而导致细胞活力丧失。由细胞存活时间增加引起的病理状况实例包括癌症，例如淋巴瘤、恶性肿瘤和激素依赖性肿瘤。这种激素依赖性肿瘤包括，例如，乳癌，前列腺癌和卵巢癌。细胞存活增加时间或细胞凋亡抑制还可导致自身免疫疾病，例如系统性红斑狼疮和免疫介导的肾小球肾炎，以及病毒感染诸如疱疹病毒、痘病毒和腺病毒。被确定的与细胞死亡途径有关的第一个基因，bcl-2基因，在癌细胞中被鉴定，并且显示其通过降低表达该基因的细胞进行细胞凋亡的发生概率来起作用。
相反，细胞凋亡疾病，其中促进了程序性细胞死亡是一个普遍病因，一般包括，例如，衰退紊乱诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病，肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑衰退，和与获得性免疫缺损病(AIDS)有关的脑病。由于成年人的神经细胞一般不分裂，故无法得到新细胞来替换垂死细胞，这种疾病中发生的神经细胞死亡导致遭受该疾病的病人状态逐渐恶化。与促进了细胞凋亡有关的其它疾病包括，例如，脊髓发育不良综合征，诸如再生障碍性贫血和局部缺血性损伤，包括心肌梗死，中风和再灌注损伤。
半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制剂包括那些抑制蛋白酶活性的试剂以及抑制半胱氨酸天冬氨酸酶9与其它多肽结合的化合物。此类化合物作为药物用于治疗或预防具有细胞凋亡特征的疾病。当在本发明中应用时，半胱氨酸天冬氨酸酶9多肽可用来筛选那些激活或作为半胱氨酸天冬氨酸酶9激动剂的化合物，激活方式如通过诱导酶原切割为活性亚基。此类化合物同样能够用作药物来治疗或预防具有细胞凋亡缺失特征的疾病。
发明概述本申请涉及鉴定能够调节半胱氨酸天冬氨酸酶9活性的化合物的方法。
附图简述
图1A显示在pH7.2时半胱氨酸天冬氨酸酶1对底物DEVD(SEQ ID NO1)、IETD(SEQ ID NO2)、LEED(SEQ ID NO3)、WEHD(SEQ ID NO4)、LEHD(SEQ ID NO5)和VEID(SEQ ID NO6)中的特异性。图1B显示pH7.2时半胱氨酸天冬氨酸酶2的底物特异性。图1C显示pH7.2时半胱氨酸天冬氨酸酶3的底物特异性。图1D显示pH7.2时半胱氨酸天冬氨酸酶6的底物特异性。图1E显示pH7.2时半胱氨酸天冬氨酸酶7的底物特异性。图1F显示pH7.2时半胱氨酸天冬氨酸酶8的底物特异性。图1G显示pH7.2时半胱氨酸天冬氨酸酶9的底物特异性。图1H显示pH7.2时半胱氨酸天冬氨酸酶10的底物特异性。
图2显示相对于半胱氨酸天冬氨酸酶各种类型，AFC的释放速率。
图3显示在含有Hofmeister系列Na盐的缓冲液中，LEHD(SEQ ID NO5)被半胱氨酸天冬氨酸酶9裂解的相对速率。
图4A到4C显示Hofmeister盐对于半胱氨酸天冬氨酸酶家庭成员的选择性。图4A显示在不同量的硫酸铵中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。图4B显示在不同量的硫酸铵中半胱氨酸天冬氨酸酶3的活性。
图4C显示在不同量的磷酸钠中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。
图5A显示30U酶、100uM Ac-LEHD-AFC(SEQ ID NO5)中，在不同浓度的柠檬酸钠盐中，半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。图5B显示30U酶、100uM Ac-LEHD-AFC(SEQ ID NO5)中，在不同磷酸钠盐和钾盐溶液中，半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。图5C显示在不同浓度的CsCl和LiCl中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。图5D显示在不同浓度的Mg(SO4)、Ca(SO4)、MgCl2和CaCl2中，半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。
发明详述半胱氨酸天冬氨酸酶9是一种由多组分装配而成的具有蛋白分解活性的细胞凋亡物(Renatus等，(2001)Dimer formation drives the activation of the deathprotease Caspase9，PNAS98，14250-14255)。该复合物调控发育中神经系统的组织体系，并且调控那些被环境应力或配体-受体激活损伤而无法恢复的细胞的去除。象半胱氨酸天冬氨酸酶家族的其它成员一样，半胱氨酸天冬氨酸酶9在细胞中处于潜伏形态，但是有一点不同于其它成员，简单的蛋白分解过程不足以使之激活。对于这样一种1百万道尔顿的复合物，为了完全使之转化为催化形式，需要其与激活形式的APAF-1的结合。纯化复合物的每个成员以及在体外将它们装配起来是非常困难的，这导致很难获得对半胱氨酸天冬氨酸酶9活化机制在结构上的了解，或设计出该种蛋白酶，使之用于筛选发现特异性调节剂。本发明通过提供一种简单而方面的在体外增强半胱氨酸天冬氨酸酶9活性的方法，而使特异性调节剂的筛选，包括高通量筛选成为可能。
以下的Hofmeister系列是根据它们沉淀母鸡蛋清蛋白混合物的能力而排列的各种离子等级。
阴离子SCN-＞NO3-＞Cl-＞柠檬酸盐＞醋酸根-＞磷酸盐＞SO42-阳离子Ca2+＞Mg2+＞Na+＝K+＞NH4+＞N(CH3)4+已经表明，Hofmeister系列盐具有非常广泛的用途，包括在生物大分子的构建或变性上显示出的分级能力。近年来，通常使用Hofmeister系列在离子方面的能力，用之稳定蛋白结构。在冻干酶的盐诱导激活研究中发现了类似的能力(Ru等人，On the salt-induced activation of lyophilized enzymes in organicsolventsEffect of salt kosmotropicity on enzyme activity，J.Am.Chem.Soc.，122(2000)1565-1571)。阴离子和阳离子的离子强度与它们的水合强度呈相反关系。
该系列中的相关位置(主要相应于水合强度)应被认为仅作预示，因为随着蛋白质、pH和温度不同，呈现明确阳离子特异效果的醋酸根离子会有变化。离子破坏水天然的氢键合网，具有与增加温度或压强相似的效果；例如粘度降低。用等效渗透压力已经成功估算出离子的这种效果。具有最大该效果的离子(同水自身相比，与水之间呈现较弱的相互作用)被称为结构破坏剂(structure-breakers)或chaotropes，而具有相反效果的离子被称为结构形成剂(structure-makers)或kosmotropes(与水分子呈现强相互作用)。
当在硫酸铵中制备半胱氨酸天冬氨酸酶9样品时，发现底物蛋白迅速转变为小肽，这表明该溶液中蛋白酶解作用显著增强。本申请在不限制普遍机制，也不限制组成和方法的情况下，发明人假定，硫酸铵的溶解增强了水溶液极性，从而导致由于低聚或构象变化引起半胱氨酸天冬氨酸酶9的结构改变，这种改变伴随着酶的激活。已知许多病毒蛋白酶是被水构成的Hofmeister系列阴离子(Kosmotropic试剂)所活化(Cacace，M.，Landau，E.和Ramsden，J.(1997)，The Hofmeister seriessalt and solvent effects on interfacial phenomena，Quart.Rev.of Biophysics30，241-277)。例如，负责病毒衣壳成熟的单纯疱疹病毒1蛋白酶显示，在1M柠檬酸钠中活性增加了860倍(Hall，D.和Darke，P.(1995)，Activation of the Herpes Simplex virus type 1 protease，JBC270，22697-22700)。用该盐进行处理被认为是模拟了活性蛋白的天然微环境，在细胞核中，该酶可能处于高浓度聚阴离子环境中。
通过调节蛋白酶所处的溶剂状态来模拟细胞凋亡物半胱氨酸天冬氨酸酶9的激活过程，从而产生了一种简单的体外筛选发现该酶抑制剂的方法。
用kosmotropic试剂激活半胱氨酸天冬氨酸酶9是令人惊讶的，这不仅体现在激活程度方面，而且体现在半胱氨酸天冬氨酸酶9被完全活化的事实方面。在本发明之前，没理由相信kosmotropic盐会活化半胱氨酸天冬氨酸酶9。用kosmotropic盐活化其它半胱氨酸天冬氨酸酶的失败，如实施例4中描写的半胱氨酸天冬氨酸酶3，更加说明了上述事实。
半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制剂可用于治疗或减弱具有程序性细胞死亡增强特征的疾病的严重度。利用此处所描述的半胱氨酸天冬氨酸酶9激活试验，可以对多种化合物进行筛选，从中发现那些抑制或增强半胱氨酸天冬氨酸酶9蛋白酶活性表达的化合物。此类筛选方法为本领域普通技术人员所知。此类抑制分子可以是那些合成的或天然产生的化合物库中的分子。
半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制剂包括，例如，通过竞争型或非竞争性型机理结合并钝化半胱氨酸天冬氨酸酶9蛋白酶活性的小分子和有机化合物，抑制将无活性的半胱氨酸天冬氨酸酶9前体转化为活性半胱氨酸天冬氨酸酶9蛋白酶的抑制剂，或其它间接抑制半胱氨酸天冬氨酸酶9途径的分子。此类半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制剂可包括，例如，自杀抑制剂，抗半胱氨酸天冬氨酸酶9抗体和蛋白，小肽类蛋白酶抑制剂，或小的非肽类有机分子抑制剂。此类抑制剂的具体实例包括底物类似物，如四肽DEVD-CHO(SEQ ID NO1)(Asp-Glu-Val-Asp-乙醛)，荧光标记的四肽如DEVD-AMC(SEQ ID NO1)(Asp-Glu-Val-Asp-氨甲基香豆素)，YVAD-AMC(SEQ ID NO7)(Tyr-Val-Ala-Asp-氨甲基香豆素)，ZEVD-AMC(苄氧羰基-Glu-Val-Asp-氨甲基香豆素)和牛痘病毒蛋白交叉反应物质A。另一个具体实例包括噬菌体展示肽库，其中大于108的肽序列可在单轮淘选中进行筛选(美国专利号6,121,416)。将半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制剂配制到培养基中，该培养基能够将抑制剂引入到预定细胞类型中，或者可将半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制剂附于目标配体，通过细胞介导的内吞作用和其它受体介导的作用，将其引入。
半胱氨酸天冬氨酸酶9底物拮抗剂可用于治疗或减弱由程序性细胞死亡增强引起的疾病的严重度。此类底物拮抗剂能够结合半胱氨酸天冬氨酸酶9并抑制半胱氨酸天冬氨酸酶9的切割能力。底物切割的抑制阻止了程序性细胞死亡的关键过程。底物拮抗剂包括，例如，配体和小分子化合物。
半胱氨酸天冬氨酸酶9抑制剂还可用本发明的半胱氨酸天冬氨酸酶9编码核酸和半胱氨酸天冬氨酸酶9多肽进行鉴定，例如，通过结合试验，诸如ELISA或RIA，或者通过使用四肽底物的酶试验，诸如香豆素标记的DEVD-AMC(SEQID NO1)和YVAD-AMC(SEQ ID NO7)。DEVD-AMC(SEQ ID NO1)和YVAD-AMC(SEQ ID NO7)分别代表聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和IL-1βP1-P4底物四肽的切割位点(Nicholson等，Nature 37637-43(1995))。
用于此类试验的半胱氨酸天冬氨酸酶9多肽可以通过，例如，体外翻译、重组表达或生化过程，来获得。此类方法和其它方法在本领域中是已知的。例如，通过将半胱氨酸天冬氨酸酶9cDNA克隆到诸如pET21b的细菌表达载体里，可以表达重组半胱氨酸天冬氨酸酶9(Novagen Inc.，Madison，Wis.)。接着，使用本领域普通技术人员所知的常规分子生物学方法表达和纯化半胱氨酸天冬氨酸酶9。使用连续的荧光试验，纯化的重组半胱氨酸天冬氨酸酶9蛋白可用于测量诸如DEVD-AMC(SEQ ID NO1)和YVAD-AMC(SEQ ID NO7)等各种底物的水解速率。
测量半胱氨酸天冬氨酸酶活性的众多方法是本领域中已知的，包括用半胱氨酸天冬氨酸酶的荧光底物、酶活性试验、免疫印迹法和亲和标记，如在CurrentProtocols in Cell Biology，第18章中所描述的，该章节在此全文引入以供参考。在本发明之前，这些方法不能用于半胱氨酸天冬氨酸酶9，因为在体外它的活性水平很低。
一旦用此处公开的方法激活了半胱氨酸天冬氨酸酶9，其活性可以用荧光试验来定量。在一个实施方案中，使用了7-氨基-三氟甲基香豆素(AFC)。当AFC从诸如Ac-LEHD-AFC(SEQ ID NO5)的肽上被切割下来时，由于它不再被乙酰基(Ac)保护基团抑制，AFC会发出荧光。AFC激发波长是400nm，其荧光波长是505nm。当肽完整时，该荧光被肽氨基末端所存在的Ac(乙酰基)保护基团所抑制，因为这两个基团在距离上非常接近。半胱氨酸天冬氨酸酶9在D(天冬氨酸)后进行切割，并且释放出AFC基团，之后AFC基团就不再被保护基团所抑制了。
除半胱氨酸天冬氨酸酶9之外的其它半胱氨酸天冬氨酸酶的高流量筛选是本领域中已知的。例如，Smith等人筛选出了半胱氨酸天冬氨酸酶8(Expression，preparation and high-throughput screening of Caspase-8discovery of redox-based andsteroid diacid inhibition，Arch Biochem Biophys，2002年3月15日；399(2)195-205，在此全文引入以作参考)，其中筛选过程如下构建半胱氨酸天冬氨酸酶8的大肠杆菌表达构建体，其中His标记序列插入半胱氨酸天冬氨酸酶8的5′端第217个密码子。该菌株产生大量可溶的、His标记的、31kDa非活性单链酶前体。该31kDa蛋白被纯化到98％纯度。羟基磷灰石柱色谱法将酶分为两种类型，一种具有正确的31,090相对质量，另一种增加了具有178个质量单元(即，31,268)。后者证实是因为在大肠杆菌中发生了His标记的修饰，修饰物是一当量的葡糖酸-1，5-内酯。在合适的缓冲条件下加入二硫苏糖醇使已纯化的蛋白自动分解为适当的19kDa和11kDa的酶，从而活化该纯化蛋白。这产生了一个在25摄氏度(℃)时、相对于200uM Ac-IETD-pNA(SEQ ID NO2)比活度为4-5单位/mg(U/mg)的酶。使用完全活化的蛋白用于对半胱氨酸天冬氨酸酶8抑制剂的高流量筛选。初步粗筛表明，在存在二硫苏糖醇(DTT)还原剂的情况下，半胱氨酸天冬氨酸酶8因为氧化而失活，但是在存在半胱氨酸的情况下，半胱氨酸天冬氨酸酶8则不会因氧化而失活。对失活机理的研究表明，本应建立活性氧氧化还原作用循环的DTT还原了醌类化合物，其还原产物(可能是H(2)O(2))使该酶失活。低微摩尔范围内具有亲合力的半胱氨酸天冬氨酸酶8抑制剂和类固醇衍生的二酸在该筛选过程中被分离。抑制剂的结构活性研究表明，类固醇模板和酸部分两者都是活性所必需。本领域技术人员应当能够懂得如何应用本发明对现有的此类筛选方法进行改进，使之适应以前无法用有效途径筛选的半胱氨酸天冬氨酸酶9。
可以理解的是，基本上不影响本发明各种实施方案的活性的任何改进均包括在此处提供的本发明的定义范围之内。相应地，下面的实施例是用来说明而不是限制本发明。
实施例1市售半胱氨酸天冬氨酸酶的底物特异性将一组市售半胱氨酸天冬氨酸酶相对于一系列底物进行测试以评估每种蛋白酶的特异性。半胱氨酸天冬氨酸酶9的优选底物是四肽，赖氨酸-谷氨酸-组氨酸-天冬氨酸(后面所称的LEHD(SEQ ID NO5))。另外，在中性缓冲盐溶液中，半胱氨酸天冬氨酸酶9对于它的优选底物(LEHD(SEQ ID NO5)所具有的活性，其数量级要低于其它任何半胱氨酸天冬氨酸酶对于它们的同源四肽的数量级。这些结果表明，在本发明前，在本领域中试图筛选半胱氨酸天冬氨酸酶9调节剂时所需要克服的困难。
用于进行特异反应的对照缓冲液如下20mM pH7.2的PIPES、1mM的EDTA、0.1％的CHAPS、10％的蔗糖、10mM的DTT。使用100uM的各种N-乙酰-四肽-7-氨基-三氟甲基香豆素底物用于对不同的市售半胱氨酸天冬氨酸酶的试验。在二甲亚砜中制备2.5mM浓度的储备底物，随后用对照缓冲液稀释到200uM。
在上文所列的对照缓冲液中制备300U的酶储备液。试验进行如下使用96孔黑色Dynex测微荧光计单板。试验体积总量为100ul。7-氨基-三氟甲基香豆素(AFC)的激发波长为400nm，在505nm处对所发射的荧光进行动力学监测，持续1小时(h)，期间AFC被从肽上切割下来。
首先添加50ul 200uM的储备底物(最终试验浓度为100uM)。然后添加对照缓冲液40ul。外加10ul 300U的半胱氨酸天冬氨酸酶储备液(最终试验浓度为30U)开始试验。计算出整个实验期间的线性速率(相对荧光U/s)，并且用图表表示出每种酶对于各种底物的线性速率。
实施例2比较各种半胱氨酸天冬氨酸酶的切割速率与半胱氨酸天冬氨酸酶3对它的优选四肽DEVD(SEQ ID NO1)的切割速率相比，得出各种半胱氨酸天冬氨酸酶对它们最佳底物的切割相对速率。按以上实施例1所描述的过程来进行试验。该结果在图2中显示。图2显示30U酶和它们最佳底物之间的相对活性。正如前面所示，在中性缓冲盐溶液中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性远远低于其它任何半胱氨酸天冬氨酸酶。表1显示产生图2数据结果的半胱氨酸天冬氨酸酶的浓度以及每种酶的最佳底物。
表1
实施例3在含有Hofmeister系列的Na盐的缓冲液中半胱氨酸天冬氨酸酶9切割LEHD(SEQ ID NO5)的相对速率将所有盐的溶解于对照缓冲液中，浓度达到0.8M。该缓冲液为20mM pH7.2的PIPES、1mM的EDTA、0.1％的CHAPS、10％的蔗糖、10mM的DTT。底物为100uM N-Ac-LEHD-Afc(SEQ ID NO5)，30U半胱氨酸天冬氨酸酶9/孔(0.72uM)。
蛋白分解活性与Hofmeister阴离子水构电势的升高有关，其中柠檬酸根＞磷酸根＞硫酸根＞醋酸根。在0.8M柠檬酸盐中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性比在0.8M溴化物中的相对活性高10,000倍，溴化物被认为是一种不能使结构稳定的阴离子(见图3)。
实施例4在Hofmeister盐中半胱氨酸天冬氨酸酶家族成员的活性在不同浓度的硫酸铵中检测半胱氨酸天冬氨酸酶1、3、7和9的活性，此外，在不同浓度的磷酸钠中进一步检测半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。如图4所示，这些盐对半胱氨酸天冬氨酸酶1和7没有影响，对半胱氨酸天冬氨酸酶3有极小影响。相反，半胱氨酸天冬氨酸酶9显示，在从0到1.6M的硫酸盐浓度范围内，其活性增加了1400倍(图4A)，在从0到1M的磷酸盐浓度范围内，增加了2200倍。所使用的缓冲液如实施例1中所述。在硫酸铵中，用作半胱氨酸天冬氨酸酶9的底物是25uM的Ac-LEHD-Afc(SEQ ID NO5)，用作半胱氨酸天冬氨酸酶3的底物是25uM的Ac-DEVD-Afc(SEQ ID NO1)。在磷酸钠中，用作半胱氨酸天冬氨酸酶9的底物为100uM的Ac-LEHD-Afc(SEQ ID NO5)。
实施例5在不同Hofmeister盐中半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性在包括阴离子和阳离子的各种Hofmeister盐中，检测了半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。结果显示，即使是Hofmeister系列中的较弱的有机阳离子也能增加半胱氨酸天冬氨酸9活性，但是不如阴离子增加得强烈，正如上述以Hofmeister系列为基础的理论所预计的那样。该结果在图5中显示。所使用的酶为30U(0.72uM)，底物是100uM的Ac-LEHD-AFC(SEQ ID NO5)，缓冲液如实施例1中所述。
实施例6用Hofmeister盐进行半胱氨酸天冬氨酸酶9的高流量筛选根据实施例3和4所观测到的数据，建立以下高流量筛选通用方案，即含有0.8M柠檬酸钠的反应缓冲液可以使半胱氨酸天冬氨酸酶9活性获得令人满意的增强。该筛选过程由以下组成将重组半胱氨酸天冬氨酸酶9、它的荧光底物LEHD-AFC(SEQ ID NO5)和测试化合物混合于96孔格式板中的0.8M柠檬酸盐缓冲液中，紧接着用自动化荧光分光计进行酶动力研究。所有操作可用机器人自动进行。
详细方案的一个实施例如下将所有试剂在反应缓冲液(20mM pH7.2的PIPES、1mM的EDTA、0.1％的CHAPS、10％的蔗糖、0.8M pH7.2的柠檬酸钠、1mM的半胱氨酸)中稀释到最终稀释，称为缓冲液A。在DMSO中，制备2.5mM的储备底物LEHD-AFC(SEQ ID NO5)(酶系统产物)。在DMSO中，制备10mM的储备抑制剂肽LEHD-CHO(SEQ ID NO5)(酶系统产物)和测试化合物。在缓冲液A中制备储备半胱氨酸天冬氨酸酶9溶液(PharMingen，San Diego，CA)，浓度为300U/100ul。在黑色96孔U型板的100ul体积的单孔中发生反应。反应混合物配制如下1.以缓冲液A，按照1∶50的比例将储备底物稀释到50uM，这称为底物混合物，2.以缓冲液A，按照1∶40的比例将储备化合物稀释到250uM，该称为化合物混合物。在单孔中加入50ul底物混合物和40ul化合物混合物准备反应，加入10ul储备半胱氨酸天冬氨酸酶9开始反应。半胱氨酸天冬氨酸酶9、底物和化合物的终浓度分别为10U/100ul、25uM和100uM。在室温下以荧光单位/秒(U/s)对蛋白分解活性进行动力学监测，时间为1小时以上。每种反应一式三份。含有下列组分的孔组成适当的对照1.单独的底物(阴性对照)；2.底物和酶(阳性对照)；3.底物、酶和肽抑制剂(抑制剂对照)。这些对照紧跟在底物、酶和试验化合物之后。任何降低半胱氨酸天冬氨酸酶9活性＝＞50％的化合物记录为阳性采样。
实施例7筛选半胱氨酸天冬氨酸酶9变构激活作用的抑制剂细胞中半胱氨酸天冬氨酸酶9的激活依赖于一种由细胞凋亡物1百万道尔顿蛋白缔合物引起的别构作用，该1百万道尔顿蛋白缔合物含有APAF1、细胞色素C和半胱氨酸天冬氨酸酶9。将纯化的半胱氨酸天冬氨酸酶9引入到含有Hofmeister系列kosmotropic盐的缓冲液中，以模拟细胞凋亡物中半胱氨酸天冬氨酸酶9的变构激活状态。这能够把那些结合于半胱氨酸天冬氨酸酶9激活区域、跟结合于蛋白酶催化部位的分子有区别的分子筛选出来。这通过初步筛选出那些在0.8M柠檬酸钠中对半胱氨酸天冬氨酸酶9特异性切割荧光四肽(LEHD(SEQ ID NO5))有抑制作用的化合物来完成(见实施例6)。采集抑制的样本，抑制原因可能是由于结合于催化裂解处，或者是由于结合于远处变构部位，从而改变了蛋白酶的构象使之变为非活性形式。接着通过同类四肽LEHD(SEQ ID NO5)对化合物的竞争取代进行二次筛选，来区分该采样，这些同类四肽仅仅结合在催化部位。通过四肽对抑制性化合物的竞争性取代来解除抑制作用，从而把作用在催化部位的分子从那些作用在变构部位的分子中区分出来。
简单方案的详细说明如下收集初筛出来的所有采样并且用缓冲液A(实施例6)稀释到250uM(1∶40)、25uM(1∶400)和2.5uM(1∶4000)。向96孔板的单孔中加入这些化合物混合物，每孔均为40ul，设置三个重复，接着加入10ul酶储备液，并在室温下预温10分钟。此后，添加50ul底物混合物开始反应(实施例6)。每个反应物的终浓度为半胱氨酸天冬氨酸酶930U/100ul，底物25uM，和初筛采样化合物100uM、10uM、1uM。使用光谱荧光计监测酶促反应动力学1小时以上。在预先确定的时间点上，对一个或多个化合物浓度用非线性动力学检测抑制性化合物的竞争性取代。从时间0点起的线性动力学或者从抑制作用起的非释放动力学分别预示着异位抑制或者非竞争性类型抑制作用。
所有抑制剂-酶关系的结构基础都可使用X-射线晶体图谱或者溶液核磁共振来最终确定。
本领域普通技术人员应当认同，很容易对本发明过程进行一些变化，如将二硫苏糖醇(DTT)替换为其它的化合物或用谷胱甘肽代替半胱氨酸。这些变化与本发明方案本质上是等同的，尽管根据所使用的特定条件不同，它们在用途途方面理所当然地存在着一些差异。
高流量筛选的典型反应条件包括120％缓冲液中50ul底物+100％缓冲液中40ul酶+50mMHEPES中10ul样品。
pH7.2的酶缓冲液20mM PIPES[先用NaOH把pH调为7.2]6048mg100mM NaCl 5844mg1mM EDTA(0.5M储备液) 2000ul0.1％W/V CHAPS 1000mg10％蔗糖w/v100g适量d H2O 1000ml1mM半胱氨酸所制得的缓冲液可以取出等份试样无菌过滤并且4℃储藏以供日常使用。
pH7.2的底物120％浓缩缓冲液(所列浓度最终不是120％)20mM PIPES[先用NaOH把pH调为7.2]7258mg100mM NaCl 7013mg1mM EDTA(0.5M储存液) 2400ul0.1％W/V CHAPS 1200mg10％蔗糖 w/v 120g适量d H2O 1000ml1mM半胱氨酸LEHD-AFC(SEQ ID NO5)(半胱氨酸天冬氨酸酶9底物)25uM终浓度酶系列产品目录号#AFC-138在175ul的100％DMSO中溶解3mg LEHD-AFC(SEQ ID NO5)并且在-20℃冷冻。该储备液浓度是25mM假定在100ul溶液中，需要终浓度为25uM。假定需要浓缩液体积为50ul，则为了达到终浓度为25mM，浓缩液的浓度就应为50uM。现在储备液的浓度为25mM(25000uM)，25000uM/50uM＝500。在每板需要大约5ml的情况下。
50uM＝1∶500稀释液＝40ul 25mM LEHD-AFC(SEQ ID NO5)/20ml缓冲液重组人半胱氨酸天冬氨酸酶9终浓度为5ng/ml阳性对照PharMingen目录号 #66281T购买的储备酶是每50ul 10ug。本申请中的酶储备液是200ng/ul本申请中需要CPP32酶的终浓度是5ng/ml。向底物(50ul)中加入浓缩酶液的体积是40ul，因此为了在100ul溶液中达到终浓度5ng/ml，则需要浓缩酶液的浓度为(5ng/ml)(100ul)＝(x ng/ml)(40ul)。经计算得出储备酶液的浓度应为12.5ng/ml。当储备酶浓度是200ng/ul＝200ug/ml时。
(200ug/ml)/0.0125ug/ml＝16,000，因此酶以1∶16,000的比例进行稀释。
终浓度 储备浓度5ng/ml＝12.5ng/ml＝1∶16,000＝2.5ul CPP32/40ml缓冲液抑制剂肽LEHD-CHO(SEQ ID NO5)酶系列目录号#AL-010 5mg MW502
-20℃干燥储藏，有效期为4个月(在二甲亚砜中-20℃储藏时，有效期为几天)DMSO中10mM储备液＝5mg/ml DMSO
序列表序列表<110>WyethWade，EDRIS<120>半胱氨酸天冬氨酸酶9的激活及其应用<130>AM101006 PCT<150>10/191,254<151>2002-07-08<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>1Asp Glu Val Asp1<210>2<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>2Ile Glu Thr Asp1
<210>3<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>3Leu Glu Glu Asp1<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>4Trp Glu His Asp1<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>5Leu Glu His Asp1<210>6<211>4
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>6Val Glu Ile Asp1<210>7<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>底物<400>7Tyr Val Ala Asp权利要求
1.一种鉴定能够调节半胱氨酸天冬氨酸酶9活性的化合物的方法，包括a)将含有半胱氨酸天冬氨酸酶9或者其酶活性片断的样品与测试化合物和Kosmotropic试剂相接触；并且b)检测半胱氨酸天冬氨酸酶9或者其片断的活性，其中活性变化表明该化合物能够调节半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述调节包括抑制半胱氨酸天冬氨酸酶9的活性。
3.权利要求1的方法，其中所述活性是用结合试验来检测的。
4.权利要求1的方法，其中所述活性是通过测定底物的周转来检测的。
5.权利要求4的方法，其中所述底物包含能够被半胱氨酸天冬氨酸酶9切割的位点，其选自多肽、寡肽和肽。
6.(修改)权利要求5的方法，其中该底物包含选自LEHD(SEQ ID NO5)、WEHD(SEQ ID NO4)、DEVD(SEQ ID NO1)、ZEVD和YVAD(SEQ ID NO7)的多肽。
7.权利要求4的方法，其中所述底物是荧光底物。
8.(修改)权利要求7的方法，其中所述荧光底物包含选自LEHD-AMC(SEQ ID NO5)、WEHD-AMC(SEQ ID NO4)、DEVD-AMC(SEQ IDNO1)、ZEVD-AMC、YVAD-AMC(SEQ ID NO7)、LEHD-AFC(SEQIDNO5)、WEHD-AFC(SEQ ID NO4)、DEVD-AFC(SEQ ID NO1)、ZEVD-AFC和YVAD-AFC(SEQ ID NO7)的标记肽。
9.权利要求1的方法，其中所述样品包含细胞裂解液。
10.权利要求1的方法，其中所述样品包含具有酶活性的半胱氨酸天冬氨酸酶9片断。
11.权利要求1的方法，其中试剂是Hofmeister系列离子。
12.权利要求1的方法，其中试剂是钠盐，该钠盐选自硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐和柠檬酸盐。
13.权利要求1的方法，其中试剂是铵盐，该铵盐选自硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐和柠檬酸盐。
14.权利要求12的方法，其中试剂是柠檬酸盐。
15.权利要求13的方法，其中试剂是柠檬酸盐。
16.一种鉴定半胱氨酸天冬氨酸酶9加工过程的抑制剂或增强剂的方法，包括a)将含有半胱氨酸天冬氨酸酶9前体或其含有切割位点的片断的样品，与能够加工半胱氨酸天冬氨酸酶9前体的蛋白和至少一种候选抑制剂或候选增强剂进行接触；并且b)检测半胱氨酸天冬氨酸酶9的大和小亚基的存在，并且由此测定半胱氨酸天冬氨酸酶9前体所加工的水平，其中加工水平降低表明存在半胱氨酸天冬氨酸酶加工过程抑制剂，而加工水平增高则表明存在半胱氨酸天冬氨酸酶加工过程增强剂。
17.权利要求16的方法，其中该能够加工半胱氨酸天冬氨酸酶9前体的蛋白是CPP32。
18.权利要求16的方法，其中该能够加工半胱氨酸天冬氨酸酶9前体的蛋白是粒酶B。
19.权利要求16的方法，其中半胱氨酸天冬氨酸酶9的大和小亚基是通过凝胶电泳检测的。
20.权利要求16的方法，其中该样品还包含柠檬酸盐。
全文摘要
本发明公开了以某种方式来激活半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)9的方法，其中使用该激活方式能够在试验中发现半胱氨酸天冬氨酸酶9的调节剂。
文档编号C12Q1/37GK1691955SQ03816063
公开日2005年11月2日 申请日期2003年7月8日 优先权日2002年7月8日
发明者W·A·埃德里斯 申请人:惠氏公司