在乳腺癌和膀胱癌中差异表达的基因及编码多肽的制作方法

专利名称：在乳腺癌和膀胱癌中差异表达的基因及编码多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及在人乳腺癌和膀胱癌中差异表达的人类新基因。更具体而言，本发明涉及编码名为C35的人类新多肽的多核苷酸。本发明还涉及C35多肽以及载体、宿主细胞、针对C35多肽的抗体和制备它们的重组方法。本发明另外涉及检测癌包括人类乳腺癌和膀胱癌的诊断方法，。本发明另外涉及C35基因及多肽在免疫原性组合物或疫苗中的组成和用途，以针对表达C35基因的靶细胞，例如肿瘤细胞，诱导抗体或细胞介导的免疫。本发明另外涉及用于鉴定C35活性的激动剂和拮抗剂的筛选方法。
背景技术：
在美国，每年约有一百二十万人受癌症折磨。其中大约50％的癌症可以利用手术、放疗和化疗进行医治。尽管在这三种治疗中取得了明显的技术进步，但每单只在美国就有超过500000人死于癌症。(Jaffee，E.M.，Ann.N.Y.Acad.Sci.88667-72(1999))。因为多数在远位例如肝、脑、骨和肺复发，故急需改善系统疗法。
癌症治疗的目标在于发展特异性针对肿瘤细胞的方法，从而避免对正常组织不必要的副作用。免疫疗法有可能为多数类型的癌症提供一种可选择的系统疗法。免疫疗法较之放疗和化疗的优势在于，它可以特异性作用于肿瘤，而不引起正常组织损伤。疫苗是免疫疗法的一种形式，它还可以提供主动免疫接种，从而放大免疫应答，所以格外引人注意。此外，疫苗可以产生记忆型免疫应答。
开发癌症疫苗的努力基础是改变肿瘤细胞的特性，使免疫系统识别为非我，从而诱导保护性免疫的可能性。此策略是否可行，取决于如何改变转化细胞的特性。由突变在肿瘤转化中重要作用的理解得出假说，肿瘤抗原是遗传不稳定细胞随机突变的结果。虽然随机突变可能产生免疫原性，但可以预计其将诱导每种肿瘤所特有的特异性免疫。这不利于开发广泛有效的肿瘤疫苗。但另外的假说是肿瘤抗原是与转化过程相关的系统性和可重复性组织特异性基因下调的结果。这可以引起某些类型肿瘤中共有抗原表达的的质或量的差异，这些抗原可能是免疫治疗的合适目标。早期研究结果证明，某些实验肿瘤的免疫原性可以回溯到随机突变(De Plaen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274-2278(1988)；Srivastava，& Old，Immunol.Today 978(1989))，显然支持第一种假说。但无法解释随机突变和系统性基因失调不能均引起肿瘤表达新免疫原的原因。实际上，近来实验肿瘤(Sahasrabudhe等，J Imunol.1516202-6310(1993)；Torigoe等，J.Immunol.1473251(1991))以及人黑素瘤(van Der Bruggen等，Science 2541643-1647(1991)；Brichard等，J.Exp.Med.178489-495(1993)；Kawakami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913515-3519(1994)；Boel等，Immunity2167-175(1995)；Van den Eynde等，J.Exp.Med.182689-698(1995))的研究清楚表明，由失调的正常基因编码的肿瘤共有抗原表达。MAGE-1和其它不同人黑素瘤共有抗原的鉴定，为今后开发多种肿瘤疫苗带来巨大希望。
尽管黑素瘤取得了进展，但对于其它人类肿瘤来说，几乎从未描述过能为细胞毒性T细胞所识别的共有抗原。主要是技术性难题。鉴定唯有肿瘤细胞表达的免疫原性分子，最普遍以及迄今最成功的方法是筛选肿瘤特异性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)的cDNA文库。已经应用此策略鉴定了数个主要在人黑素瘤中表达的基因家族。然而此方法的两个主要局限是，(1)筛选需要繁重的转染工作，将众多重组DNA小库转染到分离的目标群体(为表达抗原递呈所需的一种或多种MHC分子，其本身经常需要修饰)，以测定由某些库的微量组分产生的T细胞刺激；(2)可能除肾细胞癌以外，难以从其它类型肿瘤(特别是包含80％以上人类肿瘤的上皮细胞癌)病人的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或PBL中分离肿瘤特异性CTL。似乎是存在组织特异性特征，其导致黑素瘤中肿瘤特异性CTL被隐蔽。
用肿瘤特异性基因产物直接免疫，对于诱导针对某些肿瘤共有抗原的免疫应答是必要的。已有人争辩说，如果肿瘤表达强抗原，则在其具有临床表现之前应已被根除。或许肿瘤只表达弱抗原。免疫学者一直对是什么使抗原弱或强的问题感兴趣。有两个主要假说。弱抗原可能没有很好加工，不能有效递呈给T细胞。或者，生物体中具有适当特异性的T细胞数量可能不足以产生强有力的应答(所谓″hole in therepertoire″)。阐明抗原性肽联合MHC分子以转运到细胞表面并呈递给T细胞的复杂细胞过程，是现代免疫学的胜利。这些实验清楚证实，加工缺陷或其它肽的竞争作用所引起的递呈失败，可以降低特定肽的免疫原性。反之，由于技术原因，更难证实T细胞库中典型克隆的频率是低水平应答的重要机制。然而最近研究表明，T细胞受体转基因小鼠中蛋白质抗原的免疫显性和隐性肽之间关系的变化提示，肽特异性T细胞的相对频率确实是T细胞应答中特定肽是隐性或显性的决定性因素。这促进了疫苗开发。使用目前方法修饰肿瘤抗原性肽加工及T细胞递呈的方式，是复杂和困难的。然而可以通过在预先接种，直接并有效地增加特异性T细胞群的相对频率。因此这是使原先隐性的应答得到免疫保护的关键。隐性或亚显性抗原的这些方面，与肿瘤可能通过诱导耐受而逃避免疫特别有关。现有证据提示，肿瘤宿主的肿瘤特异性T细胞没有反应性，可能是在非专司APC上递呈抗原的结果(Morgan，D.J.等，J.Immunol.163723-27(1999)；Sotomayor，E.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611476-81(1999)；Lee，P.P.等，Nature Medicine5677-85(1999))。因此，肿瘤免疫显性抗原的特异性T细胞预先耐受可能导致了难以开发癌症免疫治疗的成功策略。这些结果提示，免疫显性肿瘤抗原的特异性T细胞对于既成肿瘤的免疫治疗不大可能有效，因为它们很可能已经耐受了。因此，亚显性抗原的特异性T细胞或最初以较低频率存在的T细胞可能会更为有效，因为它们避免了生长中肿瘤耐受的影响。
开发广泛有效的人类疫苗所关心的另一主要方面是，HLA I类分子的高度多态性。MHC I类细胞肽复合物是特异性CD8+CTL的靶抗原。细胞肽由内源合成的蛋白质降解产生，移位到前高尔基区室，在此与I类MHC分子结合，转运到细胞表面。CD8分子有助于T细胞和靶分子通过结合I类重链α3结构域而相互作用的亲和力。由于所有内源性蛋白质都转变，来源于任何胞质或核蛋白的肽可能结合MHC分子并转运，呈递于细胞表面。这使T细胞比抗体针对的细胞蛋白质群体更大，抗体只局限于识别那些分泌的或整合于细胞膜的蛋白质的构象决定簇。
T细胞受体的抗原结合位点与肽以及周围MHC的决定簇相互作用。因此必须按照MHC肽复合物来确定T细胞的特异性。肽结合MHC分子的特异性很广，与特异性抗体的抗原结合位点相比，其亲和力相对较低。I类分子结合的肽一般长为8-10个残基，并调节氨基酸侧链，限定某些关键位点的多样性，以匹配MHC肽结合位点的口袋。结合特定MHC分子的肽的这些主要特征，构成肽结合基序。
因此，需要促进人类肿瘤、癌症和感染细胞的特异性T细胞诱导和分离的方法，以及有效筛选编码由这些处于适当MHC环境下的T细胞识别的主要靶抗原的基因的方法。
发明简述
本发明涉及在人乳腺癌和膀胱癌中差异表达的新的多核苷酸C35及C35编码多肽。本发明另外涉及载体、宿主细胞、抗体，以及制备C35多肽和多核苷酸的重组方法。本发明另外涉及C35多肽、特别是C35肽表位和C35肽表位类似物以及多核苷酸在免疫原性组合物中的组成和用途，以诱导针对表达C35基因产物的靶细胞例如肿瘤细胞的抗体或细胞介导的免疫。本发明还提供检测C35基因和多肽相关疾病的诊断方法，包括用作癌症(例如人乳腺癌)的预后标志，以及上述疾病的治疗方法。本发明另外涉及鉴定C35的结合配偶体的筛选方法。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含含有两个或多个C35肽表位的肽的分离的多肽，其中所述肽选自SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113、SEQ ID NO 2的氨基酸E100-V113、SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113、SEQ ID NO2的氨基酸I93-V113、SEQ ID NO2的氨基酸D88-V113、SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113、SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113、SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113、SEQ IDNO2的氨基酸F65-V113和SEQ ID NO2的氨基酸L59-V113，并且其中所述分离的多肽不是SEQ ID NO2、SEQ ID NO153、SEQ IDNO155或SEQ ID NO2的氨基酸E100-R109。
在另一实施方案中，本发明涉及包含至少一个C35肽表位类似物的分离的多肽，其中所述C35肽表位类似物选自对于SEQ ID NO2和

图1B的肽表位G22-C30，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I25-C33，具有取代第6个氨基酸残基和/或第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K77-Y85，具有取代第9个氨基酸残基处酪氨酸的缬氨酸的类似物；对于SEQID NO2和图1B的肽表位K104-C112，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-V113，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I105-V133，具有取代第2个氨基酸残基处苏氨酸的亮氨酸或甲硫氨酸和/或取代第8个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸的类似物；以及对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位N107-L115，具有取代第6个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物。
本发明分离的多肽优选长度不超过100个氨基酸、或者长度不超过95个氨基酸、或者长度不超过90个氨基酸、或者长度不超过85个氨基酸、或者长度不超过80个氨基酸、或者长度不超过75个氨基酸、或者长度不超过70个氨基酸、或者长度不超过65个氨基酸、或者长度不超过60个氨基酸、或者长度不超过55个氨基酸、或者长度不超过50个氨基酸、或者长度不超过45个氨基酸、或者长度不超过40个氨基酸、或者长度不超过35个氨基酸。
在另一实施方案中，本发明涉及包含含有两个或多个C35肽表位的分离的肽的融合蛋白质，其中所述分离的肽选自SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113、SEQ ID NO 2的氨基酸E100-V113、SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113、SEQ ID NO2的氨基酸I93-V113、SEQ IDNO2的氨基酸D88-V113、SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113、SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113、SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113、SEQ ID NO2的氨基酸F65-V113和SEQ ID NO2的氨基酸L59-V113。在一个优选实施方案中，该融合蛋白质是所述分离的肽的同聚物。在另一优选实施方案中，该融合蛋白质是所述分离的多肽的异聚物。在另一实施方案中，该融合蛋白质与T辅助肽融合。在另一实施方案中，该融合蛋白质与载体融合。在另一实施方案中，该融合蛋白质与脂质连接。
在另一实施方案中，本发明涉及由两个或多个C35肽表位组成的分离的多肽，其中所述分离的多肽选自SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113、SEQ ID NO 2的氨基酸E100-V113、SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113、SEQ ID NO2的氨基酸I93-V113、SEQ ID NO2的氨基酸D88-V113、SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113、SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113、SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113、SEQ IDNO2的氨基酸F65-V113和SEQ ID NO2的氨基酸L59-V113，并且其中所述分离的多肽不是SEQ ID NO2、SEQ ID NO153、SEQ IDNO155或SEQ ID NO2的氨基酸E100-R109。
在另一实施方案中，本发明涉及包含含有至少一个C35肽表位类似物的肽的分离的多肽，其中所述肽选自具有取代第12个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽T101-V113的类似物、具有取代第13个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽E100-V113的类似物、具有取代第14个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽G99-V113的类似物、具有取代第20个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽I93-V113的类似物、具有取代第25个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ IDNO2的肽D88-V113的类似物、具有取代第29个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽P84-V113的类似物、具有取代第36个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽K77-V113的类似物、具有取代第41个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽Q72-V113的类似物、具有取代第48个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽F65-V113的类似物以及具有取代第54个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQID NO2的肽L59-V113的类似物。
在另一实施方案中，本发明涉及包含含有至少一个C35肽表位类似物的肽的融合蛋白质，其中所述肽选自对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位G22-C30，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I25-C33，具有取代第6个氨基酸残基和/或第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K77-Y85，具有取代第9个氨基酸残基处酪氨酸的缬氨酸的类似物；对于SEQ DNA2和图1B的肽表位K104-C112，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-V113，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或亮氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I105-V133，具有取代第2个氨基酸残基处苏氨酸的亮氨酸、丝氨酸或甲硫氨酸和/或取代第8个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物；以及对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位N107-V133，具有取代第6个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物、具有取代第12个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽T101-V113的类似物、具有取代第13个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽E100-V113的类似物、具有取代第14个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽G99-V113的类似物、具有取代第20个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽I93-V113的类似物、具有取代第25个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽D88-V113的类似物、具有取代第29个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽P84-V113的类似物、具有取代第36个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ IDNO2的肽K77-V113的类似物、具有取代第41个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽Q72-V113的类似物、具有取代第48个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽F65-V113的类似物以及具有取代第54个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽L59-V113的类似物。在一个优选实施方案中，该融合蛋白质包含所述含有至少一个C35肽表位类似物的肽的同聚物。在另一优选实施方案中，该融合蛋白质包含所述含有至少一个C35肽表位类似物的肽的异聚物。
在另一实施方案中，本发明涉及包含本发明分离的多肽或融合蛋白质以及药物可接受载体的组合物。
附图简述
图1A和1B.图1A显示C35的DNA编码序列(SEQ ID NO1)。紧接预测的ATG起始密码子上游的序列如小写字母所示，符合Kozak，M.，J.Biol.Chem.266(30)19867-19870(1991)所述预期特征。图1B显示推断的C35氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图2A-2C.图2AC35在乳腺肿瘤细胞系中过表达。上图将3周龄人胸腺、病人21的正常乳腺上皮细胞系H16N2、以及一年后取自同一病人21的原发或转移结节的4个乳腺肿瘤细胞系21NT、21PT、21MT1和21MT2的300ng的poly-A RNA，用1％琼脂糖/甲醛凝胶分离，转到GeneScreen膜。将印迹与32P标记的C35探针杂交。将印迹对胶片曝光15小时，进行杂交检测。下图为定量RNA载样量，将同一印迹洗脱并与32P标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的探针重杂交。根据GAPDH信号归一化每个样品的C35信号。数字代表每个样品相对于H16N2的C35表达倍数。图2BC35在正常组织中低水平表达。包含1μg每种指定的成人正常组织poly-A RNA(Clontech)的印迹，与32P标记的C35探针杂交。印迹在胶片上曝光15小时(上图)或96小时(下图)，进行杂交检测。图2C.C35在原发乳腺癌中过表达。包含3种原发浸润乳腺导管癌T1、T2、T3和1种正常乳腺上皮细胞N(Invitrogen)的2μg polyA RNA的印迹，与32P标记的C35探针杂交。杂交混合物中包括32P标记的β-肌动蛋白探针，以归一化载样量。将印迹对胶片曝光6小时，进行杂交检测。数字代表每个样品相对于正常乳腺上皮细胞的C35表达倍数。
图3.C35在乳腺肿瘤细胞系中的表达。C35在各种乳腺肿瘤细胞系中过表达。上图BT474(ATCC HYB-20，乳腺导管癌)、SKBR3(ATCCHTB-30，乳腺腺癌)、T47D(ATCC HTB-133，乳腺导管癌)、病人21的正常乳腺上皮细胞系H16N2以及来源于同一病人21的原发肿瘤结节的乳腺肿瘤细胞系21-NT的300ng poly-A RNA，经1％琼脂糖/甲醛凝胶分离，转到GeneScreen膜。将印迹与32P标记的C35探针杂交。将印迹对胶片曝光15小时，进行杂交检测。下图为定量RNA载样量，将同一印迹洗脱并与32P标记的β-肌动蛋白探针重杂交。根据肌动蛋白信号归一化每个样品的C35信号。数字代表每个样品相对于H16N2的C35表达倍数。
图4A-4C.利用流式细胞术检测C35蛋白质的表面表达。用3.5μl针对株系1小鼠肿瘤细胞(转导有编码人C35的逆转录病毒)的BALB/c小鼠抗血清，或放血前的BALB/c血清作对照，染色1×105个乳腺肿瘤细胞。温育30分钟后，细胞用染色缓冲液(PAB)洗涤两次，与FITC-山羊抗小鼠IgG(1μg/样品)温育30分钟。洗涤样品，用EPICS Elite流式细胞仪分析。图4A21NT.图4BSKBR3.图4CMDA-MB-231.选择这三个乳腺肿瘤细胞系代表Northern印迹中高、中和低水平表达C35RNA的肿瘤细胞(参见图3)。缩写nms，ns；正常小鼠血清；C35；C35免疫血清。
图5A和5B.CML选择的重组牛痘cDNA克隆刺激肿瘤特异性CTL。图5A测定CML选择的牛痘克隆在感染B/C.N后，刺激肿瘤特异性CTL分泌γ干扰素的能力。ELISA测定细胞因子的量，以OD490表示(14)。OD490为1.4近似等于4ng/ml IFNg，OD490为0.65近似等于1ng/mlIFNg。图5BCML选择的克隆使宿主细胞对肿瘤特异性CTL的裂解敏感。指定牛痘病毒克隆按moi＝1感染6孔板中的单层B/C.N。感染14小时后收获感染细胞和指定的对照靶细胞，用51Cr标记。靶细胞与指定比例的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞37℃温育4小时，测定特异性裂解的百分率(15)。此实验至少重复三次，得到相似结果。
图6A和6B.肿瘤抗原由核糖体蛋白质L3基因编码。H2.16和rpL3的45-56位氨基酸的序列。图6AcDNA克隆rpL3的氨基酸(单字母编码)和核苷酸序列(GenBank登录号Y00225)。图6B相对于发表的L3核糖体等位基因，H2.16肿瘤cDNA中的C170T单核苷酸置换是唯一的序列改变。此置换导致蛋白质中T54I的氨基酸置换。
图7A和7B.鉴定肿瘤特异性CTL识别的肽表位。图7ACML分析鉴定肿瘤特异性CTL识别的肽。用51Cr标记靶细胞(15)。在51Cr温育期间，将B/C.N细胞样品与1μM肽L348-56(I54)、100μML348-56(T54)或100μM肽L345-54(I54)温育。靶细胞与指定比例的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞37℃温育4小时，测定特异性裂解的百分率。此实验至少重复三次，得到相似结果。图7B肽L348-56(I54)的滴定。用51Cr标记靶细胞。在51Cr温育期间，B/C.N细胞样品在不加入肽(D)或与指定浓度(1μM、10nM、1nM)的L348-56(I54)(■)温育，BCA 39细胞用作阳性对照(▲)。靶细胞与指定比例的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞37℃温育4小时，测定特异性裂解的百分率。实验重复两次，结果相似。
图8A-8C.各个细胞系表达的L3的分析。图8A公开的rpL3和H2.16的Sau3AI图谱。首先所示为公开的核糖体蛋白质L3基因(上图)和H2.16(下图)的Sau3AI限制性图谱。公开的L3序列cDNA经消化产生200、355、348、289和84bp的片段。除了C170T所致168位另一Sau3AI位点以外，H2.16的图谱相同。这产生168bp消化产物，而不是200bp片段。图8BBCA肿瘤表达L3的两个等位基因。利用L3特异性引物，从各个细胞系或vH2.16中获得RT-PCR产物，然后用Sau3AI消化，3％琼脂糖凝胶80伏分离2小时。图8C免疫原性L3等位基因在B/C.N、BCB13和胸腺中的表达水平大幅降低。利用32P末端标记的5′PCR引物，从各个指定样品中获得L3特异性RT-PCR产物。以各个样品的RNA为PCR模板，不经cDNA合成，则未观察到PCR产物，表明样品没有污染基因组DNA。凝胶纯化PCR产物，保证其纯度，用Sau3AI消化，3％琼脂糖凝胶60伏分离15小时。不加入模板的对照PCR样品没有观察到PCR产物。此结果共重复3次。
图9A-9C.用iL3免疫具有免疫保护性。图9A用H2.16免疫诱导了肿瘤特异性CTL。通过皮下注射5×106pfu的vH2.16或对照载体v7.5/tk，免疫Balb/c小鼠(2只/组)。7天后收获脾细胞，用肽L348-56(I54)再刺激(26)。第二次再刺激五天后，如图11所述进行铬释放分析试验测定淋巴细胞。L348-56(I54)肽使用浓度为1μM，L348-56(T54)肽使用浓度为100μM。重复该免疫实验，获得相似结果。图9B和9C雌性Balb/cByJ小鼠按指定方法免疫(27)。腹壁SC注射200,000个活BCA 34肿瘤细胞，激发小鼠。激发后35天获取数据。这些数据代表4次独立实验。
图10A和10B.图10A翻译的C35编码序列；5′和3′非翻译区用小写字母表示。方框中为预测的3′端异戊二烯化位点CVIL。图10BC35基因在染色体17上的基因组排列。
图11A和11B.C35在乳腺癌中的表达。通过随机引发反应用32P标记C35，并按106cpm/ml进行Northern印迹杂交。洗脱每一印迹并用GAPDH或β-肌动蛋白重探查，以归一化mRNA载量。数字表示相对GAPDH/β-肌动蛋白归一化的密度测定法比值。指定正常细胞系H16N2的值为1，所有数值都相对于该正常细胞系的表达水平。图11AC35在乳腺上皮细胞系中的表达。图11BC35在原发乳腺组织/肿瘤中的表达。将300ng mRNA进行0.8％碱性琼脂糖凝胶电泳，然后转印到Genescreen Plus，图B最左侧图例外，其上样来自3个原发肿瘤和1个正常组织对照的1μgmRNA(Real Tumor Blots，Invitrogen)。所示对所有印迹类似的曝光结果。
图12.C35在膀胱癌中的表达。C35通过随机引发反应用32P标记，按106cpm/ml与肿瘤和正常RNA进行Northern印迹杂交。洗脱印迹并用β-肌动蛋白重探查，以归一化mRNA载量。数字表示相对β-肌动蛋白归一化的光密度法比值。数值相对于正常膀胱样品的表达水平。将300ng mRNA进行0.8％碱性琼脂糖凝胶电泳，然后印迹到Genescreen Plus。
图13A和13B.利用抗C35抗体进行的FACS分析。图13A利用经株系1细胞(用C35重组逆转录病毒感染的)免疫的小鼠的血清(上图)以及2C3纯化的单克隆抗体(下图)或同型对照，染色乳腺细胞系。图13B利用2C3纯化的单克隆抗体或同型对照染色膀胱细胞系。
图14A和14B.2C3抗体存在下的肿瘤生长抑制。21NT乳腺肿瘤细胞(图14A)或H16N2正常乳腺上皮细胞(图14B)与所示浓度的2C3抗C35单克隆抗体或非特异性同型对照抗体温育。在有或无抗体的情况下温育72小时后，利用XTT试验测定细胞生长。
图15A和15B.由表达C35的树突状细胞刺激的CTL特异性溶解C35+乳腺(21NT)和膀胱(ppT11A3)肿瘤细胞系，对正常乳腺(MEC)、永生化的非致瘤性乳腺(H16N2)和膀胱(SV-HUC)细胞系、或NK敏感细胞系(K562)具有较小的活性。图15AT细胞株系4自正常人PBL产生。图15B从株系4中筛选C35特异活性的T细胞克隆10G3。靶细胞系MEC、ppT11A3和SV-HUC为天然HLA-A2阳性。靶细胞系21NT和H16N2用HLA-A2转染，以提供所需MHC限制成分。
图16A和16B.T细胞克隆10G3在靶物质刺激下的细胞因子释放。图16AIFN-γ分泌。图16BTNF-α分泌。根据是否表达HLA-A2和C35肿瘤抗原、C35的氨基末端50个氨基酸片段(C35-50aa)或无关的小鼠L3核糖体蛋白质，来区别乳腺和膀胱靶细胞系。每个标志或为内源性表达，或通过转染HLA-A2.1构建体(pSV2.A2)或感染C35(vv.C35、vv.C35-50aa)、L3(vv.L3)或HLA-A2(vv.A2)的重组牛痘疫苗而引入。
图17A和17B.抗CD-40配基抗体(抗CD154)在阻断小鼠T细胞对特异性移植抗原反应性中的作用。用107 C57B1/6(H-2b)脾细胞腹膜内免疫DBA/2(H-2d)小鼠，并在接种时及两天后另外注射盐水或0.5mg单克隆抗CD40配基抗体(MR1，抗CD154，Pharmingen 09021D)。免疫后第10天，取出这些小鼠的脾细胞，用C57B1/6或经照射(20 Gy)的异源C3H(H-2k)对照脾细胞体外刺激。体外刺激5天后，利用特异性标记靶细胞的51Cr释放分析，按不同效应细胞靶细胞比例，分析C57B1/6和C3H特异性的溶细胞反应，在此情况下，用同源脾细胞裂解物脉冲C3H或C57B1/6树突细胞。在盐水及抗CD154处理的小鼠中均针对对照的C3H异源抗原诱导显著的细胞毒性(图17A)，但在盐水处理的小鼠而非抗CD154处理的小鼠中诱导针对C57B1/6的溶细胞反应(图17B)。
图18.株系4经天然21NT-A2肿瘤、利用不同C35肽脉冲的H16N2-A2或利用C35重组牛痘病毒感染的H16N2-A2刺激之后的GM-CSF生成。通过用自体树突细胞(DC)、然后用感染C35重组牛痘病毒的自体单核细胞刺激正常供体T细胞12天，得到T细胞株系4。每周利用异体PBL和感染HLA-A2/Kb(21NT-A2)的21NT肿瘤持续进行刺激。此处所述实验按每孔106T细胞，利用由1μg/ml C35肽9-17、77-85、104-112或105-113脉冲的5×104受照射(2500拉德)H16N2-A2/Kb以及每孔105受照射异体PBL连同处于AIM-V/5％人AB血清中的IL2(20U/ml)和IL-7(10ng/ml)，体外重复刺激T细胞。两(2)轮7天刺激以后，测试T细胞在经或未经1μg/ml肽脉冲、或vvC35或vvWT按MOI＝1感染的不同刺激物温育后诱导GM-CSF分泌。T细胞(5000)与25000个不同的刺激细胞一式三份，在AIM-V/5％人AB血清中温育过夜。
图19.杂交瘤上清的C35特异性ELISA。关于证实具有C35特异性的杂交瘤克隆的典型ELISA实验结果。
图20.C35特异性抗体的Western印迹。利用所选杂交瘤克隆的上清进行Western印迹免疫检测。在此分析中，来自4种杂交瘤(1B3、1F2、3E10、11B10)的抗体与hC35蛋白质特异性反应。所示为抗体1B3、1F2和3E10的结果。
图21.1F2抗体的免疫组化。单克隆抗体1F2显示可用于原发乳癌部分的免疫组化染色。此图证明，单克隆抗体1F2可以检测人乳肿瘤中内源性高水平的C35表达，很少或不染色正常乳腺组织。具体而言，此图显示患者01A6的侵袭性乳腺癌部分强着色，而该患者的正常乳腺组织阴性。
发明详述
定义
为帮助对本说明书所用某些术语的理解，提供下列定义。
本发明中″分离″是指物质从其天然环境中分离(例如，如果其为天然产生时的自然环境)，并因而″人工″改变其自然状态。例如，分离的多核苷酸可以是载体或物质组合物的部分，或者包含于细胞中，但仍然是″分离″的，因为载体、物质组合物或特定细胞并非该多核苷酸的原始环境。
本发明中″膜″C35蛋白质是通过直接或者间接与脂双层连接(尤其包括通过羧基末端氨基酸基序的异戊二烯化)而表达于细胞表面的一种蛋白质。异戊二烯化包括通过加成法呢基或香叶基香叶基(geranylgeranyl)类异戊二烯而共价修饰蛋白质。异戊二烯化发生在蛋白质羧基末端附近的半胱氨酸残基上。C35多肽112-115位包含氨基酸Cys-Val-Ile-Leu，该多肽的C末端残基为Leu。基序Cys-X-X-Leu(其中″X″代表任何脂肪族氨基酸)导致在Cys残基上加成20碳的香叶基香叶基团。一般在加成该脂类以后，3个末端氨基酸残基从多肽上断裂，并且脂类基团甲基化。异戊二烯化促进大多数蛋白质(其多肽中具有涉及将该异戊二烯化蛋白质导向原生质、核或高尔基膜的序列基序)的膜定位。异戊二烯化在蛋白质-蛋白质互作中起作用，许多异戊二烯化蛋白质与信号转导有关。异戊二烯化蛋白质的例子包括Ras和核纤层蛋白B。(Zhang，F.L.和Casey，P.J.，Ann.Rev.Biochem.65241-269(1996))。利用小鼠抗人C35抗血清作为初级试剂进行荧光分析，已经在两个乳腺肿瘤细胞系表面上检测到C35蛋白质(图4A-4C)。
本发明中″分泌″的C35蛋白质是指能够通过信号序列导向到ER、分泌小泡或细胞外空间的蛋白质，以及释放到细胞外空间而不一定包含信号序列的C35蛋白质。如果C35分泌蛋白质被释放到细胞外空间，则其可经胞外加工，产生″成熟″C35蛋白质。可以通过许多机制释放到细胞外空间中，包括胞吐作用和蛋白水解裂解。
此处所用C35″多核苷酸″是指具有SEQ ID NO1中包含的核酸序列的分子。例如，C35多核苷酸可包含全长cDNA序列的核苷酸序列，包括5′和3′非翻译序列、编码区、有或者没有信号序列、分泌蛋白质的编码区以及该核酸序列的片段、表位、结构域和变体。此外，此处所用C35″多肽″广义是指具有由多聚核苷酸产生的翻译的氨基酸序列的分子。
在特定实施方案中，本发明的多核苷酸长度少于300nt、200nt、100nt、50nt、15nt、10nt或7nt。在另外的实施方案中，本发明的多核苷酸包含C35编码序列中至少15个连续核苷酸，但不包含任何C35内含子的全部或部分。在另一实施方案中，包含C35编码序列的该核酸不包含基因组侧翼基因的编码序列(即基因组中C35基因的5′或3′)。
本发明全长C35编码序列如SEQ ID NO1所示。
C35″多核苷酸″也指编码C35多肽的分离的多核苷酸及其密切相关的多核苷酸。
C35″多核苷酸″也指编码SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其生物学活性片段的分离的多核苷酸。
C35″多核苷酸″还包括在严谨的杂交条件下，能够与SEQ ID NO1所含序列、其互补序列或保藏克隆中的cDNA杂交的多核苷酸。″严谨杂交条件″是指在包含50％甲酰胺、5xSSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt′s液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性断裂鲑鱼精DNA的溶液中42℃ 温育过夜，然后用0.1xSSC约65℃洗膜。
当然，″多核苷酸″的定义中不包括仅与polyA+序列(例如cDNA的任何3′端polyA+区)或互补的T(或U)残基序列杂交的多核苷酸，因为这种多核苷酸可以与任何包含poly(A)区或其互补序列的核酸分子(例如，特别是任何双链cDNA克隆)杂交。
C35多核苷酸可由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸组成，可能是未修饰或者修饰的RNA或DNA。例如，C35多核苷酸可由单链和双链DNA、单双链区混合的DNA、单链和双链RNA、单双链区混合的RNA、包含单链或一般为双链或单双链区混合的DNA和RNA的杂合分子组成。此外，C35多核苷酸可由包含RNA、或DNA、或RNA和DNA的三链区组成。C35多核苷酸还可能包含因稳定性或其它原因而修饰的一个或多个修饰碱基或DNA或RNA主链。″修饰″碱基包括，例如三苯甲基化碱基以及稀有碱基，例如次黄苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此″多核苷酸″包含化学、酶学或代谢修饰形式。
C35多肽可由通过肽键或修饰的肽键彼此相连的氨基酸(即肽等排物(isostere))组成，并可能包含除基因编码的20种氨基酸以外的氨基酸。可通过天然过程(例如翻译后加工)或者本领域熟知的化学修饰技术修饰C35多肽。在基础教科书、详尽的专题论文及长篇研究文献中详细阐述了上述修饰。可以在C35多肽的任何位点进行修饰，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可能相同或不同程度位于指定C35多肽的数个位点。此外，指定C35多肽可能包含多种修饰。C35多肽可能是分枝的，例如由泛素化引起，也可能是环状、有或没有分枝。可能利用翻译后天然过程或合成方法产生环状、分枝以及分枝的环状C35多肽。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂类或脂类衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(pegylation)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒代化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的加成，例如精氨酰化和泛素化。(例如参见Proteins-Structure And Molecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter等人，Meth Enzymol 182626-646(1990)；Rattan等人，Ann NY AcadSci 66348-62(1992).)
″SEQ ID NO1″是指C35多核苷酸序列，而″SEQ ID NO2″是指C35多肽序列。
″具有生物学活性″的C35多肽是指按照特定生物学方法测定，具有与C35多肽(包括成熟形式)活性相似而不一定相同的活性的多肽，有或没有剂量依赖性。在有剂量依赖性的情况下，不必与C35多肽相同，而是与C35多肽相比，基本上类似于剂量依赖性的指定活性(即，候选多肽活性高于C35多肽活性、或不低于其活性的约25倍以上、优选不低于约十倍以上、最优选不低于约三倍以上)。
C35多核苷酸和多肽
最初利用源自同一原发和浸润导管内乳腺癌患者的肿瘤和正常乳腺上皮细胞系中的poly-A RNA，通过消减杂交分离348bp C35片段。Band，V等人，Cancer Res.507351-7357(1990)。利用基于该序列及其重叠EST序列(登录号W57569)的引物，从BT-20乳腺肿瘤细胞系(ATCC HTB-19)扩增和克隆包括全长C35编码序列的cDNA。该C35 cDNA包含SEQ ID NO1所示完整编码区。除348bp编码序列之外，该C35克隆还包括167bp3′非翻译区。开放阅读框开始于N端1位核苷酸的甲硫氨酸，终止于348位核苷酸的终止密码子(图1A)。包含全部或大部分SEQ ID NO1序列的典型克隆于2000年8月1日保藏在美国典型培养物保藏中心(″ATCC″)，ATCC保藏号为PTA-2310。ATCC位于10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。依据国际承认的以专利程序为目的进行微生物保藏的布达佩斯条约条款，进行ATCC保藏。
因此，SEQ ID NO1和翻译的SEQ ID NO2足够准确等，适用于本领域熟知的以及下文进一步描述的各种用途。例如，SEQ ID NO1可用于设计核酸杂交探针，以检测SEQ ID NO1所含核酸序列或保藏克隆所含cDNA。这些探针也可与生物样品中的核酸分子杂交，从而建立本发明的各种法医学及诊断方法。类似地，SEQ ID NO2确定的多肽可用来产生特异性结合C35的抗体，或者联合细胞表面MHC分子来刺激C35衍生肽表位特异性的T细胞。
然而，通过测序反应获得的DNA序列可能含有测序错误。所得DNA序列的错误包括核苷酸识别错误、或者核苷酸插入或缺失。错误插入或缺失的核苷酸引起所预测的氨基酸序列的阅读框发生移码。在这些情况下，即使获得的DNA序列与实际的DNA序列的同一性可能大于99.9％(例如1000个碱基以上的开放阅读框中，插入或缺失1个碱基)，所预测的氨基酸序列也不同于实际的氨基酸序列。
因此，对于要求精确的核苷酸序列或氨基酸序列的应用，本发明不仅提供得到的SEQ ID NO1所示核苷酸序列，也提供预测的SEQ ID NO2所示翻译的氨基酸序列。根据已知方法，将保藏的克隆测序，很容易确定保藏的C35克隆的核苷酸序列。因而能从上述保藏物证实预测的C35氨基酸序列。此外，还可以通过肽测序，或者在包含保藏的人C35 cDNA的适当宿主细胞中表达蛋白质、收集该蛋白质并确定其序列，来直接确定该保藏克隆编码蛋白质的氨基酸序列。
本发明还涉及对应于SEQ ID NO1或该保藏克隆的C35基因。可以按照已知方法，利用此处公开的序列信息分离C35基因。此类方法包括根据公开序列制备探针或引物，以及从合适来源的基因组物质中鉴定或扩增C35基因。
本发明还提供了C35的物种同系物。可根据此处提供序列制备合适的探针或引物，在合适的核酸来源中筛选目的同系物，由此分离和鉴定物种同系物。
″C35多肽″是指此处描述的所有形式的C35蛋白质和多肽。可按任何适当的方式制备C35多肽。这些多肽包括分离的天然存在多肽、重组制备的多肽、合成制备的多肽或综合使用这些方法制备的多肽。制备此类多肽的方法为本领域公知。
C35多肽可能是膜蛋白质或分泌蛋白质形式(包括成熟形式)，或者可能是大蛋白质(例如融合蛋白质)的一部分(参见下文)。包括附加的氨基酸序列通常是有利的，其中包含分泌或前导序列、前-序列、有助纯化的序列(例如多个组氨酸残基)或用于重组制备期间稳定性的附加序列。
C35多肽优选以分离形式提供，并优选基本纯化的。可以利用Smith和Johnson，Gene 6731-40(1988)所述一步法基本纯化重组制备的C35多肽(包括分泌多肽)。还可以利用本发明针对C35蛋白质产生的抗体，按照本领域公知的方法，从天然或重组来源中纯化C35多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及能够在人类受试者中引发细胞毒性T淋巴细胞和/或辅助T淋巴细胞应答的分离多肽，该分离多肽包含一个或多个C35肽表位或C35肽表位类似物、或由其组成。在一个优选实施方案中，所述一个或多个C35肽表位选自SEQ ID NO2的氨基酸E4-P12、SEQ ID NO2的氨基酸S9-V17、SEQ ID NO2的氨基酸S21-Y29、SEQ ID NO2的氨基酸G22-C30、SEQ ID NO2的氨基酸I25-C33、SEQ ID NO2的氨基酸T38-V46、SEQ ID NO2的氨基酸G61-I69、SEQ ID NO2的氨基酸T62-N70、SEQ ID NO2的氨基酸G63-G71、SEQ ID NO2的氨基酸F65-L73、SEQ ID NO2的氨基酸I67-F75、SEQ ID NO2的氨基酸K77-Y85、SEQ ID NO2的氨基酸Q72-E86、SEQ ID NO2的氨基酸G81-L89、SEQ ID NO2的氨基酸K104-C112、SEQ ID NO2的氨基酸K104-V113、SEQ IDNO2的氨基酸I105-V113以及SEQ ID NO2的氨基酸N107-L115。在一个优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位(例如一个或多个表1-3或5-6中的八聚体、九聚体、十聚体、15聚体或20聚体)或C35肽表位类似物(例如表4所列类似物)的分离多肽长度不超过114个氨基酸，更优选长度不超过110个氨基酸，更优选长度不超过105个氨基酸，更优选长度不超过100个氨基酸，更优选长度不超过95个氨基酸，更优选长度不超过90个氨基酸，更优选长度不超过85个氨基酸，更优选长度不超过80个氨基酸，更优选长度不超过75个氨基酸，更优选长度不超过70个氨基酸，更优选长度不超过65个氨基酸，更优选长度不超过60个氨基酸，更优选长度不超过55个氨基酸，更优选长度不超过50个氨基酸，更优选长度不超过45个氨基酸，更优选长度不超过40个氨基酸，更优选长度不超过35个氨基酸，更优选长度不超过30个氨基酸，更优选长度不超过25个氨基酸，更优选长度20个氨基酸，更优选长度15个氨基酸，更优选长度14、13、12、11、10、9或8个氨基酸。当然，尽管此处未明白列出，本发明同样包含介于例如8-100个氨基酸之间任意长度的包含C35肽表位或C35肽表位类似物的分离多肽。在一个优选实施方案中，该分离多肽是SEQ ID NO2和图1B所示C35多肽的片段。在另一实施方案中，本发明涉及能够在人类受试者中引发细胞毒性T淋巴细胞和/或辅助T淋巴细胞应答的分离多肽，该分离多肽包含多个C35肽表位或由其组成。在一个特定优选实施方案中，所述多表位多肽选自SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113、SEQ ID NO2的氨基酸E100-V113、SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113、SEQ IDNO2的氨基酸I93-V113、SEQ ID NO2的氨基酸D88-V113、SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113、SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113、SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113、SEQ ID NO2的氨基酸F65-V113以及SEQ ID NO2的氨基酸L59-V113。在另一优选实施方案中，本发明涉及包含至少一个表1-3或5-6所列C35肽表位、或表4所列C35肽表位类似物的融合蛋白质。在另一实施方案中，所述至少一个C35肽表位或C35肽表位类似物融合到异源(即非C35)多肽。在另一优选实施方案中，所述融合蛋白质包含两个或多个C35肽表位或两个或多个C35肽表位类似物，无论同聚物或异聚物。在另一优选实施方案中，本发明融合蛋白质包含至少一个与至少一个C35肽表位连接的C35肽表位类似物。在另一实施方案中，该表位/类似物由氨基酸间隔物或接头相连。
本发明另外涉及包含该分离多肽及融合蛋白质的用作疫苗的药物组合物。
本发明另外涉及刺激人类患者中细胞毒性T细胞和/或辅助T细胞应答的方法，包括给予所述患者免疫源性有效量的本发明的药物组合物。
多核苷酸和多肽变体
″变体″是指与C35多核苷酸或多肽不同、但保持其基本特征的多核苷酸或多肽。一般来说，变体与C35多核苷酸或多肽总体非常类似，并且很多区域相同。
与本发明的参考核苷酸序列具有例如至少95％″同一性″的核苷酸序列的多核苷酸，是指除了该多核苷酸序列在编码C35多肽的参考核苷酸序列的每100个核苷酸中可包括至多5个点突变以外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可以缺失或被其它核苷酸置换，或者参考序列中可能插入参考序列总核苷酸的至多5％的若干核苷酸。查询序列可能是SEQ ID NO1所示完整序列、ORF(开放阅读框)或者此处所述的任何特定片段。
实际上，任何特定的核酸分子或者多肽，都可以利用已知的计算机程序，按常规确定其是否与本发明的核苷酸序列或多肽序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。利用基于Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6237-245(1990)算法的FASTDB计算机程序，可以确定用于确定查询序列(本发明的序列)和目标序列之间最佳总体匹配的优选方法，也称为整体序列比对。在序列比对中，查询和目标序列都是DNA序列。可以将U转变为T来比较RNA序列。所述整体序列比对的结果表示为同一性百分比。在DNA序列的FASTDB比对中，用于计算同一性百分比的优选参数是矩阵＝一元、k-tuple＝4、错配罚分＝1、连接罚分＝30、随机组长度＝0、分值阈值(Cutoff Score)＝1、空位罚分＝5、空位大小罚分0.05、窗口大小＝500或目标核苷酸序列的长度(采用其中较短者)。
如果由于5′或3′缺失而非内部缺失使目标序列短于查询序列，必须对结果进行手工修正。这是因为在计算同一性百分比时，FASTDB程序不解释5′和3′端截短的目标序列。对于5′或3′末端截短的目标序列，通过计算目标序列5′和3′不匹配/比对的查询序列碱基数目占查询序列碱基总数的百分比，校正其相对查询序列的同一性百分比。由FASTDB序列比对结果确定核苷酸是否匹配/比对。然后从利用以上FASTDB程序按特定参数计算的同一性百分比中减去该百分比，得到最后的同一性百分比分值。本发明便使用该校正的分值。为了手工调整同一性百分比分值，只计算通过FASTDB比对显示的位于目标序列5′和3′碱基以外、与查询序列不匹配/比对的碱基。
例如，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列比对，以确定同一性百分比。目标序列5′存在缺失，因此FASTDB比对不显示5′端前10个碱基的匹配/比对。该10个不配对碱基代表序列的10％(不匹配的5′和3′端碱基数/查询序列的碱基总数)，所以从FASTDB程序计算的同一性百分比分值中减去10％。如果其余的90个碱基完全匹配，最后的同一性百分比应是90％。另一个例子，比较90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列。这次缺失是内部缺失，所以目标序列的5′或3′没有与查询序列不匹配/比对的碱基。在这种情况下，不对FASTDB计算的同一性百分比进行手工校正。再次重申，只手工校正与查询序列不匹配/比对的目标序列的5′和3′碱基。不为本发明做其它的手工校正。
具有与本发明的查询氨基酸序列例如至少95％″同一性″的氨基酸序列的多肽，是指除该目标多肽序列可以在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中包括至多5个氨基酸改变以外，该目标多肽的氨基酸序列与查询序列相同。换言之，为了获得与查询氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，目标序列中至多5％的氨基酸残基可被插入、缺失或用其它氨基酸置换。参考序列的这些改变可能发生在参考氨基酸序列的氨基端或羧基端或者该末端之间的任何位置，分别散布于参考序列的残基之中或者在参考序列内分布成一个或多个连续组。
实际上，任何特定的多肽，都可以利用已知的计算机程序，按常规确定其是否与例如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者由保藏的DNA克隆编码的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。利用基于Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6237-245(1990)算法的FASTDB计算机程序，可以确定用于确定查询序列(本发明的序列)和目标序列之间最佳总体匹配的优选方法，也称为整体序列比对。在序列比对中，查询序列和目标序列都是核苷酸序列，或者都是氨基酸序列。所述整体序列比对的结果表示为同一性百分比。用于FASTDB氨基酸比对的优选参数是矩阵＝PAM 0、k-tuple＝2、错配罚分＝1、连接罚分＝20、随机组长度＝0、分值阈值＝1、窗口大小＝序列长度、空位罚分＝5、空位大小罚分＝0.05、窗口大小＝500或者目标氨基酸序列的长度(采用其中较短者)。
如果由于-或C-端缺失而不是内部缺失，使目标序列短于查询序列，必须对结果进行手工修正。这是因为在计算整体同一性百分比时，FASTDB程序不考虑目标序列的-和C-端截短。对于-或C-端截短的目标序列，通过计算目标序列-和C-端与对应目标残基不匹配/比对的查询序列残基数目占查询序列碱基总数的百分比，校正其相对于查询序列的同一性百分比。由FASTDB序列比对结果确定残基是否匹配/比对。然后从利用以上FASTDB程序按特定参数计算的同一性百分比中减去该百分比，得到最后的同一性百分比分值。该最后的同一性百分比分值用于本发明。为了手工调整同一性百分比分值，只考虑目标序列-和C-末端与查询序列不匹配/比对的残基。即，只查询目标序列最-和C-末端残基以外位置的残基。
例如，将90个氨基酸残基的目标序列与100个氨基酸残基的查询序列比对，以确定同一性百分比。目标序列的N-端发生缺失，因此FASTDB比对不显示N-端前10个残基的匹配/比对。10个未配对残基代表序列的10％(不匹配的-和C-端残基数/查询序列的残基总数)，所以从FASTDB程序计算的同一性百分比分值中减去10％。如果其余的90个碱基完全匹配，最后的同一性百分比应是90％。另一个例子，比较90个残基的目标序列与100个残基的查询序列。这次缺失是内部缺失，所以目标序列的-或C-端没有与查询序列不匹配/比对的残基。在这种情况下，不对FASTDB计算的同一性百分比进行手工校正。再次重申，只手工校正FASTDB比对中显示的与查询序列不匹配/比对的目标序列-和C-端以外位置的残基。不为本发明做其它的手工校正。
C35变体的编码区、非编码区或两者都可能包含改变。特别优选的是包含产生沉默置换、添加或缺失的改变，而不改变所编码多肽性质或活性的多核苷酸变体。优选由遗传密码简并性所致沉默置换产生的核苷酸变体。此外，还优选其中5-10、1-5或1-2氨基酸以任何组合置换、缺失或添加的变体。可因各种理由制备C35多核苷酸变体，例如为了优化特定宿主表达的密码子(将人mRNA密码子改为细菌宿主如E.coli偏性密码子)。
天然存在的C35变体称为″等位基因变体″，是指占据生物染色体指定基因座的基因的几个不同形式之一。(Genes II，Lewin，B.，ed.，John Wiley & Sons，New York(1985).)等位基因变体也能以″串联等位基因″的形式存在，是存在于生物体染色体不同基因座的高度同源序列。这些等位基因变体可以在多核苷酸和/或多肽水平上不同。另外，利用诱变技术或直接合成，可制备非天然产生的变体。
利用已知的蛋白质工程和重组DNA技术方法，可能产生提高或改变C35多肽特性的变体。例如，可以将分泌蛋白质N-端或C-端的一个或多个氨基酸缺失，而基本上不损失生物学功能。作者Ron等人，J.Biol.Chem.2682984-2988(1993)报告了甚至在缺失氨基端3、8或27个氨基酸残基后仍具有肝素结合活性的KGF蛋白质变体。类似地，缺失蛋白质羧基端8-10氨基酸残基后，γ干扰素显示高达10倍的活性(Dobeli等，J.Biotechnology 7199-216(1988))。
此外，充分证据表明变体通常保持与天然蛋白质类似的生物学活性。例如，Gayle及合作者(J.Biol.Chem 26822105-22111(1993))对人细胞因子IL-1a进行了广泛的突变分析。他们利用随机诱变产生了3,500个以上独立的IL-1a变体，每个变体分子全长中平均有2.5个氨基酸改变。在每个可能的氨基酸位置检测出多个突变。研究者发现″可以改变分子的大部分，而对其[结合或生物学活性]没有影响″(参见摘要)。事实上，在检测的超过3,500个核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列，产生了活性显著不同于野生型的蛋白质。
此外，即使多肽N-端或C-端的一个或多个氨基酸缺失引起一种或多种生物学功能的改变或丧失，仍然可能保留其它的生物学活性。例如，从N-端或C-端除去分泌形式的少数残基时，可能保留缺失变体诱导和/或结合识别分泌形式抗体的能力。利用此处所述及本领域已知的常规方法，很容易确定缺少蛋白质-或C-端残基的特定多肽是否保留该免疫原性活性。
因此，本发明另外包括显示基本生物学活性的C35多肽变体。该变体包括根据本领域已知的一般规则选择的不影响活性的缺失、插入、倒位、重复和置换。例如，Bowie J.U.等人，Science 2471306-1310(1990)提供了有关制备表型沉默的氨基酸置换的指南，其中作者指出，有两种主要的策略研究氨基酸序列对变化的耐受。
第一种策略利用进化过程中的自然选择产生氨基酸置换的耐受性。通过比较不同物种的氨基酸序列，可以鉴定保守氨基酸。这些保守氨基酸对于蛋白质功能可能是重要的。相反，通过自然选择而耐受置换的氨基酸位点，表明其对于蛋白质功能不重要。因此，可以修饰耐受氨基酸置换的位点，而仍然保持该蛋白质的生物学活性。
第二种策略利用基因工程在克隆基因的特定位点引入氨基酸改变，以鉴定对于蛋白质功能重要的区域。例如，可以使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(alanine-scanning mutagenesis)(在分子中的每个残基引入单个丙氨酸突变)。(Cunningham和Wells，Science 2441081-1085(1989).)然后测试所得突变分子的生物学活性。
如作者所述，这两种策略揭示了蛋白质惊人耐受氨基酸置换。作者进一步指出，很可能是容许蛋白质某些氨基酸位点的氨基酸改变。例如，最隐蔽(蛋白质三级结构内部)的氨基酸残基需要非极性侧链，而一般很少保留表面侧链的特征。此外，耐受的保守氨基酸置换包括脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的置换；羟基残基Ser和Thr的置换；酸性残基Asp和Glu的置换；酰胺残基Asn和Gln的置换，碱性残基Lys、Arg和His的置换；芳香族残基Phe、Tyr和Trp的置换，以及小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的置换。
除了保守氨基酸置换，C35的变体还包括(i)用一个或多个非保守氨基酸残基置换，其中被置换的氨基酸残基可能是或不是由遗传密码编码的，或者(ii)用一个或多个具有取代基团的氨基酸残基置换，或者(iii)成熟多肽与另一化合物融合，例如增强多肽稳定性和/或可溶性的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)多肽与另外的氨基酸融合，例如IgG Fc融合区肽、或前导或分泌序列、或便于纯化的序列。可以认为本领域技术人员根据此处教导可以理解此类多肽变体。
例如，包含氨基酸置换(用其它带电荷或中性的氨基酸置换带电荷的氨基酸)的C35多肽变体，可能制备具有改良特性的蛋白质，例如较少聚集的蛋白质。药物制剂的聚集因聚集物的免疫原性活性而使活性减低、清除率提高。(Pinckard等人，Clin.Exp.Immunol.2331-340(1967)；Robbins等人，Diabetes 36838-845(1987)；Cleland等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10307-377(1993).)
多核苷酸和多肽片段
本发明″多核苷酸片段″是指具有保藏克隆所含或SEQ ID NO1所示的核酸序列的短的多核苷酸。该短核苷酸片段长度优选至少约15nt、再优选至少约20nt、更优选至少约30nt、最优选至少约40nt。例如“至少20nt长”的片段是指包括保藏克隆所含cDNA序列或者SEQ ID NO1所示核苷酸序列中20个或更多的连续碱基。这些核苷酸片段如此处所述用作诊断探针和引物。当然优选大片段(例如至少50、100、150、200、250、300个核苷酸)。
此外，C35多核苷酸片段的典型例子包括，例如具有SEQ ID NO1或者保藏克隆所含cDNA大约核苷酸编号为1-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300或301到终点的序列的片段。其中″大约″包括所述的特定范围，可以在一端或两端多或少几个(5、4、3、2或1)核苷酸。优选这些片段编码具有生物学活性的多肽。更优选这些多核苷酸可以如此处所述用作探针或引物。
本发明中″多肽片段″是指SEQ ID NO2和图1B所含或保藏克隆所含cDNA编码的短氨基酸序列。蛋白质片段可能是″独立的″或包含在大的多肽内而形成其部分或区域，最优选作为单个连续区域。本发明多肽片段的典型例子包括，例如大约氨基酸编号为1-20、21-40、41-60、61-80、81-100或101到编码区终点的片段。此外，多肽片段长度可以包含7、8、9、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。其中″大约″包括所述的特定范围或长度，可以在一端或两端多或少几个(5、4、3、2或1个)氨基酸。
优选多肽片段包括分泌的C35蛋白质及其成熟形式。更优选的多肽片段包括氨基或羧基末端或两者都有一系列连续缺失残基的分泌的C35蛋白质或成熟形式。进一步优选的多肽片段包括包含一个或多个C35肽表位的C35多肽片段。
如上所述，即使蛋白质N-端的一个或多个氨基酸缺失引起该蛋白质的一种或多种生物学功能改变或丧失，仍然可能保留其它的生物学活性。因此，从N-端去除完全或成熟多肽的少数残基时，短的C35突变蛋白质通常可保留诱导和/或结合识别完整或成熟形式多肽的抗体的能力。利用此处所述及本领域已知的常规方法，很容易确定缺少完整多肽N端残基的特定多肽是否保留上述免疫学活性。N端氨基酸残基大量缺失的C35突变蛋白质并非不太可能保留某些生物学或免疫原性活性。实际上，就C35肽表位而言，由少至9、8或甚而7个C35氨基酸残基组成的肽通常引发免疫应答。
因此，本发明还提供在SEQ ID NO2所示C35氨基酸序列的氨基端缺失一个或多个残基、直至位点编号105的苏氨酸残基的多肽以及编码该多肽的多核苷酸。
还如上所述，即使蛋白质C-端的一个或多个氨基酸缺失引起该蛋白质的一种或多种生物学功能改变或丧失，仍然可能保留其它的生物学活性。因此，从C-端除去完全或成熟多肽的少数残基时，短的C35突变蛋白质通常可保留诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和/或辅助T淋巴细胞(HTL)和/或结合可识别完整或成熟形式多肽的抗体的能力。利用此处所述及本领域已知的常规方法，很容易确定缺少完整多肽C端残基的特定多肽是否保留上述免疫学活性。C端氨基酸残基大量缺失的C35突变蛋白质并非不太可能保留某些生物学或免疫原性活性。
因此，本发明还提供在SEQ ID NO2所示C35多肽氨基酸序列的羧基端缺失一个或多个残基、直至位点编号10的缬氨酸残基的多肽以及编码该多肽的多核苷酸。
此外，本发明还提供在氨基和羧基两端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在优选实施方案中，本发明涉及具有下列残基的肽SEQ ID NO2的E4-P12、S9-V17、V10-V17、E16-V23、E16-R24、E16-I25、S21-Y29、S21-F35、G22-C30、I25-C33、C30-T38、E31-Y39、E36-A43、A37-A45、A37-V46、T38-V46、Y39-V46、S44-I53、A45-I53、G52-L59、E54-T62、S57-F75、R58-I67、L59-V113、G61-I69、T62-N70、G63-G71、G63-F83、F65-L73、F65-V113、E66-L73、E66-V74、I67-F75、K77-Y85、K77-V113、Q72-E86、Q72-V113、G81-L89、F83-E103、P84-V113、D88-A96、D88-V113、L89-A96、A92-T101、I93-V113、R95-L102、A96-K104、G99-V113、E100-V113、T101-V113、K104-C112、K104-V113、I105-V113、I105-I114或N107-L115及编码上述肽的多核苷酸。
公众可以通过序列数据库获得和利用很多的多核苷酸序列，例如EST序列。
在EST数据库的BLAST检索中，鉴定了下述人EST序列。这些序列据认为是所述GenBank登录号鉴定的cDNA插入物的部分序列。在所述的GenBank数据库的检索中，未鉴定到同源序列。期望值(E)是描述在检索特定大小的数据库时，可以″期望″只是偶然发现的命中(hit)数的参数。它随着代表两个序列之间匹配的分值(S)而指数性下降。本质上，E值描述因序列之间匹配而产生的随机背景噪声。在BLAST 2.0中，还利用期望值代替P值(概率)报告匹配显著性。例如，将一个命中的E值赋为1可以解释为，是指在当前大小的数据库中，可以期待仅仅偶然发现类似分值的一个匹配。
例如，下列序列与SEQ ID NO1有关，GenBank登录号AA971857(SEQ ID NO3)；W57569(SEQ ID NO4)；AI288765(SEQ ID NO5)；W65390(SEQ ID NO6)；W37432(SEQ ID NO7)；N42748(SEQ ID NO8)；AA971638(SEQ ID NO9)；R22331(SEQ ID NO10)；AA308370(SEQID NO11)；AA285089(SEQ ID NO12)；R68901(SEQ ID NO13)；AA037285(SEQ ID NO14)；H94832(SEQ ID NO15)；H96058(SEQ IDNO16)；H56522(SEQ ID NO17)；AA935328(SEQ ID NO18)；AW327450(SEQ ID NO19)；AW406075(SEQ ID NO20)；AW406223(SEQ ID NO21)；AI909652(SEQ ID NO22)；AA026773(SEQ ID NO23)；H96055(SEQ ID NO24)；H12836(SEQ ID NO25)；R22401(SEQ ID NO26)；N34596(SEQ ID NO27)；W32121(SEQ ID NO28)；T84927(SEQ IDNO29)；R63575(SEQ ID NO30)；R23139(SEQ ID NO31)；AA337071(SEQ ID NO32)；AA813244(SEQ ID NO33)；AA313422(SEQ ID NO34)；N31910(SEQ IDNO35)；N42693(SEQ ID NO36)；N32532(SEQIDNO37)；AA375119(SEQ ID NO38)；R32153(SEQ ID NO39)；R23369(SEQ ID NO40)；AA393628(SEQ ID NO41)；H12779(SEQ ID NO42)；AI083674(SEQ ID NO43)；AA284919(SEQ ID NO44)；AA375286(SEQID NO45)；AA830592(SEQ ID NO46)；H95363(SEQ ID NO47)；T92052(SEQ ID NO48)；AI336555(SEQ ID NO49)；AI285284(SEQID NO50)；AA568537(SEQ ID NO51)；AI041967(SEQ ID NO52)；W44577(SEQ ID NO53)；R22332(SEQ ID NO54)；N27088(SEQ IDNO55)；H96418(SEQ ID NO56)；AI025384(SEQ ID NO57)；AA707623(SEQ ID NO58)；AI051009(SEQ ID NO59)；AA026774(SEQ ID NO60)；W51792(SEQ ID NO61)；AI362693(SEQ ID NO62)；AA911823(SEQ ID NO63)；H96422(SEQ ID NO64)；AI800991(SEQ ID NO65)；AI525314(SEQ ID NO66)；AI934846(SEQ ID NO67)；AI937133(SEQID NO68)；AW006797(SEQ ID NO69)；AI914716(SEQ ID NO70)；AI672936(SEQ ID NO71)；W61294(SEQ ID NO72)；AI199227(SEQID NO73)；AI499727(SEQ ID NO74)；R32154(SEQ ID NO75)；AI439771(SEQ ID NO76)；AA872671(SEQ ID NO77)；AA502178(SEQID NO78)；N26715(SEQ ID NO79)；AA704668(SEQ ID NO80)；R68799(SEQ ID NO81)；H56704(SEQ ID NO82)；AI360416(SEQ IDNO83)。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含此处所述多核苷酸片段以及全长多核苷酸(例如编码区)、而不包括一种或多种上述EST的多核苷酸。本发明也不包括SEQ ID NO152、SEQ ID NO154和SEQ ID NO156的核苷酸序列。
还优选以结构域或功能域为特征的C35多肽和多核苷酸片段。本发明的优选实施方案包括含有MHC结合表位和异戊二烯化位点的片段。
其它优选片段为生物学活性的C35片段。生物学活性片段应具有与C35多肽的活性类似而不一定相同的活性的片段。片段的生物学活性可能包括提高所需的活性、或降低不合需要的活性。
表位&抗体
由内源合成的蛋白质降解产生的细胞肽，被移位到前高尔基小室，在此与I类或II类MHC分子结合，供转运到细胞表面。这些I类MHC肽复合物是特异性CD8+细胞毒性T细胞的靶抗原。因为所有内源性蛋白质都″转变″，来源于任何细胞质或细胞核蛋白质的肽都可能结合MHC分子并转运，呈递于细胞表面。这使T细胞比抗体针对更大的细胞蛋白质群体，抗体只局限于识别那些分泌或整合于细胞膜的蛋白质的构象决定簇。T细胞受体的抗原结合位点与肽以及周围MHC的决定簇相互作用。因此必须根据MHC肽复合物来确定T细胞的特异性。肽结合MHC分子的特异性很广，相比特异性抗体的抗原结合位点，其亲和力相对较低。结合I类分子的肽一般长为8-10个残基，并在某些关键位点容许有限多样性的氨基酸侧链，匹配MHC肽结合位点的口袋。结合特定MHC分子的肽的这些主要特征，构成肽结合基序。
用于讨论肽表位时，术语″衍生″是″制备″的同义词。衍生表位可分离自天然来源或根据本领域标准规程合成。合成表位可包含人工氨基酸″氨基酸模拟物″，例如天然存在L氨基酸的D异构体、或非天然氨基酸，例如丙氨酸环己酯。衍生/制备的表位可以是天然表位的类似物。
″表位″是分子的集体(collective)特征，例如一级、二级和三级肽结构以及电荷，共同形成免疫球蛋白、T细胞受体或HLA分子的识别位点。或者，表位可定义为与特定免疫球蛋白识别有关的一组氨基酸残基，或对于T细胞而言，这些残基为T细胞受体蛋白质和/或主要组织相容性复合物(MHC)受体识别所必需。表位天然存在，并可以人为分离、纯化或制备/衍生。例如，表位可分离自天然来源或根据本领域标准规程合成。合成表位可包含人工氨基酸″氨基酸模拟物″，例如天然存在L氨基酸的D异构体、或非天然氨基酸，例如丙氨酸环己酯。术语表位和肽通常在本说明书中交互使用。此处所用术语表位还一般理解为包括所述表位的类似物。
应当理解，包含本发明一个或多个C35肽表位及其它氨基酸的蛋白质或多肽分子仍属本发明范围之内。在某些实施方案中，对本发明多肽的长度有限制，例如不多于114个氨基酸、不多于110个氨基酸、不多于100个氨基酸、不多于95个氨基酸、不多于90个氨基酸、不多于85个氨基酸、不多于80个氨基酸、不多于75个氨基酸、不多于70个氨基酸、不多于65个氨基酸、不多于60个氨基酸、不多于55个氨基酸、不多于50个氨基酸、不多于45个氨基酸、不多于40个氨基酸、不多于35个氨基酸、不多于30个氨基酸、不多于25个氨基酸、20个氨基酸、15个氨基酸或14、13、12、11、10、9或8个氨基酸。在某些情况下，当包含本发明表位的蛋白质/多肽含有与天然序列具有100％同一性的区域(即，连续氨基酸)时，该实施方案存在长度限制。为避免表位的定义通读例如整个天然分子，对与天然多肽序列具有100％同一性的任意区域有长度限制。因此，对于包含本发明表位以及与天然C35多肽序列具有100％同一性的区域的多肽而言，与天然序列具有100％同一性的区域长度一般为少于或等于114个氨基酸、更通常少于或等于100个氨基酸、通常少于或等于85个氨基酸、通常少于或等于75个氨基酸、通常少于或等于65个氨基酸、通常少于或等于50个氨基酸。在某些实施方案中，本发明的C35多肽包含一种肽，该肽具有与天然肽序列具有100％同一性的少于50个氨基酸的区域，可以是任意增量的氨基酸(即，49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5)低至5个氨基酸。优选该C35多肽包含一个或多个C35肽表位。
因此，只要不包含任何与天然多肽序列具有100％同一性的多于114个氨基酸的连续序列，超过100个氨基酸的肽或蛋白质序列就属于本发明范围之内。对具有对应天然序列的5个或更少连续残基的任何多肽没有多肽最大长度限制，以位于本发明范围之内。在一个实施方案中，包含一个或多个C35肽表位的本发明多肽长度少于60个残基，以任何增量减至8个氨基酸残基。
″免疫源性肽″或″肽表位″是结合HLA分子并诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答和/或辅助T淋巴细胞(HTL)应答的肽。因此，本发明的免疫源性肽能够结合适当的HLA分子，从而针对该肽诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答或辅助T淋巴细胞(HTL)应答。
术语″基序″是指位于确定长度氨基酸序列中的残基模式，通常I类HLA基序的肽约8-10个氨基酸，II类HLA基序的肽约16-25个氨基酸，可由特定HLA分子识别。对于由给定的人HLA等位基因编码的每个HLA蛋白质，基序一般不同。这些基序的不同之处通常在于其一级和二级锚残基的模式。
″保护性免疫应答″或″治疗性免疫应答″是指针对衍生自病原性抗原的抗原(例如来自感染剂的抗原或肿瘤抗原)的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和/或辅助T淋巴细胞(HTL)应答，以某种方式预防或至少部分阻止疾病症状、副作用或进展。免疫应答还可能包括由刺激辅助T细胞促进的抗体应答。
术语″残基″是指通过酰胺键或酰胺键模拟物结合入肽或蛋白质的氨基酸或氨基酸模拟物。
″合成肽″是指非天然存在的肽，而是使用诸如化学合成或重组DNA技术等方法人工制备。
此处所用″疫苗″是包含一个或多个本发明肽表位(参见例如表1-3和5-6，不包括肽E-100至R-109)和药物可接受载体的组合物。根据本发明有多种疫苗实施方案，例如一个或多个肽的组合；包含一个或多个本发明肽的多表位肽；或编码上述肽或多肽的核酸，例如编码多表位肽的微基因。″一个或多个肽″或″一个或多个表位″可包括例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多的本发明的肽或表位。可任意改变肽或多肽，例如脂化、加成靶或其它序列。本发明的HLA I类结合肽可以连接到HLA II类结合肽，以促进细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞二者的活化。疫苗可包含肽脉冲的抗原呈递细胞，例如树突状细胞。
在一个优选实施方案中，本发明分离的多肽包含以下一个或多个C35肽表位或由其组成SEQ ID NO2的氨基酸E4-P12、SEQ ID NO2的氨基酸S9-V17、SEQ ID NO2的氨基酸S21-Y29、SEQ ID NO2的G22-C30、SEQ ID NO2的氨基酸I25-C33、SEQ ID NO2的氨基酸T38-V46、SEQ ID NO2的氨基酸G61-I69、SEQ ID NO2的氨基酸T62-N70、SEQ ID NO2的氨基酸G63-G71、SEQ ID NO2的氨基酸F65-L73、SEQ ID NO2的氨基酸I67-F75、SEQ ID NO2的氨基酸K77-Y85、SEQ ID NO2的氨基酸Q72-E86、SEQ ID NO2的氨基酸G81-L89、SEQ ID NO2的氨基酸K104-C112、SEQ ID NO2的氨基酸K104-V113、SEQ ID NO2的氨基酸I105-V113或SEQ ID NO2的氨基酸N107-L115。在另一实施方案中，所述多肽包含选自下列的一个或多个C35肽表位或由其组成SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ ID NO2的L59-V113。本发明涵盖在某些情况下，本发明C35肽表位片段及包含C35肽表位片段的多肽也可用于刺激细胞毒性T淋巴细胞应答。因此本发明包括从肽的N端或C端缺失所述肽序列中的1、2、3、4、5或更多氨基酸的C35肽表位片段。此外，本发明涵盖包含一个或多个本发明肽表位的C35多肽大片段也可用于刺激患者CTL应答。还涵盖包含一个或多个本发明肽表位连同异源(即，非C35)侧翼序列的多肽也可用于刺激CTL应答。
除上述具体列出的特定C35肽表位之外，本发明还涵盖许多其它的肽表位。因此，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列8聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-T8；S2-S9；G3-V10；E4-A11；P5-P12；G6-P13；Q7-P14；T8-E15；S9-E16；V10-V17；A11-E18；P12-P19；P13-G20；P14-S21；E15-G22；E16-V23；V17-R24；E18-I25；P19-V26；G20-V27；S21-E28；G22-Y29；V23-C30；R24-E31；I25-P32；V26-C33；V27-G34；E28-F35；Y29-E36；C30-A37；E31-T38；P32-Y39；C33-L40；G34-E41；F35-L42；E36-A43；A37-S44；T38-A45；Y39-V46；L40-K47；E41-E48；L42-Q49；A43-Y50；S44-P51；A45-G52；V46-I53；K47-E54；E48-I55；Q49-E56；Y50-S57；P51-R58；G52-L59；I53-G60；E54-G61；I55-T62；E56-G63；S57-A64；R58-F65；L59-E66；G60-I67；G61-E68；T62-I69；G63-N70；A64-G71；F65-Q72；E66-L73；I67-V74；E68-F75；I69-S76；N70-K77；G71-L78；Q72-E79；L73-N80；V74-G81；F75-G82；S76-F83；K77-P84；L78-Y85；E79-E86；N80-K87；G81-D88；G82-L89；F83-I90；P84-E91；Y85-A92；E86-I93；K87-R94；D88-R95；L89-A96；I90-S97；E91-N98；A92-G99；I93-E100；R94-T10；R95-L102；A96-E103；S97-K104；N98-I105；G99-T106；E100-N107；T101-S108；L102-R109；E103-P110；K104-P111；I105-C112；T106-V113；N107-I114和S108-L115。
在另一实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列9聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-S9；S2-V10；G3-A11；E4-P12；P5-P13；G6-P14；Q7-E15；T8-E16；S9-V17；V10-E18；A11-P19；P12-G20；P13-S21；P14-G22；E15-V23；E16-R24；V17-I25；E18-V26；P19-V27；G20-E28；S21-Y29；G22-C30；V23-E31；R24-P32；I25-C33；V26-G34；V27-F35；E28-E36；Y29-A37；C30-T38；E31-Y39；P32-L40；C33-E41；G34-L42；F35-A43；E36-S44；A37-A45；T38-V46；Y39-K47；L40-E48；E41-Q49；L42-Y50；A43-P51；S44-G52；A45-I53；V46-E54；K47-I55；E48-E56；Q49-S57；Y50-R58；P51-L59；G52-G60；I53-G61；E54-T62；I55-G63；E56-A64；S57-F65；R58-E66；L59-I67；G60-E68；G61-I69；T62-N70；G63-G71；A64-Q72；F65-L73；E66-V74；I67-F75；E68-S76；I69-K77；N70-L78；G71-E79；Q72-N80；L73-G81；V74-G82；F75-F83；S76-P84；K77-Y85；L78-E86；E79-K87；N80-D88；G81-L89；G82-I90；F83-E91；P84-A92；Y85-I93；E86-R94；K87-R95；D88-A96；L89-S97；I90-N98；E91-G99；A92-E100；I93-T101；R94-L102；R95-E103；A96-K104；S97-I105；N98-T106；G99-N107；E100-S108；T101-R109；L102-P110；E103-P111；K104-C112；I105-V113；T106-I114和N107-L115。
在另一实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列10聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-V10；S2-A11；G3-P12；E4-P13；P5-P14；G6-E15；Q7-E16；T8-V17；S9-E18；V10-P19；A11-G20；P12-S21；P13-G22；P14-V23；E15-R24；E16-I25；V17-V26；E18-V27；P19-E28；G20-Y29；S21-C30；G22-E31；V23-P32；R24-C33；I25-G34；V26-F35；V27-E36；E28-A37；Y29-T38；C30-Y39；E31-L40；P32-E41；C33-L42；G34-A43；F35-S44；E36-A45；A37-V46；T38-K47；Y39-E48；L40-Q49；E41-Y50；L42-P51；A43-G52；S44-I53；A45-E54；V46-I55；K47-E56；E48-S57；Q49-R58；Y50-L59；P51-G60；G52-G61；I53-T62；E54-G63；I55-A64；E56-F65；S57-E66；R58-I67；L59-E68；G60-I69；G61-N70；T62-G71；G63-Q72；A64-L73；F65-V74；E66-F75；I67-S76；E68-K77；I69-L78；N70-E79；G71-N80；Q72-G81；L73-G82；V74-F83；F75-P84；S76-Y85；K77-E86；L78-K87；E79-D88；N80-L89；G81-I90；G82-E91；F83-A92；P84-I93；Y85-R94；E86-R95；K87-A96；D88-S97；L89-N98；I90-G99；E91-E100；A92-T101；I93-L102；R94-E103；R95-K104；A96-I105；S97-T106；N98-N107；G99-S108；E100-R109；T101-P110；L102-P111；E103-C112；K104-V113；I105-I114；T106-L115。
在另一实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列11聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-A11；S2-P12；G3-P13；E4-P14；P5-E15；G6-E16；Q7-V17；T8-E18；S9-P19；V10-G20；A11-S21；P12-G22；P13-V23；P14-R24；E15-I25；E16-V26；V17-V27；E18-E28；P19-Y29；G20-C30；S21-E31；G22-P32；V23-C33；R24-G34；I25-F35；V26-E36；V27-A37；E28-T38；Y29-Y39；C30-L40；E31-E41；P32-L42；C33-A43；G34-S44；F35-A45；E36-V46；A37-K47；T38-E48；Y39-Q49；L40-Y50；E41-P51；L42-G52；A43-I53；S44-E54；A45-I55；V46-E56；K47-S57；E48-R58；Q49-L59；Y50-G60；P51-G61；G52-T62；I53-G63；E54-A64；I55-F65；E56-E66；S57-I67；R58-E68；L59-I69；G60-N70；G61-G71；T62-Q72；G63-L73；A64-V74；F65-F75；E66-S76；I67-K77；E68-L78；I69-E79；N70-N80；G71-G81；Q72-G82；L73-F83；V74-P84；F75-Y85；S76-E86；K77-K87；L78-D88；E79-L89；N80-I90；G81-E91；G82-A92；F83-I93；P84-R94；Y85-R95；E86-A96；K87-S97；D88-N98；L89-G99；I90-E100；E91-T101；A92-L102；I93-E103；R94-K104；R95-I105；A96-T106；S97-N107；N98-S108；G99-R109；E100-P110；T101-P111；L102-C112；E103-V113；K104-I114；I105-L115。
在另一优选实施方案中，包含C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列12聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-P12；S2-P13；G3-P14；E4-E15；P5-E16；G6-V17；Q7-E18；T8-P19；S9-G20；V10-S21；A11-G22；P12-V23；P13-R24；P14-I25；E15-V26；E16-V27；V17-E28；E18-Y29；P19-C30；G20-E31；S21-P32；G22-C33；V23-G34；R24-F35；I25-E36；V26-A37；V27-T38；E28-Y39；Y29-L40；C30-E41；E31-L42；P32-A43；C33-S44；G34-A45；F35-V46；E36-K47；A37-E48；T38-Q49；Y39-Y50；L40-P51；E41-G52；L42-I53；A43-E54；S44-I55；A45-E56；V46-S57；K47-R58；E48-L59；Q49-G60；Y50-G61；P51-T62；G52-G63；I53-A64；E54-F65；I55-E66；E56-I67；S57-E68；R58-I69；L59-N70；G60-G71；G61-Q72；T62-L73；G63-V74；A64-F75；F65-S76；E66-K77；I67-L78；E68-E79；I69-N80；N70-G81；G71-G82；Q72-F83；L73-P84；V74-Y85；F75-E86；S76-K87；K77-D88；L78-L89；E79-I90；N80-E91；G81-A92；G82-I93；F83-R94；P84-R95；Y85-A96；E86-S97；K87-N98；D88-G99；L89-E100；I90-T101；E91-L102；A92-E103；I93-K104；R94-I105；R95-T106；A96-N107；S97-S108；N98-R109；G99-P110；E100-P111；T101-C112；L102-V113；E103-I114；K104-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列13聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-P13；S2-P14；G3-E15；E4-E16；P5-V17；G6-E18；Q7-P19；T8-G20；S9-S21；V10-G22；A11-V23；P12-R24；P13-I25；P14-V26；E15-V27；E16-E28；V17-Y29；E18-C30；P19-E31；G20-P32；S21-C33；G22-G34；V23-F35；R24-E36；I25-A37；V26-T38；V27-Y39；E28-L40；Y29-E41；C30-L42；E31-A43；P32-S44；C33-A45；G34-V46；F35-K47；E36-E48；A37-Q49；T38-Y50；Y39-P51；L40-G52；E41-I53；L42-E54；A43-I55；S44-E56；A45-S57；V46-R58；K47-L59；E48-G60；Q49-G61；Y50-T62；P51-G63；G52-A64；I53-F65；E54-E66；I55-I67；E56-E68；S57-I69；R58-N70；L59-G71；G60-Q72；G61-L73；T62-V74；G63-F75；A64-S76；F65-K77；E66-L78；I67-E79；E68-N80；I69-G81；N70-G82；G71-F83；Q72-P84；L73-Y85；V74-E86；F75-K87；S76-D88；K77-L89；L78-I90；E79-E91；N80-A92；G81-I93；G82-R94；F83-R95；P84-A96；Y85-S97；E86-N98；K87-G99；D88-E100；L89-T101；I90-L102；E91-E103；A92-K104；I93-I105；R94-T106；R95-N107；A96-S108；S97-R109；N98-P110；G99-P111；E100-C112；T101-V113；L102-I114；E103-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列14聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-P14；S2-E15；G3-E16；E4-V17；P5-E18；G6-P19；Q7-G20；T8-S21；S9-G22；V10-V23；A11-R24；P12-I25；P13-V26；P14-V27；E15-E28；E16-Y29；V17-C30；E18-E31；P19-P32；G20-C33；S21-G34；G22-F35；V23-E36；R24-A37；I25-T38；V26-Y39；V27-L40；E28-E41；Y29-L42；C30-A43；E31-S44；P32-A45；C33-V46；G34-K47；F35-E48；E36-Q49；A37-Y50；T38-P51；Y39-G52；L40-I53；E41-E54；L42-I55；A43-E56；S44-S57；A45-R58；V46-L59；K47-G60；E48-G61；Q49-T62；Y50-G63；P51-A64；G52-F65；I53-E66；E54-I67；I55-E68；E56-I69；S57-N70；R58-G71；L59-Q72；G60-L73；G61-V74；T62-F75；G63-S76；A64-K77；F65-L78；E66-E79；I67-N80；E68-G81；I69-G82；N70-F83；G71-P84；Q72-Y85；L73-E86；V74-K87；F75-D88；S76-L89；K77-I90；L78-E91；E79-A92；N80-I93；G81-R94；G82-R95；F83-A96；P84-S97；Y85-N98；E86-G99；K87-E100；D88-T101；L89-L102；I90-E103；E91-K104；A92-I105；I93-T106；R94-N107；R95-S108；A96-R109；S97-P110；N98-P111；G99-C112；E100-V113；T101-I114；L102-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列15聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E15；S2-E16；G3-V17；E4-E18；P5-P19；G6-G20；Q7-S21；T8-G22；S9-V23；V10-R24；A11-I25；P12-V26；P13-V27；P14-E28；E15-Y29；E16-C30；V17-E31；E18-P32；P19-C33；G20-G34；S21-F35；G22-E36；V23-A37；R24-T38；I25-Y39；V26-L40；V27-E41；E28-L42；Y29-A43；C30-S44；E31-A45；P32-V46；C33-K47；G34-E48；F35-Q49；E36-Y50；A37-P51；T38-G52；Y39-I53；L40-E54；E41-I55；L42-E56；A43-S57；S44-R58；A45-L59；V46-G60；K47-G61；E48-T62；Q49-G63；Y50-A64；P51-F65；G52-E66；I53-I67；E54-E68；I55-I69；E56-N70；S57-G71；R58-Q72；L59-L73；G60-V74；G61-F75；T62-S76；G63-K77；A64-L78；F65-E79；E66-N80；I67-G81；E68-G82；I69-F83；N70-P84；G71-Y85；Q72-E86；L73-K87；V74-D88；F75-L89；S76-I90；K77-E91；L78-A92；E79-I93；N80-R94；G81-R95；G82-A96；F83-S97；P84-N98；Y85-G99；E86-E100；K87-T101；D88-L102；L89-E103；I90-K104；E91-I105；A92-T106；I93-N107；R94-S108；R95-R109；A96-P110；S97-P111；N98-C112；G99-V113；E100-I114；T101-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列16聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E16；S2-V17；G3-E18；E4-P19；P5-G20；G6-S21；Q7-G22；T8-V23；S9-R24；V10-I25；A11-V26；P12-V27；P13-E28；P14-Y29；E15-C30；E16-E31；V17-P32；E18-C33；P19-G34；G20-F35；S21-E36；G22-A37；V23-T38；R24-Y39；I25-L40；V26-E41；V27-L42；E28-A43；Y29-S44；C30-A45；E31-V46；P32-K47；C33-E48；G34-Q49；F35-Y50；E36-P51；A37-G52；T38-I53；Y39-E54；L40-I55；E41-E56；L42-S57；A43-R58；S44-L59；A45-G60；V46-G61；K47-T62；E48-G63；Q49-A64；Y50-F65；P51-E66；G52-I67；I53-E68；E54-I69；I55-N70；E56-G71；S57-Q72；R58-L73；L59-V74；G60-F75；G61-S76；T62-K77；G63-L78；A64-E79；F65-N80；E66-G81；I67-G82；E68-F83；I69-P84；N70-Y85；G71-E86；Q72-K87；L73-D88；V74-L89；F75-I90；S76-E91；K77-A92；L78-I93；E79-R94；N80-R95；G81-A96；G82-S97；F83-N98；P84-G99；Y85-E100；E86-T101；K87-L102；D88-E103；L89-K104；I90-I105；E91-T106；A92-N107；I93-S108；R94-R109；R95-P110；A96-P111；S97-C112；N98-V113；G99-I114；E100-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列17聚体
M1-V17；S2-E18；G3-P19；E4-G20；P5-S21；G6-G22；Q7-V23；T8-R24；S9-I25；V10-V26；A11-V27；P12-E28；P13-Y29；P14-C30；E15-E31；E16-P32；V17-C33；E18-G34；P19-F35；G20-E36；S21-A37；G22-T38；V23-Y39；R24-L40；I25-E41；V26-L42；V27-A43；E28-S44；Y29-A45；C30-V46；E31-K47；P32-E48；C33-Q49；G34-Y50；F35-P51；E36-G52；A37-I53；T38-E54；Y39-I55；L40-E56；E41-S57；L42-R58；A43-L59；S44-G60；A45-G61；V46-T62；K47-G63；E48-A64；Q49-F65；Y50-E66；P51-I67；G52-E68；I53-I69；E54-N70；I55-G71；E56-Q72；S57-L73；R58-V74；L59-F75；G60-S76；G61-K77；T62-L78；G63-E79；A64-N80；F65-G81；E66-G82；I67-F83；E68-P84；I69-Y85；N70-E86；G71-K87；Q72-D88；L73-L89；V74-I90；F75-E91；S76-A92；K77-I93；L78-R94；E79-R95；N80-A96；G81-S97；G82-N98；F83-G99；P84-E100；Y85-T101；E86-L102；K87-E103；D88-K104；L89-I105；I90-T106；E91-N107；A92-S108；I93-R109；R94-P110；R95-P111；A96-C112；S97-V113；N98-I114；G99-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列18聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E18；S2-P19；G3-G20；E4-S21；P5-G22；G6-V23；Q7-R24；T8-I25；S9-V26；V10-V27；A11-E28；P12-Y29；P13-C30；P14-E31；E15-P32；E16-C33；V17-G34；E18-F35；P19-E36；G20-A37；S21-T38；G22-Y39；V23-L40；R24-E41；I25-L42；V26-A43；V27-S44；E28-A45；Y29-V46；C30-K47；E31-E48；P32-Q49；C33-Y50；G34-P51；F35-G52；E36-I53；A37-E54；T38-I55；Y39-E56；L40-S57；E41-R58；L42-L59；A43-G60；S44-G61；A45-T62；V46-G63；K47-A64；E48-F65；Q49-E66；Y50-I67；P51-E68；G52-I69；I53-N70；E54-G71；I55-Q72；E56-L73；S57-V74；R58-F75；L59-S76；G60-K77；G61-L78；T62-E79；G63-N80；A64-G81；F65-G82；E66-F83；I67-P84；E68-Y85；I69-E86；N70-K87；G71-D88；Q72-L89；L73-I90；V74-E91；F75-A92；S76-I93；K77-R94；L78-R95；E79-A96；N80-S97；G81-N98；G82-G99；F83-E100；P84-T101；Y85-L102；E86-E103；K87-K104；D88-I105；L89-T106；I90-N107；E91-S108；A92-R109；I93-P110；R94-P111；R95-C112；A96-V113；S97-I114；N98-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列19聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-P19；S2-G20；G3-S21；E4-G22；P5-V23；G6-R24；Q7-I25；T8-V26；S9-V27；V10-E28；A11-Y29；P12-C30；P13-E31；P14-P32；E15-C33；E16-G34；V17-F35；E18-E36；P19-A37；G20-T38；S21-Y39；G22-L40；V23-E41；R24-L42；I25-A43；V26-S44；V27-A45；E28-V46；Y29-K47；C30-E48；E31-Q49；P32-Y50；C33-P51；G34-G52；F35-I53；E36-E54；A37-I55；T38-E56；Y39-S57；L40-R58；E41-L59；L42-G60；A43-G61；S44-T62；A45-G63；V46-A64；K47-F65；E48-E66；Q49-I67；Y50-E68；P51-I69；G52-N70；I53-G71；E54-Q72；I55-L73；E56-V74；S57-F75；R58-S76；L59-K77；G60-L78；G61-E79；T62-N80；G63-G81；A64-G82；F65-F83；E66-P84；I67-Y85；E68-E86；I69-K87；N70-D88；G71-L89；Q72-I90；L73-E91；V74-A92；F75-I93；S76-R94；K77-R95；L78-A96；E79-S97；N80-N98；G81-G99；G82-E100；F83-T101；P84-L102；Y85-E103；E86-K104；K87-I105；D88-T106；L89-N107；I90-S108；E91-R109；A92-P110；I93-P111；R94-C112；R95-V113；A96-I114；S97-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列20聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G20；S2-S21；G3-G22；E4-V23；P5-R24；G6-I25；Q7-V26；T8-V27；S9-E28；V10-Y29；A11-C30；P12-E31；P13-P32；P14-C33；E15-G34；E16-F35；V17-E36；E18-A37；P19-T38；G20-Y39；S21-L40；G22-E41；V23-L42；R24-A43；I25-S44；V26-A45；V27-V46；E28-K47；Y29-E48；C30-Q49；E31-Y50；P32-P51；C33-G52；G34-I53；F35-E54；E36-I55；A37-E56；T38-S57；Y39-R58；L40-L59；E41-G60；L42-G61；A43-T62；S44-G63；A45-A64；V46-F65；K47-E66；E48-I67；Q49-E68；Y50-I69；P51-N70；G52-G71；I53-Q72；E54-L73；I55-V74；E56-F75；S57-S76；R58-K77；L59-L78；G60-E79；G61-N80；T62-G81；G63-G82；A64-F83；F65-P84；E66-Y85；I67-E86；E68-K87；I69-D88；N70-L89；G71-I90；Q72-E91；L73-A92；V74-I93；F75-R94；S76-R95；K77-A96；L78-S97；E79-N98；N80-G99；G81-E100；G82-T101；F83-L102；P84-E103；Y85-K104；E86-I105；K87-T106；D88-N107；L89-S108；I90-R109；E91-P110；A92-P111；I93-C112；R94-V113；R95-I114；A96-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列21聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-S21；S2-G22；G3-V23；E4-R24；P5-I25；G6-V26；Q7-V27；T8-E28；S9-Y29；V10-C30；A11-E31；P12-P32；P13-C33；P14-G34；E15-F35；E16-E36；V17-A37；E18-T38；P19-Y39；G20-L40；S21-E41；G22-L42；V23-A43；R24-S44；I25-A45；V26-V46；V27-K47；E28-E48；Y29-Q49；C30-Y50；E31-P51；P32-G52；C33-I53；G34-E54；F35-I55；E36-E56；A37-S57；T38-R58；Y39-L59；L40-G60；E41-G61；L42-T62；A43-G63；S44-A64；A45-F65；V46-E66；K47-I67；E48-E68；Q49-I69；Y50-N70；P51-G71；G52-Q72；I53-L73；E54-V74；I55-F75；E56-S76；S57-K77；R58-L78；L59-E79；G60-N80；G61-G81；T62-G82；G63-F83；A64-P84；F65-Y85；E66-E86；I67-K87；E68-D88；I69-L89；N70-I90；G71-E91；Q72-A92；L73-I93；V74-R94；F75-R95；S76-A96；K77-S97；L78-N98；E79-G99；N80-E100；G81-T101；G82-L102；F83-E103；P84-K104；Y85-I105；E86-T106；K87-N107；D88-S108；L89-R109；I90-P110；E91-P111；A92-C112；I93-V113；R94-I114；R95-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列22聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G22；S2-V23；G3-R24；E4-125；P5-V26；G6-V27；Q7-E28；T8-Y29；S9-C30；V10-E31；A11-P32；P12-C33；P13-G34；P14-F35；E15-E36；E16-A37；V17-T38；E18-Y39；P19-L40；G20-E41；S21-L42；G22-A43；V23-S44；R24-A45；I25-V46；V26-K47；V27-E48；E28-Q49；Y29-Y50；C30-P51；E31-G52；P32-I53；C33-E54；G34-I55；F35-E56；E36-S57；A37-R58；T38-L59；Y39-G60；L40-G61；E41-T62；L42-G63；A43-A64；S44-F65；A45-E66；V46-I67；K47-E68；E48-I69；Q49-N70；Y50-G71；P51-Q72；G52-L73；I53-V74；E54-F75；I55-S76；E56-K77；S57-L78；R58-E79；L59-N80；G60-G81；G61-G82；T62-F83；G63-P84；A64-Y85；F65-E86；E66-K87；I67-D88；E68-L89；I69-I90；N70-E91；G71-A92；Q72-I93；L73-R94；V74-R95；F75-A96；S76-S97；K77-N98；L78-G99；E79-E100；N80-T101；G81-L102；G82-E103；F83-K104；P84-I105；Y85-T106；E86-N107；K87-S108；D88-R109；L89-P110；I90-P111；E91-C112；A92-V113；I93-I114；R94-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列23聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-V23；S2-R24；G3-I25；E4-V26；P5-V27；G6-E28；Q7-Y29；T8-C30；S9-E31；V10-P32；A11-C33；P12-G34；P13-F35；P14-E36；E15-A37；E16-T38；V17-Y39；E18-L40；P19-E41；G20-L42；S21-A43；G22-S44；V23-A45；R24-V46；I25-K47；V26-E48；V27-Q49；E28-Y50；Y29-P51；C30-G52；E31-I53；P32-E54；C33-I55；G34-E56；F35-S57；E36-R58；A37-L59；T38-G60；Y39-G61；L40-T62；E41-G63；L42-A64；A43-F65；S44-E66；A45-I67；V46-E68；K47-I69；E48-N70；Q49-G71；Y50-Q72；P51-L73；G52-V74；I53-F75；E54-S76；I55-K77；E56-L78；S57-E79；R58-N80；L59-G81；G60-G82；G61-F83；T62-P84；G63-Y85；A64-E86；F65-K87；E66-D88；I67-L89；E68-I90；I69-E91；N70-A92；G71-I93；Q72-R94；L73-R95；V74-A96；F75-S97；S76-N98；K77-G99；L78-E100；E79-T101；N80-L102；G81-E103；G82-K104；F83-I105；P84-T106；Y85-N107；E86-S108；K87-R109；D88-P110；L89-P111；I90-C112；E91-V113；A92-I114；193-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列24聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-R24；S2-I25；G3-V26；E4-V27；P5-E28；G6-Y29；Q7-C30；T8-E31；S9-P32；V10-C33；A11-G34；P12-F35；P13-E36；P14-A37；E15-T38；E16-Y39；V17-L40；E18-E41；P19-L42；G20-A43；S21-S44；G22-A45；V23-V46；R24-K47；I25-E48；V26-Q49；V27-Y50；E28-P51；Y29-G52；C30-I53；E31-E54；P32-I55；C33-E56；G34-S57；F35-R58；E36-L59；A37-G60；T38-G61；Y39-T62；L40-G63；E41-A64；L42-F65；A43-E66；S44-I67；A45-E68；V46-I69；K47-N70；E48-G71；Q49-Q72；Y50-L73；P51-V74；G52-F75；I53-S76；E54-K77；I55-L78；E56-E79；S57-N80；R58-G81；L59-G82；G60-F83；G61-P84；T62-Y85；G63-E86；A64-K87；F65-D88；E66-L89；I67-I90；E68-E91；I69-A92；N70-I93；G71-R94；Q72-R95；L73-A96；V74-S97；F75-N98；S76-G99；K77-E100；L78-T101；E79-L102；N80-E103；G81-K104；G82-I105；F83-T106；P84-N107；Y85-S108；E86-R109；K87-P110；D88-P111；L89-C112；I90-V113；E91-I114；A92-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列25聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-I25；S2-V26；G3-V27；E4-E28；P5-Y29；G6-C30；Q7-E31；T8-P32；S9-C33；V10-G34；A11-F35；P12-E36；P13-A37；P14-T38；E15-Y39；E16-L40；V17-E41；E18-L42；P19-A43；G20-S44；S21-A45；G22-V46；V23-K47；R24-E48；I25-Q49；V26-Y50；V27-P51；E28-G52；Y29-I53；C30-E54；E31-I55；P32-E56；C33-S57；G34-R58；F35-L59；E36-G60；A37-G61；T38-T62；Y39-G63；L40-A64；E41-F65；L42-E66；A43-I67；S44-E68；A45-I69；V46-N70；K47-G71；E48-Q72；Q49-L73；Y50-V74；P51-F75；G52-S76；I53-K77；E54-L78；I55-E79；E56-N80；S57-G81；R58-G82；L59-F83；G60-P84；G61-Y85；T62-E86；G63-K87；A64-D88；F65-L89；E66-I90；I67-E91；E68-A92；I69-I93；N70-R94；G71-R95；Q72-A96；L73-S97；V74-N98；F75-G99；S76-E100；K77-T101；L78-L102；E79-E103；N80-K104；G81-I105；G82-T106；F83-N107；P84-S108；Y85-R109；E86-P110；K87-P111；D88-C112；L89-V113；I90-I114；E91-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列26聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-V26；S2-V27；G3-E28；E4-Y29；P5-C30；G6-E31；Q7-P32；T8-C33；S9-G34；V10-F35；A11-E36；P12-A37；P13-T38；P14-Y39；E15-L40；E16-E41；V17-L42；E18-A43；P19-S44；G20-A45；S21-V46；G22-K47；V23-E48；R24-Q49；I25-Y50；V26-P51；V27-G52；E28-I53；Y29-E54；C30-I55；E31-E56；P32-S57；C33-R58；G34-L59；F35-G60；E36-G61；A37-T62；T38-G63；Y39-A64；L40-F65；E41-E66；L42-I67；A43-E68；S44-I69；A45-N70；V46-G71；K47-Q72；E48-L73；Q49-V74；Y50-F75；P51-S76；G52-K77；I53-L78；E54-E79；I55-N80；E56-G81；S57-G82；R58-F83；L59-P84；G60-Y85；G61-E86；T62-K87；G63-D88；A64-L89；F65-I90；E66-E91；I67-A92；E68-I93；I6-R94；N70-R95；G71-A96；Q72-S97；L73-N98；V74-G99；F75-E100；S76-T101；K77-L102；L78-E103；E79-K104；N80-I105；G81-T106；G82-N107；F83-S108；P84-R109；Y85-P110；E86-P111；K87-C112；D88-V113；L89-I114；I90-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列27聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-V27；S2-E28；G3-Y29；E4-C30；P5-E31；G6-P32；Q7-C33；T8-G34；S9-F35；V10-E36；A11-A37；P12-T38；P13-Y39；P14-L40；E15-E41；E16-L42；V17-A43；E18-S44；P19-A45；G20-V46；S21-K47；G22-E48；V23-Q49；R24-Y50；I25-P51；V26-G52；V27-I53；E28-E54；Y29-I55；C30-E56；E31-S57；P32-R58；C33-L59；G34-G60；F35-G61；E36-T62；A37-G63；T38-A64；Y39-F65；L40-E66；E41-I67；L42-E68；A43-I69；S44-N70；A45-G71；V46-Q72；K47-L73；E48-V74；Q49-F75；Y50-S76；P51-K77；G52-L78；I53-E79；E54-N80；I55-G81；E56-G82；S57-F83；R58-P84；L59-Y85；G60-E86；G61-K87；T62-D88；G63-L89；A64-190；F65-E91；E66-A92；I67-I93；E68-R94；I69-R95；N70-A96；G71-S97；Q72-N98；L73-G99；V74-E100；F75-T101；S76-L102；K77-E103；L78-K104；E79-I105；N80-T106；G81-N1Q7；G82-S108；F83-R109；P84-P110；Y85-P111；E86-C112；K87-V113；D88-I114；L89-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列28聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E28；S2-Y29；G3-C30；E4-E31；P5-P32；G6-C33；Q7-G34；T8-F35；S9-E36；V10-A37；A11-T38；P12-Y39；P13-L40；P14-E41；E15-L42；E16-A43；V17-S44；E18-A45；P19-V46；G20-K47；S21-E48；G22-Q49；V23-Y50；R24-P51；I25-G52；V26-I53；V27-E54；E28-I55；Y29-E56；C30-S57；E31-R58；P32-L59；C33-G60；G34-G61；F35-T62；E36-G63；A37-A64；T38-F65；Y39-E66；L40-167；E41-E68；L42-I69；A43-N70；S44-G71；A45-Q72；V46-L73；K47-V74；E48-F75；Q49-S76；Y50-K77；P51-L78；G52-E79；I53-N80；E54-G81；I55-G82；E56-F83；S57-P84；R58-Y85；L59-E86；G60-K87；G61-D88；T62-L89；G63-I90；A64-E91；F65-A92；E66-I93；I67-R94；E68-R95；I69-A96；N70-S97；G71-N98；Q72-G99；L73-E100；V74-T101；F75-L102；S76-E103；K77-K104；L78-I105；E79-T106；N80-N107；G81-S108；G82-R109；F83-P110；P84-P111；Y85-C112；E86-V113；K87-I114；D88-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列29聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-Y29；S2-C30；G3-E31；E4-P32；P5-C33；G6-G34；Q7-F35；T8-E36；S9-A37；V10-T38；A11-Y39；P12-L40；P13-E41；P14-L42；E15-A43；E16-S44；V17-A45；E18-V46；P19-K47；G20-E48；S21-Q49；G22-Y50；V23-P51；R24-G52；I25-I53；V26-E54；V27-I55；E28-E56；Y29-S57；C30-R58；E31-L59；P32-G60；C33-G61；G34-T62；F35-G63；E36-A64；A37-F65；T38-E66；Y39-I67；L40-E68；E41-I69；L42-N70；A43-G71；S44-Q72；A45-L73；V46-V74；K47-F75；E48-S76；Q49-K77；Y50-L78；P51-E79；G52-N80；I53-G81；E54-G82；I55-F83；E56-P84；S57-Y85；R58-E86；L59-K87；G60-D88；G61-L89；T62-I90；G63-E91；A64-A92；F65-I93；E66-R94；I67-R95；E68-A96；I69-S97；N70-N98；G71-G99；Q72-E100；L73-T101；V74-L102；F75-E103；S76-K104；K77-I105；L78-T106；E79-N107；N80-S108；G81-R109；G82-P110；F83-P111；P84-C112；Y85-V113；E86-I114；K87-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列30聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-C30；S2-E31；G3-P32；E4-C33；P5-G34；G6-F35；Q7-E36；T8-A37；S9-T38；V10-Y39；A11-L40；P12-E41；P13-L42；P14-A43；E15-S44；E16-A45；V17-V46；E18-K47；P19-E48；G20-Q49；S21-Y50；G22-P51；V23-G52；R24-I53；I25-E54；V26-I55；V27-E56；E28-S57；Y29-R58；C30-L59；E31-G60；P32-G61；C33-T62；G34-G63；F35-A64；E36-F65；A37-E66；T38-I67；Y39-E68；L40-I69；E41-N70；L42-G71；A43-Q72；S44-L73；A45-V74；V46-F75；K47-S76；E48-K77；Q49-L78；Y50-E79；P51-N80；G52-G81；I53-G82；E54-F83；I55-P84；E56-Y85；S57-E86；R58-K87；L59-D88；G60-L89；G61-I90；T62-E91；G63-A92；A64-I93；F65-R94；E66-R95；I67-A96；E68-S97；I69-N98；N70-G99；G71-E100；Q72-T101；L73-L102；V74-E103；F75-K104；S76-I105；K77-T106；L78-N107；E79-S108；N80-R109；G81-P110；G82-P111；F83-C112；P84-V113；Y85-I114；E86-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列31聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E31；S2-P32；G3-C33；E4-G34；P5-F35；G6-E36；Q7-A37；T8-T38；S9-Y39；V10-L40；A11-E41；P12-L42；P13-A43；P14-S44；E15-A45；E16-V46；V17-K47；E18-E48；P19-Q49；G20-Y50；S21-P51；G22-G52；V23-I53；R24-E54；I25-I55；V26-E56；V27-S57；E28-R58；Y29-L59；C30-G60；E31-G61；P32-T62；C33-G63；G34-A64；F35-F65；E36-E66；A37-I67；T38-E68；Y39-I69；L40-N70；E41-G71；L42-Q72；A43-L73；S44-V74；A45-F75；V46-S76；K47-K77；E48-L78；Q49-E79；Y50-N80；P51-G81；G52-G82；I53-F83；E54-P84；I55-Y85；E56-E86；S57-K87；R58-D88；L59-L89；G60-I90；G61-E91；T62-A92；G63-I93；A64-R94；F65-R95；E66-A96；I67-S97；E68-N98；I69-G99；N70-E100；G71-T101；Q72-L102；L73-E103；V74-K104；F75-I105；S76-T106；K77-N107；L78-S108；E79-R109；N80-P110；G81-P111；G82-C112；F83-V113；P84-I114和Y85-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列32聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-P32；S2-C33；G3-G34；E4-F35；P5-E36；G6-A37；Q7-T38；T8-Y39；S9-L40；V10-E41；A11-L42；P12-A43；P13-S44；P14-A45；E15-V46；E16-K47；V17-E48；E18-Q49；P19-Y50；G20-P51；S21-G52；G22-I53；V23-E54；R24-I55；I25-E56；V26-S57；V27-R58；E28-L59；Y29-G60；C30-G61；E31-T62；P32-G63；C33-A64；G34-F65；F35-E66；E36-I67；A37-E68；T38-I69；Y39-N70；L40-G71；E41-Q72；L42-L73；A43-V74；S44-F75；A45-S76；V46-K77；K47-L78；E48-E79；Q49-N80；Y50-G81；P51-G82；G52-F83；I53-P84；E54-Y85；I55-E86；E56-K87；S57-D88；R58-L89；L59-I90；G60-E91；G61-A92；T62-I93；G63-R94；A64-R95；F65-A96；E66-S97；I67-N98；E68-G99；I69-E100；N70-T101；G71-L102；Q72-E103；L73-K104；V74-I105；F75-T106；S76-N107；K77-S108；L78-R109；E79-P110；N80-P111；G81-C112；G82-V113；F83-I114和P84-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列33聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-C33；S2-G34；G3-F35；E4-E36；P5-A37；G6-T38；Q7-Y39；T8-L40；S9-E41；V10-L42；A11-A43；P12-S44；P13-A45；P14-V46；E15-K47；E16-E48；V17-Q49；E18-Y50；P19-P51；G20-G52；S21-I53；G22-E54；V23-I55；R24-E56；I25-S57；V26-R58；V27-L59；E28-G60；Y29-G61；C30-T62；E31-G63；P32-A64；C33-F65；G34-E66；F35-I67；E36-E68；A37-I69；T38-N70；Y39-G71；L40-Q72；E41-L73；L42-V74；A43-F75；S44-S76；A45-K77；V46-L78；K47-E79；E48-N80；Q49-G81；Y50-G82；P51-F83；G52-P84；I53-Y85；E54-E86；I55-K87；E56-D88；S57-L89；R58-I90；L59-E91；G60-A92；G61-I93；T62-R94；G63-R95；A64-A96；F65-S97；E66-N98；I67-G99；E68-E100；I69-T101；N70-L102；G71-E103；Q72-K104；L73-I105；V74-T106；F75-N107；S76-S108；K77-R109；L78-P110；E79-P111；N80-C112；G81-V113；G82-I114和F83-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列34聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G34；S2-F35；G3-E36；E4-A37；P5-T38；G6-Y39；Q7-L40；T8-E41；S9-L42；V10-A43；A11-S44；P12-A45；P13-V46；P14-K47；E15-E48；E16-Q49；V17-Y50；E18-P51；P19-G52；G20-I53；S21-E54；G22-I55；V23-E56；R24-S57；I25-R58；V26-L59；V27-G60；E28-G61；Y29-T62；C30-G63；E31-A64；P32-F65；C33-E66；G34-I67；F35-E68；E36-I69；A37-N70；T38-G71；Y39-Q72；L40-L73；E41-V74；L42-F75；A43-S76；S44-K77；A45-L78；V46-E79；K47-N80；E48-G81；Q49-G82；Y50-F83；P51-P84；G52-Y85；I53-E86；E54-K87；I55-D88；E56-L89；S57-I90；R58-E91；L59-A92；G60-I93；G61-R94；T62-R95；G63-A96；A64-S97；F65-N98；E66-G99；I67-E100；E68-T101；I69-L102；N70-E103；G71-K104；Q72-I105；L73-T106；V74-N107；F75-S108；S76-R109；K77-P110；L78-P111；E79-C112；N80-V113；G81-I114和G82-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列35聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-F35；S2-E36；G3-A37；E4-T38；P5-Y39；G6-L40；Q7-E41；T8-L42；S9-A43；V10-S44；A11-A45；P12-V46；P13-K47；P14-E48；E15-Q49；E16-Y50；V17-P51；E18-G52；P19-I53；G20-E54；S21-I55；G22-E56；V23-S57；R24-R58；I25-L59；V26-G60；V27-G61；E28-T62；Y29-G63；C30-A64；E31-F65；P32-E66；C33-I67；G34-E68；F35-I69；E36-N70；A37-G71；T38-Q72；Y39-L73；L40-V74；E41-F75；L42-S76；A43-K77；S44-L78；A45-E79；V46-N80；K47-G81；E48-G82；Q49-F83；Y50-P84；P51-Y85；G52-E86；I53-K87；E54-D88；I55-L89；E56-I90；S57-E91；R58-A92；L59-I93；G60-R94；G61-R95；T62-A96；G63-S97；A64-N98；F65-G99；E66-E100；I67-T101；E68-L102；I69-E103；N70-K104；G71-I105；Q72-T106；L73-N107；V74-S108；F75-R109；S76-P110；K77-P111；L78-C112；E79-V113；N80-I114；G81-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列36聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E36；S2-A37；G3-T38；E4-Y39；P5-L40；G6-E41；Q7-L42；T8-A43；S9-S44；V10-A45；A11-V46；P12-K47；P13-E48；P14-Q49；E15-Y50；E16-P51；V17-G52；E18-I53；P19-E54；G20-I55；S21-E56；G22-S57；V23-R58；R24-L59；I25-G60；V26-G61；V27-T62；E28-G63；Y29-A64；C30-F65；E31-E66；P32-I67；C33-E68；G34-I69；F35-N70；E36-G71；A37-Q72；T38-L73；Y39-V74；L40-F75；E41-S76；L42-K77；A43-L78；S44-E79；A45-N80；V46-G81；K47-G82；E48-F83；Q49-P84；Y50-Y85；P51-E86；G52-K87；I53-D88；E54-L89；I55-I90；E56-E91；S57-A92；R58-I93；L59-R94；G60-R95；G61-A96；T62-S97；G63-N98；A64-G99；F65-E100；E66-T101；I67-L102；E68-E103；I69-K104；N70-I105；G71-T106；Q72-N107；L73-S108；V74-R109；F75-P110；S76-P111；K77-C112；L78-V113；E79-I114；N80-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列37聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-A37；S2-T38；G3-Y39；E4-L40；P5-E41；G6-L42；Q7-A43；T8-S44；S9-A45；V10-V46；A11-K47；P12-E48；P13-Q49；P14-Y50；E15-P51；E16-G52；V17-I53；E18-E54；P19-I55；G20-E56；S21-S57；G22-R58；V23-L59；R24-G60；I25-G61；V26-T62；V27-G63；E28-A64；Y29-F65；C30-E66；E31-I67；P32-E68；C33-I69；G34-N70；F35-G71；A37-L73；T38-V74；Y39-F75；L40-S76；E41-K77；L42-L78；A43-E79；S44-N80；A45-G81；V46-G82；K47-F83；E48-P84；Q49-Y85；Y50-E86；P51-K87；G52-D88；I53-L89；E54-I90；I55-E91；E56-A92；S57-I93；R58-R94；L59-R95；G60-A96；G61-S97；T62-N98；G63-G99；A64-E100；F65-T101；E66-L102；I67-E103；E68-K104；I69-I105；N70-T106；G71-N107；Q72-S108；L73-R109；V74-P110；F75-P111；S76-C112；K77-V113；L78-I114；E79-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列38聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-T38；S2-Y39；G3-L40；E4-E41；P5-L42；G6-A43；Q7-S44；T8-A45；S9-V46；V10-K47；A11-E48；P12-Q49；P13-Y50；P14-P51；E15-G52；E16-I53；V17-E54；E18-I55；P19-E56；G20-S57；S21-R58；G22-L59；V23-G60；R24-G61；I25-T62；V26-G63；V27-A64；E28-F65；Y29-E66；C30-I67；E31-E68；P32-I69；C33-N70；G34-G71；F35-Q72；E36-L73；A37-V74；T38-F75；Y39-S76；L40-K77；E41-L78；L42-E79；A43-N80；S44-G81；A45-G82；V46-F83；K47-P84；E48-Y85；Q49-E86；Y50-K87；P51-D88；G52-L89；I53-I90；E54-E91；I55-A92；E56-I93；S57-R94；R58-R95；L59-A96；G60-S97；G61-N98；T62-G99；G63-E100；A64-T101；F65-L102；E66-E103；I67-K104；E68-I105；I69-T106；N70-N107；G71-S108；Q72-R109；L73-P110；V74-P111；F75-C112；S76-V113；K77-I114；L78-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列39聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-Y39；S2-L40；G3-E41；E4-L42；P5-A43；G6-S44；Q7-A45；T8-V46；S9-K47；V10-E48；A11-Q49；P12-Y50；P13-P51；P14-G52；E15-I53；E16-E54；V17-I55；E18-E56；P19-S57；G20-R58；S21-L59；G22-G60；V23-G61；R24-T62；I25-G63；V26-A64；V27-F65；E28-E66；Y29-I67；C30-E68；E31-I69；P32-N70；C33-G71；G34-Q72；F35-L73；E36-V74；A37-F75；T38-S76；Y39-K77；L40-L78；E41-E79；L42-N80；A43-G81；S44-G82；A45-F83；V46-P84；K47-Y85；E48-E86；Q49-K87；Y50-D88；P51-L89；G52-I90；I53-E91；E54-A92；I55-I93；E56-R94；S57-R95；R58-A96；L59-S97；G60-N98；G61-G99；T62-E100；G63-T101；A64-L102；F65-E103；E66-K104；I67-I105；E68-T106；I69-N107；N70-S108；G71-R109；Q72-P110；L73-P111；V74-C112；F75-V113；S76-I114；K77-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列40聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-L40；S2-E41；G3-L42；E4-A43；P5-S44；G6-A45；Q7-V46；T8-K47；S9-E48；V10-Q49；A11-Y50；P12-P51；P13-G52；P14-I53；E15-E54；E16-I55；V17-E56；E18-S57；P19-R58；G20-L59；S21-G60；G22-G61；V23-T62；R24-G63；I25-A64；V26-F65；V27-E66；E28-I67；Y29-E68；C30-I69；E31-N70；P32-G71；C33-Q72；G34-L73；F35-V74；E36-F75；A37-S76；T38-K77；Y39-L78；L40-E79；E41-N80；L42-G81；A43-G82；S44-F83；A45-P84；V46-Y85；K47-E86；E48-K87；Q49-D88；Y50-L89；P51-I90；G52-E91；I53-A92；E54-I93；I55-R94；E56-R95；S57-A96；R58-S97；L59-N98；G60-G99；G61-E100；T62-T101；G63-L102；A64-E103；F65-K104；E66-I105；I67-T106；E68-N107；I69-S108；N70-R109；G71-P110；Q72-P111；L73-C112；V74-V113；F75-I114；S76-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列41聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E41；S2-L42；G3-A43；E4-S44；P5-A45；G6-V46；Q7-K47；T8-E48；S9-Q49；V10-Y50；A11-P51；P12-G52；P13-I53；P14-E54；E15-I55；E16-E56；V17-S57；E18-R58；P19-L59；G20-G60；S21-G61；G22-T62；V23-G63；R24-A64；I25-F65；V26-E66；V27-I67；E28-E68；Y29-I69；C30-N70；E31-G71；P32-Q72；C33-L73；G34-V74；F35-F75；E36-S76；A37-K77；T38-L78；Y39-E79；L40-N80；E41-G81；L42-G82；A43-F83；S44-P84；A45-Y85；V46-E86；K47-K87；E48-D88；Q49-L89；Y50-I90；P51-E91；G52-A92；I53-I93；E54-R94；I55-R95；E56-A92；S57-S97；R58-N98；L59-G99；G60-E100；G61-T101；T62-L102；G63-E103；A64-K104；F65-I105；E66-T106；I67-N107；E68-S108；I69-R109；N70-P110；G71-P111；Q72-C112；L73-V113；V74-I114；F75-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列42聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-L42；S2-A43；G3-S44；E4-A45；P5-V46；G6-K47；Q7-E48；T8-Q49；S9-Y50；V10-P51；A11-G52；P12-I53；P13-E54；P14-I55；E15-E56；E16-S57；V17-R58；E18-L59；P19-G60；G20-G61；S21-T62；G22-G63；V23-A64；R24-F65；I25-E66；V26-I67；V27-E68；E28-I69；Y29-N70；C30-G71；E31-Q72；P32-L73；C33-V74；G34-F75；F35-S76；E36-K77；A37-L78；T38-E79；Y39-N80；L40-G81；E41-G82；L42-F83；A43-P84；S44-Y85；A45-E86；V46-K87；K47-D88；E48-L89；Q49-I90；Y50-E91；P51-A92；G52-I93；I53-R94；E54-R95；I55-A96；E56-S97；S57-N98；R58-G99；L59-E100；G60-T101；G61-L102；T62-E103；G63-K104；A64-I105；F65-T106；E66-N107；I67-S108；E68-R109；I69-P110；N70-P111；G71-C112；Q72-V113；L73-I114；V74-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列43聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-A43；S2-S44；G3-A45；E4-V46；P5-K47；G6-E48；Q7-Q49；T8-Y50；S9-P51；V10-G52；A11-I53；P12-E54；P13-I55；P14-E56；E15-S57；E16-R58；V17-L59；E18-G60；P19-G61；G20-T62；S21-G63；G22-A64；V23-F65；R24-E66；I25-I67；V26-E68；V27-I69；E28-N70；Y29-G71；C30-Q72；E31-L73；P32-V74；C33-F75；G34-S76；F35-K77；E36-L78；A37-E79；T38-N80；Y39-G81；L40-G82；E41-F83；L42-P84；A43-Y85；S44-E86；A45-K87；V46-D88；K47-L89；E48-I90；Q49-E91；Y50-A92；P51-I93；G52-R94；I53-R95；E54-A96；I55-S97；E56-N98；S57-G99；R58-E100；L59-T101；G60-L102；G61-E103；T62-K104；G63-I105；A64-T106；F65-N107；E66-S108；I67-R109；E68-P110；I69-P111；N70-C112；G71-V113；Q72-I114；L73-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列44聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-S44；S2-A45；G3-V46；E4-K47；P5-E48；G6-Q49；Q7-Y50；T8-P51；S9-G52；V10-I53；A11-E54；P12-I55；P13-E56；P14-S57；E15-R58；E16-L59；V17-G60；E18-G61；P19-T62；G20-G63；S21-A64；G22-F65；V23-E66；R24-I67；I25-E68；V26-I69；V27-N70；E28-G71；Y29-Q72；C30-L73；E31-V74；P32-F75；C33-S76；G34-K77；F35-L78；E36-E79；A37-N80；T38-G81；Y39-G82；L40-F83；E41-P84；L42-Y85；A43-E86；S44-K87；A45-D88；V46-L89；K47-I90；E48-E91；Q49-A92；Y50-I93；P51-R94；G52-R95；I53-A96；E54-S97；I55-N98；E56-G99；S57-E100；R58-T101；L59-L102；G60-E103；G61-K104；T62-I105；G63-T106；A64-N107；F65-S108；E66-R109；I67-P110；E68-P111；I69-C112；N70-V113；G71-I114；Q72-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列45聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-A45；S2-V46；G3-K47；E4-E48；P5-Q49；G6-Y50；Q7-P51；T8-G52；S9-I53；V10-E54；A11-I55；P12-E56；P13-S57；P14-R58；E15-L59；E16-G60；V17-G61；E18-T62；P19-G63；G20-A64；S21-F65；G22-E66；V23-I67；R24-E68；I25-I69；V26-N70；V27-G71；E28-Q72；Y29-L73；C30-V74；E31-F75；P32-S76；C33-K77；G34-L78；F35-E79；E36-N80；A37-G81；T38-G82；Y39-F83；L40-P84；E41-Y85；L42-E86；A43-K87；S44-D88；A45-L89；V46-I90；K47-E91；E48-E92；Q49-I93；Y50-R94；P51-R95；G52-A96；I53-S97；E54-N98；I55-G99；E56-E100；S57-T101；R58-L102；L59-E103；G60-K104；G61-K105；T62-T106；G63-N107；A64-S108；F65-R109；E66-P110；I67-P111；E68-C112；I69-V113；N70-I114；G71-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列46聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-V46；S2-K47；G3-E48；E4-Q49；P5-Y50；G6-P51；Q7-G52；T8-I53；S9-E54；V10-I55；A11-E56；P12-S57；P13-R58；P14-L59；E15-G60；E16-G61；V17-T62；E18-G63；P19-A64；G20-F65；S21-E66；G22-I67；V23-E68；R24-I69；I25-N70；V26-G71；V27-Q72；E28-L73；Y29-V74；C30-F75；E31-S76；P32-K77；C33-L78；G34-E79；F35-N80；E36-G81；A37-G82；T38-F83；Y39-P84；L40-Y85；E41-E86；L42-K87；A43-D88；S44-L89；A45-I90；V46-E91；K47-A92；E48-I93；Q49-R94；Y50-R95；P51-A96；G52-S97；I53-N98；E54-G99；I55-E100；E56-T101；S57-L102；R58-E103；L59-K104；G60-I105；G61-T106；T62-N107；G63-S108；A64-R109；F65-P110；E66-P111；I67-C112；E68-V113；I69-I114；N70-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列47聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-K47；S2-E48；G3-Q49；E4-Y50；P5-P51；G6-G52；Q7-I53；T8-E54；S9-I55；V10-E56；A11-S57；P12-R58；P13-L59；P14-G60；E15-G61；E16-T62；V17-G63；E18-A64；P19-F65；G20-E66；S21-I67；G22-E68；V23-I69；R24-N70；I25-G71；V26-Q72；V27-L73；E28-V74；Y29-F75；C30-S76；E31-K77；P32-L78；C33-E79；G34-N80；F35-G81；E36-G82；A37-F83；T38-P84；Y39-Y85；L40-E86；E41-K87；L42-D88；A43-L89；S44-I90；A45-E91；V46-A92；K47-I93；E48-R94；Q49-R95；Y50-A96；P51-S97；G52-N98；I53-G99；E54-E100；I55-T101；E56-L102；S57-E103；R58-K104；L59-I105；G60-T106；G61-N107；T62-S108；G63-R109；A64-P110；F65-P111；E66-C112；I67-V113；E68-I114；I69-L115。
在另一优选实施方案中，包含一种或多种C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列48聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E48；S2-Q49；G3-Y50；E4-P51；P5-G52；G6-I53；Q7-E54；T8-I55；S9-E56；V10-S57；A11-R58；P12-L59；P13-G60；P14-G61；E15-T62；E16-G63；V17-A64；E18-F65；P19-E66；G20-I67；S21-E68；G22-I69；V23-N70；R24-G71；I25-Q72；V26-L73；V27-V74；E28-F75；Y29-S76；C30-K77；E31-L78；P32-E79；C33-N80；G34-G81；F35-G82；E36-F83；A37-P84；T38-Y85；Y39-E86；L40-K87；E41-D88；L42-L89；A43-I90；S44-E91；A45-A92；V46-I93；K47-R94；E48-R95；Q49-A96；Y50-S97；P51-N98；G52-G99；I53-E100；E54-T101；I55-L102；E56-E103；S57-K104；R58-I105；L59-T106；G60-N107；G61-S108；T62-R109；G63-P110；A64-P111；F65-C112；E66-V113；I67-I114；E68-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列49聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-Q49；S2-Y50；G3-P51；E4-G52；P5-I53；G6-E54；Q7-I55；T8-E56；S9-S57；V10-R58；A11-L59；P12-G60；P13-G61；P14-T62；E15-G63；E16-A64；V17-F65；E18-E66；P19-I67；G20-E68；S21-I69；G22-N70；V23-G71；R24-Q72；I25-L73；V26-V74；V27-F75；E28-S76；Y29-K77；C30-L78；E31-E79；P32-N80；C33-G81；G34-G82；F35-F83；E36-P84；A37-Y85；T38-E86；Y39-K87；L40-D88；E41-L89；L42-I90；A43-E91；S44-A92；A45-I93；V46-R94；K47-R95；E48-A96；Q49-S97；Y50-N98；P51-G99；G52-E100；I53-T101；E54-L102；I55-E103；E56-K104；S57-I105；R58-T106；L59-N107；G60-S108；G61-R109；T62-P110；G63-P111；A64-C112；F65-V113；E66-I114；I67-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列50聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-Y50；S2-P51；G3-G52；E4-I53；P5-E54；G6-I55；Q7-E56；T8-S57；S9-R58；V10-L59；A11-G60；P12-G61；P13-T62；P14-G63；E15-A64；E16-F65；V17-E66；E18-I67；P19-E68；G20-I69；S21-N70；G22-G71；V23-Q72；R24-L73；I25-V74；V26-F75；V27-S76；E28-K77；Y29-L78；C30-E79；E31-N80；P32-G81；C33-G82；G34-F83；F35-P84；E36-Y85；A37-E86；T38-K87；Y39-D88；L40-L89；E41-I90；L42-E91；A43-A92；S44-I93；A45-R94；V46-R95；K47-A96；E48-S97；Q49-N98；Y50-G99；P51-E100；G52-T101；I53-L102；E54-E103；I55-K104；E56-I105；S57-T106；R58-N107；L59-S108；G60-R109；G61-P110；T62-P111；G63-C112；A64-V113；F65-I114；E66-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列51聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-P51；S2-G52；G3-I53；E4-E54；P5-I55；G6-E56；Q7-S57；T8-R58；S9-L59；V10-G60；A11-G61；P12-T62；P13-G63；P14-A64；E15-F65；E16-E66；V17-I67；E18-E68；P19-I69；G20-N70；S21-G71；G22-Q72；V23-L73；R24-V74；I25-F75；V26-S76；V27-K77；E28-L78；Y29-E79；C30-N80；E31-G81；P32-G82；C33-F83；G34-P84；F35-Y85；E36-E86；A37-K87；T38-D88；Y39-L89；L40-I90；E41-E91；L42-A92；A43-I93；S44-R94；A45-R95；V46-A96；K47-S97；E48-N98；Q49-G99；Y50-E100；P51-T101；G52-L102；I53-E103；E54-K104；I55-I105；E56-T106；S57-N107；R58-S108；L59-R109；G60-P110；G61-P111；T62-C112；G63-V113；A64-I114；F65-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列52聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G52；S2-I53；G3-E54；E4-I55；P5-E56；G6-S57；Q7-R58；T8-L59；S9-G60；V10-G61；A11-T62；P12-G63；P13-A64；P14-F65；E15-E66；E16-I67；V17-E68；E18-I69；P19-N70；G20-G71；S21-Q72；G22-L73；V23-V74；R24-F75；I25-S76；V26-K77；V27-L78；E28-E79；Y29-N80；C30-G81；E31-G82；P32-F83；C33-P84；G34-Y85；F35-E86；E36-K87；A37-D88；T38-L89；Y39-I90；L40-E91；E41-A92；L42-I93；A43-R94；S44-R95；A45-A96；V46-S97；K47-N98；E48-G99；Q49-E100；Y50-T101；P51-L102；G52-E103；I53-K104；E54-I105；I55-T106；E56-N107；S57-S108；R58-R109；L59-P110；G60-P111；G61-C112；T62-V113；G63-I114；A64-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列53聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-I53；S2-E54；G3-I55；E4-E56；P5-S57；G6-R58；Q7-L59；T8-G60；S9-G61；V10-T62；A11-63；P12-A64；P13-F65；P14-E66；E15-I67；E16-E68；V17-I69；E18-N70；P19-G71；G20-Q72；S21-L73；G22-V74；V23-F75；R24-S76；I25-K77；V26-L78；V27-E79；E28-N80；Y29-G81；C30-G82；E31-F83；P32-P84；C33-Y85；G34-E86；F35-K87；E36-D88；A37-L89；T38-I90；Y39-E91；L40-A92；E41-I93；L42-R94；A43-R95；S44-A96；A45-S97；V46-N98；K47-G99；E48-E100；Q49-T101；Y50-L102；P51-E103；G52-K104；I53-I105；E54-T106；I55-N107；E56-S108；S57-R109；R58-P110；L59-P111；G60-C112；G61-V113；T62-I114；G63-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列54聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E54；S2-I55；G3-E56；E4-S57；P5-R58；G6-L59；Q7-G60；T8-G61；S9-T62；V10-G63；A11-A64；P12-F65；P13-E66；P14-I67；E15-E68；E16-I69；V17-N70；E18-G71；P19-Q72；G20-L73；S21-V74；G22-F75；V23-S76；R24-K77；I25-L78；V26-E79；V27-N80；E28-G81；Y29-G82；C30-F83；E31-P84；P32-Y85；C33-E86；G34-K87；F35-D88；E36-L89；A37-I90；T38-E91；Y39-A92；L40-I93；E41-R94；L42-R95；A43-A96；S44-S97；A45-N98；V46-G99；K47-E100；E48-T101；Q49-L102；Y50-E103；P51-K104；G52-I105；I53-T106；E54-N107；I55-S108；E56-R109；S57-P110；R58-P111；L59-C112；G60-V113；G61-I114；T62-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列55聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-I55；S2-E56；G3-S57；E4-R58；P5-L59；G6-G60；Q7-G61；T8-T62；S9-G63；V10-A64；A11-F65；P12-E66；P13-I67；P14-E68；E15-I69；E16-N70；V17-G71；E18-Q72；P19-L73；G20-V74；S21-F75；G22-S76；V23-K77；R24-L78；I25-E79；V26-N80；V27-G81；E28-G82；Y29-F83；C30-P84；E31-Y85；P32-E86；C33-K87；G34-D88；F35-L89；E36-I90；A37-E91；T38-A92；Y39-I93；L40-R94；E41-R95；L42-A96；A43-S97；S44-N98；A45-G99；V46-E100；K47-T101；E48-L102；Q49-E103；Y50-K104；P51-I105；G52-T106；I53-N107；E54-S108；I55-R109；E56-P110；S57-P111；R58-C112；L59-V113；G60-I114；G61-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列56聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E56；S2-S57；G3-R58；E4-L59；P5-G60；G6-G61；Q7-T62；T8-G63；S9-A64；V10-F65；A11-E66；P12-I67；P13-E68；P14-I69；E15-N70；E16-G71；V17-Q72；E18-L73；P19-V74；G20-F75；S21-S76；G22-K77；V23-L78；R24-E79；I25-N80；V26-G81；V27-G82；E28-F83；Y29-P84；C30-Y85；E31-E86；P32-K87；C33-D88；G34-L89；F35-I90；E36-E91；A37-A92；T38-I93；Y39-R94；L40-R95；E41-A96；L42-S97；A43-N98；S44-G99；A45-E100；V46-T101；K47-L102；E48-E103；Q49-K104；Y50-I105；P51-T106；G52-N107；I53-S108；E54-R109；I55-P110；E56-P111；S57-C112；R58-V113；L59-I114；G60-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列57聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-S57；S2-R58；G3-L59；E4-G60；P5-G61；G6-T62；Q7-G63；T8-A64；S9-F65；V10-E66；A11-I67；P12-E68；P13-I69；P14-N70；E15-G71；E16-Q72；V17-L73；E18-V74；P19-F75；G20-S76；S21-K77；G22-L78；V23-E79；R24-N80；I25-G81；V26-G82；V27-F83；E28-P84；Y29-Y85；C30-E86；E31-K87；P32-D88；C33-L89；G34-I90；F35-E91；E36-A92；A37-I93；T38-R94；Y39-R95；L40-A96；E41-S97；L42-N98；A43-G99；S44-E100；A45-T101；V46-L102；K47-E103；E48-K104；Q49-I105；Y50-T106；P51-N107；G52-S108；I53-R109；E54-P110；I55-P111；E56-C112；S57-V113；R58-I114；L59-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列58聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-R58；S2-L59；G3-G60；E4-G61；P5-T62；G6-G63；Q7-A64；T8-F65；S9-E66；V10-I67；A11-E68；P12-I69；P13-N70；P14-G71；E15-Q72；E16-L73；V17-V74；E18-F75；P19-S76；G20-K77；S21-L78；G22-E79；V23-N80；R24-G81；I25-G82；V26-F83；V27-P84；E28-Y85；Y29-E86；C30-K87；E31-E88；P32-L89；C33-I90；G34-E91；F35-A92；E36-I93；A37-R94；T38-R95；Y39-A96；L40-S97；E1-N98；L42-G99；A43-E100；S44-T101；A45-L102；V46-E103；K47-K104；E48-I105；Q49-T106；Y50-N107；P51-S108；G52-R109；I53-P110；E54-P111；I55-C112；E56-V113；S57-I114；R58-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列59聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-L59；S2-G60；G3-G61；E4-T62；P5-G63；G6-A64；Q7-F65；T8-E66；S9-I67；V10-E68；A11-I69；P12-N70；P13-G71；P14-Q72；E15-L73；E16-V74；V17-F75；E18-S76；P19-K77；G20-L78；S21-E79；G22-N80；V23-G81；R24-G82；I25-F83；V26-P84；V27-Y85；E28-E86；Y29-K87；C30-D88；E31-L89；P32-I90；C33-E91；G34-A92；F35-I93；E36-R94；A37-R95；T38-A96；Y39-S97；L40-N98；E41-G99；L42-E100；A43-T101；S44-L102；A45-E103；V46-K104；K47-I105；E48-T106；Q49-N107；Y50-S108；P51-R109；G52-P110；I53-P111；E54-C112；I55-V113；E56-I114；S57-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列60聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G60；S2-G61；G3-T62；E4-G63；P5-A64；G6-F65；Q7-E66；T8-I67；S9-E68；V10-I69；A11-N70；P12-G71；P13-Q72；P14-L73；E15-V74；E16-F75；V17-S76；E18-K77；P19-L78；G20-E79；S21-N80；G22-G81；V23-G82；R24-F83；I25-P84；V26-Y85；V27-E86；E28-K87；Y29-D88；C30-L89；E31-I90；P32-E91；C33-A92；G34-I93；F35-R94；E36-R95；A37-A96；T38-S97；Y39-N98；L40-G99；E41-E100；L42-T101；A43-L102；S44-E103；A45-K104；V46-I105；K47-T106；E48-N107；Q49-S108；Y50-R109；P51-P110；G52-P111；I53-C112；E54-V113；I55-I114；E56-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列61聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G61；S2-T62；G3-G63；E4-A64；P5-F65；G6-E66；Q7-I67；T8-E68；S9-I69；V10-N70；A11-G71；P12-Q72；P13-L73；P14-V74；E15-F75；E16-S76；V17-K77；E18-L78；P19-E79；G20-N80；S21-G81；G22-G82；V23-F83；R24-P84；I25-Y85；V26-E86；V27-K87；E28-D88；Y29-L89；C30-I90；E31-E91；P32-A92；C33-I93；G34-R94；F35-R95；E36-A96；A37-S97；T38-N98；Y39-G99；L40-E100；E41-T101；L42-L102；A43-E103；S44-K104；A45-I105；V46-T106；K47-N107；E48-S108；Q49-R109；Y50-P110；P51-P111；G52-C112；I53-V113；E54-I114；I55-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列62聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-T62；S2-G63；G3-A64；E4-F65；P5-E66；G6-I67；Q7-E68；T8-I69；S9-N70；V10-G71；A11-Q72；P12-L73；P13-V74；P14-F75；E15-S76；E16-K77；V17-L78；E18-E79；P19-N80；G20-G81；S21-G82；G22-F83；V23-P84；R24-Y85；I25-E86；V26-K87；V27-D88；E28-L89；Y29-I90；C30-E91；E31-A92；P32-I93；C33-R94；G34-R95；F35-A96；E36-S97；A37-N98；T38-G99；Y39-E100；L40-T101；E41-L102；L42-E103；A43-K104；S44-I105；A45-T106；V46-N107；K47-S108；E48-R109；Q49-P110；Y50-P111；P51-C112；G52-V113；I53-I114；E54-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列63聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G63；S2-A64；G3-F65；E4-E66；P5-I67；G6-E68；Q7-I69；T8-N70；S9-G71；V10-Q72；A11-L73；P12-V74；P13-F75；P14-S76；E15-K77；E16-L78；V17-E79；E18-N80；P19-G81；G20-G82；S21-F83；G22-P84；V23-Y85；R24-E86；I25-K87；V26-D88；V27-L89；E28-I90；Y29-E91；C30-A92；E31-I93；P32-R94；C33-R95；G34-A96；F35-S97；E36-N98；A37-G99；T38-E100；Y39-T101；L40-L102；E41-E103；L42-K104；A43-I105；S44-T106；A45-N107；V46-S108；K47-R109；E48-P110；Q49-P111；Y50-C112；P51-V113；G52-I114；I53-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列64聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-A64；S2-F65；G3-E66；E4-I67；P5-E68；G6-I69；Q7-N70；T8-G71；S9-Q72；V10-L73；A11-V74；P12-F75；P13-S76；P14-K77；E15-L78；E16-E79；V17-N80；E18-G81；P19-G82；G20-F83；S21-P84；G22-Y85；V23-E86；R24-K87；I25-D88；V26-L89；V27-I90；E28-E91；Y29-A92；C30-I93；E31-R94；P32-R95；C33-A96；G34-S97；F35-N98；E36-G99；A37-E100；T38-T101；Y39-L102；L40-E103；E41-K104；L42-I105；A43-T106；S44-N107；A45-S108；V46-R109；K47-P110；E48-P111；Q49-C112；Y50-V113；P51-I114；G52-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列65聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-F65；S2-E66；G3-I67；E4-E68；P5-I69；G6-N70；Q7-G71；T8-Q72；S9-L73；V10-V74；A11-F75；P12-S76；P13-K77；P14-L78；E15-E79；E16-N80；V17-G81；E18-G82；P19-F83；G20-P84；S21-Y85；G22-E86；V23-K87；R24-D88；I25-L89；V26-I90；V27-E91；E28-A92；Y29-I93；C30-R94；E31-R95；P32-A96；C33-S97；G34-N98；F35-G99；E36-E100；A37-T101；T38-L102；Y39-E103；L40-K104；E41-I105；L42-T106；A43-N107；S44-S108；A45-R109；V46-P110；K47-P111；E48-C112；Q49-V113；Y50-I114；P51-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列66聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E66；S2-I67；G3-E68；E4-I69；P5-N70；G6-G71；Q7-Q72；T8-L73；S9-V74；V10-F75；A11-S76；P12-K77；P13-L78；P14-E79；E15-N80；E16-G81；V17-G82；E18-F83；P19-P84；G20-Y85；S21-E86；G22-K87；V23-D88；R24-L89；I25-I90；V26-E91；V27-A92；E28-I93；Y29-R94；C30-R95；E31-A96；P32-S97；C33-N98；G34-G99；F35-E100；E36-T101；A37-L102；T38-E103；Y39-K104；L40-I105；E41-T106；L42-N107；A43-S108；S44-R109；A45-P110；V46-P111；K47-C112；E48-V113；Q49-I114；Y50-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列67聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-I67；S2-E68；G3-I69；E4-N70；P5-G71；G6-Q72；Q7-L73；T8-V74；S9-F75；V10-S76；A11-K77；P12-L78；P13-E79；P14-N80；E15-G81；E16-G82；V17-F83；E18-P84；P19-Y85；G20-E86；S21-K87；G22-D88；V23-L89；R24-I90；I25-E91；V26-A92；V27-I93；E28-R94；Y29-R95；C30-A96；E31-S97；P32-N98；C33-G99；G34-E100；F35-T101；E36-L102；A37-E103；T38-K104；Y39-I105；L40-T106；E41-N107；L42-S108；A43-R109；S44-P110；A45-P111；V46-C112；K47-V113；E48-I114；Q49-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列68聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E68；S2-I69；G3-N70；E4-G71；P5-Q72；G6-L73；Q7-V74；T8-F75；S9-S76；V10-K77；A11-L78；P12-E79；P13-N80；P14-G81；E15-G82；E16-F83；V17-P84；E18-Y85；P19-E86；G20-K87；S21-D88；G22-L89；V23-I90；R24-E91；I25-A92；V26-I93；V27-R94；E28-R95；Y29-A96；C30-S97；E31-N98；P32-G99；C33-E100；G34-T101；F35-L102；E36-E103；A37-K104；T38-I105；Y39-T106；L40-N107；E41-S108；L42-R109；A43-P110；S44-P111；A45-C112；V46-V113；K47-I114；E48-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列69聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-I69；S2-N70；G3-G71；E4-Q72；P5-L73；G6-V74；Q7-F75；T8-S76；S9-K77；V10-L78；A11-E79；P12-N80；P13-G81；P14-G82；E15-F83；E16-P84；V17-Y85；E18-E86；P19-K87；G20-D88；S21-L89；G22-I90；V23-E91；R24-A92；I25-I93；V26-R94；V27-R95；E28-A96；Y29-S97；C30-N98；E31-G99；P32-E100；C33-T101；G34-L102；F35-E103；E36-K104；A37-I105；T38-T106；Y39-N107；L40-S108；E41-R109；L42-P110；A43-P111；S44-C112；A45-V113；V46-I114；K47-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列70聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-N70；S2-G71；G3-Q72；E4-L73；P5-V74；G6-F75；Q7-S76；T8-K77；S9-L78；V10-E79；A11-N80；P12-G81；P13-G82；P14-F83；E15-P84；E16-Y85；V17-E86；E18-K87；P19-D88；G20-L89；S21-I90；G22-E91；V23-A92；R24-I93；I25-R94；V26-R95；V27-A96；E28-S97；Y29-N98；C30-G99；E31-E100；P32-T101；C33-L102；G34-E103；F35-K104；E36-I105；A37-T106；T38-N107；Y39-S108；L40-R109；E41-P110；L42-P111；A43-C112；S44-V113；A45-I114；V46-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列71聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G71；S2-Q72；G3-L73；E4-V74；P5-F75；G6-S76；Q7-K77；T8-L78；S9-E79；V10-N80；A11-G81；P12-G82；P13-F83；P14-P84；E15-Y85；E16-E86；V17-K87；E18-D88；P19-L89；G20-I90；S21-E91；G22-A92；V23-I93；R24-R94；125-R95；V26-A96；V27-S97；E28-N98；Y29-G99；C30-E100；E31-T101；P32-L102；C33-E103；G34-K104；F35-I105；E36-T106；A37-N107；T38-S108；Y39-R109；L40-P110；E41-P111；L42-C112；A43-V113；S44-I114；A45-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列72聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-Q72；S2-L73；G3-V74；E4-F75；P5-S76；G6-K77；Q7-L78；T8-E79；S9-N80；V10-G81；A11-G82；P12-F83；P13-P84；P14-Y85；E15-E86；E16-K87；V17-D88；E18-L89；P19-I90；G20-E91；S21-A92；G22-I93；V23-R94；R24-R95；I25-A96；V26-S97；V27-N98；E28-G99；Y29-E100；C30-T101；E31-L102；P32-E103；C33-K104；G34-I105；F35-T106；E36-N107；A37-S108；T38-R109；Y39-P110；L40-P111；E41-C112；L42-V113；A43-I114；S44-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列73聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-L73；S2-V74；G3-F75；E4-S76；P5-K77；G6-L78；Q7-E79；T8-N80；S9-G81；V10-G82；A11-F83；P12-P84；P13-Y85；P14-E86；E15-K87；E16-D88；V17-L89；E18-I90；P19-E91；G20-A92；S21-I93；G22-R94；V23-R95；R24-A96；I25-S97；V26-N98；V27-G99；E28-E100；Y29-T101；C30-L102；E31-E103；P32-K104；C33-1105；G34-T106；F35-N107；E36-S108；A37-R109；T38-P110；Y39-P111；L40-C112；E41-V113；L42-I114；A43-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列74聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-V74；S2-F75；G3-S76；E4-K77；P5-L78；G6-E79；Q7-N80；T8-G81；S9-G82；V10-F83；A11-P84；P12-Y85；P13-E86；P14-K87；E15-D88；E16-L89；V17-I90；E18-E91；P19-A92；G20-I93；S21-R94；G22-R95；V23-A96；R24-S97；I25-N98；V26-G99；V27-E100；E28-T101；Y29-L102；C30-E103；E31-K104；P32-I105；C33-T106；G34-N107；F35-S108；E36-R109；A37-P110；T38-P111；Y39-C112；L40-V113；E41-I114；L42-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列75聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-F75；S2-S76；G3-K77；E4-L78；P5-E79；G6-N80；Q7-G81；T8-G82；S9-F83；V10-P84；A11-Y85；P12-E86；P13-K87；P14-D88；E15-L89；E16-I90；V17-E91；E18-A92；P19-I93；G20-R94；S21-R95；G22-A96；V23-S97；R24-N98；I25-G99；V26-E100；V27-T101；E28-L102；Y29-E103；C30-K104；E31-I105；P32-T106；C33-N107；G34-S108；F35-R109；E36-P110；A37-P111；T38-C112；Y39-V113；L40-I114；E41-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列76聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-S76；S2-K77；G3-L78；E4-E79；P5-N80；G6-G81；Q7-G82；T8-F83；S9-P84；V10-Y85；A11-E86；P12-K87；P13-D88；P14-L89；E15-I90；E16-E91；V17-A92；E18-I93；P19-R94；G20-R95；S21-A96；G22-S97；V23-N98；R24-G99；I25-E100；V26-T101；V27-L102；E28-E103；Y29-K104；C30-I105；E31-T106；P32-N107；C33-S108；G34-R109；F35-P110；E36-P111；A37-C112；T38-V113；Y39-I114；L40-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列77聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-K77；S2-L78；G3-E79；E4-N80；P5-G81；G6-G82；Q7-F83；T8-P84；S9-Y85；V10-E86；A11-K87；P12-D88；P13-L89；P14-I90；E15-E91；E16-A92；V17-I93；E18-R94；P19-R95；G20-A96；S21-S97；G22-N98；V23-G99；R24-E100；I25-T101；V26-L102；V27-E103；E28-K104；Y29；I105；C30-T106；E31-N107；P32-S108；C33-R109；G34-P110；F35-P111；E36-C112；A37-V113；T38-I114；Y39-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列78聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-L78；S2-E79；G3-N80；E4-G81；P5-G82；G6-F83；Q7-P84；T8-Y85；S9-E86；V10-K87；A11-D88；P12-L89；P13-I90；P14-E91；E15-A92；E16-I93；V17-R94；E18-R95；P19-A96；G20-S97；S21-N98；G22-G99；V23-E100；R24-T101；I25-L102；V26-E103；V27-K104；E28-I105；Y29-T106；C30-N107；E31-S108；P32-R109；C33-P110；G34-P111；F35-C112；E36-V113；A37-I114；T38-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列79聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E79；S2-N80；G3-G81；E4-G82；P5-F83；G6-P84；Q7-Y85；T8-E86；S9-K87；V10-D88；A11-L89；P12-I90；P13-E91；P14-A92；E15-I93；E16-R94；V17-R9 5；E18-A96；P19-S97；G20-N98；S21-G99；G22-E100；V23-T101；R24-L102；I25-E103；V26-K104；V27-I105；E28-T106；Y29-N107；C30-S108；E31-R109；P32-P110；C33-P111；G34-C112；F35-V113；E36-I114；A37-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列80聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-N80；S2-G81；G3-G82；E4-F83；P5-P84；G6-Y85；Q7-E86；T8-K87；S9-D8；V10-L89；A11-I90；P12-E91；P13-A92；P14-I93；E15-R94；E16-R95；V17-A96；E18-S97；P19-N98；G20-G99；S21-E100；G22-T101；V23-L102；R24-E103；I25-K104；V26-I105；V27-T106；E28-N107；Y29-S108；C30-R109；E31-P110；P32-P111；C33-C112；G34-V113；F35-I114；E36-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列81聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G81；S2-G82；G3-F83；E4-P84；P5-Y85；G6-E86；Q7-K87；T8-D88；S9-L89；V10-I90；A11-E91；P12-A92；P13-I93；P14-R94；E15-R95；E16-A96；V17-S97；E18-N98；P19-G99；G20-E100；S21-T101；G22-L102；V23-E103；R24-K104；I25-I105；V26-T106；V27-N107；E28-S108；Y29-R109；C30-P110；E31-P111；P32-C112；C33-V113；G34-I114；F35-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列82聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G82；S2-F83；G3-P84；E4-Y85；P5-E86；G6-K87；Q7-D88；T8-L89；S9-I90；V10-E91；A11-A92；P12-I93；P13-R94；P14-R95；E15-A96；E16-S97；V17-N98；E18-G99；P19-E100；G20-T101；S21-L102；G22-E103；V23-K104；R24-I105；I25-T106；V26-N107；V27-S108；E28-R109；Y29-P110；C30-P111；E31-C112；P32-V113；C33-I114；G34-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列83聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-F83；S2-P84；G3-Y85；E4-E86；P5-K87；G6-D88；Q7-L89；T8-I90；S9-E91；V10-A92；A11-I93；P12-R94；P13-R95；P14-A96；E15-S97；E16-N98；V17-G99；E18-E100；P19-T101；G20-L102；S21-E103；G22-K104；V23-I105；R24-T106；I25-N107；V26-S108；V27-R109；E28-P110；Y29-P111；C30-C112；E31-V113；P32-I114；C33-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列84聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-P84；S2-Y85；G3-E86；E4-K87；P5-D88；G6-L89；Q7-I90；T8-E91；S9-A92；V10-I93；A11-R94；P12-R95；P13-A96；P14-S97；E15-N98；E16-G99；V17-E100；E18-T101；P19-L102；G20-E103；S21-K104；G22-I105；V23-T106；R24-N107；I25-S108；V26-R109；V27-P110；E28-P111；Y29-C112；C30-V113；E31-I114；P32-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列85聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-Y85；S2-E86；G3-K87；E4-D88；P5-L89；G6-I90；Q7-E91；T8-A92；S9-I93；V10-R94；A11-R95；P12-A96；P13-S97；P14-N98；E15-G99；E16-E100；V17-T101；E18-L102；P19-E103；G20-K104；S21-I105；G22-T106；V23-N107；R24-S108；I25-R109；V26-P110；V27-P111；E28-C112；Y29-V113；C30-I114；E31-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列86聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E86；S2-K87；G3-D88；E4-L89；P5-I90；G6-E91；Q7-A92；T8-I93；S9-R94；V10-R95；A11-A96；P12-S97；P13-N98；P14-G99；E15-E100；E16-T101；V17-L102；E18-E103；P19-K104；G20-I105；S21-T106；G22-N107；V23-S108；R24-R109；I25-P110；V26-P111；V27-C112；E28-V113；Y29-I114；C30-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列87聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-K87；S2-D88；G3-L89；E4-I90；P5-E91；G6-A92；Q7-I93；T8-R94；S9-R95；V10-A96；A11-S97；P12-N98；P13-G99；P14-E100；E15-T101；E16-L102；V17-E103；E18-K104；P19-I105；G20-T106；S21-N107；G22-S108；V23-R109；R24-P110；I25-P111；V26-C112；V27-V113；E28-I114；Y29-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列88聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-D88；S2-L89；G3-I90；E4-E91；P5-A92；G6-I93；Q7-R94；T8-R95；S9-A96；V10-S97；A11-N98；P12-G99；P13-E100；P14-T101；E15-L102；E16-E103；V17-K104；E18-I105；P19-T106；G20-N107；S21-S108；G22-R109；V23-P110；R24-P111；I25-C112；V26-V113；V27-I114；E28-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列89聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-L89；S2-I90；G3-E91；E4-A92；P5-I93；G6-R94；Q7-R95；T8-A96；S9-S97；V10-N98；A11-G99；P12-E100；P13-T101；P14-L102；E15-E103；E16-K104；V17-I105；E18-T106；P19-N107；G20-S108；S21-R109；G22-P110；V23-P111；R24-C112；I25-V113；V26-I114；V27-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列90聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-I90；S2-E91；G3-A92；E4-I93；P5-R94；G6-R95；Q7-A96；T8-S97；S9-N98；V10-G99；A11-E100；P12-T101；P13-L102；P14-E103；E15-K104；E16-I105；V17-T106；E18-N107；P19-S108；G20-R109；S21-P110；G22-P111；V23-C112；R24-V113；I25-I114；V26-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列91聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E91；S2-A92；G3-I93；E4-R94；P5-R95；G6-A96；Q7-S97；T8-N98；S9-G99；V10-E100；A11-T101；P12-L102；P13-E103；P14-K104；E15-I105；E16-T106；V17-N107；E18-S108；P19-R109；G20-P110；S21-P111；G22-C112；V23-V113；R24-I114；I25-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列92聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-A92；S2-I93；G3-R94；E4-R95；P5-A96；G6-S97；Q7-N98；T8-G99；S9-E100；V10-T101；A11-L102；P12-E103；P13-K104；P14-I105；E15-T106；E16-N107；V17-S108，E18-R109；P19-P110；G20-P111；S21-C112；G22-V113；V23-I114；R24-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列93聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-I93；S2-R94；G3-R95；E4-A96；P5-S97；G6-N98；Q7-G99；T8-E100；S9-T101；V10-L102；A11-E103；P12-K104；P13-I105；P14-T106；E15-N107；E16-S108；V17-R109；E18-P110；P19-P111；G20-C112；S21-V113；G22-I114；V23-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列94聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-R94；S2-R95；G3-A96；E4-S97；P5-N98；G6-G99；Q7-E100；T8-T101；S9-L102；V10-E103；A11-K104；P12-I105；P13-T106；P14-N107；E15-S108；E16-R109；V17-P110；E18-P111；P19-C112；G20-V113；S21-I114；G22-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列95聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-R95；S2-A96；G3-S97；E4-N98；P5-G99；G6-E100；Q7-T101；T8-L102；S9-E103；V10-K104；A11-I105；P12-T106；P13-N107；P14-S108；E15-R109；E16-P110；V17-P111；E18-C112；P19-V113；G20-I114；S21-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列96聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-A96；S2-S97；G3-N98；E4-G99；P5-E100；G6-T101；Q7-L102；T8-E103；S9-K104；V10-I105；A11-T106；P12-N107；P13-S108；P14-R109；E15-P110；E16-P111；V17-C112；E18-V113；P19-I114；G20-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列97聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-S97；S2-N98；G3-G99；E4-E100；P5-T101；G6-L102；Q7-E103；T8-K104；S9-I105；V10-T106；A11-N107；P12-S108；P13-R109；P124-P110；E15-P111；E16-C112；V17-V113；E18-1114；P19-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列98聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-N98；S2-G99；G3-E100；E4-T101；P5-L102；G6-E103；Q7-K104；T8-I105；S9-T106；V10-N107；A11-S108；P12-R109；P13-P110；P14-P111；E15-C112；E16-V113；V17-I114；E18-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列99聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-G99；S2-E100；G3-T101；E4-L102；P5-E103；G6-K104；Q7-I105；T8-T106；S9-N107；V10-S108；A11-R109；P12-P110；P13-P111；P14-C112；E15-V113；E16-I114；V17-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列100聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E100；S2-T101；G3-L102；E4-E103；P5-K104；G6-I105；Q7-T106；T8-N107；S9-S108；V10-R109；A11-P110；P12-P111；P13-C112；P14-V113；E15-I114；E16-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列101聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-T101；S2-L102；G3-E103；E4-K104；P5-I105；G6-T106；Q7-N107；T8-S108；S9-R109；V10-P110；A11-P111；P12-C112；P13-V113；P14-I114；E15-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列102聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-L102；S2-E103；G3-K104；E4-I105；P5-T106；G6-N107；Q7-S108；T8-R109；S9-P110；V10-P111；A11-C112；P12-V113；P13-I114；P14-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列103聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-E103；S2-K104；G3-I105；E4-T106；P5-N107；G6-S108；Q7-R109；T8-P110；S9-P111；V10-C112；A11-V113；P12-I114；P13-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列104聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-K104；S2-I105；G3-T106；E4-N107；P5-S108；G6-R109；Q7-P110；T8-P111；S9-C112；V10-V113；A11-I114；P12-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列105聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-I105；S2-T106；G3-N107；E4-S108；P5-R109；G6-P110；Q7-P111；T8-C112；S9-V113；V10-I114；A11-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列106聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-T106；S2-N107；G3-S108；E4-R109；P5-P110；G6-P111；Q7-C112；T8-V113；S9-I114；V10-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列107聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-N107；S2-S108；G3-R109；E4-P110；P5-P111；G6-C112；Q7-V113；T8-I114；S9-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列108聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-S108；S2-R109；G3-P110；E4-P111；P5-C112；G6-V113；Q7-I114；T8-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列109聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-R109；S2-P110；G3-P111；E4-C112；P5-V113；G6-I114；Q7-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列110聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-P110；S2-P111；G3-C112；E4-V113；P5-I114；G6-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列111聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-P111；S2-C112；G3-V113；E4-I114；P5-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列112聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-C112；S2-V113；G3-I114；E4-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列113聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
M1-V113；S2-I114；G3-L115。
在另一优选实施方案中，包含一个或多个C35肽表位或由其组成的本发明的分离多肽包括下列114聚体(残基对应于SEQ ID NO2和图1B)
刺激CTL和HTL应答
在过去十年中，阐明了很多有关T细胞识别抗原的机理。根据对免疫系统的理解，本发明人开发出有效的肽表位组合物，在通过各种技术可行手段给予时，可诱导对某些肿瘤相关抗原的治疗或预防性免疫应答。此外，利用本发明的肽表位或符合此处公开原则的肽表位组合，能够在显著百分比的非遗传偏性世界人口中获得应答。为理解所公开组合物的价值和效力，提供免疫相关技术的简述。
HLA分子和肽抗原的复合物作为HLA限制性T细胞识别的配基(Buus，S.等人，Cell 471071，1986；Babbitt，B.P.等人，Nature 317359，1985；Townsend，A.和Bodmer，H.，Annu.Rev.Immunol.7601，1989；Germain，R.N.，Annu.Rev.Immunol.11403，1993)。通过研究单氨基酸取代的抗原类似物并测序内源性结合的天然加工肽，已经鉴定了特异性结合HLA抗原分子所需基序对应的关键残基。
另外，HLA肽复合物X射线结晶分析揭示了HLA分子的肽结合裂隙内的口袋，通常以等位基因特异性为基础接纳肽配基的残基；这些残基反过来决定其所处肽的HLA结合能力。(参见例如Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13587，1995；Smith等人，Immunity 4203，1996；Fremont等人，Immunity 8305，1998；Stern等人.，Structure2245，1994；Jones，E.Y.Curr.Opin.Immunol.975，1997；Brown，J.H.等人，Nature 36433，1993；Guo，H.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908053，1993；Guo，H.C.等人，Nature 360364，1992；Silver，M.L.等人，Nature 360367，1992；Matsumura，M.等人，Science 257927，1992；Madden等人，Cell 701035，1992；Fremont，D.H.等人，Science 257919，1992；Saper，M.A.，Bjorkman，P.J.和Wiley，D.C.，J.Mol.Biol.219277，1991.)因此，定义I类和II类等位基因特异性HLA结合基序或I类和II类超基序，使得可以鉴定蛋白质内具有预测的结合特定HLA抗原能力的区域。
此外，此处公开的结合亲和力和免疫原性的相关性，是评价候选肽时要考虑的重要因素。因此，利用抗原性序列的基序查询组合和HLA-肽结合分析，已经鉴定了基于表位的疫苗。如本领域人员所理解，在确定其结合亲和性之后，可以进行其它工作以在这些疫苗肽中选择，例如可以根据人群覆盖范围、抗原性和免疫原性等，选择具有任选特征的疫苗肽。
可以利用多种策略评价免疫原性，包括
1)评价正常个体的原代T细胞培养物(参见例如Wentworth，P.A.等人，Mol.Immunol.32603，1995；Celis，E.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912105，1994；Tsai，V.等人，J.Immunol.1581796，1997；Kawashima，1.等人，Human Immunol.591，1998)。该方法包括在抗原呈递细胞存在下，利用待测肽体外刺激正常受试者的外周血淋巴细胞(PBL)几个星期。在此期间，肽特异性的T细胞开始活化，使用例如有关肽致敏靶细胞和/或内源性产生抗原的靶细胞的51Cr释放分析进行检测。
2)免疫HLA转基因小鼠(参见例如Wentworth，P.A.等人，J.Immunol.2697，1996；Wentworth，P.A.等人，Int.Immunol.8651，1996；Alexander，J.等人，J.Immunol.1594753，1997)；在此方法中，将处于弗氏不完全佐剂中的肽经皮下给予HLA转基因小鼠。免疫几周后，取出脾细胞，在待测肽存在下体外培养约一周。使用例如有关肽致敏靶细胞和表达内源性产生抗原的靶细胞的51Cr释放分析进行检测。
3)证明经受疾病的个体(例如有效治疗及病愈的免疫个体)和/或活跃疾病患者的T细胞回忆应答(参见例如Rehermann，B.等人，J.Exp.Med.1811047，1995；Doolan，D.L.等人，Immunity 797，1997；Bertoni，R.等人，J.Clin.Invest.100503，1997；Threlkeld，S.C.等人，J.Immunol.1591648，1997；Diepolder，H.M.等人，J.Virol.716011，1997)。在应用此策略时，在待测肽及抗原呈递细胞(APC)存在下，体外培养受试者PBL 1-2周，使″记忆″T细胞相比″天然″T细胞活化，来检测回忆应答。在培养期之后，使用T细胞活性分析，包括有关肽致敏靶细胞的51Cr释放、T细胞增殖或淋巴因子释放，来检测T细胞活性，。
下文详述本发明的肽表位及对应核酸。
HLA分子肽表位的结合亲和性
如此处所示，HLA的高度多态性是基于表位的疫苗产生方法所需考虑的重要因素。针对这一因素，优选利用能够以高或中等亲和性结合多个HLA分子肽的表位选择包括鉴定，最优选以高或中等亲和性结合两种或多种等位基因特异性HLA分子的表位。
疫苗组合物有关的诱导CTL的目的肽表位优选包括其I类HLA分子的IC50或结合亲和性数值为500nM或更好(即，该值＜500nM)。诱导HTL的肽表位优选包括其II类HLA分子的IC50或结合亲和性数值为1000nM或更好(即，该值＜1000nM)。例如，通过测试候选肽体外结合纯化的HLA分子的能力来评价肽结合性。然后考虑进一步分析具有高或中等亲和性的肽。通常对超型(supertype)家族的其它成员测试所选肽。在优选实施方案中，然后将具有交叉反应性结合的肽用于细胞筛选分析或疫苗。
已经确定了HLA I类分子的结合亲和性与所结合抗原上各个肽表位的免疫原性之间的关系。如此处所详述，高HLA结合亲和性与高免疫原性相关。
高免疫原性可以有若干不同方式表现。免疫原性对应于是否完全引发免疫应答、任一特定应答的强度以及引发应答的群体适用范围。例如，某一肽表位可能在不同群体中引发免疫应答，但从不产生有力应答。按照这些原则，已经发现接近90％的高结合肽引发应答，因而是″免疫原性的″，相比之下，以中等亲和性结合的肽约为50％。(参见例如Schaeffer等人PNAS 1988)。此外，高结合亲和性的肽不仅产生免疫应答的可能性增加，其所产生的应答往往比弱结合的肽更强。因此，如果使用高亲和性结合的肽，而非低亲和性的肽，其引发类似的生物学效应只需较少的肽。因此，在本发明优选实施方案中，使用高亲和性结合的表位。
利用两种不同的实验方法分析结合亲和性与免疫原性之间的相关性(参见例如Sette等人，J.Imunol.1535586-5592，1994)。第一种方法，在HLA-A*0201结合转基因小鼠中分析HLA结合亲和性处于10,000倍范围内的潜在表位的免疫原性。第二种方法，使用急性肝炎患者PBL评价约100种携带A*0201结合基序的不同乙肝病毒(HBV)来源的潜在表位的抗原性。按照上述方法，确定约500nM(优选50nM或更低)的亲和性阈值决定一个肽表位引发CTL应答的能力。以上数据对天然加工的肽表位以及合成的T细胞表位的I类结合亲和性测定均成立。以上数据还表明决定簇选择在T细胞应答形成中的重要作用(参见例如Schaeffer等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864649-4653，1989)。
也描述了有关HLA II类(即，HLA DR)分子免疫原性的亲和性阈值(参见例如Southwood等人J.Immunology 1603363-3373，1998)。为了确定HLA II类结合亲和性的生物学显著性阈值，编辑了其限制性成分(即，结合该表位的HLA分子)的32个DR限制性表位的结合亲和性数据库。约半数例子(32个表位中的15个)的DR限制与高结合亲和性有关，即，结合亲和性数值为100nM或更低。另一半例子(32中的16个)的DR限制与中等结合亲和性有关(结合亲和性数值为100-1000nM)。32个例子中只有一个是有关IC50为1000nM或更高的DR限制。因此，将1000nM确定为有关DR分子免疫原性的亲和性阈值。
本发明的疫苗也可能包含结合MHC II类DR分子的表位。II类肽配基的基序大小以及结合框相对于肽N和C端的位置具有较高的不均一性。这种增加的HLA II类肽配基的不均一性应归于HLA II类分子结合槽的结构，不同于其I类对应物，其两端很少物理压缩。
除A2超基序和A2.1等位基因特异性基序之外，存在大量其它的超基序和基序。通过包括一种或多种来自其它基序或超基序的表位，可以获得对主要通用群体而言增强的群体适用范围。
肽类似物
一般而言，CTL和HTL应答并不针对所有可能的表位。而是局限于几种″免疫显性″的决定簇(Zinkernagel等人，Adv.Immunol.275159，1979；Bennink等人，J.Exp.Med.16819351939，1988；Rawle等人，J；Immunol.1463977-3984，1991)。公认由给定表位选择性结合特定HLA蛋白质的能力(决定簇选择理论)(Vitiello等人，J.Immunol.1311635，1983；Rosenthal等人，Nature 267156-158，1977)，或由现存TCR(T细胞受体)的特异性来选择性识别(全体理论)(Klein，J.，IMMUNOLOGY，THE SCIENCE OF SELFNONSELFDISCRIMINATION，John Wiley & Sons，New York，pp.270-310，1982)，可以解释免疫显性(Benacerraf等人，Science 175273-279，1972)。已经证明，除严格的免疫原性之外，其中许多潜在的决定簇被呈递为免疫显性，其它因素(主要与加工事件有关)也可以在指令中起主要作用(Sercarz等人，Annu.Rev.ImmunoL 11729-766，1993)。
显性和亚显性的概念与感染性疾病和恶性肿瘤的免疫治疗有关。例如，在慢性病毒性疾病过程中，补充亚显性表位对于成功清除感染是重要的，特别是在显性CTL或HTL特异性已因功能性耐受、抑制、病毒突变及其它机制而失活时(Franco等人，Curr.Opin.Immunol.7524-531，1995)。就癌症和肿瘤抗原而言，识别至少某些最高结合亲和性肽的CTL可能被功能性失活。此时较低亲和性的肽被优先识别，因而可能优选为治疗或预防性抗癌疫苗。
特别是注意到大量来源于已知非病毒性肿瘤相关抗原(TTA)的表位以中等亲和性(IC50为50-500nM)而非高亲和性(IC50少于50nM)与HLA I类结合。
例如，发现15种已知TAA肽中的8种由以50-500nM结合的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或CTL识别。(估计90％的已知病毒性抗原以50nM或更少的IC50结合HLA I类分子，而只有约10％以50-500nM结合，正与上述数据相反(Sette等人，J.Immunol.，153558-5592，1994)。在癌症环境中，该现象可能应归于大概因T细胞耐受事件而去除了CTL识别几种最高结合肽的功能性抑制。
并非意在受理论约束，相信因为针对显性表位的T细胞可能克隆缺失，选择亚显性表位可使现有T细胞得到补充，然后引起治疗性或预防性应答。但HLA分子与亚显性表位的结合常常不如显性表位强。
因此，需要能够调节特定免疫原性表位与一种或多种HLA分子的结合亲和性，从而调节该肽引发的免疫应答，例如制备可引发更强应答的模拟肽。按照上述原则调节结合亲和性及所致免疫应答的能力，极大增强了基于肽表位的疫苗和治疗剂的用途。
尽管利用上述筛选方法鉴定了在超家族所有等位基因中具有合适交叉反应性的肽，但交叉反应性并不一定尽可能的圆满，在某些情况下，提高肽交叉反应性的方法是有用的；此外，这类方法也可以用于改变肽的其它特性，诸如结合亲和性或肽稳定性。已经建立了控制肽与HLA等位基因的指定基序或超基序中的交叉反应性的一般原则，可以进行特定目的肽的结构改变(即，模拟)，以获得较宽(或改变)的HLA结合能力。更具体而言，按照此处教导可以制备具有最宽交叉反应性形式的肽。
简言之，该模拟策略利用与结合某些HLA分子有关的基序或超基序。通过取代一级锚、二级锚或一级和二级锚位的氨基酸残基，可以制备模拟肽。一般为已带有基序或超基序的肽制备类似物。对于许多基序或超基序而言，不利于等位基因特异性HLA分子或可结合各自基序或超基序的HLA超型(supertype)成员结合的残基是确定的。因此，可以去除这类不利结合的残基。例如，就A3超型而言，从分析所用的肽群体中去除所有具有这类有害残基的肽以后，交叉反应性的发生率从22％升到37％(参见例如Sidney，J.等人，Hu.ImmunoL 4579，1996)。本发明C35肽表位类似物的例子见表4。在一个特别优选实施方案中，本发明的分离多肽包含下列C35肽表位类似物或由其组成对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位G22-C30(即GVRIVVEYC)，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即GVRIVVEYA或GVRIVVEYG)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I25-C33(即IVVEYCEPC)，具有取代第6个氨基酸残基和/或第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即IVVEYAEPC，IWEYCEPA，IVVEYGEPC，IVVEYCEPG，IVVEYAEPA，IVVEYAEPG，IVVEYGEPA，IVVEYGEPG)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K77-Y85(即KLENGGFPY)，具有取代第9个氨基酸残基处酪氨酸的缬氨酸的类似物(即KLENGGFPV)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-C112(即KITNSRPPC)，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物(即KITNSRPPL，KITNSRPPA，KITNSRPPG)；对于SEQ IDNO2和图1B的肽表位K104-V113(即KITNSRPPCV)，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或亮氨酸的类似物(即KITNSRPPLV，KITNSRPPAV，KITNSRPPGV，KITNSRPPSV)；对于SEQ IDNO2和图1B的肽表位I105-V133(即ITNSRPPCV)，具有取代第2个氨基酸残基处苏氨酸的亮氨酸或甲硫氨酸和/或取代第8个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸的类似物(即ILNSRPPCV，IMNSRPPCV，ITNSRPPAV，ITNSRPPGV，ILNSRPPAV，ILNSRPPGV，IMNSRPPAV，IMNSRPPGV，ILNSRPPSV，IMNSRPPSV，ITNSRPPSV)；以及对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位N107-L115(即NSRPPCVIL)，具有取代第6个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即NSRPPAVIL，NSRPPGVIL)。本发明另外涉及包含一个或多个C35表位类似物或由其组成的多肽。在一个优选实施方案中，本发明涉及包含一个或多个C35表位类似物以及一个或多个C35肽表位的多肽。在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及包含选自下列的至少一个C35肽表位类似物的融合蛋白质对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位G22-C30(即GVRIVVEYC)，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即GVRIVVEYA或GVRIVVEYG)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I25-C33(即IVVEYCEPC)，具有取代第6个氨基酸残基和/或第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即IVVEYAEPC，IVVEYCEPA，IVVEYGEPC，IVVEYCEPG，IVVEYAEPA，IVVEYAEPG，IVVEYGEPA，IVVEYGEPG)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K77-Y85(即KLENGGFPY)，具有取代第9个氨基酸残基处酪氨酸的缬氨酸的类似物(即KLENGGFPV)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-C112(即KITNSRPPC)，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物(即KITNSRPPL，KITNSRPPA，KITNSRPPG)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-V113(即KITNSRPPCV)，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或亮氨酸的类似物(即KITNSRPPLV，KITNSRPPAV，KITNSRPPGV，KITNSRPPSV)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I105-V133(即ITNSRPPCV)，具有取代第2个氨基酸残基处苏氨酸的亮氨酸或甲硫氨酸和/或取代第8个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸的类似物(即ILNSRPPCV，IMNSRPPCV，ITNSRPPAV，ITNSRPPGV，ILNSRPPAV，ILNSRPPGV，IMNSRPPAV，IMNSRPPGV，ILNSRPPSV，IMNSRPPSV，ITNSRPPSV)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位N107-L115(即NSRPPCVIL)，具有取代第6个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即NSRPPAVIL，NSRPPGVIL)，和至少一种选自下列的C35肽表位SEQ ID NO2的氨基酸E4-P12、SEQ ID NO2的氨基酸S9-V17、SEQ ID NO2的氨基酸S21-Y29、SEQ ID NO2的氨基酸G22-C30、SEQ ID NO2的氨基酸125-C33、SEQ ID NO2的氨基酸T38-V46、SEQ ID NO2的氨基酸G61-169、SEQ ID NO2的氨基酸T62-N70、SEQ ID NO2的氨基酸G63-G71、SEQ ID NO2的氨基酸F65-L73、SEQ ID NO2的氨基酸I67-F75、SEQ ID NO2的氨基酸K77-Y85、SEQ ID NO2的氨基酸Q72-E86、SEQ ID NO2的氨基酸G81-L89、SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113、SEQ ID NO2的氨基酸E100-V113、SEQ ID NO2的氨基酸K104-C112、SEQ ID NO2的氨基酸K104-V113、SEQ ID NO2的氨基酸I105-V113以及SEQ ID NO2的氨基酸N107-L115。
因此，提高肽在给定超基序中交叉反应性的一个策略是，简单缺失肽中存在的一个或多个有害残基，取代为小的″中性″残基，例如丙氨酸(而可能不影响肽的T细胞识别)。若在去除肽中有害残基的同时，插入与高亲和性结合超家族中等位基因特异性HLA分子或多个HLA分子有关的″优选″残基，则可期望增强交叉反应性的可能性。
为保证模拟肽在用作疫苗时确实体内引发针对天然表位的CTL应答(或者，就II类表位而言，引发与野生型肽交叉反应的辅助T细胞)，可能使用该模拟肽体外诱导合适HLA等位基因受试者的T细胞。其后评价该致免疫细胞裂解野生型肽致敏的靶细胞的能力。或者，通过监控IFN释放来进行细胞活性评价。其中每一细胞监控策略均评价CTL对APC的识别。已经感染或转染合适基因的细胞或(由于HLA类型II的不同肽加工途径，一般只针对II类表位)，利用完整蛋白质抗原脉冲的细胞，很理想用作抗原呈递细胞，以确立内源性生成的抗原是否也可被模拟肽所诱导的T细胞识别。应该注意到，肽/蛋白质脉冲的树突细胞可以用于呈递针对HLA I类和II类的完整蛋白质抗原。
本发明另一实施方案是制备弱结合肽的类似物，藉此保证足够数量的细胞结合物。通过取代符合各自超型的优选锚定残基，可以″修理(fix)″表现500-5000nM结合亲和性并在一个或两个位点带有可接受但次优的一级锚定残基的I类结合肽。然后测试此模拟肽的结合和/或交叉结合能力。
本发明另一实施方案是制备已经是交叉反应性结合物、疫苗候选物但与超型的一种或多种等位基因弱结合的肽类似物。若交叉反应性结合物在一级或二级锚位带有次优残基(次优选或有害)，该肽可以通过取代有害残基并替换为优选或次优选残基、或取代次优选残基并替换为优选残基来模拟。然后测试此模拟肽的交叉结合能力。
产生有效肽类似物的另一实施方案包括取代对肽稳定性或可溶性(例如在液体环境中)具有不利影响的残基。该取代可能发生在肽表位的任意位点。例如，可以取代半胱氨酸(C)为α-氨基丁酸。因其化学性质，半胱氨酸有形成二硫桥倾向并足以改变肽结构，以致降低结合能力。取代C为α-氨基丁酸不仅减低这个难题，也实际上提高了某些情况下的结合及交叉结合能力(参见例如Sette等人综述Persistent ViralInfections，Eds.R.Ahmed和I.Chen，John Wiley & Sons，England，1999)。可能在肽表位的任何残基处(即锚位或非锚位)发生α-氨基丁酸取代半胱氨酸。
此外，已经表明在一组包含至少一个优选二级锚定残基而避免存在任何有害二级锚定残基的带有A*0201基序的肽中，69％的肽以小于500nM的IC50结合A*0201(Ruppert，J.等人Cell 74929，1993)。可以使用Ruppert确定优选或有害残基的方法产生算法(参见例如22)。该算法可以变通，可能按需调整其阈值得分，以选择具有较高或较低的预测结合特性的一组肽。
包含半胱氨酸残基的C35表位倾向于与其它包含半胱氨酸的肽二聚化。因此，本发明的一个实施方案是包含本发明肽表位(例如表1-3或5-6所列的C35肽表位，不包括SEQ ID NO2的E100-R109)以及合适还原剂的组合物，该还原剂保护半胱氨酸残基的自由巯基而不抑制表位结合。在一个优选实施方案中，该组合物包含肽表位ITNSRPPCV或KITNSRPPCV连同合适的还原剂。合适的还原剂包括但不限于TCEP和二硫苏糖醇(DTT)。
本发明另一实施方案是制备肽表位类似物，其中肽表位(例如表1-3或5-6所列的C35肽表位，不包括SEQ ID NO2的E100-R109)的半胱氨酸残基为方便合成已取代为任何其它氨基酸。(参见Zarling，A.L.等人，J.Exp.Med.192(12)1755-1762(2000))。虽然只要该取代不负面影响结合MHC或T细胞的识别，便可以取代为任何氨基酸，但优选由丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸残基取代半胱氨酸残基。因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离多肽包含下列C35肽表位类似物或由其组成对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位G22-C30(即GVRIVVEYC)，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即GVRIVVEYA或GVRIVVEYG)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I25-C33(即IVVEYCEPC)，具有取代第6个氨基酸残基和/或第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即IVVEYAEPC或IVVEYGEPC或IVVEYCEPA或IVVEYCEPG或IVVEYAEPA或IVVEYAEPG或IVVEYGEPA或IVVEYGEPG)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-C112(即KITNSRPPC)，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即KITNSRPPA或KITNSRPPG)；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-V113(即KITNSRPPCV)，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸的类似物(即KITNSRPPAV，KITNSRPPSV或KITNSRPPGV)；以及对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I105-V113(即ITNSRPPCV)，具有取代第8个残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸的类似物(即ITNSRPPAV，ITNSRPPSV或ITNSRPPGV)；对于肽表位N107-L115(即NSRPPCVIL)，具有取代第6个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即NSRPPAVIL，NSRPPGVIL)；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽T101-V113(即TLEKITNSRPPCV)，具有取代第12个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即TLEKITNSRPPAV或TLEKITNSRPPGV)；对于SEQID NO2和图1B的多表位肽E100-V113(即ETLEKITNSRPPCV)，具有取代第13个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即ETLEKITNSRPPAV，ETLEKITNSRPPGV)；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽G99-V113(即GETLEKITNSRPPCV)，具有取代第14个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即GETLEKITNSRPPAV，GETLEKITNSRPPGV)；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽I93-V113(即IRRASNGETLEKITNSRPPCV)，具有取代第20个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即IRRASNGETLEKITNSRPPAV或IRRASNGETLEKITNSRPPGV)；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽D88-V113(即DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，具有取代第25个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPAV或DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPGV)；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽P84-V113(即PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，具有取代第29个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPAV或PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPGV)；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽K77-L115(即KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，具有取代第36个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPAV或KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPGV)；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽Q72-L115(即QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，具有取代第41个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPAV或QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPGV)；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽F65-L115(即FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，具有取代第48个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPAV或FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPGV)；以及对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽L59-L115(即LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，具有取代第54个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物(即LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPAV或LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNS RPPGV)。
本发明另一实施方案是制备肽表位类似物，其中肽表位(例如表1-3或5-6所列的具有一个或多个半胱氨酸残基的C35肽表位，不包括SEQID NO2的E100-R109)的半胱氨酸残基已被″半胱氨酰化″(即，与第二个半胱氨酸残基反应)。(参见Pierce，R.A.等人，J.Immunol.163(12)6360-6364(1999))。此处所用术语″半胱氨酰化″描述本发明肽(例如肽表位)中的半胱氨酸残基与第二个自由半胱氨酸(即，并非较大肽一部分的半胱氨酸)在自由巯基处反应，从而形成二硫键(-SH+HS-＝-S-S-)。
因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离多肽包含下列C35肽表位类似物或由其组成对于SEQ ID NO2和FIG.1B的肽表位K104-V113(即KITNSRPPCV)，其中第9个残基处半胱氨酸已被半胱氨酰化的类似物以及对于SEQ ID NO2和FIG.1B的肽表位I105-V113(即ITNSRPPCV)，其中第8个残基处半胱氨酸已被半胱氨酰化的类似物。
本发明另一实施方案是制备肽表位类似物，其中肽表位(例如表1-3或5-6所列的C35肽表位，不包括SEQ ID NO2的E100-R109)的丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基已被磷酸化。因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离多肽包含下列C35肽表位类似物或由其组成对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位E4-P12(即EPGQTSVAP)，其中T8的苏氨酸和/或S9的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位S9-V17(即SVAPPPEEV)，其中S9的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位S21-Y29(即SGVRIVVEY)，其中S21的丝氨酸和/或Y29的酪氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位G22-C30(即GVRIVVEYC)，其中Y29的酪氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位T38-V46(即TYLELASAV)，其中T38的苏氨酸、Y39的酪氨酸和/或S44的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于肽表位G61-I69(即GTGAFEIEI)，其中T62的苏氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位T62-N70(即TGAFEIEIN)，其中T62的苏氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K77-Y85(即KLENGGFPY)，其中Y85的酪氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位Q72-E86(即QLVFSKLENGGFPYE)，其中S76的丝氨酸和/或Y85的酪氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位G81-L89(即GGFPYEKDL)，其中Y85的酪氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-C112(即KITNSRPPC)，其中T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-V113(即KITNSRPPCV)，其中T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于肽表位I105-V113(即ITNSRPPCV)，其中T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于肽表位N107-L115(即NSRPPCVIL)，其中S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽T101-V113(即TLEKITNSRPPCV)，其中T101和T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽I93-V113(即IRRASNGETLEKITNSRPPCV)，其中S97的丝氨酸和/或T101的苏氨酸和/或T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽D88-V113(即DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，其中S97的丝氨酸和/或T101的苏氨酸和/或T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽P84-V113(即PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，其中Y85的酪氨酸和/或S97的丝氨酸和/或T101的苏氨酸和/或T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽K77-V113(即KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，其中Y85的酪氨酸和/或S97的丝氨酸和/或T101的苏氨酸和/或T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的多表位肽Q72-V113(即QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，其中S76的苏氨酸和/或Y85的酪氨酸和/或S97的丝氨酸和/或T101的苏氨酸和/或T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQID NO2和图1B的多表位肽F65-V113(即FEEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV)，其中S76的苏氨酸和/或Y85的酪氨酸和/或S97的丝氨酸和/或T101的苏氨酸和/或T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物；对于SEQ IDNO2和图1B的多表位肽L59-V113(即LGGTGAFEIEINGLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNS RPPCV)，其中T62的苏氨酸和/或S76的丝氨酸和/或Y85的酪氨酸和/或S97的丝氨酸和/或T101的苏氨酸和/或T106的苏氨酸和/或S108的丝氨酸已被磷酸化的类似物。
本发明另一实施方案是制备肽表位类似物，其中肽表位(例如表1-3或5-6所列的C35肽表位，不包括SEQ ID NO2的E100-R109)的天冬酰胺残基在翻译后已转变为天冬氨酸。(参见Skipper，J.C.等人，J.Exp.Med.183(2)527-534(1996))。
在优选实施方案中，本发明的C35肽表位类似物包含多个修饰，只要该修饰不抑制结合MHC分子或T细胞识别即可。因此，优选类似物包括其中一个或多个残基已如此处所述修饰以提高MHC分子结合亲和性、一个或多个半胱氨酸残基已被替换为丙氨酸或甘氨酸残基以方便合成以及一个或多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基已被磷酸化的C35肽表位。
另外，可以在肽表位末端加入其它氨基酸以供容易肽表位相互连接、偶联到载体支持物或较大的多肽、改变肽或寡肽的物理或化学特性等。可以将氨基酸例如酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等引入肽或寡肽、特别是I类肽的C-或N-端。应该注意到，位于CTL表位羧基端的修饰在某些情况下可能改变肽的结合特征。此外，通过末端NH2酰化(例如烷酰基(C1-C20)或硫醇酰基乙酰化)、末端羧基酰胺化(例如氨、甲胺等)、C端聚乙二醇修饰(即聚乙二醇化)以及添加脂类尾部(例如棕榈酰赖氨酸链)等修饰，以增强T细胞呈递及免疫原性，肽或寡肽的序列可以不同于天然序列。(参见Brinckerhoff，L.H.等人，Int.J Cancer 83(3)326-334(1999)；Le Gal，F.A.等人，Int.J.Cancer98(2)221-227(2002)。特别是N端酰胺对某些肽酶的抗性强，因而可防止肽表位的原位破坏而不影响识别。这可有效提高肽表位的半寿期并增强其刺激免疫细胞的能力。这些修饰在某些情况下可能提供连接支持物或其它分子的位点。
肽表位的制备
本发明的肽表位可以合成制备(通过重组DNA技术或化学合成)或来自天然来源，例如自然肿瘤或病原生物。肽表位可分别合成或合成为多表位多肽(例如同聚物或异聚物)。虽然优选肽基本不含其它天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段，在某些实施方案中，肽可能经合成缀合到天然片段或微粒。
另外，可以将一个或多个非C35肿瘤相关肽连接到一个或多个C35肽表位和/或C35肽表位类似物，以提高经由HLA I和/或II类的免疫应答。特别优选包含一系列表位的多肽(称为″polytopes″)及其编码核酸。表位可以带或不带天然侧翼序列以连续或重叠方式排列(参见例如Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925845-5849(1995)；Gilbert等人，Nature/Biotechnology 151280-1284(1997))，如果需要，可以由无关的接头序列分隔开。Polytope经加工产生可由免疫系统识别而产生免疫应答的单独表位。
因此，例如C35肽表位和C35肽表位类似物可以与来自其它肿瘤排斥抗原的肽组合(例如通过制备杂合核酸或多肽)，形成″polytopes″(Zeng，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.98(7)3964-3969(2001)；Zeng，G.等人，J.Immunol.1651153-1159(2000)；Mancini，S.等人，J.Exp.Med.189(5)871-876(1999))。给予后可诱导或增强免疫应答的典型肿瘤相关抗原来源于肿瘤相关基因及编码蛋白质，包括MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、MAGE-7、MAGE-8、MAGE-9、MAGE-10、MAGE-11、MAGE-12、MAGE-13、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、BAGE-1、RAGE-1、LB33/MUM-1、PRAME、NAG、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、酪氨酸酶、脑糖原磷酸化酶、Melan-A、MAGE-C1、MAGE-C2、NY-ESO-1、LAGE-1、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-4 0)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7。例如，肿瘤特征性的特异性抗原肽包括表A所列。
表A
基因MHC肽 位置
MAGE-1 HLA-A1 EADPTGHSY 161-169
HLA-Cw16 SAYGEPRKL 230-238
MAGE-3 HLA-A1 EVDPIGHLY 168-176
HLA-A2 FLWGPRALV 271-279
HLA-B44MEVDPIGHLY 167-176
BAGEHLA-Cw16 AARAVFLAL 2-10
GAGE-1，2 HLA-Cw16 YRPRPRRY 9-16
RAGEHLA-B7 SPSSNRIRNT 11-20
GnT-V HLA-A2 VLPDVFIRC(V) 2-10/11
MUM-1 HLA-B44EEKLIVVLF 外显子2/内含子
EEKLSVVLF (野生型)
CDK4HLA-A2 ACDPHSGHFV 23-32
ARDPHSGHFV (野生型)
β-连环蛋白 HLA-A24SYLDSGIHF 29-37
SYLDSGIHS (野生型)
酪氨酸酶 HLA-A2 MLLAVLYCL1-9
HLA-A2 YMNGTMSQV369-377
HLA-A2 YMDGTMSQV369-377
HLA-A24AFLPWHRLF206-214
HLA-B44SEIWRDIDF192-200
HLA-B44YEIWRDIDF192-200
HLA-DR4QNILLSNAPLGPQFP 56-70
HLA-DR4DYSYLQDSDPDSFQD 448-462
Melan-AMartl HLA-A2 (E)AAGIGILTV 26/27-35
HLA-A2 JLTVILGVL32-40
gp100Pme117 HLA-A2 KTWGQYWQV154-162
HLA-A2 ITDQVPFSV209-217
HLA-A2 YLEPGPVTA280-288
HLA-A2 LLDGTATLRL 457-466
HLA-A2 VLYRYGSFSV 476-485
PRAMEHLA-A24LYVDSLFFL301-309
MAGE-6 HLA-Cw16 KISGGPRISYPL 292-303
NY-ESO-1 HLA-A2 SLLMWITQCFL 157-167
HLA-A2 SLLMWITQC157-165
HLA-A2 QLSLLMWIT155-163
非C35 HLA I类和HLA II类结合肽的其它例子为本领域一般技术人员已知，可按与此处公开相似的方式用于本发明。本领域一般技术人员按照标准分子生物学方法，可以制备包含一个或多个C35肽表位或C35肽表位类似物以及一个或多个前述肿瘤排斥肽的多肽、或编码所述多肽的核酸。包含本发明C35肽表位或C35肽表位类似物以及各种肿瘤排斥抗原肽的polytope的例子如下表B和C所示。
因此，polytope是一组可以按各种排列(例如串连或重叠)连在一起的两种或多种潜在免疫原性或免疫应答刺激性肽。Polytope(或polytope编码核酸)可按标准免疫规程给予例如动物，以测试polytope刺激、增强和/或激发免疫应答的有效性。肽可以直接相连或通过使用侧翼序列相连而形成polytope，使用polytope作为疫苗为本领域公知。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多肽包含与一个或多个肿瘤排斥肽相连的一个或多个C35肽表位或C35肽表位类似物。在一个特别优选的实施方案中，所述一个或多个C35肽表位选自SEQ ID NO2的氨基酸E4-P12、SEQ ID NO2的氨基酸S9-V17、SEQ ID NO2的氨基酸S21-Y29、SEQ ID NO2的氨基酸G22-C30、SEQ ID NO2的氨基酸I25-C33、SEQ ID NO2的氨基酸T38-V46、SEQ ID NO2的氨基酸G61-I69、SEQ ID NO2的氨基酸T62-N70、SEQ ID NO2的氨基酸G63-G71、SEQ ID NO2的氨基酸F65-L73、SEQ ID NO2的氨基酸I67-F75、SEQ ID NO2的氨基酸K77-Y85、SEQ ID NO2的氨基酸Q72-E86、SEQ ID NO2的氨基酸G81-L89、SEQ ID NO2的氨基酸K104-C112、SEQ ID NO2的氨基酸K104-V113、SEQ IDNO2的氨基酸I105-V113、SEQ ID NO2的氨基酸N107-L115、SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113、SEQ ID NO2的氨基酸E100-V113、SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113、SEQ ID NO2的氨基酸I93-V113、SEQ ID NO2的氨基酸D88-V113、SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113、SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113、SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113、SEQ ID NO2的氨基酸F65-V113和SEQ ID NO2的氨基酸L57-V113；所述一个或多个肿瘤排斥肽选自表A所示抗原性肽。
在另一实施方案中，一个或多个非C35细胞穿透性肽可以连接到一个或多个C35肽表位和/或C35肽表位类似物，以增强C35肽表位到细胞例如树突细胞的传送。特别优选包含一系列C35肽表位或C35肽表位类似物以及细胞穿透性肽的多肽及其编码核酸。表位和肽可以带或不带天然侧翼序列以连续或重叠方式排列，如果需要，可以由无关接头序列分隔开。多肽经加工产生可由免疫系统识别而产生免疫应答的各个C35表位。
因此，例如C35肽表位和C35肽表位类似物可以与细胞穿透性肽组合。(Wang，R.-F.等人，Nature Biotechnology 20(2)149-154(2002)；Frankel，A.D.等人，Cell 551189-1193(1988)；Elliott，G.等人，Cell 88(2)223-233(1997)；Phelan，A.等人，Nature Biotechnology16(5)440-443(1998)；Lin，Y.-Z.等人，J.Biol.Chem.270(24)14255-14258(1995)；Rojas，M.等人，Nature Biotechnology 16(4)370-375(1998))。给予后可增强C35肽传送到细胞例如树突细胞的典型细胞穿透性肽包括人免疫缺陷病毒的Tat蛋白质、HSV-1结构性蛋白质VP22以及从卡波西(Kaposi)成纤维细胞生长因子信号序列的16残基h区修饰得到的12残基膜移位序列(MTS)。
一个或多个C35肽表位/类似物和一个或多个细胞穿透性肽可以按各种排列连在一起(例如串连、重叠)。得到的多肽(或多肽编码核酸)可按标准免疫规程给予例如动物，以测试该多肽刺激、增强和/或激发免疫应答的有效性。C35肽表位/类似物和一个或多个细胞穿透性肽可以直接或通过使用侧翼序列相连而形成多肽，使用此类多肽作为疫苗为本领域公知。包含本发明C35肽表位或C35肽表位类似物以及各种细胞穿透性肽的多肽的例子如下表D和E所示。
表B
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesSEQ ID NO2的I93-V113IRRASNGETLEKITNSRPPCVMAGE-1的161-169氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSY，EADPTGHSYIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSYMAGE-1的230-238氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKL，SAYGEPRKLIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKLMAGE-3的168-176氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLY，EVDPIGHLYIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLYMAGE-3的271-279氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALV，FLWGPRALVIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALVMAGE-3的167-176氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLY，MEVDPIGHLYIRRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLYBAGE的2-10氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLAL，AARAVFLALIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLALGAGE-1，2 9-16氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRY，YRPRPRRYIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRYRAGE的11-20氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNT，SPSSNRIRNTIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNTCDK4的23-32氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFV，ARDPHSGHFVIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFVβ-连环蛋白29-37氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS，SYLDSGIHSIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS酪氨酸酶的1-9氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL，MLLAVLYCLIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL酪氨酸酶的206-214氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF，AFLPWHRLFIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopes酪氨酸酶的56-70氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP，QNILLSNAPLGPQFPIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP酪氨酸酶的448-462氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQD，DYSYLQDSDPDSFQDIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQDMelan-AMART-132-40氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVL，JLTVILGVLIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVLgp100pme117 154-162氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQV，KTWGQYWQVIRRASNGEILEKITNSRPPCVKTWGQYWQVgp100pme117 209-217氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVILITDQVPFSV，ITDQVPFSVIRRASNGETLEKITNSRPPCVILTDQVPFSVgp100pme117 280-288氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTA，YLEPGPVTAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTAgp100pme117 457-466氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRL，LLDGTATLRLIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRLgp100pme117 476-485氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSV，VLYRYGSFSVIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSVPRAME的301-309氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFL，LYVDSLFFLIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFLMAGE-6的292-303氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPL，KISGGPRISYPLIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPLNY-ESO-1 157-167氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFL，SLLMWITQCFLIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFLNY-ESO-1 157-165氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQC，SLLMWITQCIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQC
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesNY-ESO-1 155-163氨基酸IRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWIT，QLSLLMWITIRRASNGETLEKITNSRPPPCVQLSLLMWITNY-ESO-1 157-170氨基酸和MAGE-3的281-295氨基酸SLLMWITQCFLPVFIRRASNGETLEKITNSRPPCVTSYVKVLHHMVKISGSEQ ID NO2的D88-V113DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMAGE-1的161-169氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSY，EADPTGHSYDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSYMAGE-1的230-238氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKL，SAYGEPRKLDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKLMAGE-3的168-176氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLY，EVDPIGHLYDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLYMAGE-3的271-279氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALV，FLWGPRALVDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALVMAGE-3的167-176氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLY，MEVDPIGHLYDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLYBAGE的2-10氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLAL，AARAVFLALDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLALGAGE-1，2 9-16氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRY，YRPRPRRYDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRYRAGE的11-20氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNT，SPSSNRIRNTDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNTCDK4的23-32氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFV，ARDPHSGHFVDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFVβ-连环蛋白29-37氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS，SYLDSGIHSDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopes酪氨酸酶的1-9氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL，MLLAVLYCLDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL酪氨酸酶的206-214氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF，AFLPWHRLFDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF酪氨酸酶的56-70氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP，QNILLSNAPLGPQFPDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP酪氨酸酶的448-462氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQD，DYSYLQDSDPDSFQDDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQDMelan-AMART-132-40氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVL，JLTVILGVLDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVLgp100pme117154-162氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQV，KTWGQYWQVDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQVgp100pme117209-217氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSV，ITDQVPFSVDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSVgp100pme117280-288氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTA，YLEPGPVTADLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTAgp100pme117457-466氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRL，LLDGTATLRLDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRLgp100pme117476-485氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSV，VLYRYGSFSVDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSVPRAME的301-309氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFL，LYVDSLFFLDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFLMAGE-6的292-303氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPL，KISGGPRISYPLDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPL
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesNY-ESO-1 157-167氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFL，SLLMWITQCFLDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFLNY-ESO-1 157-165氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQC，SLLMWITQCDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCNY-ESO-1 155-163氨基酸DLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWIT，QLSLLMWITDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMITNY-ESO-1 157-170氨基酸和MAGE-3的281-295氨基酸SLLMWITQCFLPVFDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVTSYVKVLHHMVKISGSEQ ID NO2的P84-V113PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMAGE-1的161-169氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSY，EADPTGHSYPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSYMAGE-1的230-238氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKL，SAYGEPRKLPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKLMAGE-3的168-176氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLY，EVDPIGHLYPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLYMAGE-3的271-279氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALV，FLWGPRALVPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALVMAGE-3的167-176氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLY，MEVDPIGHLYPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLYBAGE的2-10氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLAL，AARAVFLALPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLALGAGE-1，2 9-16氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRY，YRPRPRRYPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRYRAGE的11-20氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNT，SPSSNRIRNTPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNT
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesCDK4的23-32氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFV，ARDPHSGHFVPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFVβ-连环蛋白29-37氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS，SYLDSGIHSPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS酪氨酸酶的1-9氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL，MLLAVLYCLPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL酪氨酸酶的206-214氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF，AFLPWHRLFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF酪氨酸酶的56-70氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP，QNILLSNAPLGPQFPPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP酪氨酸酶的448-462氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQD，DYSYLQDSDPDSFQDPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQDMelan-AMART-1 32-40氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVL，JLTVILGVLPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVLgp100pme117 154-162氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQV，KTWGQYWQVPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQVgp100pme117 209-217氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSV，ITDQVPFSVPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSVgp100pme117 280-288氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTA，YLEPGPVTAPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTAgp100pme117 457-466氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRL，LLDGTATLRLPYEKDLIEAIRRASNGEYLEKITNSRPPCVLLDGTATLRLgp100pme117 476-485氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSV，VLYRYGSFSVPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSV
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesPRAME的301-309氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLVDSLFFL，LYVDSLFFLPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFLMAGE-6的292-303氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPL，KISGGPRISYPLPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPLNY-ESO-1 157-167氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFL，SLLMWITQCFLPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFLNY-ESO-1 157-165氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQC，SLLMWITQCPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCNY-ESO-1 155-163氨基酸PYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWIT，QLSLLMWITPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWITNY-ESO-1 157-170氨基酸和MAGE-3的281-295氨基酸SLLMWITQCFLPVFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVTSYVKVLHHMVKISGSEQ ID NO2的K77-V113KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMAGE-1的161-169氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSY，EADPTGHSYKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSYMAGE-1的230-238氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKL，SAYGEPRKLKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKLMAGE-3的168-176氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLY，EVDPIGHLYKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLYMAGE-3的271-279氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALV，FLWGPRALVKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALVMAGE-3的167-176氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLY，MEVDPIGHLYKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLYBAGE的2-10氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLAL，AARAVFLALKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLAL
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesGAGE-1，2 9-16氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRY，YRPRPRRYKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRYRAGE的11-20氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNT，SPSSNRIRNTKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNTCDK4的23-32氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFV，ARDPHSGHFVKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFVβ-连环蛋白29-37氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS，SYLDSGIHSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS酪氨酸酶的1-9氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL，MLLAVLYCLKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL酪氨酸酶的206-214氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF，AFLPWHRLFKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF酪氨酸酶的56-70氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP，QNILLSNAPLGPQFPKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP酪氨酸酶的448-462氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQD，DYSYLQDSDPDSFQDKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQDMelan-AMART-1 32-40氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVL，JLTVILGVLKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVLgp100pme117 154-162氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQV，KTWGQYWQVKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQVgp100pme117 209-217氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVILITDQVPFSV，ITDQVPFSVKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVILITDQVPFSV
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesgp100pme117 280-288氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTA，YLEPGPVTAKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTAgp100pme117 457-466氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRL，LLDGTATLRLKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRLgp100pme117 476-485氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSV，VLYRYGSFSVKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSVPRAME的301-309氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFL，LYVDSLFFLKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFLMAGE-6的292-303氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPL，KISGGPRISYPLKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPLNY-ESO-1 157-167氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFL，SLLMWITQCFLKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFLNY-ESO-1 157-165氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQC，SLLMWITQCKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCNY-ESO-1 155-163氨基酸KLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWIT，QLSLLMWITKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWITNY-ESO-1 157-170氨基酸和MAGE-3的281-295氨基酸SLLMWITQCFLPVFKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLIEKITNSRPPCVTSYVKVLHHMVKISGSEQ ID NO2的Q72-V113QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMAGE-1的161-169氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSY，EADPTGHSYQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSYMAGE-1的230-238氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKL，SAYGEPRKLQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKTNSRPPCVSAYGEPRKLMAGE-3的168-176氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLY，EVDPIGHLYQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLY
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesMAGE-3的271-279氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALV，FLWGPRALVQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALVMAGE-3的167-176氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLY，MEVDPIGHLYQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLYBAGE的2-10氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLAL，AARAVFLALQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLALGAGE-1，2 9-16氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRY，YRPRPRRYQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRYRAGE的11-20氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNT，SPSSNRIRNTQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNTCDK4的23-32氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFV，ARDPHSGHFVQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFVβ-连环蛋白29-37氨基酸QLVFSKLENGGPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS，SYLDSGIHSQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS酪氨酸酶的1-9氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL，MLLAVLYCLQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL酪氨酸酶的206-214氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF，AFLPWHRLFQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF酪氨酸酶的56-70氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP，QNILLSNAPLGPQFPQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCV QNILLSNAPLGPQFP
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopes酪氨酸酶的448-462氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQD，DYSYLQDSDPDSFQDQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQDMelan-AMART-1 32-40氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVL，JLTVILGVLQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVLgp100pme117 154-162氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQV，KTWGQYWQVQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQVgp100pme117 209-217氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSV，ITDQVPFSVQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSVgp100pme117 280-288氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTA，YLEPGPVTAQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTAgp100pme117 457-466氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRL，LLDGTATLRLQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRLgp100pme117 476-485氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSV，VLYRYGSFSVQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSVPRAME的301-309氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFL，LYVDSLFFLQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFLMAGE-6的292-303氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPL，KISGGPRISYPLQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPLNY-ESO-1 157-167氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFL，SLLMWITQCFLQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFL
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesNY-ESO-1 157-165氨基酸QLVFSKLENGGPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQC，SLLMWITQCQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCNY-ESO-1 155-163氨基酸QLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWIT，QLSLLMWITQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWITNY-ESO-1 157-170氨基酸和MAGE-3的281-295氨基酸SLLMWITQCFLPVFQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVTSYVKVLHHMVKISGSEQ ID NO2的F65-V113FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMAGE-1的161-169氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSY，EADPTGHSYFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSYMAGE-1的230-238氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKL，SAYGEPRKLFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKLMAGE-3的168-176氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLY，EVDPIGHLYFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLYMAGE-3的271-279氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALV，FLWGPRALVFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALVMAGE-3的167-176氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLY，MEVDPIGHLYFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLY
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesBAGE的2-10氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLAL，AARAVFLALFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLALGAGE-1，2 9-16氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRY，YRPRPRRYFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRYRAGE的11-20氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNT，SPSSNRIRNTFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNTCDK4的23-32氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFV，ARDPHSGHFVFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFVβ-连环蛋白29-37氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS，SYLDSGIHSFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS酪氨酸酶的1-9氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL，MLLAVLYCLFEIEINGQLVFSKLENGGFPVEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL酪氨酸酶的206-214氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF，AFLPWHRLFFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopes酪氨酸酶的56-70氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP，QNILLSNAPLGPQFPFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP酪氨酸酶的448-462氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQD，DYSYLQDSDPDSFQDFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQDMelan-AMART-1 32-40氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVL，JLTVILGVLFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVLgp100pme117 154-162氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQV，KTWGQYWQVFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQVgp100pme117 209-217氨基酸FEIEGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSV，ITDQVPFSVFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSVgp100pme117 280-288氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTA，YLEPGPVTAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTAgp100pme117 457-466氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRL，LLDGTATLRLFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRL
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesgp100pme117 476-485氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSV，VLYRYGSFSVFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSVPRAME的301-309氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFL，LYVDSLFFLFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFLMAGE-6的292-303氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPL，KISGGPRISYPLFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPLNY-ESO-1 157-167氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVILSLLMWITQCFL，SLLMWITQCFLFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRRPCVSLLMWITQCFLNY-ESO-1 157-165氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQC，SLLMWITQCFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCNY-ESO-1 155-163氨基酸FEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWIT，QLSLLMWITFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQLSLLMWITNY-ESO-1 157-170氨基酸和MAGE-的281-295氨基酸SLLMWITQCFLPVFFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVTSYVKVLHHMVKISG
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesSEQ ID NO2的L59-V113LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMAGE-1的161-169氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSY，EADPTGHSYLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEADPTGHSYMAGE-1的230-238氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKL，SAYGEPRKLLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSAYGEPRKLMAGE-3的168-176氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLY，EVDPIGHLYLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVEVDPIGHLYMAGE-3的271-279氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALV，FLWGPRALVLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVFLWGPRALVMAGE-3的167-176氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLY，MEVDPIGHLYLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMEVDPIGHLYBAGE的2-10氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLAL，AARAVFLALLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAARAVFLAL
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesGAGE-1，2 9-16氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPPCVYRPRPRRY，YRPRPRRYLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYRPRPRRYRAGE的11-20氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNT，SPSSNRIRNTLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSPSSNRIRNTCDK4的23-32氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFV，ARDPHSGHFVLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVARDPHSGHFVβ-连环蛋白29-37氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS，SYLDSGIHSLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSYLDSGIHS酪氨酸酶的1-9氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL，MLLAVLYCLLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVMLLAVLYCL酪氨酸酶的206-214氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF，AFLPWHRLFLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVAFLPWHRLF
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopes酪氨酸酶的56-70氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP，QNILLSNAPLGPQFPLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVQNILLSNAPLGPQFP酪氨酸酶的448-462氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQD，DYSYLQDSDPDSFQDLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVDYSYLQDSDPDSFQDMelan-AMART-1 32-40氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVL，JLTVILGVLLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVJLTVILGVLgp100pme117 154-162氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQV，KTWGQYWQVLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKTWGQYWQVgp100pme117 209-217氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSV，ITDQVPFSVLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVITDQVPFSVgp100pme117 280-288氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTA，YLEPGPVTALGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVYLEPGPVTA
C35肽/表位典型的肿瘤排斥肽典型的polytopesgp100pme117 457-466氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRL，LLDGTATLRLLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLLDGTATLRLgp100pme117 476-485氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSV，VLYRYGSFSVLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVVLYRYGSFSVPRAME的301-309氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFL，LYVDSLFFLLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVLYVDSLFFLMAGE-6的292-303氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPL，KISGGPRISYPLLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVKISGGPRISYPLNY-ESO-1 157-167氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFL，SLLMWITQCFLLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQCFLNY-ESO-1 157-165氨基酸LGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQC，SLLMWITQCLGGTGAFEIEINGQLVESKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVSLLMWITQC
表C
NY-ESO-1 157-170氨基酸和MAGE-3的281-295氨基酸SLLMWITQCFLPVFKITNSRPPATSYVKVLHHMVKISG
表D
表E
符合本发明的肽可以是各种长度，可以是中性(不带电)形式或盐的形式。符合本发明的肽可以包含修饰，例如糖基化、侧链氧化或磷酸化，通常在所述修饰并不破坏肽的生物学活性的条件下。
本发明的肽可以按多种多样的方法制备。对于优选相对较短的肽，可以按照常规技术在溶液或固相支持物中合成。可以商品化获得各种自动合成仪，并根据已知方法使用。(参见例如Stewart & Young，SOLIDPHASE PEPTIDE SYNTHESIS，2D.ED.，Pierce Chemical Co.，1984)。另外，各个C35肽表位和C35肽表位类似物可以使用化学连接相连，产生较大的同聚物或异聚物多肽，仍处于本发明范围之内。
或者，可以利用重组DNA技术，其中将编码免疫原性目的肽的核酸序列插入表达载体，转化或转染到合适的宿主细胞并在适于表达的条件下培养。上述方法为本领域普遍了解，一般如Sambrook等人，MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)所述。因此，可以使用包含一个或多个本发明肽表位序列的重组多肽呈递合适的T细胞表位。
可以利用化学技术，例如Matteucci等人，J Am.Chem.Soc.1033185(1981)的磷酸三酯方法，合成此处涵盖的优选长度C35肽表位或C35肽表位类似物的核苷酸编码序列。可以通过将编码天然肽序列的核酸碱基取代为合适的所需核酸碱基而简单制备肽类似物；典型的核酸取代是由此处基序/超基序确定的氨基酸的编码核酸。可以提供编码序列连同合适的接头，连接到本领域常见的表达载体，将该载体转化合适的宿主，以制备所需融合蛋白质。现有许多此类载体及合适的宿主系统。为表达融合蛋白质，应提供编码序列连同有效连接的起始和终止密码子、启动子和终止子区域，通常还有复制系统，以提供表达载体，用于在所需细胞宿主中表达。例如，在质粒中提供与细菌宿主相容的启动子序列，包含合适的限制性位点，供插入目的编码序列。将所得表达载体转化合适的细菌宿主。当然，也可能利用合适的载体和控制序列，使用酵母、昆虫或哺乳动物细胞宿主。
一般优选尽可能小而仍基本保持天然蛋白质所有免疫学活性的肽表位。可能的情况下，希望将本发明结合HLA I类的肽表位优化到约8-13个氨基酸残基，优选9-10个。应当理解，较长的多肽，例如C35多肽片段或合成多肽，可以在此长度范围内包含一个或多个C35肽表位或C35肽表位类似物(肽长度的进一步讨论参见定义部分的术语″表位″)。优选将HLA II类结合表位优化到长度约6-30个氨基酸长度，优选约13-20个残基。优选地，表位大小等同于结合相关HLA分子的内源性加工的病原体来源的肽或肿瘤细胞肽。使用此处所述技术可以进行各种长度的肽的鉴定和制备。
本发明的另一优选实施方案包含给予连接为多表位多肽(例如同聚物或异聚物)的本发明肽或编码多表位多肽的微基因(minigene)。
通过鉴定天然C35多肽包含高度聚集的I类和/或II类C35肽表位的区域，获得另一优选实施方案。一般根据每个氨基酸长度所包含C35表位的最大数量，来选择此类序列。应当理解，表位能够以移框方式存在，例如10个氨基酸长度的肽可以包含两个9氨基酸长度的表位以及一个10氨基酸长度的表位；给予此类肽以后，经过细胞内加工，每一表位可以暴露并被HLA分子结合。因此，通过合成、重组或从天然来源中切割，可以获得较大的、优选多表位的多肽。
检测T细胞应答的分析
一旦鉴定了HLA结合肽，便可以测试其引发T细胞应答的能力。PCT公开物WO 94/20127和WO 94/03205描述了带基序肽的制备及评价，其全部内容在此引入供参考。简言之，合成包含特定抗原表位的肽，并测试其结合相关HLA蛋白质的能力。这些分析可能包括，相对于放射性碘化的参考肽的结合，来评价肽与纯化的HLA I类分子的结合。或者，可能利用免疫荧光染色及流式显微荧光测定，评价表达空的I类分子(即，没有任何结合肽的细胞表面HLA分子)的细胞的肽结合。可能使用其它分析来评价肽的结合，包括肽依赖性I类装配分析和/或由肽竞争性来抑制CTL识别。进一步评价结合HLA I类分子的肽(一般亲和性为500nM或更低)作为来源于感染或免疫个体的TCL的靶标的能力，以及体外诱导初级应答或体内诱导CTL应答(可产生能够与所选病理学相关靶细胞反应的CTL群体)的能力。
使用模拟分析来评价HLA II类结合肽。带有HLA II类基序的肽一般显示以1000nM或更低的亲和性结合，进一步分析其刺激HTL应答的能力。
用于检测T细胞应答的常规分析包括增殖分析、淋巴因子分泌分析、直接细胞毒性分析及有限稀释分析。例如，可以分析与肽温育过的抗原呈递细胞在响应细胞群体中诱导CTL应答的能力。抗原呈递细胞可以是正常细胞，例如外周血单核细胞或树突细胞。或者，使用转染人I类MHC基因以及不能负载带有内部加工肽的I类分子的突变的非人哺乳动物细胞，评价该肽体外诱导初级CTL应答的能力。外周血单核细胞(PBMC)可以用作CTL前体来源。将抗原呈递细胞与肽温育，然后在优化的培养条件下，将荷载肽的抗原呈递细胞与响应细胞群体温育。通过分析培养物中存在裂解放射性标记靶细胞(特定肽脉冲的靶细胞，或表达内源性加工的、特定肽所来源的抗原的靶细胞)的CTL，来确定阳性CTL活化。或者，可以由IFNγ原位ELISA确定表位特异性CTL的存在。
另外，设计了通过利用荧光标记的HLA四聚体复合物染色来直接定量抗原特异性T细胞的方法(Altman，J.D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010330，1993；Altman，J.D.等人，Science 27494，1996)。其它选项包括细胞内淋巴因子染色以及干扰素释放分析或ELISPOT分析。四聚体染色、细胞内淋巴因子染色及ELISPOT分析均似乎比更常规方法敏感至少10倍(Lalvani，A.等人，J.Exp.Med.186859，1997；Dunbar，P.R.等人，Curr.Biol.8413，1998；Murali-Krishna，K.等人，Inamunity 8177，1998)。
使用本领域已知技术，例如T细胞增殖或淋巴因子分泌，也可能评价辅助T淋巴细胞(HTL)活化(参见例如Alexander等人，Immunity 1751-761，1994)。
或者，可以使用HLA转基因小鼠的免疫接种来确定肽表位的免疫原性。已经表征了若干转基因小鼠品系，例如带有人A2.1、A11(可另外用于分析HLA-A3表位)和B7等位基因的小鼠。正在发展其它转基因小鼠品系(例如HLA-A1和A24转基因小鼠)。此外，已经开发了HLA-DR1和HLA-DR3小鼠模型。按本领域原则，带有其它HLA等位基因的其它转基因小鼠按需产生。
可以利用在弗氏不完全佐剂中乳化的肽来免疫此类小鼠，其后测试任何所得T细胞识别靶细胞(已经过肽脉冲或利用目的肽编码基因转染)的能力。使用上述细胞毒性分析，可以分析CTL应答。类似地，使用例如T细胞增殖或淋巴因子分泌分析，可以分析HTL应答。
疫苗组合物
本发明的另一实施方案是，包含免疫有效量的一种或多种本发明C35肽表位和/或C35肽表位类似物的疫苗。肽可以通过多种方式或剂型传送，均通称为″疫苗″组合物。此类疫苗组合物和/或给药方式可以包括，例如处于阳离子脂质制剂中的裸cDNA；脂肽(例如Vitiello，A.等人，J.Clin.Invest.95341，1995)，包裹于例如多聚(DL-丙交酯-co-乙交酯)(″PLG″)微球中的裸cDNA或肽(参见例如Eldridge等人Molec.Immunol.28287-294，1991Alonso等人，Vaccine 12299-306，1994；Jones等人，Vaccine 13675-681，1995)；包含于免疫刺激复合物(ISCOMS)中的肽组合物(参见例如Takahashi等人，Nature 344873-875，1990；Hu等人Clin Exp Immunol.113235-243，1998)；多抗原肽系统(MAPs)(参见例如Tam，J.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855409-5413，1988；Tam，J.P.，J.Immunol.Methods 19617-32，1996)；病毒、细菌或真菌传送载体(Perkus，M.E.等人，InConcepts in vaccine development，Kaufmann，S.H.E.，ed.，p.379，1996；Chakrabarti，S.等人.，Nature 320535，1986；Hu，S.L.等人，Nature 320537，1986；Kieny，M.-P.等人，AIDS′Bio/Technology 4790，1986；Top，F.H.等人，J.Infect.Dis.124148，1971；Chanda，P.K.等人，Virology 175535，1990)；病毒或合成来源的颗粒(例如Kofler，N.等人，J.Immunol.Methods.19225，1996；Eldridge，J.H.等人，Sem.Hemato.3016，1993；Falo，L.D.，Jr.等人，Nature Med.7649，1995)；佐剂(Warren，H.S.，Vogel，F.R.和Chedid，L.A.Annu.Rev.Immunol.4369，1986；Gupta，R.K.等人，Vaccine 11293，1993)；脂质体(Reddy，R.等人，J.Immunol.1481585，1992；Rock，K.L.，Immunol.Today 17131，1996)；或颗粒吸附的cDNA(Ulmer，J.B.等人，Science 2591745，1993；Robinson，H.L.，Hunt，L.A.和Webster，R.G.，Vaccine 11957，1993；ShiVer，J.W.等人，InConcepts in vaccine development，Kaufinann，S.H.E.，ed.，p.423，1996；Cease，K.B.和Berzofsky，J.A.，Annu.Rev.Immunol.12923，1994以及Eldridge，J.H.等人，Sem.Hematol.3016，1993)等。也可以使用毒素靶向的传送技术，也称受体介导靶向作用，例如Avant Immunotherapeutics，Inc.(Needham，Massachusetts)或附加到应激蛋白质例如HSP 96(StressgenBiotechnologies Corp.，Victoria，BC，Canada)。
本发明的疫苗包含核酸介导的形式。可以将编码一种或多种本发明多肽的DNA或RNA给予患者。该方法描述于例如Wolff等人，Science2471465(1990)以及美国专利5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647和WO 98/04720。基于DNA的传送技术的例子包括″裸DNA″、促进(bupivicaine、多聚物、肽介导的)传送、阳离子脂质复合物以及颗粒介导(″基因枪″)或压力介导的传送(参见例如美国专利5,922,687)。因此，本发明的肽疫苗可以由病毒或细菌载体表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，例如牛痘或禽痘。例如，使用牛痘病毒作为载体，表达编码本发明肽的核酸序列。引入急性或慢性感染的宿主或未感染宿主之后，重组牛痘病毒表达免疫原性肽，从而引发免疫应答。用于免疫程序的牛痘载体和方法描述于例如美国专利4,722,848。另一载体是BCG(Bacille Canette Guerin)。BCG载体描述于Stover等人，Nature 351456-460(1991)。可用于治疗性给予或免疫本发明肽的多种其它载体，例如腺病毒或腺相关病毒载体、α病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体等，为本领域技术人员根据此处说明所显见。
另外，符合本发明的疫苗可以包含一种或多种本发明的C35肽表位。因此，C35肽表位或C35肽表位类似物可以单独存在于疫苗中；或者，该肽表位或类似物以相同肽表位或类似物的多个拷贝存在(同聚物)，或以多个不同的肽表位或类似物存在(异聚物)。多聚物的优点在于，可提高免疫反应的可能性，当使用不同的肽表位或类似物组成多聚物时，能够诱导与免疫应答所靶向抗原的不同抗原性决定簇反应的抗体和/或T细胞。该组合物可以是抗原的天然存在区域，或通过例如重组或化学合成而制备。
可以随本发明疫苗使用的载体为本领域公知，包括例如甲状球蛋白、白蛋白例如人血清白蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸例如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸、流感病毒蛋白质、乙肝病毒核心蛋白质等。疫苗可以包含生理性耐受的稀释剂，例如水或盐溶液，优选磷酸盐缓冲液。通常疫苗还包含佐剂。佐剂例如弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾，都是本领域公知的物例。另外，如此处所述，将本发明的肽缀合脂类，例如三棕榈酰-S-甘氨酰-半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，可以引发CTL应答。
通过注射(例如皮下、真皮内、肌内、气雾剂、口服、透皮、经粘膜、胸膜内、鞘内)或其它合适途径利用本发明的肽组合物免疫后，宿主免疫系统通过产生目的抗原特异性的抗体、CTL和/或HTL来对疫苗进行响应。因此，宿主对其后接触TAA变得至少部分免疫，或对进一步产生带有肿瘤相关抗原的细胞变得至少部分抗性，从而得到预防性或治疗性益处。
在某些实施方案中，诱导T细胞应答的组分与诱导针对目的靶抗原抗体应答的组分相联合。该组合物的一个优选实施方案包含符合本发明的I类和II类表位。或者，组合物包含符合本发明的I类和/或II类表位连同PADRETM分子(Epimmune，San Diego，CA)。
本发明的疫苗组合物可以包含抗原呈递细胞，例如树突状细胞，作为呈递本发明肽的运载体。例如，利用符合本发明的微基因构建体转染树突细胞，以引发免疫应答。在下文部分中详细讨论微基因。在动员并收获树突细胞从而发生体外树突状细胞荷载之后，可以体外制备疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物也可能与抗病毒药物例如干扰素α、或免疫佐剂例如IL-12、GM-CSF等联用。
在选择基于肽或核酸剂型的疫苗中所含表位时，优选利用以下原则。可以权衡下列各个原则，以便做出选择。疫苗中使用多个表位时，表位可能但不一定按表位所来源的天然抗原中的顺序相邻接。
1)选择在给予之后可以模拟所观察到的与防止或清除TAA表达肿瘤有关的免疫应答的表位。对于HLA I类而言，这一般包括来自至少一种TAA的3-4个表位。
2)选择已经得到有关免疫原性所必需的结合亲和性的表位HLA I类的IC50为500nM或更低，II类的IC50为1000nM或更低。对于HLAI类，目前优先选择IC50为200nM或更低的肽，因为据信这不仅与诱导免疫应答、而且还与体外肿瘤细胞杀伤比较相关。
3)选择带有超基序的肽、或带有足够一批等位基因特异性基序的肽，以得到较宽的群体适用范围(polulation coverage)。一般优选具有至少80％的群体适用适用范围。可以利用本领域已知的统计评价Monte Carlo分析来评估群体适用范围的宽度。
4)选择来自癌相关抗原的表位时，优选在选择中包括类似物肽，因为患者可能已对天然表位形成耐受。选择感染性疾病相关抗原的表位时，目前优先选择天然或类似物肽。
5)特别适合的是″巢式″表位。当给定多肽序列中至少重叠两个表位或类似物(或一个表位和一个类似物)时，存在″巢式″表位(或表位类似物)。包含″特优巢式表位″的多肽是其中具有HLA I类和HLA II类两种表位和/或类似物的多肽。提供巢式表位时，优选提供的序列具有每一所述序列最多数量的表位或类似物。优选避免提供超过肽表位或类似物总长度的多肽。提供包含巢式表位的多肽时，评价该多肽以确保没有病原性或其它有害的生物学特性很重要；这对针对感染性生物的疫苗特别重要。因此，在一个优选实施方案中，本发明的疫苗组合物包含一个或多个选自下列的多表位多肽SEQ ID NO2和图1B的I105-V113、SEQ ID NO2和图1B的T101-V113、SEQ ID NO2和图1B的E100-V113、SEQ ID NO2和图1B的G99-V113、SEQ ID NO2和图1B的I93-V113、SEQ ID NO2和图1B的D88-V113、SEQ ID NO2和图1B的P84-V113、SEQ ID NO2和图1B的K77-V113、SEQ ID NO2和图1B的Q72-V113、SEQ ID NO2和图1B的F65-V113以及SEQID NO2和图1B的L59-V113。
6)如果制备包含一个以上C35肽表位或C35肽表位类似物的多肽、或制备微基因时，目标是产生包括目的表位/类似物的最小多肽。此原则与选择包含巢式表位的多肽时所用原则类似或相同。然而，对于人工多表位多肽，长度最小化目标要和在该多表位多肽的表位之间整合任意间隔序列的需要保持平衡。可以引入间隔或接头氨基酸残基，以避免接合表位(免疫系统可识别的一种表位，不存在于靶抗原中，只因表位的人为并列而产生)或便于表位之间的断裂，从而增强表位的呈递。一般要避免接合表位，因为接受者可能产生针对非天然表位的免疫应答。特别关注属于″显性表位″的接合表位。显性表位可能引起积极的应答，以致于针对其它表位的免疫应答被减弱或抑制。
微基因疫苗
可以利用多种不同方法同时传送多个表位。编码多个C35肽表位或类似物的核酸是本发明有用的实施方案；可以编码单个表位/类似物或多表位多肽。根据前一部分所述指导方针来优选微基因中包括的表位或类似物。微基因中可包括的氨基酸序列的例子包括HLA I类表位或类似物、HLA II类表位或类似物、泛素化信号序列和/或靶向序列，例如促进所得肽进入内质网的内质网(ER)信号序列。
多表位微基因的用途也描述于例如Ishioka等人，J.Immunol.1623915-3925，1999；An，L.和Whitton，J.L.，J.Virol.712292，1997；Thomson，S.A.等人，J.Immunol.157822，1996；Whitton，J.L.等人，J.Virol.67348，1993；Hanke，R.等人，Vaccine 16426，1998。可以使用类似方法产生编码TAA表位的微基因。
例如，为产生编码所选表位的DNA序列(微基因)以供在人类细胞中表达，可能反向翻译表位的氨基酸序列。可以使用人密码子用表来指导选择每一氨基酸的密码子。这些编码表位的DNA序列可能直接相连，以便在翻译后产生连续的多肽序列。但是，为优化表达和/或免疫原性，可以在微基因设计中引入其它元件，例如表位之间的一个或多个间隔或接头氨基酸残基。通过在靠近CTL或HTL表位处包括合成的(例如多聚丙氨酸)或天然存在的侧翼序列，可能改善CTL和HTL表位的HLA呈递，所述包含表位/类似物的较大多肽属于本发明范围之内。
通过组装编码微基因正负链的寡核苷酸，可将微基因序列转换为DNA。使用公知的技术，重叠的寡核苷酸(30-100个碱基长度)可在合适条件下合成、磷酸化、纯化和退火。例如使用T4 DNA连接酶，寡核苷酸的末端可以相连。然后可将该合成的、编码表位多肽的微基因克隆到所需表达载体中。
载体中优选包括本领域人员公知的标准调节序列，以确保在靶细胞中表达。需要若干载体元件带有供微基因插入的下游克隆位点的启动子；供有效转录终止的多聚腺苷酰化信号；大肠杆菌复制原点以及大肠杆菌选择标志(例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。多种启动子可用于此目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。其它合适的启动子序列参见例如美国专利5,580,859和5,589,466。
对微基因构建体进行某些改变，可以获得优化的肽表达和免疫原性。例如，内含子在某些情况下促进有效的基因表达，因而可将一个或多个合成的或天然存在的内含子引入微基因的转录区。为提高微基因的表达，也可考虑包括mRNA稳定性序列以及用于哺乳动物细胞中复制的序列。
一旦选择了表达载体，便将微基因克隆到启动子下游的多接头区。将质粒转化合适的细菌菌株，使用标准技术制备DNA。使用限制性图谱及DNA序列分析，证实微基因的定位和DNA序列以及载体中包括的所有其它元件。可以将带有正确质粒的细菌细胞保存为细胞库。
此外，免疫刺激序列(ISS或CpG)似乎在DNA疫苗的免疫原性中起一定作用。这些序列可能包含在载体中，位于微基因编码序列之外，以增强免疫原性。
在某些实施方案中，可以使用允许生成微基因编码的表位以及第二种蛋白质(例如调节免疫原性的蛋白质)的双顺反子载体。与表位共表达时可以增强免疫应答的蛋白质或多肽的例子包括细胞因子(例如IL-2、IL-12、GM-CSF)、诱导细胞因子的分子(例如LeIF)、共刺激分子或泛DR结合蛋白质(PADRETM，Epimmune，San Diego，CA)。辅助T细胞(HTL)表位，例如PADRETM分子可以连接细胞内定位信号，并与所表达的CTL表位分开表达。可以这样做，以便指引HTL表位到达不同于CTL表位的细胞区室，可为HTL表位提供更有效的进入到HLA II类通路，从而提高HTL的诱导。与HTL或CTL诱导相反，通过共表达免疫抑制分子(例如TGF-β)来特异性降低免疫应答，可能在某些疾病中有益。
例如通过在大肠杆菌中发酵，然后纯化，可以制备治疗数量的质粒DNA。按照公知技术，使用工作细胞库中的等分样品接种生长培养基，在摇瓶或生物反应器中生长到饱和状态。使用标准生物分离技术例如现有的固相阴离子交换树脂(例如来自QIAGEN，Inc.(Valencia，California))，纯化质粒DNA。如果需要，可以使用凝胶电泳或其它方法将超螺旋DNA与打开的环状及线性形式相分离。
可以使用各种剂型制备供注射用的纯化质粒DNA。其中最简单的是，将冻干的DNA在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中重新构成。此方法称为″裸DNA″，当前在临床试验中用于肌内(IM)给药。为最大化微基因疫苗的免疫治疗效果，可能使用另外方法配制纯化的质粒DNA。已经描述了多种此类方法，也可能利用新技术。剂型中也可以使用阳离子脂类、糖脂和融合性脂质体(参见例如WO 93/24640；Mannino & Gould-Fogerite，BioTechniques6(7)682(1988)；美国专利5,279,833；WO 91/06309以及Felgner等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 847413(1987)。此外，通称为保护性、相互作用性、非浓缩性化合物(PINC)的肽和化合物也可以与纯化的质粒DNA复合，以影响各种变量，例如稳定性、肌内分散或运送到特定的器官或细胞类型。
可以将靶细胞致敏用作微基因编码表位的表达及HLA I类呈递的功能性分析。例如，将质粒DNA引入作为标准CTL铬释放分析合适靶标的哺乳动物细胞系。所用转染方法有赖于最终的剂型，对″裸″DNA可以使用电穿孔，而阳离子脂类则可以指导体外转染。可共转染表达绿色荧光蛋白质(GFP)的质粒，以利用荧光活化细胞分选(FACS)来富集转染细胞。然后将转染细胞用铬51(51Cr)标记，用作表位特异性CTL的靶细胞。51Cr释放分析所检测的靶细胞溶解作用表示微基因编码的CTL表位的生成及HLA呈递。按类似方式，使用评价HTL活性的分析，可评价HTL表位的表达。
功能性测试微基因DNA制剂的第二种途径是体内免疫原性。利用DNA产物免疫表达合适人类HLA蛋白质的转基因小鼠。给药计量与途径为剂型依赖性(例如PBS中的DNA为IM，脂质复合的DNA为腹膜内(IP))。免疫后11-21天，收获脾细胞，在编码每种待测表位的肽存在下，再刺激一周。此后，对于CTL，进行标准分析来确定是否存在负载肽的51Cr标记靶细胞的细胞溶解作用。再次重申，接触微基因对应表位的靶细胞的溶解证明DNA疫苗的功能及CTL诱导。以类似方式在转基因小鼠中评价HTL表位的免疫原性。
或者，可以使用生物弹运送方法给予核酸，例如美国专利5,204,253所述。使用该技术给予只包含DNA的颗粒。在生物弹运送的另一实施方案中，可将DNA附着在颗粒上，例如金颗粒。
CTL肽与辅助肽的联合
可以修饰本发明包含CTL表位的疫苗组合物，以提供所需属性，例如提高血清半寿期、拓宽群体适用范围或增强免疫原性。
例如，通过将CTL表位与包含至少一种HTL表位的序列相连，可以增强肽诱导CTL活性的能力。
尽管CTL肽可以与T辅助肽直接相连，但特别优选的CTL表位/HTL表位缀合物是通过间隔分子相连。该间隔物一般包含相对较小的中性分子，例如在生理条件下基本上不带电荷的氨基酸或氨基酸模拟物。间隔物一般选自例如Ala、Gly或其它非极性氨基酸或中性极性氨基酸的中性间隔物。应当理解，可选的间隔物不需要由相同残基组成，因此可能是异源或同源寡聚物。若有间隔物，则一般至少1或2个残基，通常3-13个，更常见3-6个残基。CTL肽表位可在其氨基或羧基端与T辅助肽表位直接或通过间隔物相连。CTL肽或HTL肽的氨基端可以酰基化。
在某些实施方案中，T辅助肽是可以被存在于大部分群体中的T辅助细胞识别的肽。这可以通过选择可结合许多、大多或全部HLA II类分子的氨基酸序列而实现。所述称为″HLA松散限制性″或″泛宿主性(promiscuous)″T辅助序列。泛宿主性氨基酸序列的例子包括下述抗原的序列，例如破伤风类毒素的830-843位(QYIKANSKFIGITE)、镰形疟原虫(Plasmodium falciparum)CS蛋白质的378-398位(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS)以及链球菌18kD蛋白质的116位(GAVDSlLGGVATYGAA)。其它例子包括带有DR 1-4-7超基序或任何DR3基序的肽。
或者，可能使用自然中未发现的氨基酸序列，制备能够以HLA松散限制性方式刺激T辅助淋巴细胞的合成肽。合成化合物属于称作泛DR结合表位的分子家族(例如PADRETM，Epimmune Inc.，San Diego，CA)。PADRETM设计为可结合多个HLA-DR(人HLA II类)分子。例如，已经发现具有通式aKXVAAZTLKAAa的泛DR结合表位肽(其中″X″是丙氨酸环己酯、苯丙氨酸、或酪氨酸；″Z″是色氨酸、酪氨酸、组氨酸或天冬酰胺；″a″是D-丙氨酸或L-丙氨酸)可结合多种等位基因特异性HLA-DR分子。因此，这些分子刺激大多数个体的T辅助淋巴细胞应答，而与其HLA类型无关。某些泛DR结合表位包含所有″L″天然氨基酸；可以肽或肽编码核酸形式提供这些分子。
可以修饰HTL肽表位来改变其生物学特性。可按与CTL肽相同的方式修饰HTL肽表位。例如，可能修饰为包括D-氨基酸或缀合其它分子，例如脂质、蛋白质、糖等。包含D-氨基酸的肽一般对蛋白酶的抗性提高，因而延长了血清半寿期。
此外，包含本发明一种或多种肽表位的多肽可以缀合其它分子，例如脂质、蛋白质或糖、或其它合成的化合物，以提高其生物学活性。例如，T辅助肽可以在氨基或羧基端缀合一条或多条软脂酸链。
CTL肽与T细胞引发物的联合
在某些实施方案中，可能希望在本发明药物组合物中包括至少一种可引发细胞毒性T淋巴细胞的组分。已经确认脂质为能够促进体外引发抗病毒性抗原的CTL应答的试剂。例如，可以将软脂酸残基附着到赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接免疫原性肽。可以使用一种或多种连接成分，例如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等。然后在微粒或颗粒中、掺入脂质体中或乳化于佐剂中(例如弗氏不完全佐剂)直接给予该脂质化的肽。优选的免疫原性组合物包含软脂酸通过连接成分例如Ser-Ser附着到赖氨酸残基的ε-和α-氨基，添加到免疫原性肽的氨基端。
在脂质促进引发CTL应答的另一实施方案中，可以使用大肠杆菌脂蛋白例如三棕榈酰-S-甘氨酰-半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，在共价附着到合适的肽时引发CTL。(参见例如Deres等人，Nature 342561，1989)。因此，可以将本发明的肽偶联到P3CSS，将该脂肽给予个体，以特异性引发针对靶抗原的CTL应答。此外，由于P3CSS缀合表位也可以引发诱导中和抗体，两种此类组合物可以联合引发体液及细胞介导的应答。
包含利用CTL和/或HTL肽脉冲的树突状细胞的疫苗组合物
符合本发明的疫苗组合物的一个实施方案包含将带有表位的肽混合物离体给予来自患者血液的PBMC或从中分离的DC。可以使用促进DC收获的药剂，例如ProgenipoietinTM(Monsanto，St.Louis，MO)或GM-CSF/IL-4。在利用肽脉冲DC之后、重输注患者之前，洗涤DC以去除未结合肽。在此实施方案中，一种疫苗包含肽脉冲的DC，在其表面上的HLA分子中存在脉冲的肽表位。
DC可以利用肽混合物离体脉冲，其中某些刺激针对一种或多种目的抗原例如肿瘤相关抗原(TAA)(诸如HER2/neu、p53、MAGE2、MAGE3)和/或癌胚抗原(CEA)的CTL应答。这些TAA总体与乳腺、结肠及肺癌相关。可任选包括辅助T细胞(HTL)肽例如PADRETM，以促进CTL应答。因此，使用包含来自HER2/neu、p53、MAGE2、MAGE3和癌胚抗原(CEA)的表位的本发明疫苗，来治疗恶性肿瘤(例如乳腺、结肠或肺癌)患者的后轻微后遗症；利用该疫苗也可以治疗任何带有这些TAA的恶性肿瘤。可在根除(debulking)程序例如手术、放射治疗或化学治疗之后使用TAA疫苗；疫苗因而为接受者提供提高疾病自由存活及整体存活的益处。
因此，在优选实施方案中，本发明的疫苗是治疗多种不同肿瘤类型中大多数患者的一种产品。包含多表位、优选带有超基序的表位的疫苗具有这种益处。
为治疗或预防性目的给予疫苗
包含一种或多种本发明肽表位的多肽，包括其药物及疫苗组合物，可用于给予哺乳动物、特别是人类，以治疗和/或预防疾病。在一个实施方案中，将本发明的疫苗组合物(肽或核酸)给予具有与一种或多种TAA的表达相关的恶性肿瘤患者、或易有产生TAA相关疾病或处于发展TAA相关疾病风险的个体。给予后引发抗TAA的免疫应答，从而增强患者自身的免疫应答能力。在治疗性应用中，将肽和/或核酸组合物以给予患者，其数量足以引发针对TAA表达细胞的有效免疫应答，从而治愈、阻抑或减缓症状和/或并发症。足以实现此目的的数量定义为″治疗有效剂量″。此应用的有效数量取决于，例如所给予的特定组合物、给药方式、所治疗疾病的时期和严重性、患者的体重及一般健康状态以及处方医生的判断。
本发明的疫苗组合物可以仅仅用作预防剂。一般而言，初次预防性免疫的剂量通常在一个单位剂量范围内，其中较低值约1、5、50、500或1000μg的肽，较高值约10,000、20,000、30,000或50,000μg的肽。人用剂量值一般每70千克患者约500μg-约50,000μg的肽。之后为约1.0μg-50,000μg肽的加强剂量，按初次给予疫苗后约4周-6个月的确定间隔给药。通过测定患者血液样品中CTL和HTL的特异性活性，来评价疫苗的免疫原性。
如上所述，包含本发明CTL和/或HTL表位的多肽在由HLA分子呈递并接触特异性针对肽所含表位的CTL或HTL时，诱导免疫应答。肽接触CTL或HTL的方式对本发明并不重要。例如，肽可以体外或体内接触CTL或HTL。若接触在体内发生，肽可以直接、或以其它形式/运载体给予，例如此处所述编码一种或多种肽的DNA载体、编码肽的病毒性载体、脂质体、抗原呈递细胞诸如树突细胞等。
因此，对于肽或多肽形式的本发明药物组合物而言，可以直接给予该肽或多肽。或者，肽/多肽可以呈递在APC上、或作为其编码DNA而间接给予。另外，可以各自或作为一种或多种肽序列的融合物而给予多肽、肽表位或其编码DNA。
对于治疗性应用，一般应该在初次诊断TAA相关疾病时开始给药。继之以加强剂量，至少直至症状基本减弱，并在其后持续一段时间。在慢性疾病状态中，在加强剂量之前可能需要工作剂量(loading dose)。
初次治疗性免疫的剂量通常在一个单位剂量范围内，其中较低值约1、5、50、500或1000μg的肽，较高值约10,000、20,000、30,000或50,000μg的肽。人用剂量值一般每70千克患者约500μg-50,000μg的肽。可以根据患者的反应和条件，给予按照加强方案给药数周至数月的约1.0μg-50,000μg肽的加强剂量。通过测定得自患者血液中的CTL和HTL的特异性活性，可以确定患者的反应。
在某些实施方案中，将本发明的多肽、肽和组合物用于严重疾病状态。在此情况下，由于外源物质的最低量及肽的相对无毒性质，有可能并需要给予相对于所述剂量大大过量的肽。
对于治疗慢性疾病，典型剂量位于上述范围内，即较低值约1、5、50、500或1000μg的肽，较高值约10,000、20,000、30,000或50,000μg的肽；优选每70千克患者约500μg-50,000μg的肽。可能需要在初次剂量后继之以确定间隔的加强剂量，例如4周-6个月，可能持续很长时间，以有效免疫个体。在慢性疾病情况下，应该持续给药，最低限度直至临床症状或实验室检测表明疾病已经消除或基本减弱，并在其后持续一段时间。根据本领域已知方法调整给药剂量、途径及剂量方案。
胃肠外、表面、口服、膜内或局部给予用于治疗性治疗的药物组合物。优选胃肠外给予该药物组合物，例如静脉内、皮下、皮内或肌内。
因此，在一个优选实施方案中，本发明提供了胃肠外给予的药物组合物，其包含溶解或悬浮于合适载体、优选水性载体中的免疫原性肽的溶液。可使用多种载体，例如水、缓冲水、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可能通过常规、公知的灭菌技术灭菌，或可能无菌过滤。所得水溶液可能包装以供使用，或冻干，冻干制剂在给药前与无菌溶液混合。该组合物可能包含为接近生理条件所需的药物可接受的辅助物或药用赋形剂，例如pH调节剂及缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、保存剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨聚糖、油酸三乙醇胺等。
本发明肽和多肽在药物制剂中的浓度可以变动很大，即以重量计，从低于约0.1％、一般为或至少约2％到多达20％-50％或更多，按照所选的特定给药方式，主要根据液体体积、粘性等进行选择。
药物组合物中一般包括肽和多肽组合物的人用单位剂量形式，也包含人用单位剂量的可接受载体、优选水性载体，按本领域技术人员已知的此类组合物人用给药的液体体积给药(参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences，17′Edition，A.Gennaro，Editor，MackPublishing Co.，Easton，Pennsylvania，1985)。
也可以通过脂质体给予本发明的肽和多肽，用于将肽和多肽定位到特定组织例如淋巴组织，或选择性定位到感染细胞，以及提高肽组合物的半寿期。脂质体包括乳剂、泡沫、胶粒、不溶性单分子层、液态晶体、磷脂分散剂、片层等。在这些制剂中，将待运送的肽和多肽作为脂质体的一部分，单独或连同结合淋巴细胞优势受体的分子(例如结合CD45抗原的单克隆抗体)或其它治疗性或免疫原性组合物而掺入。因此，装入或附着本发明目的肽的脂质体可以定位到淋巴细胞部位，然后脂质体在此运送该肽组合物。符合本发明应用的脂质体由标准的成载体脂质形成，其中一般包括中性和负电性磷脂以及固醇，例如胆固醇。一般考虑例如脂质体大小、酸不稳定性以及脂质体在血流中的稳定性，来指导脂质的选择。现有多种方法制备脂质体，例如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)以及美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369所述。
为了将本发明组合物定位到免疫系统的细胞，可以在脂质体中掺入配基，例如特异性针对目的免疫系统细胞表面决定簇的抗体或其片段。可能静脉内、局部、表面等给予包含肽的脂质体悬浮剂，其剂量特别依给药方式、待运送的肽以及待治疗疾病的阶段而变化。
对固体组合物可使用常规无毒固体载体，包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，通过引入任何常用赋形剂(例如前文所列载体)形成药物可接受的无毒组合物，活性成分(即本发明的一种或多种肽)一般为10-95％，通常浓度为25％-75％。
对于气雾剂给药，优选提供细碎(finely divided)形式的免疫原性肽，连同表面活化剂和推进剂。肽的百分比一般为重量的0.01％-20％，通常1％-10％。表面活化剂当然必须是药物可接受的，优选可溶于推进剂中。典型的此类试剂是包含6-22个碳原子的脂肪酸的酯或不完全酯，例如带有脂肪族多羟基醇或其环状酸酐的己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric和油酸。可利用混合酯，例如混合或天然甘油酯。表面活化剂可占组合物重量的0.1％-20％，优选0.25-5％。平衡组合物的通常是推进剂，尽管可使用不需推进剂的雾化器并相应调整其它百分比。也可以包括载体，例如用于鼻内输送的卵磷脂。
也已经使用本发明的抗原性多肽离体引发CTL和/或HTL应答。所得CTL或HTL可用于治疗慢性感染，或治疗对常规治疗形式、或本发明治疗性肽或核酸疫苗没有反应的患者的肿瘤。通过在组织培养中将患者或遗传相容性CTL或HTL前体细胞连同抗原呈递细胞(APC)的来源(例如树突细胞)以及合适的免疫原性肽温育，可诱导对特定抗原(感染性或肿瘤相关抗原)的离体CTL或HTL应答。在适当的温育时间后(一般约7-28天)，其中前体细胞活化并扩增为效应细胞，将细胞输注回患者，它们将破坏(CTL)或促进破坏(HTL)其特异性靶细胞(感染细胞或肿瘤细胞)。
已经描述了许多计算机算法，来鉴定大蛋白质中符合特异性MHC I类或MHC II类分子的肽结合基序要求的肽。由于MHC分子的广泛多态性，不同的肽常常结合不同的MHC分子。表1-6列出了利用三种不同算法预测的为MHC结合肽的C35肽。特别地，利用在SYFPEITHI网站(wysiwyg//35/http//134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm)发现的规则，并根据Rammensee，H.G.，Bachmann，J.和Stevanovic，S.(Chapman & Hall，New York 1997)的著作″MHC Ligandsand Peptide Motifs″预测的C35 HLA I类和II类表位，列于表1和5。利用网上得到的NIH BIMAS程序(http//bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)预测的来源于C35序列的MHC结合肽，列于表2。最后，表3和6所列为利用Tepitope程序(该程序用于预测可与多个不同的MHC II类分子结合的肽)预测的C35肽。利用Tepitope，确定出四种C35肽为结合各种HLA II类分子的可能候选者。通常这些肽比结合HLA I类的肽长，在结合多种HLA II类分子方面更为简并。由于HLA分子与结合算法的固有限制之间的相关性，预计许多这些预测结合特定HLA分子的C35肽表位将也结合一种或多种其它HLA分子。
表1
SYFPEITHI网站预测的C35肽
(分值反映连接强度)
I类MHC
HLA-A*0201
九聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
9
S V A P P P E E V
23
88
D L I E A I R R A
21
37
A T Y L E L A S A
19
97
S N G E T L E K I
18
105
I T N S R P P C V
18
2
S G E P G Q T S V
17
45
A V K E Q Y P G I
17
38
T Y L E L A S A V
16
61
G T G A F E I E I
16
85
Y E K D L I E A I
16
65
F E I E I N G Q L
15
107
N S R P P C V I L
15
41
E L A S A V K E Q
14
58
R L G G T G A F E
14
59
L G G T G A F E I
14
66
E I E I N G Q L V
14
68
E I N G Q L V F S
14
81
G G F P Y E K D L
14
94
R R A S N G E T L
14
HLA-A*0201
十聚体
位置分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0
58
R L G G T G A F E I
22
96
A S N G E T L E KI
19
104
K I T N S R P P C V
19
37
A T Y L E L A S A V
18
17
V E P G S G V R I V
17
33
C G F E A T Y L E L
16
44
S A V K E Q Y P G I
16
92
A I R R A S N G E T
16
39
Y L E L A S A V K E
15
53
I E I E S R L G G T
15
65
F E I E I N G Q L V
15
105
I T N S R P P C V I
15
1
M S G E P G Q T S V
14
63
G A F E I E I N G Q
14
68
E I N G Q L V F S K
14
69
I N G Q L V F S K L
14
83
F P Y E K D L I E A
14
88
D L I E A I R R A S
14
93
I R R A S N G E T L
14
72
Q L V F S K L E N G
13
89
L I E A I R R A S N
13
8
T S V A P P P E E V
12
16
E V E P G S G V R I
12
50
Y P G I E I E S R L
12
60
G G T G A F E I E I
12
81
G G F P Y E K D L I
12
106
T N S R P P C V I L
12
HLA-A*0203
九聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
35
F E A T Y L E L A
12
HLA-A*0203
十聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0
36
E A T Y L E L A S A
18
HLA-A1九聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
77
K L E N G G F P Y
29
2
S G E P G Q T S V
18
21
S G V R I V V E Y
18
16
E V E P G S G V R
17
29
Y C E P C G F E A
17
42
L A S A V K E Q Y
17
31
E P C G F E A T Y
16
34
G F E A T Y L E L
16
39
Y L E L A S A V K
14
84
P Y E K D L I E A
14
66
E I E I N G Q L V
13
13
P P E E V E P G S
12
46
V K E Q Y P G I E
12
52
G I E I E S R L G
12
96
A S N G E T L E K
12
HLA-A1十聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0
20
G S G V R I V V E Y
20
29
Y C E P C G F E A T
19
76
S K L E N G G F P Y
18
2
S G E P G Q T S V A
17
52
G I E I E S R L G G
17
66
E I E I N G Q L V F
17
41
E L A S A V K E Q Y
16
46
V K E Q Y P G I E I
16
16
E V E P G S G V R I
15
30
C E P C G F E A T Y
15
39
Y L E L A S A V K E
15
77
K L E N G G F P Y E
14
86
E K D L I E A I R R
14
98
N G E T L E K I T N
14
34
G F E A T Y L E L A
12
64
A F E I E I N G Q L
12
101
T L E K I T N S R P
12
HLA-A26九聚体
位置分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
68
E I N G Q L V F S
24
100
E T L E K I T N S
24
88
D L I E A I R R A
23
54
E I E S R L G G T
22
41
E L A S A V K E Q
21
45
A V K E Q Y P G I
20
31
E P C G F E A T Y
19
34
G F E A T Y L E L
19
73
L V F S K L E N G
19
16
E V E P G S G V R
18
77
K L E N G G F P Y
18
66
E I E I N G Q L V
17
21
S G V R I V V E Y
16
37
A T Y L E L A S A
16
24
R I V V E Y C E P
15
9
S V A P P P E E V
14
22
G V R I V V E Y C
14
51
P G I E I E S R L
14
70
N G Q L V F S K L
14
57
S R L G G T G A F
13
65
F E I E I N G Q L
13
25
I V V E Y C E P C
12
48
E Q Y P G I E I E
12
67
I E I N G Q L V F
12
75
F S K L E N G G F
12
81
G G F P Y E K D L
12
104
K I T N S R P P C
12
105
I T N S R P P C V
12
HLA-A26十聚体
位置分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0
41
E L A S A V K E Q Y
27
66
E I E I N G Q L V F
26
68
E I N G Q L V F S K
23
26
V V E Y C E P C G F
21
16
E V E P G S G V R I
20
88
D L I E A I R R A S
19
100
E T L E K I T N S R
19
74
V F S K L E N G G F
18
33
C G F E A T Y L E L
17
54
E I E S R L G G T G
17
56
E S R L G G T G A F
17
20
G S G V R I V V E Y
16
31
E P C G F E A T Y L
16
64
A F E I E I N G Q L
15
69
I N G Q L V F S K L
15
61
G T G A F E I E I N
14
73
L V F S K L E N G G
14
9
S V A P P P E E V E
13
25
I V V E Y C E P C G
13
45
A V K E Q Y P G I E
13
72
Q L V F S K L E N G
13
77
K L E N G G F P Y E
13
79
E N G G F P Y E K D
13
4
E P G Q T S V A P P
12
7
Q T S V A P P P E E
12
30
C E P C G F E A T Y
12
36
E A T Y L E L A S A
12
37
A T Y L E L A S A V
12
76
S K L E N G G F P Y
12
89
L I E A I R R A S N
12
HLA-A3九聚体
位置分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
39
Y L E L A S A V K
28
77
K L E N G G F P Y
25
16
E V E P G S G V R
24
58
R L G G T G A F E
22
67
I E I N G Q L V F
19
96
A S N G E T L E K
18
92
A I R R A S N G E
17
9
S V A P P P E E V
16
101
T L E K I T N S R
16
22
G V R I V V E Y C
15
31
E P C G F E A T Y
15
45
A V K E Q Y P G I
15
72
Q L V F S K L E N
15
21
S G V R I V V E Y
14
68
E I N G Q L V F S
14
69
I N G Q L V F S K
14
88
D L I E A I R R A
14
91
E A I R R A S N G
14
25
I V V E Y C E P C
13
37
A T Y L E L A S A
13
55
I E S R L G G T G
13
57
S R L G G T G A F
13
79
E N G G F P Y E K
13
87
K D L I E A I R R
13
104
K I T N S R P P C
13
24
R I V V E Y C E P
12
42
L A S A V K E Q Y
12
66
E I E I N G Q L V
12
89
L I E A I R R A S
12
90
I E A I R R A S N
12
94
R R A S N G E T L
12
HLA-A3十聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0
68
E I N G Q L V F S K
22
16
E V E P G S G V R I
20
38
T Y L E L A S A V K
20
41
E L A S A V K E Q Y
20
66
E I E I N G Q L V F
20
9
S V A P P P E E V E
19
58
R L G G T G A F E I
19
39
Y L E L A S A V K E
18
92
A I R R A S N G E T
18
95
R A S N G E T L E K
18
45
A V K E Q Y P GI E
17
54
E I E S R L G G T G
16
88
D L I E A I R R A S
16
89
L I E A I R R A S N
16
26
V V E Y C E P C G F
15
37
A T Y L E L A S A V
15
22
G V R I V V E Y C E
14
77
K L E N G G F P Y E
14
93
I R R A S N G E T L
14
25
I V V E Y C E P C G
13
30
C E P C G F E A T Y
13
52
G I E I E S R L G G
13
76
S K L E N G G F P Y
13
78
L E N G G F P Y E K
13
101
T L E K I T N S R P
13
104
K I T N S R P P C V
13
24
R I V V E Y C E P C
12
72
Q L V F S K L E N G
12
HLA-B*0702
九聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
18
E P G S G V R I V
19
107
N S R P P C V I L
18
4
E P G Q T S V A P
15
11
A P P P E E V E P
15
31
E P C G F E A T Y
14
34
G F E A T Y L E L
13
94
R R A S N G E T L
13
12
P P P E E V E P G
12
19
P G S G V R I V V
12
32
P C G F E A T Y L
12
83
F P Y E K D L I E
12
106
T N S R P P C V I
12
HLA-B*0702
十聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0
31
E P C G F E A T Y L
24
50
Y P G I E I E S R L
21
18
E P G S G V R I V V
20
83
F P Y E K D L I E A
16
4
E P G Q T S V A P P
15
11
A P P P E E V E P G
15
93
I R R A S N G E T L
14
106
T N S R P P C V I L
14
69
I N G Q L V F S K L
13
33
C G F E A T Y L E L
12
64
A F E I E I N G Q L
12
HLA-B*08八聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8
83
F P Y E K D L I
25
66
E I E I N G Q L
16
52
G I E I E S R L
15
18
E P G S G V RI
14
54
E I E S R L G G
14
91
E A I R R A S N
14
95
R A S N G E T L
14
100
E T L E K I T N
14
33
C G F E A T Y L
12
45
A V K E Q Y P G
12
58
R L G G T G A F
12
68
E I N G Q L V F
12
71
G Q L V F S K L
12
75
F S K L E N G G
12
82
G F P Y E K D L
12
107
N S R P P C V I
12
108
S R P P C V I L
12
HLA-B*08九聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
75
F S K L E N G G F
19
83
F P Y E K D L I E
19
45
A V K E Q Y P G I
18
85
Y E K D L I E A I
18
107
N S R P P C V I L
17
100
E T L E K I T N S
15
54
E I E S R L G G T
14
65
F E I E I N G Q L
14
91
E A I R R A S N G
14
20
G S G V R I V V E
12
34
G F E A T Y L E L
12
51
P G I E I E S R L
12
81
G G F P Y E K D L
12
HLA-B*1510
九聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
107
N S R P P C V I L
15
34
G F E A T Y L E L
13
51
P G I E I E S R L
13
81
G G F P Y E K D L
13
94
R R A S N G E T L
13
HLA-B*2705
九聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
57
S R L G G T G A F
26
94
R R A S N G E T L
25
67
I E I N G Q L V F
19
87
K D L I E A I R R
19
51
P G I E I E S R L
17
81
G G F P Y E K D L
17
65
F E I E I N G Q L
16
69
I N G Q L V F S K
16
96
A S N G E T L E K
16
16
E V E P G S G V R
15
34
G F E A T Y L E L
15
50
Y P G I E I E S R
15
70
N G Q L V F S K L
15
101
T L E K I T N S R
15
23
V R I V V E Y C E
14
32
P C G F E A T Y L
14
39
Y L E L A S A V K
14
79
E N G G F P Y E K
14
93
I R R A S N G E T
14
21
S G V R I V V E Y
13
27
V E Y C E P C G F
13
75
F S K L E N G G F
13
86
E K D L I E A I R
13
107
N S R P P C V I L
13
17
V E P G S G V R I
12
31
E P C G F E A T Y
12
77
K L E N G G F P Y
12
HLA-B*2709
九聚体
位置分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
94
R R A S N G E T L
25
57
S R L G G T G A F
20
81
G G F P Y E K D L
16
34
G F E A T Y L E L
14
51
P G I E I E S R L
13
65
F E I E I N G Q L
13
23
V R I V V E Y C E
12
107
N S R P P C V I L
12
HLA-B*5101
九聚体
位置分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
18
E P G S G V R I V
21
81
G G F P Y E K D L
21
51
P G I E I E S R L
20
70
N G Q L V F S K L
20
19
P G S G V R I V V
19
31
E P C G F E A T Y
19
2
S G E P G Q T S V
18
42
L A S A V K E Q Y
18
59
L G G T G A F E I
18
21
S G V R I V V E Y
14
83
F P Y E K D L I E
14
97
S N G E T L E K I
14
13
P P E E V E P G S
13
38
T Y L E L A S A V
13
45
A V K E Q Y P G I
13
63
G A F E I E I N G
13
94
R R A S N G E T L
13
12
P P P E E V E P G
12
33
C G F E A T Y L E
12
50
Y P G I E I E S R
12
66
E I E I N G Q L V
12
85
Y E K D L I E A I
12
95
R A S N G E T L E
12
105
I T N S R P P C V
12
HLA-B*5101八聚体
位置分值
1 2 3 4 5 6 7 8
83
F P Y E K D L I
25
95
R A S N G E T L
23
10
V A P P P E E V
21
18
E P G S G V R I
21
33
C G F E A T Y L
21
98
N G E T L E K I
19
19
P G S G V R I V
18
60
G G T G A F E I
18
62
T G A F E I E I
18
63
G A F E I E I N
14
71
G Q L V F S K L
14
48
E Q Y P G I E I
13
67
I E I N G Q L V
13
106
T N S R P P C V
12
Class II MHC
HLA-DRB1*0101 15聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5
72
Q L V F S K L E N G G F P Y E
29
37
A T Y L E L A S A V K E Q Y P
26
26
V V E Y C E P C G F E A T Y L
25
63
G A F E I E I N G Q L V F S K
25
24
R I V V E Y C E P C G F E A T
24
36
E A T Y L E L A S A V K E Q Y
24
39
Y L E L A S A V K E Q Y P G I
24
53
I E I E S R L G G T G A F E I
24
56
E S R L G G T G A F E I E I N
24
14
P E E V E P G S G V R I V V E
23
43
A S A V K E Q Y P G I E I E S
23
20
G S G V R I V V E Y C E P C G
20
62
T G A F E I E I N G Q L V F S
20
32
P C G F E A T Y L E L A S A V
19
47
K E Q Y P G I E I E S R L G G
19
64
A F E I E I N G Q L V F S K L
19
82
G F P Y E K D L I E A I R R A
19
34
G F E A T Y L E L A S A V K E
18
54
E I E S R L G G T G A F E I E
18
90
I E A I R R A S N G E T L E K
18
99
G E T L E K I T N S R P P C V
18
31
E P C G F E A T Y L E L A S A
17
49
Q Y P G I E I E S R L G G T G
17
58
R L G G T G A FE I E I N G Q
17
66
E I E I N G Q L V F S K L E N
17
67
I E I N G Q L V F S K L E N G
17
68
E I N G Q L V F S K L E N G G
17
84
P Y E K D L I E A I R R A S N
17
86
E K D L I E A I R R A S N G E
17
35
F E A T Y L E L A S A V K E Q
16
74
V F S K L E N G G F P Y E K D
16
87
K D L I E A I R R A S N G E T
16
91
E A I R R A S N G E T L E K I
16
1
M S G E P G Q T S V A P P P E
15
4
E P G Q T S V A P P P E E V E
15
11
A P P P E E V E P G S G V R I
15
12
P P P E E V E P G S G V R I V
15
29
Y C E P C G F E A T Y L E L A
15
5
P G Q T S V A P P P E E V E P
14
6
G Q T S V A P P P E E V E P G
14
44
S A V K E Q Y P G I E I E S R
14
52
G I E I E S R L G G T G A F E
14
61
G T G A F E I E I N G Q L V F
13
50
Y P G I E I E S R L G G T G A
12
HLA-DRB1*0301
(DR17)15聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5
64
A F E I E I N G Q L V F S K L
26
39
Y L E L A S A V K E Q Y P G I
25
72
Q L V F S K L E N G G F P Y E
23
62
T G A F E I E I N G Q L V F S
22
24
R I V V E Y C E P C G F E A T
19
71
G Q L V F S K L E N G G F P Y
19
86
E K D L I E A I R R A S N G E
19
7
Q T S V A P P P E E V E P G S
18
23
V R I V V E Y C E P C G F E A
18
50
Y P G I E I E S R L G G T G A
18
90
I E A I R R A S N G E T L E K
18
20
G S G V R I V V E Y C E P C G
17
87
K D L I E A I R R A S N G E T
17
99
G E T L E K I T N S R P P C V
16
28
E Y C E P C G F E A T Y L E L
15
37
A T Y L E L A S A V K E Q Y P
14
48
E Q Y P G I E I E S R L G G T
14
78
L E N G G F P Y E K D L I E A
14
14
P E E V E P G S G V R I V V E
13
70
N G Q L V F S K L E N G G F P
13
43
A S A V K E Q Y P G I E I E S
12
52
G I E I E S R L G G T G A F E
12
54
E I E S R L G G T G A F E I E
12
74
V F S K L E N G G F P Y E K D
12
82
G F P Y E K D L I E A I R R A
12
HLA-DRB1*0401
(DR4D4)15聚体
位置 分值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5
36
E A T Y L E L A S A V K E Q Y
28
62
T G A F E I E I N G Q L V F S
28
86
E K D L I E A I R R A S N G E
26
87
K D L I E A I R R A S N G E T
26
90
I E A I R R A S N G E T L E K
26
72
Q L V F S K L E N G G F P Y E
22
82
G F P Y E K D L I E A I R R A
22
50
Y P G I E I E S R L G G T G A
20
99
G E T L E K I T N S R P P C V
20
26
V V E Y C E P C G F E A T Y L
16
32
P C G F E A T Y L E L A S A V
16
47
K E Q Y P G I E I E S R L G G
16
80
N G G F P Y E K D L I E A I R
16
14
P E E V E P G S G V R I V V E
14
20
G S G V R I V V E Y C E P C G
14
22
G V R I V V E Y C E P C G F E
14
37
A T Y L E L A S A V K E Q Y P
14
39
Y L E L A S A V K E Q Y P G I
14
56
E S R L G G T G A F E I E I N
14
64
A F E I E I N G Q L V F S K L
14
66
E I E I N G Q L V F S K L E N
14
10
V A P P P E E V E P G S G V R
12
12
P P P E E V E P G S G V R I V
12
16
E V E P G S G V R I V V E Y C
12
29
Y C E P C G F E A T Y L E L A
12
30
C E P C G F E A T Y L E L A S
12
31
E P C G F E A T Y L E L A S A
12
34
G F E A T Y L E L A S A V K E
12
35
F E A T Y L E L A S A V K E Q
12
42
L A S A V K E Q Y P G I E I E
12
48
E Q Y P G I E I E S R L G G T
12
49
Q Y P G I E I E S R L G G T G
12
53
I E I E S R L G G T G A F E I
12
58
R L G G T G A F E I E I N G Q
12
59
L G G T G A F E I E I N G Q L
12
61
G T G A F E I E I N G Q L V F
12
63
G A F E I E I N G Q L V F S K
12
67
I E I N G Q L V F S K L E N G
12
68
E I N G Q L V F S K L E N G G
12
69
I N G Q L V F S K L E N G G F
12
85
Y E K D L I E A I R R A S N G
12
93
I R R A S N G E T L E K I T N
12
94
R R A S N G E T L E K I T N S
12
96
A S N G E T L E K I T N S R P
12
97
S N G E T L E K I T N S R P P
12
表2
HLA肽基序检索结果用户参数和记分信为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A1选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 177KLENGGFPY225.000 216EVEPGGGVP90.000 329YCEPCGFEA45.000 439YLELASAVK36.000 52SGEPGQTSV2.250 626VVEYCEPCG1.800 796ASNGETLEK1.500 8101TLEKITNSR0.900 989LIEAIRRAS0.900 1054EIESRLGGT0.900 1166EIEINGQLV0.900 1252GIEIESRLG0.900 1386EKDLIEAIR0.500 1442LASAVKEQY0.500 1531EPCGFEATY0.250 1669INGQLVFSK0.250 1734GFEATYLEL0.225 1898NGETLEKIT0.225 1961GTGAFEIEI0.125 2079ENGGFPYEK0.100
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A1选择的记分亚序列长度10选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果排位 起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 166EIEInGQLVF45.000 216EVEPgSGVRI18.000 329YCEPcGFEAT9.000 426VVEYcEPCGF9.000 552GIEIeSRLGG4.500 62SGEPgQTSVA2.250 789LIEAlRRASN1.800 820GSGVrIVVDY1.500 986EKDLlEAIRR1.250 1098NGETlEKITN1.125 1195RASNgETLEK1.000 1268EINGqLVFSK1.000 1354EIESrLGGTG0.900 1441ELASaVKEQY0.500 15100ETLEkITNSR0.250 1646VKEQyPGIEI0.225 1739YLELaSAVKE0.180 1877KLENgGFPYE0.180 1976SKLEnGGFPY0.125 2048EQYPgIEIES0.075
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A_0201选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果 排位 起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 19SVAPPPEEV2.982 2104KITNSRPPC2.391 3105ITNSRPPCV1.642 425IVVEYCEPC1.485 565FEIEINGQL1.018 647KEQYPGIEI0.710 788DLIEAIRRA0.703 859LGGTGAFEI0.671 961GTGAFEIEI0.551 1081GGFPYEKDL0.516 1137ATYLELASA0.508 1235FEATYLELA0.501 1315EEVEPGSGV0.416 1417VEPGSGVRI0.345 1597SNGETLEKI0.315 1670NGQLVFSKL0.265 1722GVRIVVEYC0.205 1845AVKEQYPGI0.196 1985YEKDLIEAI0.151 2038TYLELASAV0.147
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A_0201选择的记分亚序列长度10选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果 排位 起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 158RLGGtGAFEI60.510 2104KITNsRPPCV33.472 365FEIEiNGQLV25.506 483FPYEkDLIEA4.502 533CGFEaTYLEL3.173 61MSGEpGQTSV3.165 737ATYLeLASAV3.091 850YPGIeIESRL0.641 969INGQlVFSKL0.450 1017VEPGsGVRIV0.434 1124RIVVeYCEPC0.335 1253IEIEsRLGGT0.302 1360GGTGaFEIEI0.259 148TSVApPPEEV0.222 1544SAVKeQYPGI0.217 1621SGVRiVVEYC0.201 1755IESRlGGTGA0.164 1880NGGFpYEKDL0.139 1981GGFPyEKDLI0.123 20105ITNSrPPCVI0.101
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数 20选择的HLA分子类型 A_0205选择的记分亚序列长度 9选择的输入序列回复方式 Y回复方式 编号行用户输入的肽序列长度 115计算的亚序列分值数 107分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 165FEIEINGQL8.820 225IVVEYCEPC3.060 39SVAPPPEEV2.000 4104KITNSRPPC1.500 581GGFPYEKDL1.260 645AVKEQYPGI1.200 770NGQLVFSKL0.700 847KEQYPGIEI0.420 9105ITNSRPPCV0.340 1037ATYLELASA0.300 1135FEATYLELA0.252 1217VEPGSGVRI0.238 1361GTGAFEIEI0.200 1497SNGETLEKI0.150 1530CEPCGFEAT0.140 1685YEKDLIEAI0.126 1751PGIEIESRL0.105 1859LGGTGAFEI0.102 1922GVRIVVEYC0.100 2015EEVEPGSGV0.084
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数 20选择的HLA分子类型 A_0205选择的记分亚序列长度 10选择的输入序列回复方式 Y回复方式 编号行用户输入的肽序列长度 115计算的亚序列分值数 106分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 133CGFEaTYLEL6.300 2104KITNsRPPCV6.000 365FEIEiNGQLV2.520 453IEIEsRLGGT1.428 583FPYEkDLIEA1.350 658RLGGtGAFEI1.200 769INGQlVPSKL1.190 850YPGIeIESRL1.050 937ATYLeLASAV0.600 101MSGEpGQTSV0.510 1180NGGFpYEKDL0.420 12106TNSRpPCVIL0.350 1324RIVVeYCEPC0.300 1444SAVKeQYPGI0.200 1517VEPGsGVRIV0.190 16105ITNSrPPCVI0.170 1797SNGEtLEKIT0.150 1855IESRlGGTGA0.119 1960GGTGaFEIEI0.100 2092AIRRaSNGET0.100
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数 20选择的HLA分子类型 A24选择的记分亚序列长度 9选择的输入序列回复方式 Y回复方式 编号行用户输入的肽序列长度 115计算的亚序列分值数 107分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20记分结果 排位 起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 134GFEATYLEL33.000 249QYPGIEIES11.550 370NGQLVFSKL11.088 438TYLELASAV10.800 582GFPYEKDLI7.500 681GGFPYEKDL4.800 7107NSRPPCVIL4.800 875FSKLENGGF2.000 997SNGETLEKI1.320 1045AVKEQYPGI1.200 1161GTGAFEIEI1.100 1259LGGTGAFEI1.100 1365FEIEINGQL1.008 1451PGIEIESRL1.008 15106TNSRPPCVI1.000 1684PYEKDLIEA0.825 1794RRASNGETL0.800 1828EYCEPCGFE0.600 1932PCGFEATYL0.400 2047KEQYPGIEI0.330
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数 20选择的HLA分子类型 A24选择的记分亚序列长度 10选择的输入序列回复方式 Y回复方式 编号行用户输入的肽序列长度 115计算的亚序列分值数 106分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 164AFEIeINGQL42.000 274VFSKlENGGF10.000 384PYEKdLIEAI9.000 4691NGQlVFSKL7.392 528EYCEpCGFEA6.600 650YPGIeIESRL5.600 733CGFEaTYLEL5.280 8106TNSRpPCVIL4.000 931EPCGfEATYL4.000 1080NGGFpYEKDL4.000 1126VVEYcEPCGF3.000 1266EIEInGQLVF3.000 1358RLGGtGAFEI2.200 1456ESRLgGTGAF2.000 1516EVEPgSGVRI1.800 1696ASNGeTLEKI1.650 17105ITNSrPPCVI1.500 1844SAVKeQYPGI1.500 1981GGFPyEKDLI1 200 2060GGTGaFEIEI1.100
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数 20选择的HLA分子类型 A3选择的记分亚序列长度 9选择的输入序列回复方式 Y回复方式 编号行用户输入的肽序列长度 115计算的亚序列分值数 107分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 177KLENGGFPY36.000 239YLELASAVK20.000 3101TLEKITNSR6.000 461GTGAFEIEI0.540 569INGQLVFSK0.360 696ASNGETLEK0.300 722GVRIVVEYC0.270 879ENGGFPYEK0.162 925IVVEYCEPC0.135 1045AVKEQYPGI0.090 1137ATYLELASA0.075 1242LASAVKEQY0.060 13104KITNSRPPC0.060 1450YPGIEIESR0.060 1572QLVFSKLEN0.060 1616EVEPGSGVR0.054 1731EPCGFEATY0.054 189SVAPPPEEV0.045 1987KDLIEAIRR0.036 2027VEYCEPCGF0.030
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A3选择的记分亚序列长度10选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期)168EIMGqLVFSK8.100258RLGGtGAFEI2.700341ELASaVKEQY1.800478LENGqFPYEN0.810595RASNgETLEE0.400620GSGVrIVVEY0.2707100ETLEkITNSR0.203826VVEYcEPCGF0.200977KLENgGFPYE0.1801066EIEInGQLVF0.1201124RIVVeYCEPC0.09012104KITNsRPPCV0.0601337ATYLeLASAVO.0501438TYLElASAVK0.0451583FPYEkDLIEA0.04516105ITNSrPPCVI0.0451772QLVFsKLENG0.0451830CEPCgFEATY0.0361922GTRIvVEYCE0.0272016EVEPgSGVRI0.027
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A_1101选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果 排位 起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期)139YLELASAVK0.400269INGQLVFSK0.120316EVEPGSGVR0.1204101TLEKITNSR0.080561GTGAFEIEI0.060650YPGIEIESR0.040796ASNGETLEK0.040887KDLIEAIRR0.036977KLENGGFPY0.0361079ENGGFPYEK0.024119SVAPPPEEV0.0201245AVKEQYPGI0.0201337ATYLELASA0.0201434GFEATYLEL0.01215105ITNSRPPCV0.0101622GVRIVVEYC0.0061738TYLELASAV0.0061882GFPYEKDLI0.0061929YCEPCGFEA0.0062073LVFSKLENG0.004
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A_3101选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果排位 起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期)1101TLEKITNSR2.000216EVEPGSGVR0.600350YPGIEIESR0.400487KDLIEAIRR0.240539YLELASAVK0.200677KLENGGFPY0.180737ATYLELASA0.060869INGQLVFSK0.024945AVKEQYPGI0.0201061GTGAFEIEI0.020119SVAPPPEEV0.0201224RIVVEYCEP0.0121334GFEATYLEL0.0121473LVFSKLENG0.0121538TYLELASAV0.01216105ITNSRPPCV0.0101772QLVFSKLEN0.0081882GFPYEKDLI0.00619104KITNSRPPC0.0062079ENGGFPYEK0.006
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A_3302选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果排位起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期)116EVEPGSGVR45.0002101TLEKITNSR9.000350YPGIEIESR3.000466EIEINGQLV1.500556ESRLGGTGA1.500654EIESRLGGT1.500768EINGQLVFS1.500886EKDLIEAIR0.900941ELASAVKEQ0.9001088DLIEAIRRA0.9001196ASNGETLEK0.5001222GVRIVVEYC0.500131MSGEPGQTS0.5001489LIEAIRRAS0.50015107NSRPPCVIL0.500169SVAPPPEEV0.5001738TYLELASAV0.5001825IVVEYCEPC0.5001945AVKEQYPGI0.5002049QYPGIEIES0.500
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A_3302选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果 排位起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 116EVEPGSGVR45.000 2101TLEKITNSR9.000 350YPGIEIESR3.000 466EIEINGQLV1.500 556ESRLGGTGA1.500 654EIESRLGGT1.500 768EINGQLVFS1.500 886EKDLIEAIR0.900 941ELASAVKEQ0.900 1088DLIEAIRRA0.900 1196ASNGETLEK0.500 1222GVRIVVEYC0.500 131MSGEPGQTS0.500 1489LIEAIRRAS0.500 15107NSRPPCVIL0.500 169SVAPPPEEV0.500 1738TYLELASAV0.500 1825IVVEYCEPC0.500 1945AVKEQYPGI0.500 2049QYPGIEIES0.500
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A68.1选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果 排位起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 116EVEPGSGVR900.000 29SVAPPPEEV12.000 350YPGIEIESR10.000 496ASNGETLEK9.000 5101TLEKITNSR5.000 645AVKEQYPGI4.000 779ENGGFPYEK3.600 839YLELASAVK3.000 961GTGAFEIEI3.000 1086EKDLIEAIR2.250 1169INGQLVFSK1.200 1287KDLIEAIRR1.000 13105ITNSRPPCV1.000 1437ATYLELASA1.000 1556ESRLGGTGA0.900 1625IVVEYCEPC0.800 1773LVFSKLENG0.800 1888DLIEAIRRA0.600 1918EPGSGVRIV0.600 2026VVEYCEPCG0.600
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A68.1选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果排位起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期)116EVEPGSGVR900.00029SVAPPPEEV12.000350YPGIEIESR10.000496ASNGETLEK9.0005101TLEKITNSR5.000645AVKEQYPGI4.000779ENGGFPYEK3.600839YLELASAVK3.000961GTGAFEIEI3.0001086EKDLIEAIR2.2501169INGQLVFSK1.2001287KDLIEAIRR1.00013105ITNSRPPCV1.0001437ATYLELASA1.0001556ESRLGGTGA0.9001625IVVEYCEPC0.8001773LVFSKLENG0.8001888DLIEAIRRA0.6001918EPGSGVRIV0.6002026VVEYCEPCG0.600
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A68.1选择的记分亚序列长度10选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果 排位起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1100ETLEkITNSR300.000 216EVEPgSGVRI18.000 368EINGqLVFSK9.000 415EEVEpGSGVR9.000 595RASNgETLEK3.000 685YEKDlIEAIR2.250 79SVAPpPEEVE1.800 886EKDLiEAIRR1.500 973LVFSkLENGG1.200 1025IVVEyCEPCG1.200 11105ITNSrPPCVI1.000 1237ATYLeLASAV1.000 1378LENGgFPYEK0.900 148TSVApPPEEV0.600 1522GVRIvVEYCE0.600 1618EPGSgVRIVV0.600 171MSGEpGQTSV0.600 1838TYLElASAVK0.600 1949QYPGiEIESR0.500 2045AVKEqYPGIE0.400
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型B14选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果排位起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期)194RRASNGETL20.000257SRLGGTGAF5.0003100ETLEKITNS3.3754105ITNSRPPCV2.000588DLILAIRRA1.350618EPGSGVRIV1.200770NGQLVFSKL1.000881GGFPYEKDL1.000954EIESRLGGT0.9001097SNGETLEKI0.6001191EAIRRASNG0.4501268EINGQLVFS0.4501365FEIEINGQL0.3001423VRIVVEYCE0.3001521SGVRIVVEY0.3001651PGIEIESRL0.30017104KITNSRPPC0.2501848EQYPGIEIE0.2251993IRRASNGET0.20020107NSRPPCVIL0.200
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法 确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型B14选择的记分亚序列长度10选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果排位起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期)1103EKITnSRPPC6.750233CGFEaTYLEL5.000393IRRAsNGETL4.000418EPGSgVEIVV3.000588DLIEaIRRAS2.2506104KITNsRPPCV2.0007106TNSRpPCVIL1.000850YPGIeIESRL1.000969INGQlVFSKL1.0001037ATYLeLASAV1.0001131EPCGfEATYL0.9001248EQYPgIEIES0.7501376SKLEnGGFPY0.7501483FPYEkDLIEA0.750158TSVApPPEEV0.6001696ASNGeTLEKI0.6001744SAVKeQYPGI0.6001857SRLGgTGAFE0.5001953IEIEsRLGGT0.4502021SGVRiVVEYC0.300
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A_2705选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果排位起始位点亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期)194RRASNGETL6000.000257SRLGGTGAF1000.000393IRRASNGET200.000427VEYCEPCGF75.000577KLENGGFPY45.000639YLELASAVK30.000765FEIEINGQL30.000847KEQYPGIEI27.000969INGQLVFSK20.0001023VRIVVEYCE20.00011101TLEKITNSR15.0001267TEINGQLVF15.00013107NSRPPCVIL10.0001496ASNGETLEK10.0001585YEKDLIEAI9.0001617VEPGSGVRI9.0001781GGFPYEKDL7.50018106TNSRPPCVI6.0001997SNGETLEKI6.0002075FSKLENGGF5.000
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_2705 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 93 IRRAsNGETL 2000.000 2 94 RRASnGETLE 60.000 3 78 LENGgFPYEK 30.000 4 95 RASNgETLEK 30.000 5 58 RLGGtGAFEI 27.000 6 33 CGFEaTYLEL 25.000 7 106 TNSRpPCVIL 20.000 8 71 GQLVfSKLEN 20.000 9 23 VRIVvEYCEP 20.000 10 57 SRLGgTGAFE 20.000 11 69 INGQlVFSKL 20.000 12 30 CEPCgFEATY 15.000 13 85 YEKDlIEAIR 15.000 14 37 ATYLeLASAV 15.000 15 48 EQYPgIEIES 10.000 16 50 YPGIeIESRL 10.000 17 104 KITNsRPPCV 9.000 18 65 FEIEiNGQLV 9.000 19 81 GGFPyEKDLI 7.500 20 83 FPYEkDLIEA 5.000
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_3501 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 31 EPCGFEATY 40.000 2 75 FSKLENGGF 22.500 3 107 NSRPPCVIL 15.000 4 42 LASAVKEQY 6.000 5 18 EPGSGVRIV 4.000 6 45 AVKEQYPGI 2.400 7 21 SGVRIVVEY 2.000 8 56 ESRLGGTGA 1.500 9 77 KLENGGFPY 1.200 10 81 GGFPYEKDL 1.000 11 1 MSGEPGQTS 1.000 12 70 NGQLVFSKL 1.000 13 97 SNGETLEKI 0.800 14 83 FPYEKDLIE 0.400 15 61 GTGAFEIEI 0.400 16 59 LGGTGAFEI 0.400 17 106 TNSRPPCVI 0.400 18 50 YPGIEIESR 0.300 19 22 GVRIVVEYC 0.300 20 11 APPPEEVEP 0.300
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_3501 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 31 EPCGfEATYL 30.000 2 50 YPGIeIESRL 20.000 3 56 ESRLgGTGAF 15.000 4 20 GSGVrIVVEY 10.000 5 83 FPYEkDLIEA 6.000 6 18 EPGSgVRIVV 4.000 7 33 CGFEaTYLEL 2.000 8 1 MSGEpGQTSV 2.000 9 96 ASNGeTLEKI 2.000 10 41 ELASaVKEQY 2.000 11 44 SAVKeQYPGI 1.200 12 69 INGQlVFSKL 1.000 13 8 TSVApPPEEV 1.000 14 80 NGGFpYEKDL 1.000 15 106 TNSRpPCVIL 1.000 16 58 RLGGtGAFEI 0.800 17 81 GGFPyEKDLI 0.600 18 26 VVEYcEPCGF 0.450 19 36 EATYlELASA 0.450 20 12 PPPEeVEPGS 0.400
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_3901 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 94 RRASNGETL 15.000 2 34 GFEATYLEL 9.000 3 38 TYLELASAV 4.000 4 66 EIEINGQLV 3.000 5 2 SGEPGQTSV 3.000 6 97 SNGETLEKI 3.000 7 70 NGQLVFSKL 3.000 8 81 GGFPYEKDL 3.000 9 18 EPGSGVRIV 1.500 10 65 FEIEINGQL 1.200 11 57 SRLGGTGAF 1.000 12 106 TNSRPPCVI 1.000 13 9 SVAPPPEEV 1.000 14 59 LGGTGAFEI 1.000 15 105 ITNSRPPCV 1.000 16 107 NSRPPCVIL 0.900 17 45 AVKEQYPGI 0.600 18 51 PGIEIESRL 0.600 19 88 DLIEAIRRA 0.600 20 100 ETLEKITNS 0.600
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_3901 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 33 CGFEaTYLEL 12.000 2 64 AFEIeINGQL 9.000 3 93 IRRAsNGETL 4.500 4 46 VKEQyPGIEI 3.000 5 16 EVEPgSGVRI 3.000 6 106 TNSRpPCVIL 3.000 7 69 INGQlVFSKL 3.000 8 31 EPCGfEATYL 3.000 9 44 SAVKeQYPGI 2.000 10 1 MSGEpGQTSV 2.000 11 8 TSVApPPEEV 2.000 12 37 ATYLeLASAV 2.000 13 80 NGGFpYEKDL 1.500 14 50 YPGIeIESRL 1.500 15 96 ASNGeTLEKI 1.500 16 58 RLGGtGAFEI 1.000 17 105 ITNSrPPCVI 1.000 18 81 GGFPyEKDLI 1.000 19 104 KITNsRPPCV 1.000 20 83 PPYEkDLIEA 0.600
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B40 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 65 FEIEINGQL 80.000 2 3 GEPGQTSVA 40.000 3 35 FEATYLELA 40.000 4 15 EEVEPGSGV 24.000 5 67 IEINGQLVF 16.000 6 81 GGFPYEKDL 8.000 7 27 VEYCEPCGF 8.000 8 47 KEQYPGIEI 6.000 9 17 VEPGSGVRI 4.000 10 30 CEPCGFEAT 4.000 11 99 GETLEKITN 2.400 12 90 IEAIRRASN 2.400 13 37 ATYLELASA 2.000 14 85 YEKDLIEAI 2.000 15 53 IEIESRLGG 1.600 16 40 LELASAVKE 0.800 17 107 NSRPPCVIL 0.750 18 29 YCEPCGFEA 0.500 19 70 NGQLVFSKL 0.500 20 78 LENGGFPYE 0.400
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B40 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 55 IESRlGGTGA 20.000 2 53 IEIEsRLGGT 16.000 3 65 FEIEiNGQLV 16.000 4 67 IEINgQLVFS 16.000 5 99 GETLeKITNS 8.000 6 35 FEATvLELAS 8.000 7 87 KDLIeAIRRA 5.000 8 17 VEPGsGVRIV 4.000 9 30 CEPCgFEATY 4.000 10 33 CGFEaTYLEL 2.000 11 15 EEVEpGSGVR 1.600 12 81 GGFPyEKDLI 1.600 13 27 VEYCePCGFE 1.200 14 83 FPYEkDLIEA 1.000 15 40 LELAsAVKEQ 0.800 16 3 GEPGqTSVAP 0.800 17 90 IEAIrRASNG 0.800 18 106 TNSRpPCVIL 0.750 19 8 TSVApPPEEV 0.600 20 2 SGEPgQTSVA 0.500
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5201 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 18 EPGSGVRIV 75.000 2 67 IEINGQLVF 22.500 3 59 LGGTGAFEI 11.250 4 98 NGETLEKIT 11.000 5 19 PGSGVRIVV 10.000 6 106 TNSRPPCVI 10.000 7 48 EQYPGIEIE 9.900 8 2 SGEPGQTSV 9.000 9 81 GGFPYEKDL 6.600 10 38 TYLELASAV 4.800 11 27 VEYCEPCGF 3.750 12 83 FPYEKDLIE 3.000 13 17 VEPGSGVRI 3.000 14 70 NGQLVFSKL 2.400 15 85 YEKDLIEAI 2.200 16 3 GEPGQTSVA 2.200 17 82 GFPYEKDLI 2.200 18 97 SNGETLEKI 2.178 19 61 GTGAPEIEI 1.800 20 105 ITNSRPPCV 1.500
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5201 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 18 EPGSgVRIVV 100.000 2 17 VEPGsGVRIV 45.000 3 81 GGFPyEKDLI 33.000 4 105 ITNSrPPCVI 15.000 5 37 ATYLeLASAV 12.000 6 66 EIEInGQLVF 9.000 7 33 CGFEaTYLEL 9.000 8 60 GGTGaFEIEI 7.500 9 2 SGEPgQTSVA 6.600 10 83 FPYEkDLIEA 3.300 11 1 MSGEpGQTSV 2.700 12 97 SNGEtLEKIT 2.640 13 65 FEIEiNGQLV 2.640 14 50 YPGIeIESRL 2.400 15 48 EQYPgIEIES 2.400 16 106 TNSRpPCVIL 2.000 17 96 ASNGeTLEKI 1.815 18 58 RLGGtGAFEI 1.500 19 8 TSVApPPEEV 1.320 20 59 LGGTgAFEIE 1.238
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B60 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 65 FEIEINGQL 387.200 2 17 VEPGSGVRT 17.600 3 15 EEVEPGSGV 16.000 4 47 KEPYPGIEI 16.000 5 85 YEKDLIEAI 8.800 6 107 NSRPPCVIL 8.000 7 35 PEATYLELA 8.000 8 70 NGQLVFSKL 4.840 9 3 GEPGQTSVA 4.000 10 81 GGFPYEKDL 4.000 11 30 CEPCGFEAT 4.000 12 67 IEINGQLVF 3.200 13 90 IEAIRRASN 2.400 14 99 GETLEKITN 2.400 15 40 LELASAVKE 1.760 16 53 IEIESRLGG 1.600 17 51 PGIEIESRL 0.968 18 55 IESRLGGTG 0.880 19 34 GFEATYLEL 0.800 20 94 RRASNGETL 0.800
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B60 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 65 FEIEiNGQLV 16.000 2 106 TNSRpPCVIL 16.000 3 53 IEIEsRLGGT 8.000 4 33 CGFEaTYLEL 8.000 5 17 VEPGsGVRIV 8.000 6 55 IESRlGGTGA 8.000 7 69 INGQlVFSKL 4.840 8 50 YPGIeIESRL 4.840 9 80 NGGFpYEKDL 4.000 10 31 EPCGfEATYL 4.000 11 35 FEATyLELAS 3.520 12 67 IEINgQLVFS 3.200 13 87 KDLIeAIRRA 1.100 14 78 LENGgFPYEK 0.800 15 15 EEVEpGSGVR 0.800 16 99 GETLeKITNS 0.800 17 30 CEPCgFEATY 0.800 18 90 IEAIrRASNG 0.800 19 3 GEPGgTSVAP 0.800 20 40 LELAsAVKEQ 0.800
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B61 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 15 EEVEPGSGV 80.000 2 35 FEATYLELA 40.000 3 3 GEPGQTSVA 22.000 4 65 FEIEINGQL 16.000 5 85 YEKDLIEAI 16.000 6 17 VEPGSGVRI 8.000 7 47 KEQYPGIEI 8.000 8 30 CEPCGFEAT 4.000 9 99 GETLEKITN 2.640 10 90 IEAIRRASN 2.400 11 27 VEYCEPCGF 1.600 12 67 IEINGQLVF 1.600 13 2 SGEPGQTSV 1.000 14 18 EPGSGVRIV 1.000 15 105 ITNSRPPCV 1.000 16 37 ATYLELASA 1.000 17 53 IEIESRLGG 0.800 18 40 LELASAVKE 0.800 19 81 GGFPYEKDL 0.660 20 29 YCEPCGFEA 0.500
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B61 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 65 FEIEiNGQLV 80.000 2 17 VEPGsGVRIV 40.000 3 55 IESRlGGTGA 20.000 4 87 KDLIeAIRRA 10.000 5 53 IEIEsRLGGT 8.000 6 14 PEEVePGSGV 4.000 7 99 GETLeKITNS 3.520 8 37 ATYLeLASAV 2.000 9 8 TSVApPPEEV 2.000 10 67 IEINgQLVFS 1.600 11 35 FEATyLELAS 1.600 12 1 MSGEPGQTSV 1.000 13 18 EPGSgVRIVV 1.000 14 36 EATYlEIASA 1.000 15 83 PPYEkDLIEA 1.000 16 15 EEVEpGSGVR 0.800 17 27 VEYCePCGFE 0.800 18 30 CEPCgFEATY 0.800 19 90 IEAIrRASNG 0.800 20 40 LELAsAVKEQ 0.800
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B62 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 77 KLENGGFPY 24.000 2 21 SGVRIVVEY 4.800 3 75 FSKLENGGF 3.000 4 31 EPCGFEATY 2.640 5 88 DLIEAIRRA 2.200 6 42 LASAVKEQY 2.000 7 48 EQYPGIEIE 0.960 8 71 GQLVFSKLE 0.800 9 6 GQTSVAPPP 0.800 10 67 IEINGQLVF 0.686 11 22 GVRIVVEYC 0.660 12 58 RLGGTGAFE 0.480 13 57 SRLGGTGAF 0.480 14 18 EPGSGVRIV 0.400 15 59 LGGTGAFEI 0.400 16 56 ESRLGGTGA 0.360 17 45 AVKEQYPGI 0.330 18 104 KITNSRPPC 0.250 19 72 QLVFSKLEN 0.240 20 61 GTGAFEIEI 0.240
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B62 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 41 ELASaVKEQY 40.000 2 58 RLGGtGAFEI 9.600 3 66 EIEInGQLVF 7.920 4 56 ESELgGTGAF 6.000 5 20 GSGVrIVVEY 4.800 6 92 AIRRaSNGET 1.500 7 48 EQYPgIEIES 1.152 8 26 VVEYcEPCGF 0.600 9 24 RIVVeYCEPC 0.500 10 104 KITNsRPPCV 0.500 11 71 GQLVfSKLEN 0.480 12 76 SKLEnGGFPY 0.440 13 88 DLIEaIRRAS 0.440 14 6 GQTSvAPPPE 0.400 15 1 MSGEpGQTSV 0.264 16 18 EPGSgVRIVV 0.264 17 69 INGQlVFSKL 0.260 18 21 SGVRiVVEYC 0.220 19 30 CEPCgFEATY 0.220 20 74 VFSKlENGGF 0.200
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B7 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 107 NSRPPCVIL 60.000 2 45 AVKEQYPGI 6.000 3 22 GVRIVVEYC 5.000 4 70 NGQLVFSKL 4.000 5 81 GGFPYEKDL 4.000 6 18 EPGSGVRIV 4.000 7 9 SVAPPPEEV 1.500 8 56 ESRLGGTGA 1.000 9 106 TNSRPPCVI 0.600 10 11 APPPEEVEP 0.600 11 25 IVVEYCEPC 0.500 12 65 FEIEINGQL 0.400 13 61 GTGAFEIEI 0.400 14 31 EPCGFEATY 0.400 15 94 RRASNGETL 0.400 16 59 LGGTGAFEI 0.400 17 51 PGIEIESRL 0.400 18 32 PCGFEATYL 0.400 19 97 SNGETLEKI 0.400 20 92 AIRRASNGE 0.300
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B7 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 50 YPGIeIESRL 80.000 2 31 EPCGfEATYL 80.000 3 18 EPGSgVRIVV 6.000 4 106 TNSRpPCVIL 6.000 5 80 NGGFpYEKDL 4.000 6 69 INGQlVFSKL 4.000 7 93 IRRAsNGETL 4.000 8 33 CGFEaTYLEL 4.000 9 92 AIRRaSNGET 3.000 10 83 FPYEkDLIEA 2.000 11 44 SAVKeQYPGI 1.200 12 96 ASNGeTLEKI 1.200 13 11 APPPeEVEPG 0.600 14 16 EVEPgSGVRI 0.600 15 37 ATYLeLASAV 0.600 16 105 ITNSrPPCVI 0.600 17 22 GVRIvVEYCE 0.500 18 60 GGTGaFEIEI 0.400 19 81 GGFPyEKDLI 0.400 20 58 RLGGtGAFEI 0.400
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B8 选择的记分亚序列长度 8 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 108 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 83 FPYEKDLI 6.000 2 107 NSRPPCVI 1.000 3 91 EAIRRASN 0.800 4 20 GSGVRIVV 0.600 5 18 EPGSGVRI 0.400 6 95 RASNGETL 0.400 7 100 ETLEKITN 0.300 8 105 ITNSRPPC 0.200 9 10 VAPPPEEV 0.120 10 73 LVFSKLEN 0.100 11 43 ASAVKEQY 0.100 12 22 GVRIVVEY 0.100 13 36 EATYLELA 0.080 14 31 EPCGFEAT 0.080 15 66 EIEINGQL 0.080 16 4 EPGQTSVA 0.080 17 33 CGFEATYL 0.060 18 71 GQLVFSKL 0.060 19 56 ESRLGGTG 0.040 20 106 TNSRPPCV 0.030
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B8 选择的记分亚序列长度 8 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 108 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 83 FPYEKDLI 6.000 2 107 NSRPPCVI 1.000 3 91 EAIRRASN 0.800 4 20 GSGVRIVV 0.600 5 18 EPGSGVRI 0.400 6 95 RASNGETL 0.400 7 100 ETLEKITN 0.300 8 105 ITNSRPPC 0.200 9 10 VAPPPEEV 0.120 10 73 LVFSKLEN 0.100 11 43 ASAVKEQY 0.100 12 22 GVRIVVEY 0.100 13 36 EATYLELA 0.080 14 31 EPCGPEAT 0.080 15 66 EIEINGQL 0.080 16 4 EPGQTSVA 0.080 17 33 CGFEATYL 0.060 18 71 GQLVFSKL 0.060 19 56 ESRLGGTG 0.040 20 106 TNSRPPCV 0.030
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 Cw_0702 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 20 GSGVrIVVEY 38.400 2 30 CEPCgFEATY 16.000 3 41 ELASaVKEQY 16.000 4 50 YPGIeIESRL 7.920 5 76 SKLEnGGFPY 4.000 6 69 INGQlVFSKL 2.880 7 18 EPGSgVRIVV 2.400 8 33 CGFEaTYLEL 1.440 9 80 NGGFpYEKDL 1.440 10 56 ESRLgGTGAF 1.200 11 93 IRRAsNGETL 1.200 12 64 AFEIeINGQL 1.200 13 66 EIEInGQLVF 1.000 14 35 PEATyLELAS 0.960 15 87 KDLIeAIRRA 0.800 16 97 SNGEtLEKIT 0.800 17 17 VEPGsGVRIV 0.800 18 21 SGVRiVVEYC 0.800 19 28 EYCEpCGFEA 0.720 20 48 EQYPgIEIES 0.672
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B8 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 50 YPGIeIESRL 0.800 2 93 IRRAsNGETL 0.400 3 31 EPCGfEATYL 0.320 4 104 KITNsRPPCV 0.300 5 18 EPGSgVRIVV 0.240 6 56 ESRLgGTGAF 0.200 7 44 SAVKeQYPGI 0.200 8 92 AIRRaSNGET 0.200 9 69 INGQlVFSKL 0.200 10 106 TNSRpPCVIL 0.200 11 42 LASAvKEQYP 0.160 12 33 CGFEaTYLEL 0.060 13 105 ITNSrPPCVI 0.050 14 58 RLGGtGAFEI 0.050 15 96 ASNGeTLEKI 0.050 16 1 MSGEpGQTSV 0.045 17 75 FSKLeNGGFP 0.040 18 80 NGGFpYEKDL 0.040 19 72 QLVFsKLENG 0.040 20 53 IEIEsRLGGT 0.030
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_2702 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 57 SRLGGTGAF 200.000 2 94 RRASNGETL 180.000 3 93 IRRASNGET 20.000 4 27 VEYCEPCGF 15.000 5 77 KLENGGFPY 9.000 6 67 IEINGQLVF 3.000 7 47 KEQYPGIEI 2.700 8 23 VRIVVEYCE 2.000 9 42 LASAVKEQY 1.000 10 75 FSKLENGGF 1.000 11 85 YEKDLIEAI 0.900 12 17 VEPGSGVRI 0.900 13 65 FEIEINGQL 0.900 14 97 SNGETLEKI 0.600 15 106 TNSRPPCVI 0.600 16 37 ATYLELASA 0.500 17 21 SGVRIVVEY 0.500 18 107 NSRPPCVIL 0.300 19 30 CEPCGFEAT 0.300 20 48 EQYPGIEIE 0.300
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_2702 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 93 IRRAsNGETL 60.000 2 94 RRASnGETLE 6.000 3 30 CEPCgFEATY 3.000 4 58 RLGGtGAFEI 2.700 5 23 VRIVvEYCEP 2.000 6 57 SRLGgTGAFE 2.000 7 48 EQYPgIEIES 1.500 8 26 VVEYcEPCGF 1.000 9 20 GSGVrIVVEY 1.000 10 71 GQLVfSKLEN 1.000 11 41 ELASaVKEQY 0.900 12 33 CGFEaTYLEL 0.750 13 81 GGFPyEKDLI 0.750 14 106 TNSRpPCVIL 0.600 15 69 INGQlVFSKL 0.600 16 83 FPYEkDLIEA 0.500 17 37 ATYLeLASAV 0.500 18 55 IESRlGGTGA 0.300 19 96 ASNGeTLEKI 0.300 20 56 ESRLgGTGAF 0.300
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_3701 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 65 FEIEiNGQLV 10.000 2 67 IEINgQLVFS 5.000 3 81 GGFPyEKDLI 5.000 4 87 KDLIeAIRRA 4.000 5 30 CEPCgFEATY 2.000 6 17 VEPGsGVRIV 2.000 7 50 YPGIeIESRL 1.500 8 64 AFEIeINGQL 1.500 9 69 INGQlVESKL 1.500 10 99 GETLeKITNS 1.000 11 60 GGTGaFEIEI 1.000 12 46 VKEQyPGIEI 1.000 13 53 IEIEsRLGGT 1.000 14 16 EVEPgSGVRI 1.000 15 44 SAVKeQYPGI 1.000 16 105 ITNSrPPCVI 1.000 17 96 ASNGeTLEKI 1.000 18 80 NGGFpYEKDL 1.000 19 55 IESRlGGTGA 1.000 20 31 EPCGfEATYL 1.000
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型B_3801选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 134GFEATYLEL6.000 270NGQLVFSKL1.560 338TYLELASAV1.040 481GGFPYEKDL1.000 597SNGETLEKI0.720 666EIEINGQLV0.600 72SGEPGQTSV0.600 882GFPYEKDLI0.600 949QYPGIEIES0.520 1018EPGSGVRIV0.400 1131EPCGFEATY0.400 1289LIEAIRRAS0.390 1398NGETLEKIT0.390 1477KLENGGFPY0.300 1561GTGAFEIEI0.300 16107NSRPPCVIL0.300 1775FSELENGGF0.300 18106TNSRPPCVI0.300 1929YCEPCGFEA0.300 2054EIESRLGGT0.300
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_3801 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 64 AFEIeINGQL 7.800 2 31 EPCGfEATYL 4.800 3 66 EIEInGQLVF 3.000 4 26 VVEYcEPCGF 3.000 5 50 YPGIeIESRL 2.600 6 74 VFSKlENGGF 2.000 7 33 CGFEaTYLEL 2.000 8 69 INGQlVFSKL 1.560 9 106 TNSRpPCVIL 1.000 10 80 NGGPpYEKDL 1.000 11 16 EVEPgSGVRI 0.900 12 96 ASNGeTLEKI 0.720 13 34 GFEAtYLELA 0.600 14 60 GGTGaFEIEI 0.600 15 58 RLGGtGAFEI 0.600 16 18 EPGSgVRIVV 0.520 17 83 FPYEkDLIEA 0.400 18 28 EYCEpCGFEA 0.400 19 1 MSGEpGQTSV 0.400 20 2 SGEPgQTSVA 0.300
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_3902 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 70 NGQLVFSKL 2.400 2 81 GGFPYEKDL 2.400 3 94 RRASNGETL 2.000 4 34 GFEATYLEL 2.000 5 107 NSRPPCVIL 0.600 6 57 SRLGGTGAF 0.500 7 65 PEIEINGQL 0.480 8 51 PGIEIESRL 0.240 9 32 PCGFEATYL 0.200 10 75 FSKLENGGF 0.150 11 86 EKDLIEAIR 0.120 12 6 GQTSVAPPP 0.120 13 71 GQLVFSKLE 0.120 14 46 VKEQYPGIE 0.120 15 89 LIEAIRRAS 0.120 16 21 SGVRIVVEY 0.120 17 98 NGETLEKIT 0.120 18 36 EATYLELAS 0.120 19 38 TYLELASAV 0.120 20 31 EPCGFEATY 0.120
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_3902 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 70 NGQLVFSKL 2.400 2 81 GGFPYEKDL 2.400 3 94 RRASNGETL 2.000 4 34 GFEATYLEL 2.000 5 107 NSRPPCVIL 0.600 6 57 SRLGGTGAF 0.500 7 65 FEIEINGQL 0.480 8 51 PGIEIESRL 0.240 9 32 PCGFEATYL 0.200 10 75 FSKLENGGF 0.150 11 86 EKDLIEAIR 0.120 12 6 GQTSVAPPP 0.120 13 71 GQLVFSKLE 0.120 14 46 VKEQYPGIE 0.120 15 89 LIEAIRRAS 0.120 16 21 SGVRIVVEY 0.120 17 98 NGETLEKIT 0.120 18 36 EATYLELAS 0.120 19 38 TYLELASAV 0.120 20 31 EPCGFEATY 0.120
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_3902 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 2 64 AFEIeINGQL 2.400 3 50 YPGIeIESRL 2.400 4 80 NGGFpYEKDL 2.400 5 106 TNSRpPCVIL 2.000 6 31 EPCGfEATYL 2.000 7 33 CGFEaTYLEL 2.000 8 48 EQYPgIEIES 1.200 9 76 SKLEnGGFPY 1.000 10 71 GQLVfSKLEN 1.000 11 46 VKEQyPGIEI 1.000 12 103 EKITnSRPPC 1.000 13 93 IRRAsNGETL 0.600 14 66 EIEInGQLVF 0.500 15 26 VVEYcEPCGF 0.500 16 74 VFSKlENGGF 0.500 17 56 ESRLgGTGAF 0.150 18 24 RIVVeYCEPC 0.120 19 34 GFEAtYLELA 0.120 20 60 GGTGaFEIEI 0.120
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_4403 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 67 IEINGQLVF 200.000 2 27 VEYCEPCGF 40.000 3 21 SGVRIVVEY 36.000 4 65 FEIEINGQL 20.000 5 35 FEATYLELA 12.000 6 3 GEPGQTSVA 9.000 7 15 EEVEPGSGV 8.000 8 17 VEPGSGVRI 6.000 9 42 LASAVKEQY 4.500 10 31 EPCGFEATY 4.500 11 85 YEKDLIEAI 4.000 12 30 CEPCGFEAT 4.000 13 47 KEQYPGIEI 4.000 14 90 IEAIRRASN 3.600 15 53 IEIESRLGG 2.000 16 40 LELASAVKE 1.800 17 99 GETLEKITN 1.200 18 75 FSKLENGGF 1.000 19 57 SRLGGTGAF 0.900 20 78 LENGGFPYE 0.600
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_4403 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 30 CEPCgFEATY 120.000 2 53 IEIEsRLGGT 30.000 3 67 IEINgQLVFS 30.000 4 65 FEIEiNGQLV 20.000 5 17 VEPGsGVRIV 18.000 6 20 GSGVrIVVEY 9.000 7 99 GETLeKITNS 9.000 8 35 FEATyLELAS 8.000 9 55 IESRlGGTGA 6.000 10 40 LELAsAVKEQ 5.400 11 87 KDLIeAIRRA 2.250 12 76 SKLEnGGFPY 1.800 13 90 IEAIrRASNG 1.800 14 21 SGVRiVVEYC 1.800 15 56 ESRLgGTGAF 1.500 16 41 ELASaVKEQY 0.900 17 15 EEVEpGSGVR 0.800 18 96 ASNGeTLEKI 0.675 19 3 GEPGqTSVAP 0.600 20 78 LENGgFPYEK 0.600
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5101 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 18 EPGSGVRIV 484.000 2 59 LGGTGAFEI 114.400 3 2 SGEPGQTSV 48.400 4 81 GGFPYEKDL 44.000 5 70 NGQLVFSKL 22.000 6 31 EPCGFEATY 7.260 7 97 SNGETLEKI 5.856 8 36 EATYLELAS 5.000 9 19 PGSGVRIVV 4.840 10 66 EIEINGQLV 4.840 11 45 AVKEQYPGI 4.400 12 82 GFPYEKDLI 4.400 13 61 GTGAFEIEI 4.000 14 106 TNSRPPCVI 4.000 15 83 FPYEKDLIE 2.860 16 105 ITNSRPPCV 2.600 17 42 LASAVKEQY 2.595 18 51 PGIEIESRL 2.420 19 4 EPGQTSVAP 2.200 20 9 SVAPPPEEV 2.200
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5101 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 18 EPGSgVRIVV 440.000 2 44 SAVKeQYPGI 220.000 3 31 EPCGfEATYL 220.000 4 81 GGFPyEKDLI 176.000 5 50 YPGIeIESRL 157.300 6 60 GGTGaFEIEI 88.000 7 33 CGFEaTYLEL 48.400 8 83 FPYEkDLIEA 31.460 9 80 NGGFpYEKDL 22.000 10 36 EATYlELASA 11.000 11 16 EVEPgSGVRI 8.800 12 96 ASNGeTLEKI 5.856 13 105 ITNSrPPCVI 5.200 14 37 ATYLeLASAV 4.000 15 1 MSGEpGQTSV 3.461 16 21 SGVRiVVEYC 2.420 17 58 RLGGtGAFEI 2.420 18 4 EPGQtSVAPP 2.200 19 8 TSVApPPEEV 2.200 20 2 SGEPgQTSVA 2.000
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5102 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 18 EPGSGVRIV 242.000 2 81 GGFPYEKDL 110.000 3 59 LGGTGAFEI 96.800 4 70 NGQLVFSKL 48.400 5 2 SGEPGQTSV 24.200 6 51 PGIEIESRL 13.200 7 83 FPYEKDLIE 11.000 8 97 SNGETLEKI 10.648 9 38 TYLELASAV 6.600 10 19 PGSGVRIVV 4.840 11 106 TNSRPPCVI 4.400 12 61 GTGAFEIEI 4.000 13 82 GFPYEKDLI 4.000 14 31 EPCGFEATY 3.630 15 63 GAFEIEING 2.750 16 36 EATYLELAS 2.500 17 50 YPGIEIESR 2.420 18 45 AVKEQYPGI 2.420 19 9 SVAPPPEEV 2.200 20 105 ITNSRPPCV 2.000
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5102 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 44 SAVKeQYPGI 726.000 2 50 YPGIeIESRL 400.000 3 81 GGFPyEKDLI 400.000 4 18 EPGSgVRIVV 220.000 5 31 EPCGfEATYL 121.000 6 33 CGFEaTYLEL 121.000 7 83 FPYEkDLIEA 110.000 8 60 GGTGaFEIEI 88.000 9 80 NGGFpYEKDL 22.000 10 37 ATYLeLASAV 11.000 11 96 ASNGeTLEKI 10.648 12 21 SGVRiVVEYC 8.785 13 8 TSVApPPEEV 6.600 14 36 EATYlELASA 5.000 15 58 RLGGtGAFEI 4.840 16 16 EVEPgSGVRI 4.000 17 105 ITNSrPPCVI 4.000 18 65 FEIEiNGQLV 3.194 19 63 GAFEiEINGQ 3.025 20 1 MSGEpGQTSV 2.662
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5103 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 44 SAVKeQYPGI 110.000 2 81 GGFPyEKDLI 52.800 3 18 EPGSgVRIVV 44.000 4 60 GGTGaPEIEI 44.000 5 33 CGFEaTYLEL 7.920 6 37 ATYLeLASAV 6.600 7 31 EPCGfEATYL 6.600 8 83 FPYEkDLIEA 6.600 9 80 NGGFpYEKDL 6.000 10 50 YPGIeIESRL 6.000 11 36 EATYlELASA 5.000 12 21 SGVRiVVEYC 2.420 13 2 SGEPgQTSVA 2.420 14 1 MSGEpGQTSV 2.420 15 104 KITNsRPPCV 2.420 16 58 RLGGtGAFEI 2.420 17 96 ASNGeTLEKI 2.200 18 8 TSVApPPEEV 2.200 19 16 EVEPgSGVRI 2.200 20 105 ITNSrPPCVI 2.000
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5103 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 44 SAVKeQYPGI 110.000 2 81 GGFPyEKDLI 52.800 3 18 EPGSgVRIVV 44.000 4 60 GGTGaFEIEI 44.000 5 33 CGFEaTYLEL 7.920 6 37 ATYLeLASAV 6.600 7 31 EPCGfEATYL 6.600 8 83 FPYEkDLIEA 6.600 9 80 NGGFpYEKDL 6.000 10 50 YPGIeIESRL 6.000 11 36 EATYlELASA 5.000 12 21 SGVRjVVEYC 2.420 13 2 SGEPgQTSVA 2.420 14 1 MSGEpGQTSV 2.420 15 104 KITNsRPPCV 2.420 16 58 RLGGtGAFEI 2.420 17 96 ASNGeTLEKI 2.200 18 8 TSVApPPEEV 2.200 19 16 EVEPgSGVRI 2.200 20 105 ITNSrPPCVI 2.000
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5801 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 175FSKLENGGF40.000 242LASAVKEQY4.500 3107NSRPPCVIL4.000 461GTGAFEIEI3.000 5105ITNSRPPCV3.000 637ATYLELASA2.400 71MSGEPGQTS0.880 867IEINGQLVF0.660 956ESRLGGTGA0.600 1021SGVRIVVEY0.540 1127VEYCEPCSF0.400 1263GAFEIEING0.330 13100ETLEKITNS0.317 1495RASNGETLE0.300 1520GSGVEIVVE0.240 1696ASNGETLEK0.220 1744SAVKEQYPG0.220 182SGEPGQTSV0.200 1910VAPPPEEVE0.200 2057SRLGGTGAF0.200
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 B_5801 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 56 ESRLgGTGAF 12.000 2 20 GSGVrIVVEY 10.800 3 1 MSGEpGQTSV 4.000 4 105 ITNSrPPCVI 3.000 5 37 ATYLeLASAV 3.000 6 96 ASNGeTLEKI 2.640 7 44 SAVKeQYPGI 2.000 8 8 TSVApPPEEV 2.000 9 74 VFSKlENGGF 0.800 10 61 GTGAfEIEIN 0.480 11 26 VVEYcEPCGF 0.400 12 36 EATYlELASA 0.360 13 95 RASNgETLEK 0.330 14 63 GAFEiEINGQ 0.264 15 83 FPYEkDLIEA 0.240 16 29 YCEPcGFEAT 0.240 17 33 CGFEaTYLEL 0.220 18 43 ASAVkEQYPG 0.220 19 75 FSKLeNGGPP 0.200 20 7 QTSVaPPPEE 0.200
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 Cw_0301 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 65 FEIEINGQL 30.000 2 81 GGFPYEKDL 18.000 3 70 NGQLVFSKL 12.000 4 57 SRLGGTGAF 10.000 5 34 GFEATYLEL 10.000 6 94 RRASNGETL 5.760 7 27 VEYCEPCGF 5.000 8 67 IEINGQLVF 5.000 9 107 NSRPPCVIL 2.000 10 51 PGIEIESRL 1.800 11 15 EEVEPGSGV 1.800 12 38 TYLELASAV 1.800 13 21 SGVRIVVEY 1.500 14 25 IVVEYCEPC 1.500 15 88 DLIEAIRRA 1.500 16 37 ATYLELASA 1.000 17 45 AVKEQYPGI 0.750 18 97 SNGETLEKI 0.750 19 106 TNSRPPCVI 0.750 20 29 YCEPCGFEA 0.500
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 Cw_0301 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 44 SAVKeQYPGI 50.000 2 33 CGFEaTYLEL 45.000 3 69 INGQlVFSKL 12.000 4 81 GGFPyEKDLI 3.750 5 106 TNSRpPCVIL 3.000 6 29 YCEPcGFEAT 2.500 7 16 EVEPgSGVRI 2.500 8 65 FEIEiNGQLV 2.160 9 31 EPCGfEATYL 2.000 10 64 AFEIeINGQL 2.000 11 53 IEIEsRLGGT 1.500 12 83 FPYEkDLIEA 1.500 13 76 SKLEnGGFPY 1.500 14 21 SGVRiVVEYC 1.500 15 37 ATYLeLASAV 1.200 16 80 NGGFpYEKDL 1.200 17 50 YPGIeIESRL 1.200 18 93 IRRAsNGETL 1.152 19 23 VRIVvEYCEP 1.000 20 8 TSVApPPEEV 1.000
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 Cw-0401 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 34 GFEATYLEL 240.000 2 38 TYLELASAV 30.000 3 82 GFPYEKDLI 25.000 4 18 EPGSGVRIV 20.000 5 31 EPCGFEATY 12.000 6 81 GGFPYEKDL 4.800 7 107 NSRPPCVIL 4.800 8 70 NGQLVFSKL 4.400 9 75 FSKLENGGF 2.000 10 97 SNGETLEKI 1.584 11 64 AFEIEINGQ 1.000 12 84 PYEKDLIEA 1.000 13 49 QYPGIEIES 1.000 14 21 SGVRIVVEY 1.000 15 2 SGEPGQTSV 0.660 16 28 EYCEPCGFE 0.600 17 45 AVKEQYPGI 0.600 18 9 SVAPPPEEV 0.600 19 105 ITNSRPPCV 0.550 20 77 KLENGGFPY 0.500
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 Cw_0401 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 64 AFEIeINGQL 200.000 2 74 VFSKlENGGF 100.000 3 50 YPGIeIESRL 80.000 4 31 EPCGfEATYL 80.000 5 18 EPGSgVRIVV 10.000 6 34 GFEAtYLELA 10.000 7 28 EYCEpCGFEA 6.000 8 33 CGFEaTYLEL 5.760 9 84 PYEKdLIEAI 5.000 10 83 FPYEkDLIEA 4.800 11 69 INGQlVFSKL 4.400 12 80 NGGFpYEKDL 4.000 13 106 TNSRpPCVIL 4.000 14 56 ESRLgGTGAF 2.000 15 66 EIEInGQLVF 2.000 16 26 VVEYcEPCGF 2.000 17 96 ASNGeTLEKI 1.320 18 49 QYPGiEIESR 1.100 19 20 GSGVrIVVEY 1.000 20 38 TYLElASAVK 0.792
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 Cw_0602 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 85 YEKDLIEAI 6.600 2 65 FEIEINGQL 6.600 3 21 SGVRIVVEY 6.000 4 31 EPCGFEATY 3.300 5 61 GTGAFEIEI 3.000 6 38 TYLELASAV 3.000 7 18 EPGSGVRIV 2.420 8 81 GGFPYEKDL 2.200 9 94 RRASNGETL 2.200 10 97 SNGETLEKI 2.000 11 70 NGQLVFSKL 2.000 12 34 GFEATYLEL 2.000 13 107 NSRPPCVIL 2.000 14 105 ITNSRPPCV 1.100 15 47 KEQYPGIEI 1.100 16 66 EIEINGQLV 1.100 17 42 LASAVKEQY 1.100 18 77 KLENGGFPY 1.100 19 15 EEVEPGSGV 1.000 20 45 AVKEQYPGI 1.000
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 Cw_0702 选择的记分亚序列长度 9 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 107 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 31 EPCGFEATY 24.000 2 21 SGVRIVVEY 19.200 3 42 LASAVKEQY 8.800 4 77 KLENGGFPY 4.000 5 49 QYPGIEIES 2.880 6 57 SRLGGTGAF 2.400 7 18 EPGSGVRIV 2.400 8 94 RRASNGETL 2.400 9 85 YEKDLIEAI 1.478 10 34 GFEATYLEL 1.440 11 38 TYLELASAV 1.440 12 70 NGQLVPSKL 1.440 13 65 FEIEINGQL 1.200 14 81 GGFPYEKDL 1.008 15 67 IEINGQLVF 1.000 16 97 SNGETLEKI 0.960 17 61 GTGAFEIEI 0.960 18 107 NSRPPCVIL 0.840 19 22 GVRIVVEYC 0.800 20 35 FEATYLELA 0.800
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
HLA肽基序检索结果 用户参数和记分信息 为限制结果数而选择的方法 确切数字 要求的结果数 20 选择的HLA分子类型 Cw_0702 选择的记分亚序列长度 10 选择的输入序列回复方式 Y 回复方式 编号行 用户输入的肽序列长度 115 计算的亚序列分值数 106 分值输出表中回报的最高分值亚序列数 20 记分结果 排位 起始位点 亚序列残基列表 分值(包含亚序列的分子估计的分解半衰期) 1 20 GSGVrIVVEY 38.400 2 30 CEPCgFEATY 16.000 3 41 ELASaVKEQY 16.000 4 50 YPGIeIESRL 7.920 5 76 SKLEnGGFFY 4.000 6 69 INGQlVFSKL 2.880 7 18 EPGSgVRIVV 2.400 8 33 CGFEaTYLEL 1.440 9 80 NGGFpYEKDL 1.440 10 56 ESRLgGTGAF 1.200 11 93 IRRAsNGETL 1.200 12 64 AFEIeINGQL 1.200 13 66 EIEInGQLVF 1.000 14 35 FEATyLELAS 0.960 15 87 KDLIeAIRRA 0.800 16 97 SNGEtLEKIT 0.800 17 17 VEPGsGVRIV 0.800 18 21 SGVRiVVEYC 0.800 19 28 EYCEpCGFEA 0.720 20 48 EQYPgIEIES 0.672
响应的用户肽序列
(长度＝115个残基)
表3
HLA肽基序检索结果
重要提示Tepitope设计为按Ala评价Cys残基，由于合成和分析的限制，不可能系统地测试包含Cys的肽。所以，只要预测序列包含Cys残基，我们建议您用Ala残基代替Cys进行合成。
文件名称C35
预测参数
定量阈值[％]3
抑制阈值[变化倍数的对数]-1
抑制残基[数]1
0--------30----
DRB1*0101 SGVRIVVEYCEPCGF
DRB1*0301 SGVRIVVEYCEPCGF
DRB1*0401 SGVRIVVEYCEPCGF
DRB1*0701 SGVRIVVEYCEPCGF
DRB1*0801 SGVRIVVEYCEPCGF
DRB1*1101 SGVRIVVEYCEPCGF
DRB1*1501 SGVRIVVEYCEPCGF
DRB5*0101 SGVRIVVEYGEPCGF
(包含一个抑制残基的B5*0101的结合框架-100倍)
定量分析 ′SGVRIVVEYCEPCGF′
阈值(％) 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01
DRB1*0101 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....
DRB1*0102 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....
DRB1*0301 xxxxxxxxxxxxxxxxxxx...................
DRB1*0401 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
DRB1*0402 xx....................................
DRB1*0404 xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*0405 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0410 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx........
DRB1*0421 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....
DRB1*0701 xxxxxxxxxx............................
DRB1*0801 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0802 xxxxxx................................
DRB1*0804 xxxxxxxxxxxxxxx.......................
DRB1*0806 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx.........
DRB1*1101 xxxxxxxxxx............................
DRB1*1104 xxxxxxxxxx............................
DRB1*1106 xxxxxxxxxx............................
DRB1*1107 xxxxxxxxxxxxxxxxxxx...................
DRB1*1305 xxxxxxxxxxxxxxxxxxx...................
DRB1*1307 xxxxxxxxxx............................
DRB1*1311 xxxxxxxxxx............................
DRR1*1321 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx.........
DRB1*1501 xxxxxxxxxx............................
DRB1*1502 xxxxxxxxxx............................
DRB5*0101 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx.........
文件名称C35
预测参数
定量阈值[％]3
抑制阈值[变化倍数的对数]-1
抑制残基[数]1
---60--------70----
DRB1*0101 SRLGGTGAFEIEINGQLVF
DRB1*0301 SRLGGTGAFEIEINGQLVF
DRB1*0401 SRLGGTGAFEIEINGQLVF
DRB1*0701 SRLGGTGAFEIEINGQLVF
DRB1*0801 SRLGGTGAFEIEINGQLVF
DRB1*1101 SRLGGTGAFEIEINGQLVF
DRB1*1501 SRLGGTGAFEIEINGQLVF
DRB5*0101 SRLGGTGAFEIEINGQLVF
(包含两个抑制残基的*0401的结合框架-10倍)
定量分析 ′SRLGGTGAFEIEINGQLVF′
阈值(％) 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01
DRB1*0101xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*0102xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0301xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*0401xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....
DRB1*0402xxxxxxxxxx............................
DRB1*0404......................................
DRB1*0405xxxxxxxxxx............................
DRB1*0410xx....................................
DRB1*0421xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....
DRB1*0701xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
DRB1*0801......................................
DRB1*0802......................................
DRB1*0804xxxxxx................................
DRB1*0806xxxxxx................................
DRB1*1101xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*1104xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*1106xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*1107xx....................................
DRB1*1305xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx........
DRB1*1307xx....................................
DRB1*1311xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*1321xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*1501xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*1502xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB5*0101xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx........
文件名称C35
预测参数
定量阈值[％]3
抑制阈值[变化倍数的对数]-1
抑制残基[数]1
-------70--------80--
DRB1*0101GAFEIEINGQLVFSKLENGGF
DRB1*0301GAFEIEINGQIVFSKLENGGF
DRB1*0401GAFEIEINGQLVFSKLENGGF
DRB1*0701GAFEIEINGQLVFSKLENGGF
DRB1*0801GAFEIEINGQLVFSKLENGGF
DRB1*1101GAFEIEINGQLVFSKLENGGF
DRB1*1501GAFEIEINGQLVFSKLENGGF
DRB5*0101GAFEIEINGQLVFSKLENGGF
(包含两个抑制残基的*0401的结合框架-10倍)
定量分析 ′GAFEIEINGQLVFSKLENGGF′
阈值(％) 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01
DRB1*0101xxxxxxxxxxxxxxxxxx......................
DRB1*0102xxxxxxxxxxxxxx..........................
DRB1*0301xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....
DRB1*0401xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....
DRB1*0402xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0404xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0405xxxxxxxxxx..............................
DRB1*0410xxxxxx..................................
DRB1*0421xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....
DRB1*0701xxxxxxxxxxxxxxxxxx......................
DRB1*0801........................................
DRB1*0802........................................
DRB1*0804xxxxxx..................................
DRB1*0806xxxxxx..................................
DRB1*1101xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx..................
DRB1*1104xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx..............
DRB1*1106xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx..............
DRB1*1107xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....
DRB1*1305xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx........
DRB1*1307xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*1311xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*1321xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*1501xxxxxxxxxxxxxxxx........................
DRB1*1502xxxxxxxxxxxxxxxx........................
DRB5*0101xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
文件名称C35
预测参数
定量阈值[％]5
抑制阈值[变化倍数的对数]-1
抑制残基[数]1
-------90--------100-
DRB1*0101 FPYEKDLIEAIRRASNGETLE
DRB1*0301 FPYEKDLIEAIRRASNGETLE
DRB1*0401 FPYEKDLIEAIRRASNGETLE
DRB1*0701 FPYEKDLIEAIRRASNGETLE
DRB1*0801 FPYEKDLIEAIRRASNGETLE
DRB1*1101 FPYEKDLIEAIRRASNGETLE
DRB1*1501 FPYEKDLIEAIRRASNGETLE
DRB5*0101 FPYEKDLIEAIRRASNGETLE
定量分析′FPYEKDLIEAIRRASNGETLE’
阈值(％) 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01
DRB1*0101xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*0102xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0301xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*0401xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0402xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*0404xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0405xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0410xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx........
DRB1*0421xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............
DRB1*0701xxxxxxxxxx............................
DRB1*0801xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*0802xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*0804xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*0806xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*1101xxxxxxxxxx............................
DRB1*1104xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*1106xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*1107xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*1305xxxxxx................................
DRR1*1307xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*1311xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................
DRB1*1321xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................
DRB1*1501xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx........
DRB1*1502xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx........
DRB5*0101xxxxxxxxxxxxxx........................
改变的肽配基
利用特异性人T细胞系鉴定C35的MHC I类抗原免疫显性表位，是其成功用于癌症疫苗的关键。包含在MHC结合残基处氨基酸置换的修饰的C35肽，有可能用于增强免疫功能。上述改变的肽配基或不规则肽甚至在低于原始肽100倍的浓度下，也可成为强的T细胞激动剂(Dressel，A.等，″Autoantigen recognition by human CD8T Cell clonesenhanced agonist response induced by alteredpeptideligand，″J.Immunol.1594943-51(1997)。这些改变的肽配基可以具有两种形式增强T细胞受体与肽的接触(必须由实验确定)的修饰以及通过改进锚定残基增强HLA对肽的结合的修饰。表4详细说明了通过引入有利的锚定残基或置换有害残基而增强HLA I类结合的修饰。
表4
增强HLA I类结合的修饰
(除非另有陈述，实例适用于9个氨基酸的肽；对于10聚体，忽略位置5的氨基酸，评价其余的9聚体(http//bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/hla_coefficient viewing_page)。下列修饰是根据现有数据库中的当时数据例举的，决不是包括了与全部潜在HLA分子结合的所有可能的肽改变，无论迄今其是否已知。)
HLA A*0101
任何一种改变的肽，其2位为S或T
任何一种改变的肽，其3位为D或E
任何一种改变的肽，其4位为P
任何一种改变的肽，其7位为A、F、I、L、M、P、V或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为F、K、R或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，F，G，H，K，M，N，P，Q，R，W，Y
P3E，K，R，W
P4K，R
P7D，E，G，R
P9D，E，P
HLA A*0201
任何一种改变的肽，其1位为F、I、K、L、M、V、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、M、Q或V
任何一种改变的肽，其3位为F、L、M、W或Y
任何一种改变的肽，其4位为D或E
任何一种改变的肽，其5位为F
任何一种改变的肽，其辅助锚位6为F、I、L、M、V、W或Y
任何一种改变的肽，其7位为F或W
任何一种改变的肽，其8位为F、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、T或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1D，E，H，P
P2C，F，H，K，N，P，R，S，W，Y
P3D，E，K，R
P7D，E，G，R
P8I，V
P9D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-A*0205
任何一种改变的肽，其1位为F、I、K、L、M、V、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位2为E、I、L、M、Q或V
任何一种改变的肽，其3位为F、L、M、W或Y
任何一种改变的肽，其4位为D或E
任何一种改变的肽，其5位为F、Y
任何一种改变的肽，其辅助锚位6为F、I、L、M、V、W或Y
任何一种改变的肽，其7位为F或W
任何一种改变的肽，其8位为F、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、T或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1D，E，P
P2C，D，F，G，H，K，N，P，R，S，W，Y
P3D，E，K，R
P7D，E，R
P9D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-A*03
任何一种改变的肽，其1位为G或K
任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、M、Q、T或V
任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、V、W或Y
任何一种改变的肽，其4位为E、G或P
任何动力种改变的肽，其5位为F、I、P、V、W、Y
任何一种改变的肽，其6位为F、I、L、M或V
任何一种改变的肽，其7位为F、I、L、M、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、K、L、Q或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1D，E，P
P2D，E，F，G，H，K，N，R，S，W，Y
P7G，K，R
P9D，E，G，H，N，P，Q，S，T
HLA-A*1101
任何一种改变的肽，其1位为G、K或R
任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、M、Q、T、V、Y
任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、V、W、Y
任何一种改变的肽，其7位为F、I、L、M、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为K或R
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1D，E，P
P2D，E，G，H，K，N，R，S，W
P7K，R
P9C，D，E，G，N，P，Q，S，T
HLA-A24
任何一种改变的肽，其1位为K或R
任何一种改变的肽，其锚位2为F或Y
任何种改变的肽，其3位为E、I、L、M、N、P、Q或Vat
任何一种改变的肽，其4位为D、E或P
任何一种改变的肽，其5位为I、L或V
任何一种改变的肽，其6位为F
任何一种改变的肽，其7位为N或Q
任何一种改变的肽，其8位为E或K
任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L或M
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，H，K，R
P9D，E，G，H，K，P，Q，R
HLA A*3101
任何一种改变的肽，其1位为K或R
任何一种改变的肽，其锚位2为F、I、L、M、Q、T、V或Y
任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、V、W或Y
任何一种改变的肽，其6位为F、I、L、M或V
任何一种改变的肽，其7位为F、I、L、M、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为K或R
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
PID，E，P
P2D，E，G，H，K，N，R，S
P7K，R
P9C，G，N，P，Q，S，T
HLA A*3302
任何一种改变的肽，其1位为D或E
任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、M、S、V或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为R
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1K，P，R
P2D，E，K，R
P9D，E，F，G，N，P，W，Y
HLA-B7
任何一种改变的肽，其1位为A
任何一种改变的肽，其锚位2为A、P或V
任何一种改变的肽，其3位为M或R
任何一种改变的肽，其5位为P
任何一种改变的肽，其6位为R
任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，F，H，K，R，W，Y
P3D，E
P9D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-B8
任何一种改变的肽，其1位为D或E
任何一种改变的肽，其锚位2为A、C、L或P
任何一种改变的肽，其3位为K或R
任何一种改变的肽，其4位为D或E
任何一种改变的肽，其5位为K或R
任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
PIK，P，R
P2D，E，F，G，H，K，Q，R，W，或Y
P3D，E
P5D，E
P9D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-B8(8聚体肽)
任何一种改变的肽，其1位为D或E
任何一种改变的肽，其锚位2为A、C、L或P
任何一种改变的肽，其3位为K或R
任何一种改变的肽，其4位为D或E
任何一种改变的肽，其5位为K或R
任何一种改变的肽，其锚位8为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1K，P，R
P2D，E，F，G，H，K，Q，R，W，或Y
P3D，E
P5D，E
P8D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-B14
任何一种改变的肽，其1位为D或E
任何一种改变的肽，其锚位2为K或R
任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、P、V、W、Y
任何一种改变的肽，其5位为H或R
任何一种改变的肽，其6位为I、L、M、R或V
任何一种改变的肽，其7位为T
任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，F，W，或Y
P3E，R
P5E，W，Y
P9D，E，G，H，K，N，P，Q，R
HLA-B*2702
任何一种改变的肽，其1位为K或R
任何一种改变的肽，其锚位2为E、L、M、N、Q或R
任何一种改变的肽，其3位为F、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L、W或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1D，E，P
P2D，F，G，H，K，W，或Y
P7K
P9D，E，G，K，N，P，Q，R，S
HLA-B27*05(8聚体肽)
任何一种改变的肽，其1位为K或R
任何一种改变的肽，其锚位2为E、L、M、N、Q或R
任何一种改变的肽，其3位为F、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位8为F、I、K、L、M、R、V或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1D，E，P
P2D，F，G，H，K，W，或Y
P7K
P9D，E，G，K，N，P，Q，R，S
HLA-B*3501(8聚体肽)
任何一种改变的肽，其1位为K或R
任何一种改变的肽，其锚位2为A、P或S
任何一种改变的肽，其3位为K或R
任何一种改变的肽，其4位为D或E
任何一种改变的肽，其5位为D或E
任何一种改变的肽，其锚位8为F、I、L、M、V、W或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，F，H，K，R，W，Y
P3D，E
P8D，E，F，G，H，K，P，Q，R
HLA-B*3701
任何一种改变的肽，其锚位2为D或E
任何一种改变的肽，其5位为I或V
任何一种改变的肽，其8位为F、L或M
任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L、M、V或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P9D，E，G，H，K，P，Q，R
HLA-B*3801
任何一种改变的肽，其锚位2为F、H、P、W或Y
任何一种改变的肽，其第3位为D或E
任何一种改变的肽，其4位为D、E或G
任何一种改变的肽，其5位为A、I、L、M或V
任何一种改变的肽，其8位为K或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，K，R
P3K，R
P9D，E，G，H，K，P，Q，R
HLA-B*3901(8聚体肽)
任何一种改变的肽，其锚位2为H或R
任何一种改变的肽，其3位为D、E、F、I、L、M、V、W或W
任何一种改变的肽，其4位为D或E
任何一种改变的肽，其6位为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其锚位8为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E
P3K，R
P6D，E，K，R
P8D，E，G，H，K，P，Q，R
HLA-B*3902
任何一种改变的肽，其锚位2为K或Q
任何一种改变的肽，其5位为F、I、L、M、V、W或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为F、L或M
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E
P3K，R
P9D，E，G，H，K，P，Q，R
HLA-B40
任何一种改变的肽，其1位为A或G
任何一种改变的肽，其锚位2为D或E
任何一种改变的肽，其3位为A、F、I、L、M、V、W或Y
任何一种改变的肽，其4位为P
任何一种改变的肽，其5位为P
任何一种改变的肽，其锚位9为A、L、M或W
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，或Y
P3D，E，K，R
P9D，E，G，H，K，N，P，Q，R
HLA-B44*03
任何一种改变的肽，其1位为A、D或S
任何一种改变的肽，其锚位2为D或E
任何一种改变的肽，其3位为A、I、L、M或V
任何一种改变的肽，其4位为F、I或P
任何一种改变的肽，其5位为A、K或V
任何一种改变的肽，其6位为A、L、T或V
任何法种改变的肽，其7位为F、K或T
任何一种改变的肽，其8位为K
任何一种改变的肽，其锚位9为F、W或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，Y
P9D，E，G，H，K，N，P，Q，R
HLA-B*5101(8聚体肽)
任何一种改变的肽，其1位为D、E、F、I、L、M、V或Y
任何一种改变的肽，其锚位2为A、G或P
任何一种改变的肽，其3位为F、W或Y
任何一种改变的肽，其4位为D、E、G、I、K或V
任何一种改变的肽，其5位为A、G、I、S、T或V
任何一种改变的肽，其6位为I、K、L、N或Q
任何一种改变的肽，其7位为D、K、Q或R
任何一种改变的肽，其锚位8为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1K，P，R
P2D，E，H，K
P8D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-B*5102
任何一种改变的肽，其1位为F或Y
任何一种改变的肽，其锚位2为A、G或P
任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、V、W或Y
任何一种改变的肽，其4位为E、G、H、K、L、N、Q、R或T
任何一种改变的肽，其5位为G、N、Q、T或V
任何一种改变的肽，其6位为I、N、Q或T
任何一种改变的肽，其7位为E、K、Q或R
任何一种改变的肽，其8位为K、R、T或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，H，K，R
P3D，E，K，R
P9D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-B*5102(8聚体肽)
任何一种改变的肽，其1位为F或Y
任何一种改变的肽，其锚位2为A、G或P
任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、V、W或Y
任何一种改变的肽，其4位为E、G、H、K、L、V、W或Y
任何一种改变的肽，其5位为G、N、Q、T、V
任何一种改变的肽，其6位为I、N或Q
任何一种改变的肽，其7位为Q或R
任何一种改变的肽，其8位为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，H，K，R
P3D，E，K，R
P8D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA B*5103
任何一种改变的肽，其1位为D、T或V
任何一种改变的肽，其锚位2为A、G或P
任何一种改变的肽，其3位为D、F、L或Y
任何一种改变的肽，其4位为E、G、L、N、Q、R、T或V
任何一种改变的肽，其5位为A、G、M、N、Q、R、K或V
任何一种改变的肽，其6位为I、K或T
任何一种改变的肽，其7位为M或V
任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，H，K，R
P9D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA B*5201(8聚体肽)
任何一种改变的肽，其1位为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其锚位2为G、P或Q
任何一种改变的肽，其3位为D、F、I、L、P、W或Y
任何一种改变的肽，其4位为A、E、I、K、L、P或V
任何一种改变的肽，其5位为A、F、G、I、L、M、T或V
任何一种改变的肽，其6位为K、L、N、S或T
任何一种改变的肽，其7位为E、K、Q或Y
任何一种改变的肽，其锚位8为F、I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2H，K，R
P3R
P8D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S
HLA-B*5801
任何一种改变的肽，其1位为I、K或R
任何一种改变的肽，其锚位2为A、S或T
任何一种改变的肽，其3位为D
任何一种改变的肽，其4位为E、K或P
任何一种改变的肽，其5位为F、I、L、M或V
任何一种改变的肽，其6位为F、I、L或V
任何一种改变的肽，其7位为L、M、N或Y
任何一种改变的肽，其8位为K、N、R或T
任何一种改变的肽，其锚位9为F、W或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1D，E，P
P2D，E，F，H，I，K，L，M，N，Q，R，V，W，Y
P9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S
HLA-B*60
任何一种改变的肽，其锚位2为D或E
任何一种改变的肽，其3位为A、I、L、M、S或V
任何一种改变的肽，其5位为L、I或V
任何一种改变的肽，其7位为I、L、M、V或Y
任何一种改变的肽，其8位为K、Q或R
任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，Y
P9D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-B*61
任何一种改变的肽，其1位为G或R
任何一种改变的肽，其锚位2为D或E
任何一种改变的肽，其3位为A、F、I、L、M、T、V、W或Y
任何一种改变的肽，其6位为I
任何一种改变的肽，其7位为Y
任何一种改变的肽，其锚位9为A、I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，Y
P9D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-B*61(8聚体肽)
任何一种改变的肽，其1位为G或R
任何一种改变的肽，其锚位2为D或E
任何一种改变的肽，其3位为A、F、I、L、M、T、V、W或Y
任何一种改变的肽，其6位为I
任何一种改变的肽，其7位为Y
任何一种改变的肽，其锚位8为A、I、L、M或V
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，Y
P8D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-B*62
任何一种改变的肽，其1位为I
任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、Q
任何一种改变的肽，其3位为G、K、R
任何一种改变的肽，其4位为D、E、G或P
任何一种改变的肽，其5位为F、G、I、L或V
任何氚种改变的肽，其6位为I、L、T、V
任何一种改变的肽，其7位为T、V或Y
任何一种改变的肽，其锚位9为F、W、Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，F，H，K，N，R，S，W，Y
P3D，E
P6D，E，K，R
P9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S
HLA-Cw0301
任何一种改变的肽，其锚位2为A或R
任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、V或Y
任何一种改变的肽，其4位为E、P或R
任何一种改变的肽，其5位为N
任何一种改变的肽，其6位为F、M或Y
任何一种改变的肽，其7位为K、M、R或S
任何一种改变的肽，其8位为T
任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L、M
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P3D，K，R
P6D，E，K，R
P9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S，
HLA-Cw0401
任何一种改变的肽，其锚位2为F、P、W或Y
任何一种改变的肽，其3位为D或H
任何一种改变的肽，其4位为D或E
任何一种改变的肽，其5位为A、H、M、R或T
任何一种改变的肽，其6位为I、L、M或V
任何一种改变的肽，其7位为A
任何一种改变的肽，其8位为H、K或S
任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L、M、V或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P2D，E，H，K，R
P9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S
HLA-Cw0602
任何一种改变的肽，其1位为F、I、K或Y
任何一种改变的肽，其锚位2为A、P、Q或R
任何一种改变的肽，其5位为F、I、K、L或M
任何一种改变的肽，其位为I、L或V
任何一种改变的肽，其7位为K、N、Q或R
任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M、V或Y
任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换
P1P
P9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S
从C35氨基酸序列预测人I类MHC结合肽及其可能如何变化以加强结合的例子
HLA-A*0101 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 1 77 KLENGGRPY 225.000 2 16 EVEPGSGVR 90.000 3 29 YCEPCGFEA 45.000 4 39 YLELASAVK 36.000 5 2 SGEPGQTSV 2.250在P2位G是有害的 改善的肽的例子STEPGQTSV 22.50在P2位用T置换G
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 改善的肽的例子STEPGQISY 5625.00 在P9位用Y置换V，P7被增强 HLA-A*0101(10聚体肽) 1 66 EIEINGQLVF 45.000 2 16 EVEPGSGVRI 18.000 3 29 YCEPCGFEAT 9.000 4 26 VVEYCEPCGF 9.000 5 52 GIEIESRLGG 2.250 改善的肽的例子GTEPSRLGY 1125.000在P2位用T置换I 在P9位用Y置换G P5被P增强 HLA-A*0201(9聚体肽) 1 9 SVAPPPEEV 2.982 2 104 KITNSRPPC 2.391 3 105 ITNSRPPCV 1.642 4 25 IVVEYCEPC 1.485 5 65 FEIEINGQL 1.018 改善的肽的例子FLIEINWYL 16619.000 HIA-A*0201(10聚体肽) 1 58 RLGGTGAFEI 60.510 2 104 KITNSRPPCV 33.472 3 65 FEIEINGQLV 25.506 4 83 FPYEKDLIEA 4.502在P2位是P是有害的 改善的肽的例子FLYEKDLIEA 689.606在P2位用L置换P 改善的肽的例子FLYEKDLIEV 9654.485在P9位用V置换A
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 5 33 CGFEATYLEL 3.173 HLA-A*0205 1 65 FEIEINGQL 8.820 2 25 IVVEYCEPC 3.060 3 9 SVAPPPEEV 2.000 4 104 KITNSRPPC 1.500 5 81 GGFPYEKDL 1.260在P2位是G是有害的 改善的肽的例子GVFPYEKDL 50.400在P2位用V置换G ILA-A*0205(10聚体肽) 1 33 CGEFATYLEL 6.300在P2位是G是有害的 改善的肽的例子CVEFATYLEL 11.200在P2位用V置换G 2 104 KITNSRPPCV 6.000 3 65 FEIEINGQLV 2.520 4 53 IEIESRLGGT 1.428 5 83 FPYEKDLIEA 1.350在P2位是P是有害的 改善的肽的例子FVYEKDLIEA 54.000在P2位用V置换P HLA-A24 1 34 GFEATYLEL 33.000 2 49 QYPGIEIES 11.550 改善的肽的例子QYPGIEIEL 462.000增强P9 3 70 NGQLZFSKL 11.088 4 38 TYLELASAV 10.800 5 82 GFPYEKDLI 7.500
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-A24(10聚体肽) 1 64 AFEIEINGQL 42.000 2 74 VFSKLENGGF 10.000 3 84 PYEKDLIEAI 9.000 4 69 INGQLVFSKL 7.392 改善的肽的例子IYGQLVFSKL 369.6增强P2 5 28 EYCEPCGFEA 6.600 HLA-A3 1 77 KLENGGFPY 36.000 改善的肽的例子KLENGGFPK 180.000增强P9 2 39 YLELASAVK 20.000 3 101 TLEKITNSR 6.000 4 61 GTGAFEIEI 0.540 5 69 INGQLVFSK 0.360在P2位是N是有害的 改善的肽的例子ILGQLVFSK 180.000在P2位用L置换N HLA-A3(10聚体肽) 1 68 EINGQLVFSK 8.100 2 58 RLGGTGAFEI 2.700 3 41 ELASAVKEQY 1.800 4 78 LENGGFPYEK 0.810在P2位是E是有害的 改善的肽的例子LLNGGFPYEK 270.000在P2位用L置换E 5 95 RASNGETLEK 0.400
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-A*1101 1 39 YLELASAVK 0.400 2 69 INGQLVFSK 0.120在P2位是N是有害的 改善的肽的例子IVGQLVFSK 6.000在P2位用V置换N 3 16 EVEPGSGVR 0.120 4 101 TIEKITNSR 0.080 5 61 GTGAFEIEI 0.060 HLA-A*1101(10聚体肽) 1 95 RASNGETLEK 1.200 2 38 TYLELASAVK 0.600 3 68 EINGGLVFSK 0.360 4 78 LENGGFPYEK 0.120在P2位是E是有害的 改善的肽的例子LVNGGFPYEK 4.000在P2位用V置换E 5 100 ETLEKITNSR 0.090 HLA-A*3101 1 101 TLEKITNSR 2.000 2 16 EVEPGSGVR 0.600 3 50 YPGIEIESR 0.400 4 87 KDLlEAIRR 0.240在P2位是D是有害的 改善的肽的例子KILIEAIRR 12.000在P2位用I置换D 5 39 YLELASAVK 0.200
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-A*3302 1 16 EVEPGSGVR 45.000 2 101 TLEKITNSR 9.000 3 50 YPGIEIESR 3.000 4 66 EIEINGQLV 1.500 5 56 ESRLGGTGA 1.500 HLA-A*3302(10聚体肽) 1 49 QYPGIEIESR 15.000 2 100 ETLEKITNSR 9.000 3 16 EVEPGSGVRI 1.500 4 28 EYCEPCGFEA 1.500 5 68 EINGQLVFSK 1.500 HLA-A68.1 1 16 EVEPGSGVR 900.000 2 9 SVAPPPEEV 12.000 3 50 YPGIEIESR 10.000 改善的肽的例子YVGIEIESR 400.000增强P2 4 96 ASNGETLEK 9.000 5 101 TLEKITNSR 5.000 HLA-A68.1(10聚体肽) 1 100 ETLEKITNSR 300.000 2 16 EVEPGSGVRI 18.000 3 68 EINGGLVFSK 9.000 4 15 EEVEPGSGVR 9.000在P2位是E是有害的
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 改善的肽的例子EVVEPGSGR 1200.00在P2位用V置换E 5 95 RASNGETLEK 3.000 HLA-B14 1 94 RRASNGETL 20.000 2 57 SRLGGTGAF 5.000 改善的肽的例子SRLGGTGAL 100.000增强P9 3 100 ETLEKITNS 3.375 4 105 ITNSRPPCV 2.000 5 88 DLIEAIRRA 1.350 HLA-B14(10聚体肽) 1 103 EKITNSRPPC 6.750 改善的肽的例子ERITNSRPPL 900.000增强P10 2 33 CGFEATYLEL 5.000 3 93 IRRASNGETL 4.000 4 18 EPGSGVRIVV 3.000 5 88 DLIEAIRRAS 2.250 HLA-B40 1 65 FEIEINGQL 80.000 2 3 GEPGQTSVA 40.000 3 35 FEATYLELA 40.000 4 15 EEVEPGSGV 24.000 改善的肽的例子EEVEPGSGL 120.000增强P9 5 67 IEINGQLVF 16.000
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-B40(10聚体肽) 1 55 IESRLGGTGA 20.000 2 53 IEIESRLGGT 16.000 改善的肽的例子IEIESRLGGL 80.000增强P10 3 65 FEIEINGQLV 16.000 4 67 IEINGQLVFS 16.000 5 99 GETLEKITNS 8.000 HLA-B60 1 65 FEIEFNGQL 387.200 2 17 VEPGSGVRI 17.600 改善的肽的例子VEPGSGVRL 352.000增强P9 3 15 EEVEPGSGV 16.000 4 47 KEQYPGIEI 16.000 5 85 YEKDLIEAI 8.800 HLA-B60(10聚体肽) 1 65 FEIEINGQLV 16.000 改善的肽的例子FEIEINGQLL 320.000增强P10 2 106 TNSRPPCVIL 16.000 3 53 IEIESRLGGT 8.000 4 33 CGFEATYLEL 8.000 5 17 VEPGSGVRIV 8.000 HLA-B61 1 15 EEVEPGSGV 80.000 2 35 FEATYLELA 40.000
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 改善的肽的例子FEATYLELV 160.000增强P9 3 3 GEPGQTSVA 22.000 4 65 FEIEINGQL 16.000 5 85 YEKDLIEAI 16.000 HLA-B61(10聚体肽) 1 65 FEIEINGQLV 80.000 2 17 VEPGSGVRIV 40.000 3 55 IESRLGGTGA 20.000 4 87 KDLIEAIRRA 10.000 改善的肽的例子KELIEAIRRV 160.000增强P2，P10 5 53 IEIESRLGGT 8.000 HLA-B62 1 77 KLENGGFPY 24.000 2 21 SGVRIVVEY 4.800 3 75 FSKLENGGF 3.000 4 31 EPCGFEATY 2.640在P2位是P是有害的 改善的肽的例子EQCGFEATY 105.6在P2位用Q置换P 5 88 DLIEAIRRA 2.200 HLA-B62(10聚体肽) 1 41 ELASAVKEQY 40.000 2 58 RLGGTGAFEI 9.600 3 66 EIEINGQLVF 7.920 4 56 ESRLGGTGAF 6.000在P2位是S是有害的
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 改善的肽的例子EQRLGGTGA 480.000在P2位用Q置换S 5 20 GSGVRIVVEY 4.800在P2位是S是有害的 改善的肽的例子GQGVRIVVEY 384.000在P2位用Q置换S HLA-B7 1 107 NSRPPCVIL 60.000 改善的肽的例子NPRPPCVIL 1200.000增强P2 2 45 AVKEQYPGI 6.000 3 22 GVRIVVEYC 5.000 4 70 NGQLVFSKL 4.000 5 81 GGFPYEKDL 4.000 HLA-B7(10聚体肽) 1 50 YPGIEIESRL 80.000 2 31 EPCGFEATYL 80.000 3 18 EPGSGVRIVV 6.000 改善的肽的例子EPGSGVRIVL 120.000增强P10 4 106 TNSRPPCVIL 6.000 5 80 NGGFPYEKDL 4.000 HLA-B8 1 107 NSRPPCVIL 4.000 2 45 AVKEQYPGI 1.500 3 105 ITNSRPPCV 0.600 4 56 ESRLGGTGA 0.400 5 100 ETLEKITNS 0.300在P9位是S是有害的
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 改善的 肽的例子ETLEKITNL 12.000在P9位用L置换S HLA-B8(8聚体肽) 1 83 FPYEKDLI 6.000 2 107 NSRPPCVI 1.000 3 91 EAIRRASN 0.800在P8位是N是有害的 改善的 肽的例子EAIRRASL 32.000在P9位用L置换N 4 20 GSGVRIVV 0.600 5 18 EPGSGVRI 0.400 HLA-B8(10聚体肽) 1 50 YPGIEIESRL 0.800 2 93 IRRASNGETL 0.400 改善的 肽的例子IARASNGETL 16.000在P2位用A置换R 3 31 EPCGFEATYL 0.320 4 104 KITNSRPPCV 0.300 5 18 EPGSGVRIVV 0.240 HLA-B*2702 1 57 SRLGGTGAF 200.000 2 94 RRASNGETL 180.000 改善的 肽的例子RRASNGETF 600.000增强P9 3 93 IRRASNGET 20.000 4 27 VEYCEPCGF 15.000 5 77 KLENGGFPY 9.000
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-B*2702(10聚体肽) 1 93 IRRASNGETL 60.000 2 94 RRASNGETLE 6.000 3 30 CEPCGFEATY 3.000 4 58 RLGGTGAFEI 2.700 5 23 VRIVVEYCEP 2.000在P10位是P是有害的 改善的 肽的例子VRIVVEYCEY 200.000在P10位用Y置换P HLA-B*2705 1 94 RRASNGETL 6000.000 2 57 SRLGGTGAF 1000.000 3 93 IRRASNGET 200.000 改善的 肽的例子IRRASNGEL 2000.000增强P9 4 27 VEYCEPCGF 75.000 5 77 KLENGGFPY 45.000 HLA-B*2705(10聚体肽) 1 93 IRRASNGETL 2000.000 2 94 RRASNGETLE 60.000在P2位是E是有害的 改善的 肽的例子RRASNGETLL 6000.000在P2位用L置换E 3 78 LENGGFPYEK 30.000 4 95 RASNGETLEK 30.000 5 58 RLGGTGAFEI 27.000 HLA-B*3501 1 31 EPCGFEATY 40.000 2 75 FSKLENGGF 22.500
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 改善的 肽的例子FPKLENGGM 120.000增强P2，P9 3 107 NSRPPCVIL 15.000 4 42 LASAVKEQY 6.000 5 18 EPGSGVRIV 4.000 HLA-B*3501(10聚体肽) 1 31 EPCGFEATYL 30.000 2 50 YPGIEIESRL 20.000 3 56 ESRLGGTGAF 15.000 4 20 GSGVRIVVEY 10.000 5 83 FPYEKDLIEA 6.000 改善的 肽的例子FPYEKDLIEM 120.000增强P10 HLA-B*3701 1 65 FEIEINGQL 15.000 改善的 肽的例子FDIEINGQL 60.000增强P2 2 47 KEQYPGIEI 10.000 3 85 YEKDLLEAI 10.000 4 17 VEPGSGVRI 10.000 5 35 FEATYLELA 5.000 HLA-B*3701(10聚体肽) 1 65 FEIEINGQLV 10.000 改善的 肽的例子FDIEINGQLI 200.000增强P2，P10 2 67 IEINGQLVFS 5.000 3 81 GGFPYEKDLI 5.000
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 4 87 KDLIEAIRRA 4.000 5 30 CEPCGFEATY 2.000 HLA-B*3801 1 34 GFEATYLEL 6.000 改善的 肽的例子GHEATYLEL 90.000增强P2 2 70 NGQLVFSKL 1.560 3 38 TYLELASAV 1.040 4 81 GGFPYEKDL 1.000 5 97 SNGETLEKI 0.720 HLA-B*3801(10聚体肽) 1 64 AFEIEINGQL 7.800 改善的 肽的例子AHEIEINGQL 117.000增强P2 2 31 EPCGFEATYL 4.800 3 66 EIEINGQLVF 3.000 4 26 VVEYCEPCGF 3.000 5 50 YPGIEIESRL 2.600 HLA-B*3901 1 94 RRASNGETL 15.000 改善的 肽的例子RHASNGETL 90.000增强P2 2 34 GFEATYLEL 9.000 3 38 TYLELASAV 4.000 4 66 EIEINGQLV 3.000 5 2 SGEPGQTSV 3.000
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-B*3901(10聚体肽) 1 33 CGFEATYLEL 12.000 改善的 肽的例子CHFEATYLEL 360.000增强P2 2 64 AFEIEINGQL 9.000 3 93 IRRASNGETL 4.500 4 46 VKEQYPGIEI 3.000 5 16 EVEPGSGVRI 3.000 HLA-B*3902 1 70 NGQLVFSKL 2.400 改善的 肽的例子NKQLVFSKL 24.000增强P2 2 81 GGFPYEKDL 2.400 3 94 RRASNGETL 2.000 4 34 GFEATYLEL 2.000 5 107 NSRPPCVIL 0.600 HLA-B*3902(10聚体肽) 1 69 INGQLVFSKL 2.400 2 64 AFEIEINGQL 2.400 3 50 YPGIEIESRL 2.400 4 80 NGGFPYEKDL 2.400 5 106 TNSRPPCVIL 2.000 HLA-B*4403 1 67 IEINGQLVF 200.000 改善的 肽的例子IEINGQLVY 900.000增强P9 2 27 VEYCEPCGF 40.000
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 3 21 SGVRIVVEY 36.000 4 65 FEIEINGQL 20.000 5 35 FEATYLELA 12.000 HLA-B*4403(10聚体肽) 1 30 CEPCGFEATY 120.000 2 53 IEIESRLGGT 30.000 改善的 肽的例子IEIESRLGGY 900.000增强P10 3 67 IEINGQLVFS 30.000 4 65 FEIEINGQLV 20.000 5 17 VEPGSGVRIV 18.000 HLA-B*5101 1 18 EPGSGVRIV 484.000 59 LGGTGAFEI 114.400 改善的 肽的例子LPGTGAFEI 572.000增强P2 3 2 SGEPGQTSV 48.400 4 81 GGFPYEKDL 44.000 5 70 NGQLVFSKL 22.000 HLA-B*5101(10聚体肽) 1 18 EPGSGVRIVV 440.000 2 44 SAVKEQYPGI 220.000 改善的 肽的例子SPVKEQYPGI 440.000增强P2 3 31 EPCGFEATYL 220.000 4 81 GGFPYEKDLI 176.000 5 50 YPGIEIESRL 157.300
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-B*5102 1 18 EPGSGVRIV 242.000 2 81 GGFPYEKDL 110.000 改善的 肽的例子GPFPYEKDI 2200.000增强P2，P9 3 59 LGGTGAFEI 96.800 4 70 NGQLVFSKL 48.400 5 2 SGEPGQTSV 24.200 HLA-B*5102(10聚体肽) 1 44 SAVKEQYPGI 726.000 改善的 肽的例子SPVKEQYPGI 1452.000增强P2 2 50 YPGIEIESRL 400.000 81 GGFPYEKDLI 400.000 4 18 EPGSGVRIVV 220.000 5 31 EPCGFEATYL 121.000 HLA-B*5103 1 59 LGGTGAFEI 48.400 改善的 肽的例子LAFTGAFEI 145.200增强P2 2 2 SGEPGQTSV 44.000 3 18 EPGSGVRIV 44.000 4 70 NGQLVFSKL 7.260 5 81 GGFPYEKDL 7.200
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-B*5103(10聚体肽) 1 44 SAVKEQYPGI 110.000 2 81 GGFPYEKDLI 52.800 3 18 EPGSGVRIVV 44.000 改善的 肽的例子EAGSGVRIVV 110.000增强P2 4 60 GGTGAFEIEI 44.000 5 33 CGFEATYLEL 7.920 HLA-B*5201 1 18 WPGSGVRIV 75.000 2 67 LEINGQLVF 22.500 改善的 肽的例子LQINGQLVI 450.000增强P2，P9 3 59 LGGTGAFEI 11.250 4 98 NGETLEKIT 11.000 5 19 PGSGVRIVV 10.000 HLA-B*5201(10聚体肽) 1 18 EPGSGVRIVV 100.000 2 17 VEPGSGVRIV 45.000 改善的 肽的例子VQPGSGVRIV 450.000增强P2 3 81 GGFPYEKDLI 33.000 4 105 ITNSRPPCVI 15.000 5 37 ATYLELASAV 12.000
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-B*5801 1 75 FSKLENGGF 40.000 改善的 肽的例子FSKLENGGW 80.000增强P9 2 42 LASAVKEQY 4.500 3 107 NSRPPCVIL 4.000 4 61 GTGAFEIEI 3.000 5 105 ITNSRPPCV 3.000 HLA-B*5801(10聚体肽) 1 56 ESRLGGTGAF 12.000 2 20 GSGVRIVVEY 10.800 改善的 肽的例子GSGVRIVVEW 144.000增强P10 3 1 MSGEPGQTSV 4.000 4 105 ITNSRPPCVI 3.000 5 37 ATYLELASAV 3.000 HLA-Cw*0301 1 65 FEIEINGQL 30.000 2 81 GGFPYEKDL 18.000 3 70 NGQLVFSKL 12.000 4 57 SRLGGTGAF 10.000 5 34 GFEATYLEL 10.000 HLA-Cw*0301(10聚体肽) 1 44 SAVKEQYPGI 50.000 改善的 肽的例子SAVKEQYPGL 100.000增强P10 2 33 CGFEATYLEL 45.000
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) 3 69 INGQLVFSKL 12.000 4 81 GGFPYEKDLI 3.750 5 106 TNSRPPCVIL 3.000 HLA-Cw*0401 1 34 GFEATYLEL 240.000 2 38 TYLELASAV 30.000 3 82 GFPYEKDLI 25.000 4 18 EPGSGVRIV 20.000 5 31 EPCGFEATY 12.000 改善的 肽的例子EFCGFEATL 200.000增强P2，P9 HLA-Cw*0401(10聚体肽) 1 64 AFEIEINGQL 200.000 2 74 VFSKLENGGF 100.000 改善的 肽的例子VFSKLENGGL 200.000增强P10 3 50 YPGIEIESRL 80.000 4 31 EPCGFEATYL 80.000 5 18 EPGSGVRIVV 10.000 HLA-Cw*0602 1 85 YEKDLIEAI 6.600 2 65 FEIEINGQL 6.600 3 21 SGVRIVVEY 6.000 4 31 EPCGFEATY 3.300 5 61 GTGAGEIEI 3.000
预测的人I类MHC结合肽的例子-续 排位 起始位点 亚序列 分值(估计的解离半衰期) HLA-Cw*0702 1 31 EPCGFEATY 24.000 2 21 SGVRIVVEY 19.200 3 42 LASAVKEQY 8.800 4 77 KLENGGFPY 4.000 5 49 QYPGIEIES 2.880 HLA-Cw*0702(10聚体肽) 1 20 GSGVRIVVEY 38.400 2 30 CEPCGFEATY 16.000 3 41 ELASAVKEQY 16.000 4 50 YPGIEIESRL 7.920 5 76 SKLENGGFPY 4.000
表5
预测的C35 HLA I类表位* HLA限制性元件 包含的氨基酸 序列 A*0201 9-17 SVAPPPEEV A*0201 10-17 VAPPPEEV A*0201 16-23 EVEPGSGV A*0201 16-25 EVEPGSGVRI A*0201 36-43 EATYLELA A*0201 37-45 ATYLELASA A*0201 37-46 ATYLELASAV A*0201 39-46 YLELASAV A*0201 44-53 SAVKEQYPGI A*0201 45-53 AVKEQYPGI A*0201 52-59 GIEIESRL A*0201 54-62 EIESRLGGT A*0201 58-67 RLGGTGAFEI A*0201 61-69 GTGAFEIEI A*0201 66-73 EIEINGQL A*0201 66-74 EIEINGQLV A*0201 88-96 DLIEAIRRA A*0201 89-96 LIEAIRRA A*0201 92-101 AIRRASNGET A*0201 95-102 RASNGETL A*0201 104-113 KITNSRPPCV A*0201 105-113 ITNSRPPCV A*0201 105-114 ITNSRPPCVI A*3101 16-24 EVEPGSGVR B*3501 30-38 EPCGFEATY A*30101超基序 96-104 ASNGETLEK
*利用在SYFPEITHI网站(wysiwyg//35/http//134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm)发现的规则，并根据Rammensee，H.G.，Bachmann，J.和S.Stevanovic(Chapman & Hall，NewYork 1997)的著作″MHC Ligands and Peptide Motifs″进行预测。
表6
预测的C35 HLA II类表位* 序列 包含的氨基酸 限制性元件 SGVRIVVEYCEPCGF SRLGGTGAFEIEINGQLVF 21-35 57-75DRBl*0101 DRB1*0102 DRB1*0301 DRB1*0401 DRB1*0404 DRB1*0405 DRB1*0410 DRB1*0421 DRB1*0701 DRB1*0801 DRB1*0804 DRB1*0806 DRB1*1101 DRB1*1104 DRB1*1106 DRB1*1107 DRB1*1305 DRB1*1307 DRB1*1321 DRB1*1501 DRB1*1502 DRB5*0101 DRB1*0101 DRB1*0102 DRB1*0301 DRB1*0401 DRB1*0402 DRB1*0421 DRB1*0701 DRB1*0804 DRB1*0806 DRB1*1101 DRB1*1104 DRB1*1106 DRB1*1305 DRB1*1321 DRB1*1501 DRB1*1502 DRB5*0101
GAFEIEINGQLVFSKLENGGFFPYEKDLIEAIRRASNGETLE 63-8383-103 DRB1*0101 DRB1*0102 DRB1*0301 DRB1*0401 DRB1*0402 DRB1*0404 DRB1*0405 DRB1*0410 DRB1*0421 DRB1*0701 DRB1*0804 DRB1*0806 DRB1*1101 DRB1*1104 DRB1*1106 DRB1*1107 DRB1*1305 DRB1*1307 DRB1*1311 DRB1*1321 DRB1*1501 DRB1*1502 DRB5*0101 DRB1*0101 DRB1*0102 DRB1*0301 DRB1*0401 DRB1*0402 DRB1*0404 DRB1*0405 DRB1*0410 DRB1*0421 DRB1*0701 DRB1*0801 DRB1*0802 DRB1*0804 DRB1*0806 DRB1*1101 DRB1*1104 DRB1*1106 DRB1*1107 DRB1*1305 DRB1*1307 DRB1*1311
DRB1*1321 DRB1*1501 DRB1*1502 DRB5*0101
*利用TEPITOPE软件预测II类MHC表位。Sturniolo，T.等人，1999。Generation of tissue-specific and promiscuous HLA liganddatabases using DNA microarrays and virtual HLA class IImatricws。Nature Biotechnology 17555-571。
本发明中″表位″是指在动物特别是人中具有抗原性或免疫原性、或者能够激发动物、优选人的T淋巴细胞应答的C35多肽片段。本发明优选的实施方案涉及包含C35肽表位的C35多肽片段，以及编码该片段的多核苷酸。本发明另一优选的实施方案涉及包含表位的C35多肽片段，以及编码该片段的多核苷酸。本发明特定的优选实施方案中，表位包含表1-3或5-6任一个中所列C35片段，除了SEQ ID NO2的E100-R109之外。本发明又一优选实施方案中，表位由表1-3或5-6任一个中所列C35片段组成，除了SEQ ID NO2的E100-R109外。抗体能结合的蛋白质分子区域定义为″抗原性表位″，相反，″免疫原性表位″定义为激发抗体应答的蛋白质的一部分。(例如参见Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。因而本发明另一优选实施方案是免疫原性的C35肽片段，当结合MHC分子的肽结合裂隙时，其能够激发T细胞应答。本发明特定的优选实施方案中，免疫原性的C35肽片段包含表1-3或5-6中任一项中所列的表位，除了SEQ ID NO2的E100-R109之外。本发明又一优选实施方案中，免疫原性的C35肽片段由表1-3或5-6中任一项中所列的表位组成，除了SEQ ID NO2的E100-R109外。本发明另一实施方案涉及包含所述免疫原性C35肽片段或其编码多核苷酸的药物制剂和疫苗组合物。
可利用任何常规方法制备起表位作用的片段。(例如参见Houghten，R.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135(1985)，美国专利No.4,631,211有进一步描述。)
按照能提高MHC结合亲和力的可预测方式，可以在已知的肽锚位改变已知与特定MHC分子结合的肽表位序列。该″表位增强″已用于改进许多不同MHC I类或MHC II类结合肽表位的免疫原性(Berzofsky，J.A.等，Immunol.Rev.170151-72(1999)；Ahlers，J.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.9410856-61(1997)；Overwijk，等，J.Exp.Med.188277-86(1998)；Parkhurst，M.R.等，J.Immunol.1572539-48(1996))。因此，本发明的另一实施方案涉及该增强的C35表位类似物，以及编码该类似物的多核苷酸。
本发明的抗原性表位优选包含至少7个、更优选包含至少9个以及最优选包含约15-30个氨基酸的序列。抗原性表位可用于引发特异性结合该表位的抗体，包括单克隆抗体。(例如参见Wilson等人，Cell 37767-778(1984)；Sutcliffe，J.G.等人，Science 219660-666(1983).)
类似地，根据本领域公知的方法，免疫原性表位可用于诱导B细胞和T细胞。(参见Sutcliffe等人，上文；Wilson等人，上文；Chow，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82910-914；以及Bittle，F.J.等人，J.Gen.Virol.662347-2354(1985).)免疫原性表位可与载体蛋白质(例如白蛋白)一起呈递给动物系统(例如兔或小鼠)，或者如果足够长(至少约25个氨基酸)，则可不需要载体。然而已经证明，仅含9个氨基酸的免疫原性表位，足以引发至少能够结合变性多肽线性表位(例如在Western印迹中)的抗体。
此处所用术语″抗体″(Ab)或″单克隆抗体″(Mab)，是指包括能够特异性结合蛋白质的完整分子以及抗体片段(例如Fab和F(ab′)2片段)。缺少完整抗体Fc片段的Fab和F(ab′)2片段，在循环中清除更快，并且其可能具有的非特异性组织结合比完整抗体更少。(Wahl等，J.Nucl.Med.24316-325(1983).)因而，这些片段以及Fab或其它免疫球蛋白表达文库的产物，更适于某些应用。此外，本发明的抗体包括嵌合的、单链和人源化的抗体。
抗体的诊断和治疗用途
本发明进一步涉及与人癌细胞，特别是人乳腺癌和膀胱癌细胞反应的C35抗体、C35抗体片段和抗体缀合物以及单链免疫毒素。
表7所列为已经分离并鉴定的适于不同应用的C35特异性单克隆抗体。
表7C35特异性鼠单克隆抗体 融合 杂交瘤 ELISA 同种型 Western 印迹 流式细胞术 免疫组化 α 1F5 阳性 IgM 阳性 阳性 1F7 阳性 IgM 阳性 1F11 阳性 IgM 阳性 2D9 阳性 IgM 阳性 阳性 阳性 β 2G3 阳性 IgG1 2G8 阳性 2G10 阳性 IgG3 2G11 阳性 IgG3 3F9 阳性 IgG1 4D11 阳性 IgG1 4G3 阳性 IgG3 7C2 阳性 IgM 8B11 阳性 IgM 8G2 阳性 IgM 10F4 阳性 IgG1 11B10 阳性 IgM 阳性 12B10 阳性 16C10 阳性 IgM 16F10 阳性
ELISA分析细菌合成的C35
空白＝未测定
实施例所用的下列单词或短语具有指定的含义。
实施例所用的″连接″是指通过任何方式，例如共价结合、非共价结合、离子结合或非离子结合，直接或间接地将一个分子与另一个分子偶联。共价结合包括通过各种接头(例如硫醚接头或硫酯接头)的结合。直接偶联包括一个分子连接目的分子。间接偶联包括一个分子连接于另一个非目的分子，其随后直接或间接与目的分子偶联。
实施例所用的″重组分子″是指通过基因工程方法制备的分子。
实施例所用″片段″定义为至少一部分可与目标结合的免疫球蛋白分子可变区(即抗原结合区域)。可以包括免疫球蛋白的某些恒定区。
实施例所用″免疫缀合物″是指与细胞毒素、放射性试剂、抗肿瘤药或治疗剂化学或生物学连接的任何分子或配基，例如抗体或生长因子。只要能够与目标结合，该抗体或生长因子就可在分子的任何位置连接细胞毒素、放射性试剂、抗肿瘤药或治疗剂。免疫缀合物的例子包括免疫毒素和抗体缀合物。
实施例所用″选择性杀伤″是指杀伤抗体结合的细胞。
实施例所用″癌″的例子包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌。
实施例所用″免疫毒素″是指化学或生物学连接细胞毒素或细胞毒性剂的抗体或生长因子。
实施例所用″有效量″是指杀伤细胞或抑制其增殖的抗体、免疫缀合物、重组分子的量。
实施例所用″竞争性抑制″是指能够与另一分子的相同靶物质相结合。对于抗体，竞争性抑制是指抗体能够识别并结合另一抗体所针对的同一抗原结合区。
实施例所用″抗原结合区″是指本发明中能识别靶物质或其部分的抗体、重组分子、融合蛋白质或免疫缀合物的一部分。
实施例所用″治疗剂″是指可用于治疗的任何试剂，包括抗肿瘤药、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性剂。
实施例所用″抗肿瘤药″是指可用于治疗癌症的任何试剂，包括但不限于细胞毒素及药剂，例如抗代谢物、烷化剂、蒽环霉素、抗生素、抗有丝分裂剂、甲基苄肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类甾醇、mytotane(O，P′-(DDD))、干扰素和放射性试剂。
实施例所用″细胞毒素或细胞毒性剂″是指对细胞有害的任何试剂。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、tenoposide、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、潘妥卡因、昔罗卡因、心得安和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
实施例所用″放射性同位素″包括有效破坏肿瘤的任何放射性同位素。例子包括而不限于钴-60和X射线。另外，天然存在的放射性元素，例如铀、镭和钍(其一般为放射性同位素的混合物)，是放射性试剂的合适例子。
实施例所用″给药″是指对受试者经口服给药、栓剂给药、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给药，或者缓释装置植入(例如微型渗透泵)。
实施例所用″直接″是指利用偶联标记物的抗体。样品与标记的抗体温育，洗涤除去未结合抗体，然后检验样品。
实施例所用″间接″是指样品与非缀合抗体温育、洗涤，然后与荧光素缀合的抗体温育。由二抗或″夹心″抗体显示一抗的存在。
实施例所用″反应″是指识别并结合靶物质。结合可以是非特异性的。优选特异性结合。
实施例所用″治疗″是指基本上使肿瘤完全退化，以致一段时期，(即＞/＝10倍的肿瘤体积倍增时间(TVDD＝对照肿瘤大小倍增所需的时间天数))肿瘤仍不可触知的。
实施例所用″肿瘤靶向抗体″是指识别肿瘤(即癌症)细胞上的C35抗原的任何抗体。
实施例所用″抑制增殖″是指以任何方法干扰细胞生长。
实施例所用″哺乳动物肿瘤细胞″包括来自动物例如人、羊、猪、鼠、牛的细胞。
实施例所用″药物可接受的载体″包括与抗体结合时保持抗体的免疫原性并不与受试者免疫系统反应性的任何物质。例子包括而不限于任何标准的药物载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(例如油/水乳剂)，以及各种类型的湿润剂。其它载体可能还包括无菌溶液、片剂(包括糖衣片)和胶囊。
上述载体一般包括赋形剂，例如淀粉、奶、糖、某种粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石粉、植物脂肪或油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。上述载体可能还包括调味剂和色素添加剂或其它成分。利用熟知的常规方法配制包含上述载体的组合物。
本发明涉及针对癌细胞高度特异的C35抗体。更具体而言，该抗体与多种癌，例如乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌发生反应，而与人正常组织或其它类型肿瘤例如肉瘤或淋巴瘤没有反应性或者反应性有限。
此处所用术语″C35抗体″包括全部、完整的多克隆和单克隆抗体物质以及嵌合的抗体分子。上述C35抗体包括利用本领域已非常成熟的技术获得的、其中包含抗体的活性抗原结合区(例如Fab、F(ab′)2和Fv片段)的其任何片段[例如参见Rousseaux等人，″Optimal ConditionsFor The Preparation of Proteolytic Fragments From Monoclonal IgGof Different Rat IgG Subclasses″，Methods Enzymol.，121663-69(Academic Press 1986)]。本发明的C35抗体还包括融合蛋白质。
本发明还包括本发明C35抗体的抗独特型抗体。可利用C35抗体和/或其片段作为免疫原制备这些抗独特型抗体，并用于检测肿瘤的体液应答和治疗应用的诊断目的，例如疫苗，以诱导病人的抗肿瘤反应[例如参见Nepom等人，″Anti-Idiotypic Antibodies And The InductionOf Specific Tumor Immunity″，Cancer And Metastasis Reviews，6487-501(1987)]。
此外，本发明包括能够结合与C35抗体相同的抗原决定簇、并在该位点与该抗体竞争结合的抗体。这包括具有与C35抗体相同的抗原特异性、但来源物种、同种型、结合亲和力或生物学功能(例如细胞毒性)不同的抗体。例如，可以利用本领域已知的重组类别-转换(class-switching)和融合技术，构建具有C35抗体抗原结合区的本发明抗体的类别、同种型及其它变体[例如参见Thammana等人，″Immunoglobulin Heavy Chain Class Switch From IgM to IgG In AHybridoma″，Eur.J.Immunol.，13614(1983)；Spira等人，″TheIdentification Of Monoclonal Class Switch Variants BySubselection And ELISA Assay″，J.Immunol.Meth.74307-15(1984)；Neuberger等人，″Recombinant Antibodies Possessing Novel EffectorFunctions″，Nature 312614-608(1984)；以及Oi等人，″ChimericAntibodies″，Biotechniques 4(3)214-21(1986)]。因此，具有与C35特异性抗体相同结合特异性的其它嵌合抗体或其它重组抗体(例如融合蛋白质，其中抗体与另一蛋白质例如淋巴因子或肿瘤抑制生长因子结合)，都属于本发明范围之内。
如此处所述可利用本领域已知的基因工程技术制备重组免疫毒素，方法是在DNA水平将C35抗体的抗原结合区与治疗剂或细胞毒性剂融合，并制备嵌合蛋白质形式的细胞毒性分子。治疗剂的例子包括而不限于抗代谢物、烷化剂、蒽环霉素、抗生素和抗有丝分裂剂。抗代谢物包括氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺(decarbazine)。烷化剂包括氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、二甲磺酸丁酯、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺-二氯双胺铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂(cisplatin)。蒽环霉素包括柔红霉素(原来的道诺霉素)和阿霉素(此处也指亚德里亚霉素)。其它例子包括米托蒽醌和比山群。抗生素包括放线菌素(dactinomycin，原来的放线菌素actinomycin)、博莱霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC)。抗有丝分裂剂包括长春新碱和长春花碱(通常称为长春花生物碱)。其它细胞毒剂包括甲基苄肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类甾醇、mytotane(O，P′-(DDD))、干扰素。另外的细胞毒剂例子包括而不限于蓖麻素、阿霉素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、鬼臼亚乙苷、tenoposide、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮，1-脱氢睾酮和糖皮质激素。
本发明显然包括上述治疗剂和细胞毒剂的类似物和同系物。例如化疗药物氨基蝶呤有一个相关的改进类似物，即氨甲蝶呤。另外，阿霉素的改进类似物是铁-螯合物。还有，1-甲基亚硝脲的改进类似物是环己亚硝脲。另外，长春花碱的改进类似物是长春新碱。另外，氮芥的改进类似物是环磷酰胺。
重组免疫毒素，特别是单链免疫毒素，与药物/抗体缀合物相比，优点在于比这些缀合物更易于制备，并得到均一的分子群体，即由相同氨基酸残基组成的单一的肽。克隆和表达编码与C35单链免疫毒素相应的氨基酸序列的DNA序列的技术，例如寡核苷酸合成、PCR、转化细胞、构建载体、表达系统等，在本领域已非常成熟，大多数专业人员熟悉用于特定条件和方法的标准原料[例如参见Sambrook等人，eds.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)]。
以下包括本发明免疫缀合物的优选实施方案。本发明包括本领域已知的其它实施方案。本发明并不局限于这些特异性免疫缀合物，还包括含有本发明抗体和/或抗体片段的其它免疫缀合物。
缀合物包含至少一种药物分子，其通过本发明的接头连接与目的靶细胞群体反应的靶向作用的配基分子。配基分子可以是免疫活性蛋白质(例如抗体或其片段)、非免疫活性蛋白质或肽配基(例如蛙皮素)、或识别细胞相关受体(如凝集素或类固醇分子)的结合配基。
另外，由于本发明的缀合物可用于修饰给定的生物反应，不能认为药物部分局限于经典化疗药物。例如，药物部分可能是具有目的生物学活性的蛋白质或多肽。该蛋白质可包括，例如毒素如相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源性生长因子、组织纤溶酶原激活物；或者生物反应调节物如淋巴因子、白细胞介素-1(″IL-1″)、白细胞介素-2(″IL-2″)、白细胞介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)，粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其它生长因子。
本发明所用的优选的药物是细胞毒药物，特别是用于癌症治疗的细胞毒药物。这些药物通常包括烷化剂、抗增殖剂、微管蛋白结合剂等。优选的细胞毒剂类别包括，例如蒽环霉素家族药物、长春花属药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒核苷、蝶啶家族药物、diynenes和鬼臼毒素。这些类别中特别有用的药物包括，例如阿霉素、洋红霉素、柔红霉素、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、甲喋呤、二氯氨甲喋呤、丝裂霉素C、甲基丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素或者鬼臼毒素衍生物如鬼臼亚乙苷或磷酸鬼臼亚乙苷、苯丙氨酸氮芥、长春花碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。如上所述，本领域技术人员可以对目的化合物进行化学修饰，以便使化合物的反应更为方便，以制备本发明的偶联物。
如上所述，本领域技术人员应当理解本发明还包括识别抗原的免疫球蛋白片段的应用。该免疫球蛋白片段可包括，例如Fab′、F(ab′)2、F[v]或Fab片段、或者可识别抗原的其它免疫球蛋白片段。可以利用例如蛋白水解酶消化(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化)、还原性烷基化作用或者重组技术制备该免疫球蛋白片段。制备该免疫球蛋白片段的材料和方法为本领域技术人员所熟知。一般参见Parham，J.Immunology，131，2895(1983)；Lamoyi等人，J.Immunological Methods，56，235(1983)；Parham，id.，53，133(1982)；以及Matthew等人，id.，50，239(1982)。
免疫球蛋白可以是如本领域所知的术语″嵌合抗体″。免疫球蛋白还可能是″双功能″或″杂合″抗体，即抗体的一个臂具有一个抗原性位点(例如肿瘤相关抗原)的特异性，而另一个臂识别不同的靶物质，例如半抗原，本身即是或者结合有对携带抗原的肿瘤细胞具有杀伤作用的药物。另外，双功能抗体可以是每个臂对将要治疗或者生物学修饰的细胞的肿瘤相关抗原不同表位具有特异性的抗体。无论如何，杂合抗体具有双重特异性，优选地，具有针对所选半抗原的一个或多个结合位点，或者针对靶抗原(例如与肿瘤、感染性生物体或其它疾病相关的抗原)的一个或多个结合位点。
例如欧洲专利文献EPA 0 105 360描述了生物学双功能抗体，供本领域技术人员参考。该杂合或双功能抗体可如所述，通过生物学细胞融合技术或化学方法(特别是交联剂或二硫键形成试剂)得到，并可包含其抗体和/或其片段。例如，1983年10月27日公开的PCT申请WO83/03679以及1987年4月8日的已公布的欧洲申请EPA 0 217 577，公开了获得该杂合抗体的方法。特别优选的双功能抗体是从″多巢″或″细胞杂交瘤(quadroma)″生物学制备的，或者利用交联剂诸如双-(马来酰亚胺)甲醚(″BMME″)或本领域技术人员熟悉的其它交联剂合成制备。
另外免疫球蛋白可能是单链抗体(″SCA″)。其可由单链Fv片段(″scFv″)组成，其中轻链可变结构域(″V[L]″)和重链可变结构域(″V[H]″)通过肽桥或二硫键连接。免疫球蛋白还可由具有抗原结合活性的单独的V[H]结构域(dAbs)组成。例如参见G.Winter和C.Milstein，Nature 349295(1991)；R.Glockshuber等人，Biochemistry 291362(1990)；以及E.S.Ward等人，Nature 341544(1989)。
本发明特别优选使用嵌合单克隆抗体，优选对肿瘤相关抗原具有特异性的嵌合抗体。实施例所用术语″嵌合抗体″是指通常利用重组DNA技术制备的、包含来自一种来源或物种的可变区(即结合区)以及至少一部分来自不同来源或物种的恒定区的单克隆抗体。本发明的某些应用，特别是人的治疗，优选包含鼠可变区以及人恒定区的嵌合抗体，因为该抗体易于制备，并可能比完全的鼠单克隆抗体免疫原性更低。该鼠/人嵌合抗体是包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA片段以及编码人免疫球蛋白恒定区的DNA片段的免疫球蛋白基因的表达产物。本发明包含的其它形式的嵌合抗体是原始抗体的类别或亚类已经修饰或改变的抗体。该″嵌合″抗体也指″类别转换的抗体″。制备嵌合抗体的方法包括本领域当前熟知的常规重组DNA和基因转染技术。例如参见Morrison，S.L.等人，Proc.Natl Acad.Sci.，81，6851(1984)。
术语″嵌合抗体″包含″人源化抗体″的概念，即构架或″互补性″决定区(″CDR″)已被修饰，以包含与亲代免疫球蛋白特异性不同的免疫蛋白的CDR的抗体。优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区，以制备″人源化抗体″。例如参见L.Riechmann等人，Nature 332323(1988)；M.S.Neuberger等人，Nature 314268(1985)。特别优选的CDR对应于嵌合和双功能抗体识别上述抗原的代表序列。读者可参考EPA 0 239 400(出版于1987年9月30日)中有关CDR修饰的抗体的教导。
本领域技术人员应当承认，可以制备双功能-嵌合抗体，其具有嵌合抗体或人源化抗体的较低免疫原性的优点，以及上述双功能抗体的灵活性，特别是对于治疗的灵活性。例如利用交联剂化学合成和/或上述的重组方法，可以合成该双功能-嵌合抗体。无论如何，本发明不应被理解为局限于通过任何特定的方法制备抗体的范围内，不论是双功能的、嵌合的、双功能-嵌合的、人源化的抗体或其抗原识别片段或衍生物。
此外，在本发明范围内包含免疫球蛋白(如上所述)或免疫球蛋白片段，其融合了活性蛋白质，例如Neuberger等人1986年3月13日公开的PCT申请WO86/01533中公开的类型的酶。该公开内容于此处引入作为参考。
如上所述，″双功能的″、″融合的″、″嵌合的″(包括人源化的)以及″双功能-嵌合的″(包括人源化的)抗体构建体，也包括在其各自范围内包含抗原识别片段的构建体。本领域技术人员应当承认，该片段可以利用传统的酶解完整的双功能的、嵌合的、人源化的或嵌合-双功能抗体的方法制备。然而，如果完整的抗体由于所涉及构建物的本性而对降解不敏感，可以利用免疫球蛋白片段为原始材料制备所述构建物；或者，如果利用重组技术，可以使DNA序列本身适于编码目的″片段″，其被表达以后，可以在体内或体外通过化学或生物学方法组合，以制备最终所需的完整的免疫球蛋白″片段″。因此，在该背景下使用术语″片段″。
此外，如上所述，本发明所用的免疫球蛋白(抗体)或其片段本质上可能是多克隆或单克隆的。然而优选的免疫球蛋白是单克隆抗体。本领域技术人员目前熟知多克隆或单克隆抗体的制备方法，他们当然完全能够制备可用于本发明的有用的免疫球蛋白。例如参见G.Kohler和C.Milstein，Nature 256495(1975)。此外，杂交瘤和/或通过该杂交瘤制备的用于实现本发明的单克隆抗体可公开获得，例如以美国典型培养物保藏中心(″ATCC″)10801 University Blvd.，Manassas，VA.20110。
用于本发明的单克隆抗体特别优选识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体。
诊断技术
血清学诊断技术包括检测和定量分泌到或“流(shed)”到据认为是患癌病人的血清或其它生物学液体中的肿瘤相关抗原。可以利用本领域已知技术，例如放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测体液中的该抗原，其中利用与″流出″抗原反应的抗体检测流体样品中存在的抗原[例如参见Uotila等人，″Two-Site Sandwich ELISA WithMonoclonal Antibodies To Human AFP″，J.Immunol.Methods，4211(1981)以及Allum等人，前文48-51页]。因此，利用此处公开的C35抗体进行的这些测定，可以用于检测生物学流体中与C35抗体反应的抗原，从而检测病人中的癌。因此根据上文显而易见，本发明的C35抗体可用于涉及抗原抗体反应的大多数试验。这些试验包括而不限于标准的液相和固相RIA技术、ELISA试验、ELISPOT、免疫荧光技术及其它的免疫细胞化学试验[例如参见Sikora等人(eds.)，MonoclonalAntibodies，pp.32-52(Blackwell Scientific Publications 1984)]。
本发明也包括进行上述试验的诊断试剂盒。一个实施方案中，诊断试剂盒包含本发明的C35单克隆抗体、其片段、融合蛋白质或嵌合抗体，以及包含C35抗体的特异性结合配偶体和能够产生可检测信号的标记物的缀合物。试剂还可包括辅助试剂，例如缓冲剂和蛋白质稳定剂(例如多糖)。必要时诊断试剂盒可进一步包含信号产生系统的其它组分，包括降低背景干扰的试剂、对照试剂或进行测试的装置或容器。
另一实施方案中，诊断试剂盒包含本发明C35抗体和能够产生可检测信号的标记物的缀合物。也可以包含上述的辅助试剂。
本发明C35抗体也可用于人癌检测的体内诊断应用。该方法之一涉及通过肿瘤造影技术体内检测肿瘤。根据该方法，用能产生可检测信号的合适造影剂标记C35抗体。可以使用的造影剂的例子包括而不限于，放射性标记例如<131>I，<111>In，<123>I，<99m>Tc，<32>P，<125>I，<3>H，和<14>C，荧光标记例如荧光素和罗丹明，以及化学发光剂例如虫萤光素。可利用本领域已知技术用该试剂标记抗体。例如有关抗体放射标记技术参见Wensel和Meares，Radioimmunoimaging AndRadioimmunotherapy，Elsevier，New York(1983)[也参见Colcher等人，″Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals ForThe Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice″，Meth.Enzyinol.121802-16(1986)]。
就放射性标记抗体而言，给予病人抗体，定位到具有与该抗体反应的抗原的肿瘤，并利用已知技术(诸如利用例如γ照相机或发射断层术进行放射性核的扫描)体内检测或″造影″[例如参见Bradwell等人，″Developments In Antibody Imaging″，Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，pp.65-85(Academic Press 1985)]。给予病人在药物可接受的载体(诸如水、盐、Ringer′s液、Hank′s液或非水载体如不挥发油)中的抗体。载体也可包含增强抗体等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲液或防腐剂。抗体制剂是通过例如静脉内给药，其剂量足以提供足够的γ发射而使肿瘤靶位点可见。在给予抗体和检测之间应有足够时间，使之完成肿瘤靶定位。肿瘤造影的一般讨论参见Allum等人，前文51-55页。
C35抗体的治疗应用
C35抗体的特性适于许多体内的治疗应用。
首先，C35抗体能够单独用于体内靶向和杀伤肿瘤细胞。该抗体还可以与合适的治疗剂联用，治疗人类癌症。例如，该抗体可与标准或常规治疗方法诸如化疗、放疗联用，或者缀合或连接治疗药物或毒素，以及淋巴因子或肿瘤-抑制生长因子，将治疗剂传递到癌位点。
将治疗剂与抗体缀合的技术众所周知[例如参见Amon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，″Antibodies For Drug Delivery″，Controlled Drug Delivery(2ndEd.)，Robinson等人(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review″，Monoclonal Antibodies′84Biological And ClinicalApplications，Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985)；以及Thorpe等人，″The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62119-58(1982)]。
另外，C35抗体可结合高能辐射，例如放射性同位素如<131>I，其定位于肿瘤位点时引起数个细胞直径的杀伤[例如参见Order，″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)]。根据另一实施方案，C35抗体可缀合另一抗体，形成治疗肿瘤细胞的抗体杂缀合体(如Segal在美国专利4,676,980中所述)。
本发明C35抗体的其它治疗应用还包括，例如通过重组DNA技术缀合或连接能将前体药物转变为细胞毒药物的酶，以及该抗体-酶缀合物与前体药物结合，在肿瘤位点将前体药物转变为细胞毒药物的用途[例如参见Senter等人，″Anti-Tumor Effects Of Antibody-alkalinePhosphatase″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，854842-46(1988)；″Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites ofPhosphoiylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives byMonoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates″，CancerResearch 495789-5792(1989)；以及Senter，″Activation ofProdrugs by Antibody-Enzyme ConjugatesAnewApproach to CancerTherapy，″FASEB J.4188-193(1990)]。
C35抗体的另一治疗应用还包括，在补体存在下或作为抗体-药物或抗体-毒素缀合物的一部分，从癌症病人的骨髓中除去肿瘤细胞的应用。依据这种方法，自体骨髓可通过该抗体处理而离体净化，然后骨髓被回输给病人[例如参见Ramsay等人，″Bone Marrow Purging UsingMonoclonal Antibodies″，J.Clin.Immunol.，8(2)81-88(1988)]。
此外，前述本发明嵌合C35、重组免疫毒素及其它重组构建体，其包含C35单克隆抗体的抗原结合区特异性，可用于治疗。例如本发明的单链免疫毒素，可用来体内治疗人类癌症。
类似地，至少包含C35抗体的抗原结合区(其至少与具有抗肿瘤活性的另一蛋白质(例如淋巴因子或制瘤素)的功能活性部分连接)的融合蛋白质，可用于体内治疗人类癌症。此外，本领域已知的重组技术可用于构建双特异性抗体，其中该抗体的一种结合特异性是C35的结合特异性，而另一种结合特异性是除C35以外分子的结合特异性。
最后，C35抗体的抗独特型抗体可用于主动肿瘤免疫和肿瘤治疗[例如参见Hellstrom等人，″Immunological Approaches To TumorTherapyMonoclonal Antibodies，Tumor Vaccines，AndAnti-Idiotypes″，Covalently Modified Antigens And Antibodies InDiagnosis And Therapy，前文35-41页]。
本发明提供了选择性杀伤表达特异性结合C35单克隆抗体或功能等价物的抗原的肿瘤细胞的方法。该方法包括使所述肿瘤细胞与本发明的免疫缀合物(例如免疫毒素)反应。这些肿瘤细胞可来自人类癌症。
另外，本发明提供体内治疗癌症(例如人类癌症)的方法。该方法包含给予受试者药物有效量的包含至少一种本发明免疫缀合物(例如免疫毒素)的组合物。
根据本发明的实践，受试者可能是人、马、猪、牛、鼠、犬、猫和鸟。其它温血动物也包括在本发明内。
本发明也提供治疗癌症受试者的方法。受度者可以是人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊、牛、鸡。癌症可为乳腺癌、膀胱癌、视网膜母细胞瘤、卵巢乳头状囊腺癌、Wilm′s肿瘤或小细胞肺癌，通常其特征为细胞表面具有肿瘤相关抗原的一群细胞。该方法包括给予受试者癌症杀伤剂量的与细胞毒剂连接的肿瘤靶向抗体。通常，在允许抗体与其细胞表面靶物质结合的条件下，将肿瘤靶向抗体与细胞毒剂结合。通过与其靶物质结合，肿瘤靶向抗体直接或间接导致或促进杀伤所结合的细胞，从而治疗受试者。
本发明还提供了抑制哺乳动物肿瘤细胞增殖的方法，其包含将哺乳动物肿瘤细胞与足够浓度的本发明的免疫缀合物接触，以抑制哺乳动物肿瘤细胞的增殖。
本发明另外提供了抑制人肿瘤细胞生长、治疗受试者肿瘤以及治疗受试者增殖性疾病的方法。这些方法包含给予受试者有效量的本发明组合物。
因此显然本发明包含治疗人类癌症的药物组合物、组合和方法。例如，本发明包括用于治疗人类癌症的药物组合物，其中包含药物有效剂量的C35抗体和药物可接受的载体。
该组合物可包含未修饰的、与治疗剂缀合的(例如药物、毒素、酶或另一抗体)或者重组形式(例如嵌合的C35、嵌合C35的片段、双特异性C35或单链免疫毒素C35)的C35抗体或抗体片段。该组合物另外可包括用于治疗癌症的其它抗体或缀合物(例如抗体混合物)。
本发明的抗体、抗体缀合物和免疫毒素组合物可利用常规给药方式给药，包括但不限于静脉内、腹膜内、口服、淋巴内给药或直接给药到肿瘤内。优选静脉内给药。
本发明的组合物可以是各种剂型，包括而不限于液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、栓剂、聚合微胶囊或微囊、脂质体以及可注射或输注的溶液。优选的形式取决于给药方式和治疗应用。
本发明的组合物还优选包括本领域已知的常规药物可接受的载体和助剂，诸如人血清白蛋白、离子交换剂、氧化铝、卵磷脂、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾以及盐或电解质如硫酸鱼精蛋白。
本发明组合物的最有效给药方式和剂量方案取决于疾病的严重性和病程、病人的健康状态和对治疗的反应，以及治疗医师的判断。因此，组合物的剂量应当针对单独的病人确定。然而，本发明组合物的有效剂量可在大约1-2000mg/kg范围内。
此处所述分子可以是各种剂型，包括而不限于液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、栓剂、聚合微胶囊或微囊、脂质体以及可注射或输注的溶液。优选的形式取决于给药方式和治疗应用。
本发明分子的最有效给药方式和剂量方案取决于所治疗肿瘤的部位、癌症的严重性和病程、患者的健康状态和对治疗的反应，以及治疗医师的判断。因此，该分子的剂量应当针对单独的受试者确定。
Freireich，E.J.等人Cancer Chemother.，Rep.50(4)219-244(1966)描述了基于mg/kg体表面积各种大小和物种的动物与人的剂量相互关系。调整剂量方案可优化肿瘤细胞生长抑制及杀伤反应，例如可以分开剂量并按日给药，或者根据情况按比例降低剂量(例如每日给药几个分剂量，或者根据特定的治疗情况按比例降低)。
显然，完成治疗所需的本发明组合物的剂量可以按预定优化进一步降低。
依照本发明的实践，该药物载体可以是脂类载体。该脂类载体可以是磷脂。另外，该脂类载体可以是脂肪酸。该脂类载体还可以是去污剂。此处所用去污剂是改变(一般是降低)液体表面张力的任何物质。
本发明的一个实施例中，去污剂可以是非离子型去污剂。非离子型去污剂的例子包括而不限于聚山梨醇酯80(又名Tween 80或(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯))、Brij和Triton(例如Triton WR-1339和TritonA-20)。
另外，该去污剂可以是离子型去污剂。离子型去污剂的例子包括而不限于烷基三甲基溴化铵。
另外，依照本发明，该脂类载体可以是脂质体。本申请所用″脂质体″是包含本发明任何分子或其组合的任何膜结合囊。
疫苗制剂
利用重组DNA方法可大量制备C35表位，并与促进细胞介导免疫应答的佐剂配剂。本发明包括在真核或原核重组表达载体中表达C35多肽或C35表位(包括细胞毒性或辅助T细胞诱导的表位)；以及将其配制成免疫原性和/或抗原性组合物。例如，美国专利申请号08/935,377描述了该组合物，在此全文引入供参考。根据本发明，重组表达的C35表位可以被表达、纯化和配制为亚单位疫苗。优选地，编码C35表位的DNA也可构建到病毒载体中，优选痘病毒、腺病毒、疱疹病毒和甲病毒载体，用于疫苗。在这方面可以配制活的、灭活的或杀死的重组病毒疫苗。
(i)在原核和真核表达系统中表达C35
本发明包括可用来表达C35表位的真核和原核表达载体的表达系统。C35表位可以表达为截短的或全长形式，特别是用于组成亚单位疫苗。
本发明包含表达编码C35多肽及免疫学等价片段的核苷酸序列。可通过制备编码鉴定表位的核苷酸序列的类似物(在该序列5′和/或3′端截短和/或具有一个或多个内部缺失)、表达该类似物核苷酸序列、以及确定所得片段是否受表位特异性T淋巴细胞免疫识别并诱导细胞介导免疫应答、或受表位特异性B淋巴细胞识别以诱导体液免疫应答，从而鉴定该免疫学等价片段。
本发明包括含有任何上述编码序列(可操作性地连接有指导编码序列表达的调节元件)的DNA表达载体以及包含任何上述编码序列(可操作性地连接有在宿主细胞中指导编码序列表达的调节元件)的基因工程宿主细胞。此处所用调节元件包括而不限于可驱动并调节表达的可诱导型和非诱导型启动子、增强子、操作子及本领域技术人员已知的其它元件。
可以利用本领域公知的方法，通过重组DNA技术制备C35表位的基因产物或其肽片段。因此，此处描述了通过表达包含表位基因序列的核酸，来制备本发明C35表位基因多肽和肽的方法。本领域技术人员公知的方法可用于构建包含表位基因产物编码序列以及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。例如参见Sambrook等人，在Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press，以及Ausubel等人，1989，前文中所述技术。另外，可以利用例如合成仪，化学合成能够编码糖蛋白表位基因产物序列的RNA。例如参见″Oligonucleotide Synthesis″，1984，Gait，M.J.ed.，IRL Press，Oxford所述技术，在此全文引入供参考。
本发明也包含编码C35表位基因产物肽片段的核苷酸序列。例如，对应于C35表位胞外结构域的多肽或肽可用作促进分泌的″可溶性″蛋白质，特别是用于制备亚单位疫苗。C35表位基因产物或其肽片段(可以与商品化的抗体识别的异源表位相连接)也包括在本发明之内。也可制备耐久的融合蛋白质；即C35表位序列和异源蛋白质序列之间具有裂解位点的融合蛋白质，因此可以将所选的C35与异源部分分开。例如，可以在C35表位蛋白质或肽与异源肽或蛋白质之间制造胶原酶裂解识别的共有序列。通过胶原酶处理，可以从该融合蛋白质中释放表位结构域。本发明的优选实施方案中，可以制备谷胱甘肽-S-转移酶与C35表位的融合蛋白质。
本发明用于疫苗制剂，特别是亚单位疫苗制剂的C35表位蛋白质，基本上是纯的或同质的。至少60-75％的样品呈现单一多肽序列时，可认为该蛋白质基本上是纯的或同质的。基本上纯的蛋白质优选包含60-90％、更优选大约95％、最优选99％的蛋白质样品。可用本领域技术人员公知的方法确定蛋白质纯度或同质性，诸如样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳、然后在染色凝胶上显现单一的多肽条带。可利用本领域公知的HPLC或其它类似方法，确定更高的分辨率。
本发明包含的C35多肽，其一般从表达编码这些蛋白质的重组核苷酸序列的宿主细胞中纯化。利用本领域公知的各种方法完成该蛋白质的纯化。优选实施方案中，本发明的C35表位蛋白质表达为与谷胱甘肽-S-转移酶融合的融合蛋白质。利用亲和层析纯化得到的重组融合蛋白质，表位蛋白质结构域与异源部分断裂，得到基本上纯的蛋白质样品。可利用本领域技术人员所知的其它方法；例如参见″Methods In Enzymology″，1990，Academic Press，Inc.，San Diego，″Protein PurificationPrinciples and Practice″，1982，SpringerVerlag，New York中所述技术，在此全文引入供参考。
(ii)真核和原核表达载体
本发明包括可用来表达C35表位的真核和原核表达载体的表达系统。多种宿主-表达载体系统可用于表达本发明的C35表位基因。该宿主-表达系统代表载体，通过它可以制备C35编码序列并进行随后纯化，也代表用C35核苷酸编码序列转化或转染后、可原位呈现本发明C35表位基因产物的细胞。其包括而不限于，用包含C35表位基因产物编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的表达载体转化的微生物如细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用包含C35表位基因产物编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如糖酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用包含C35表位基因产物编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含C35表位基因产物编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或者重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)，其中带有包含来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体。
(iii)宿主细胞
本发明包含在动物和昆虫细胞系中表达C35表位。本发明的优选实施方案中，C35表位在昆虫细胞系中杆状病毒载体上表达，以制备非糖基化抗原。本发明的另一优选实施方案中，在稳定转染的哺乳动物宿主细胞(例如CHO细胞系)中表达C35表位，以制备糖基化抗原。这些细胞系重组表达的C35表位可以配制成亚单位疫苗。本发明另外涉及过表达C35基因产物的宿主细胞。该细胞可以是利用任何合适载体瞬时或者稳定转染或转化的宿主细胞，载体中包括编码C35多肽或其片段的多核苷酸序列，以及指导C35基因产物过表达的合适启动子和增强子序列。然而，过表达的细胞也可以是插入(例如通过同源重组)指导内源性C35基因过表达的异源启动子或增强子的产物。术语″过表达″是指其它条件都相同时，表达水平高于给定细胞特征性的基础表达水平。
可以选择调节插入序列表达、或以所需特定方式修饰和加工C35基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如分裂)对该蛋白质的功能可能很重要。不同的宿主细胞具有特征的和特定的蛋白质及基因产物翻译后加工和修饰的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以保证所表达的外源蛋白的正确修饰。为此，可以利用具有可适当加工始转录本、对C35基因产物糖基化、磷酸化和异戊二烯化的细胞器的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括而不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38细胞系。
为长期、高产量制备重组蛋白质，优选稳定性表达。例如，可以改造稳定表达C35目标表位的细胞系。除了利用包含病毒复制起点的表达载体，可以利用合适的表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA以及选择标志转化宿主细胞。引入外源DNA后，可使改造的细胞在丰富培养基中生长1-2天，然后转到选择性培养基。重组质粒的选择标志提供选择抗性，使细胞将质粒稳定整合到染色体中，形成基因座，随后被克隆并扩增到细胞系中。此方法可方便地用于改造细胞系。此方法可方便地用于改造表达C35表位基因产物的细胞系。该细胞系可特别用于筛选和评价影响C35表位基因产物内源活性的化合物。
可以利用多种选择系统，包括而不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11223)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA482026)，以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，Cell 22817)基因，其可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。还可以利用抗代谢物抗性针对以下基因的选择基础提供氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567；O′Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；提供霉酚酸抗性的gpt(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；提供氨基糖苷G-418抗性的neo(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.1501)；以及提供潮霉素抗性的hygro(Santerre等人，1984，Gene 30147)。
另外，利用特异性针对所表达的融合蛋白质的抗体，可以很容易纯化任何融合蛋白质。例如，Janknecht等人描述的系统允许容易纯化人细胞系中表达的未变性融合蛋白质(Janknecht等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888972-8976)。该系统中，将目的基因亚克隆到牛痘重组质粒，使该基因的开放阅读框架可翻译地与包含6个组氨酸残基的氨基端标记融合。将经重组痘苗病毒感染的细胞的提取物，上样到Ni2+·氮川乙酸-琼脂糖柱上，用包含咪唑的缓冲液选择性洗脱组氨酸-标记的蛋白质。
(iv)重组病毒疫苗中C35表位的表达
本发明的另一实施方案中，能够制备表达C35表位的活重组病毒疫苗或灭活重组病毒疫苗。优选活疫苗，因为其在宿主中扩增导致与自然感染种类和大小相似的刺激延长，因而提供大量、持久的免疫力。可以利用在细胞培养或鸡胚尿囊中繁殖病毒、并随后纯化的常规方法进行重组活病毒疫苗制剂的制备。
在这方面，多种病毒可以基因工程改造以表达C35表位。对于疫苗来说，其可能需要具有减毒特性的重组病毒。当前供人使用的活病毒疫苗候选物是耐冷、热敏或减毒的。在用于转染的模板中引入合适的突变(例如缺失)，可提供具有减毒特性的新病毒。例如，与温度敏感性或寒冷适应性有关的特定的多重错义突变，能够制成缺失突变和/或多重突变，其可引入各个病毒基因中。这些突变体应该比包含单一点突变的冷敏或温度敏感突变体更稳定，回复频率应该非常低。另外，可构建具有″自杀″特性的重组病毒。此病毒在宿主中只经历一轮或几轮复制。
为了本发明目的，具有以下特征的任何病毒可用于本发明(a)表现减毒表型或可改造为表现减毒表型特征；(b)表现对哺乳动物特别是对人的趋向性，或者可改造为表现这种趋向性；以及(c)可以改造为表达本发明的C35表位。
牛痘病毒载体可用于本发明，因为大的DNA片段很容易被克隆到其基因组中并且重组减毒牛痘变体已有描述(Meyer等人，1991，J.Gen.Virol.721031-1038)。正粘病毒，包括流感病毒；副粘病毒，包括呼吸道合胞病毒和仙台病毒；以及弹状病毒可以改造为表达可产生减毒表型的突变(参见美国专利Serial No.5,578,473,1996年11月26日颁发)。这些病毒基因组也可改造为表达外源核苷酸序列，例如本发明的C35表位(参见美国专利Serial No.5,166,057,1992年11月24日颁发，在此全文引入以供参考)。可以应用反向遗传学技术操作负链或正链RNA病毒基因组，以引入可产生减毒表型的突变，例如在流感病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和EB病毒、新培斯病毒以及脊髓灰质炎病毒中所示(参见Palese等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9311354-11358)。这些技术也可用于引入外源DNA(即C35表位)，以制备用作本发明疫苗的重组病毒载体。例如参见美国专利申请号08/935,377，在此全文引入以供参考。此外，可以改造减毒腺病毒和逆转录病毒，以表达C35表位。因此，可以改造多种病毒，以设计本发明的疫苗，然而，通过而不受限于实施例，此处描述了表达C35表位、用作疫苗的重组减毒牛痘载体。
一个实施方案中，重组修饰的牛痘变体、修饰的安卡拉病毒(Modified Virus Ankara，MVA)用于疫苗制剂。此修饰的病毒已经在鸟类细胞中传代500次，不能在哺乳动物细胞中进行完整的感染周期。(Meyer等人，1991，J.Gen.Virol.7210311038)。用作疫苗时，重组病毒经历单个复制周期，并诱导足够水平的免疫应答，而不在人类宿主中继续生存并导致疾病。缺少一种或多种牛痘病毒必需基因的重组病毒不能进行连续的复制循环。通过与缺少病毒复制所需特定基因的牛痘载体共转染永久表达该基因的细胞系，可以制备该缺陷病毒。缺少必需基因的病毒将在这些细胞系中复制，但给予人类宿主时，将不能完成一轮复制。该制剂可在此无效循环中转录和翻译足量的基因，以诱导免疫应答。
另外，可以将大量毒株给药，因此这些制剂可作为灭活(死)病毒、疫苗。对于灭活疫苗，优选表达异源C35基因产物作为病毒组分，因此C35基因产物与病毒颗粒有关。该制剂的优点在于其包含天然蛋白质，无需用福尔马林或者其它用于制备死病毒疫苗的试剂处理，进行灭活。
本发明另一实施方案中，利用常规方法″杀死″重组病毒，制备灭活疫苗制剂。灭活疫苗是″死的″是指其感染性已被破坏。理想地是破坏病毒的感染性，而不影响免疫原性。为了制备灭活疫苗，重组病毒可在细胞培养物或者鸡胚尿囊中生长，区带超速离心法纯化，甲醛或者β-丙内酯灭活，并混合。获得的疫苗通常肌内接种。
为了增强免疫应答，灭活病毒可与合适的佐剂一起配制。佐剂可包括而不限于矿物凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子；肽；寡核苷酸、油乳剂；以及具有潜在用途的人类佐剂，例如BCG和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
(v)治疗和/或接种方法
技术领域：
本发明的C35表位可以大量制备，因此制备和纯化的抗原可用作疫苗制剂。C35表位可配制成亚单位疫苗制剂，或者可构建到病毒载体中并配制成疫苗制剂。另外，编码C35表位的DNA可作为疫苗制剂直接给药。一旦给予受试者的″裸″质粒DNA侵入细胞、表达、加工成肽片段，其中一些可与MHC分子联合存在于所侵入细胞的表面，并诱导细胞免疫应答，以致T淋巴细胞会攻击显示C35表位的细胞。C35表位也可用于诊断，例如检测或者测量受试者体液样品中表达C35的肿瘤的存在或者由表达C35的肿瘤诱导的抗体或T细胞的存在，并因而诊断癌症和肿瘤和/或监测受试者在接种之后的细胞免疫应答。
本发明的重组病毒可用于治疗带有肿瘤的哺乳动物，包括人类，以产生针对肿瘤细胞的免疫应答。产生足够并合适的免疫应答，导致体内肿瘤退化。这种″疫苗″能够单独使用或者与其它用于肿瘤治疗的方法(包括而不限于化疗、放疗、手术、骨髓移植等)联合使用。例如，可用手术或放射技术缩小肿块，然后给予本发明的疫苗制剂，以确保剩余肿块的退化并防止剩余肿瘤团块发展或在体内微转移。另外，″疫苗″给药可先于手术、放疗或化疗。
另外，本发明的重组病毒可用于免疫或″接种″没有肿瘤的受试者，以防止肿瘤生成。随着遗传检验的出现，现在有可能预测个体对某些癌症的易感性。因此，这种个体可以利用表达C35抗原的重组牛痘病毒进行免疫。
可以通过监测试验动物免疫后的免疫应答，或者利用本领域已知的任何免疫测定方法，确定C35表位疫苗制剂的致免疫力。产生细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答可作为免疫应答的指征。试验动物可包括小鼠、仓鼠、犬、猫、猴、兔、黑猩猩等，以及最后人类受试者。
合适的该疫苗制剂包括可注射的液体溶液或者悬浮液；也可制备成适合注射前溶解、悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以乳化，或将多肽包在脂质体中。活性的免疫原性成分常常与药物可接受的、并与该活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为，例如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，疫苗制剂还可包括小量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强疫苗有效性的佐剂。
有效佐剂的例子包括而不限于氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-Sn-甘油-3-hydroxyphosphoryloxy)-乙胺、GM-CSF、QS-21(研究性药物，Progenies Pharmaceuticals，Inc.)、DETOX(研究性药物，RibsPharmaceuticals)、BCG以及CpG丰富的寡核苷酸。
通过测定诱导针对C35表位的细胞免疫应答，可确定佐剂的有效性。
本发明的疫苗可以是多价或单价的。多价疫苗由指导一种以上的抗原表达的重组病毒制成。优选的多价疫苗包含细胞毒T细胞以及辅助T细胞的多个表位。
如果需要，组合物还可以包含小量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂、或粉末。口服制剂可以包括标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
通常，这些成分分别或以混合成单元剂型提供，例如装在标明活性剂数量的密闭容器(诸如安瓿或小袋(sachette))中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物。组合物经注射给药时，可提供一安瓿无菌稀释剂，以在给药之前混合成分。
特定的实施方案中，一个容器中提供冻干的本发明C35表位；另一个容器包含稀释剂，其由50％甘油、0.25％苯酚和防腐剂(例如0.005％亮绿)的水溶液组成。
可以利用标准方法使用纯化的C35抗原作为疫苗制剂。例如，应将纯化的C35表位调整为合适浓度、与任何合适的疫苗佐剂组合、并包装以供使用。合适的佐剂可包括而不限于矿物凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂、多聚醇；聚阴离子；肽；油乳剂；明矾和MDP。免疫原也可掺入到脂质体、或与多醣和/或其它聚合物缀合，供疫苗制剂之用。重组抗原是半抗原(即具有抗原性，可以选择性与相关的抗体反应，但没有免疫原性，不能引起免疫应答的分子)的情况下，半抗原可与载体或免疫原性分子共价结合；例如，大蛋白质诸如血清白蛋白，可以赋与与之结合的半抗原免疫原性。半抗原-载体可配成疫苗。
很多方法可能用来将上述疫苗制剂引入病人。包括而不限于口腔的、皮内的、肌内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、透皮的、硬膜外的、肺的、胃的、肠的、直肠的、阴道的或尿道的途径。治疗方法使用本发明的重组活牛痘疫苗时，可优选的通过牛痘病毒的天然感染途径引入该制剂，即通过粘膜或表面，例如口的、鼻的、胃的、肠的、直肠的、阴道的或尿道的途径，或者通过皮肤。为了诱导CTL应答，可通过口或鼻的粘膜给药途径。另外，可利用肌内或腹腔内给药途径。人类患者给药优选剂量106-107PFU(噬斑形成单位)的耐冷重组牛痘病毒。
制剂中所用疫苗制剂的准确剂量还取决于给药途径和患者的性质，并应根据专业人员的判断以及按标准临床技术的每个患者状况来决定。有效的免疫量是足以对给予疫苗制剂的宿主中抗原产生免疫应答的量。
需要后续或加强剂量时，可以选择修饰的牛痘病毒例如MVA作为亲代病毒，用于产生重组体。另外，其它病毒例如腺病毒、金丝雀痘病毒或亚基制剂可用于加强免疫。可以利用联合免疫方案，例如利用本发明重组牛痘病毒疫苗进行免疫并用重组腺病毒疫苗加强，实现免疫和/或癌症的免疫治疗。在这样的实施方案中，初次免疫并用表达相同表位的不同病毒加强免疫以后，诱导强的继发的CD8+T细胞应答(有关该免疫和加强的方法参见，例如Murata等人，Cellular Immunol.17396107)。例如，患者首先用本发明的包含表达表位(例如选择的肿瘤相关抗原或其片段)的重组牛痘病毒疫苗制剂初次免疫。然后，例如21天以后，利用包含表达相同表位的牛痘以外的重组病毒对患者加强免疫。这种初次免疫继之加强免疫，诱导强的继发的T细胞应答。这种初级并加强免疫方案将优选用于治疗患有表达肿瘤相关抗原(例如C35)的肿瘤、转移瘤或成瘤性生长的患者。
另一实施方案中，重组牛痘病毒可用作经灭活的肿瘤细胞、包含C35抗原或其表位的亚单位疫苗、或其它重组病毒疫苗(例如腺病毒、金丝雀痘病毒或MVA)初级免疫后的加强免疫。
另一实施方案中，编码C35表位或其片段的重组牛痘病毒可用于过继性免疫疗法，以活化与患者具有组织相容性并对C35抗原特异的T淋巴细胞(有关过继性免疫疗法参见，例如Rosenberg，美国专利No.4,690,915，1987年9月1日颁发；Zarling等人，美国专利号5,081,029，1992年1月14日颁发)。可以从患者或组织相容性供者中分离这种T淋巴细胞。通过接触本发明的重组牛痘病毒体外活化该T淋巴细胞。活化的T淋巴细胞扩增并接种给患者，以传递针对C35抗原表位的T细胞免疫。
本发明也提供包含一种或多种容器的药物包装或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的疫苗制剂成分。该容器带有按管理药品或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定形式的通知，其反映该机构批准用于人的生产、使用或销售。
癌症诊断和预后
有两种类型基因影响肿瘤发展。一类基因是通过DNA水平改变(例如突变)直接作用而影响癌症表型，例如BRCA1、BRCA2和p53。另一类基因通过调节表达水平而影响表型。乳腺癌的发展以及继发的恶性发展与多种两类基因的改变有关。鉴定恶性乳腺中基因表达的量变化，如果充分表征，可得到新的分子标志，其可用于人类乳腺癌的诊断和治疗。
本发明者已经鉴定了一个新的乳癌标志C35，其在原发性浸润的乳腺导管癌细胞中差异表达。正常乳腺上皮细胞中C35的低水平表达提示C35过表达表明乳腺癌恶性发展。有可能在某些其它组织类型，包括膀胱和肺的肿瘤中，C35也可能过表达。
本发明者已经证明，具有癌症的哺乳动物中的某些组织，与相应的″标准″哺乳动物(没有癌症的相同物种哺乳动物)相比，C35蛋白质及其编码mRNA的表达水平显著增强。另外，认为与没有癌症的相同物种哺乳动物的血清相比，可以在生有癌症的哺乳动物的某些体液(例如血清、血浆、尿和脊髓液)中检测到水平提高的C35蛋白质、或特异性针对其的抗体或淋巴细胞。因此，本发明提供可用于肿瘤诊断的诊断方法，其中包括测定哺乳动物细胞或体液中编码C35蛋白质的基因的表达水平，并将该基因表达水平与标准C35基因表达水平相比较，基因表达水平超过标准则预示某些肿瘤。另外，可以确定血液或其它体液中C35蛋白质或C35多肽特异性的抗体或淋巴细胞的表达水平，与C35特异性的抗体或淋巴细胞的表达标准相比较。
如果已经按常规方法进行肿瘤诊断，本发明可用于预后指示，相对于低水平表达该基因的患者，显示C35基因表达增强的患者临床结果更差。
″测定编码C35蛋白质的基因的表达水平″，意在直接(例如确定或评价绝对的蛋白质或mRNA水平)或相对(例如与另一份生物样品的C35蛋白质或mRNA水平相比)、定性或定量测定或评价一份生物样品中C35蛋白质或编码C35蛋白质的mRNA的水平。
优选地，测定或者评价一份生物样品的C35蛋白质水平或mRNA水平，并与标准的C35蛋白质水平或mRNA水平相比较，该标准取自从没有癌症的个体获得的另一份生物样品。本领域应当理解，一旦标准的C35蛋白质或mRNA水平已知，其可以重复用作比较标准。
″生物样品″是指从包含C35蛋白质或mRNA的个体、细胞系、组织培养物或其它来源获得的任何生物样品。生物样品包括含有分泌的成熟C35蛋白质的哺乳动物体液(例如血清、血浆、尿、滑液和脊液)，以及可能含有前体或成熟形式C35的卵巢、前列腺、心脏、胎盘、胰腺、肝、脾、肺、乳腺、膀胱和脐带组织。
本发明可用于检测哺乳动物的癌症。本发明特别用于诊断哺乳动物中下列类型的癌症乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、骨癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和脾癌。优选哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、牛、猪、马、兔和人。特别优选人。
利用Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.162156-159(1987)所述的硫氰酸胍-酚-氯仿一步法可提取生物样品的细胞总RNA。然后利用任何合适方法测定编码C35蛋白质mRNA的水平。其中包括Northern印迹分析(Harada等人，Cell 63303-312(1990))，S1核酸酶图谱(Fujita等人，Cell 49357-367(1987))、聚合酶链式反应(PCR)、反转录结合聚合酶链式反应(RT-PCR)(Makino等人，Technique2295-301(1990))，以及反转录结合连接酶链式反应(RT-LCR)。
可利用基于抗体的技术测定生物样品的C35蛋白质水平。例如，可以利用经典的免疫组化方法研究C35蛋白质在组织中的表达(Jalkanen，M.，等人，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，M.等人，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。
可用于检测C35蛋白质表达的基于抗体的其它方法包括免疫测定技术，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISPOT和放射免疫测定(RIA)。
合适的标记为本领域已知，并包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶，以及放射性同位素，例如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(112In)，和锝(99mTc)，荧光标记例如荧光素和罗丹明，以及生物素。
根据本领域已知方法，在通过抗原呈递细胞呈递的C35活化以后，可以在多种增殖和淋巴因子分泌测定中检测C35特异性的T细胞。结合可溶性MHC分子的C35肽表位的四聚体复合物，可以用于直接染色和计数细胞群体中的C35特异性T细胞(Lee，P.P.等人，Nature Medicine5677-85(1999)在此全文引入以供参考)。
除了测定生物样品中的分泌蛋白质水平，还可以利用造影体内检测蛋白质。蛋白质体内造影的抗体标记或标志包括那些可通过X射线照相术、NMR或ESR检测的标记或标志。X射线照相术的合适标记包括放射性同位素(例如钡或铯)，其发射可检测的射线，而不明显对患者有害。NMR和ESR的合适标志包括具有可检测的特征自旋的标志，例如氘，其可通过标记有关杂交瘤的营养物，而掺入到抗体。
将利用可检测的合适造影成分(例如放射性同位素131I，112In，99mTc)、不透射线物质或核磁共振可检测物质标记的蛋白质特异性抗体或抗体片段，导入(例如非肠道、皮下或腹膜内)哺乳动物中。本领域应当理解，受试者大小及使用的成像系统将决定产生诊断影像所需造影成分的量。就放射性同位素成分而言，人类受试者注射的放射性量正常为大约5-20毫居99mTc。然后该标记的抗体或抗体片段优先积累在包含特定蛋白质的细胞部位。体内肿瘤造影描述见S.W.Burchiel等人，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments.″(Tumor imaging第13章The Radiochemical Detectionof Cancer，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes，eds.，Masson PublishingInc.(1982).)
融合蛋白质
任何C35多肽可用于产生融合蛋白质。例如，融合另一种蛋白质的C35多肽可用作抗原性标记。针对C35多肽的抗体通过与C35结合，可用于间接检测另一种蛋白质。此外，由于分泌型蛋白质以通行信号(trafficking signal)为基础靶向细胞部位，C35多肽一旦与其它蛋白质融合，可用作靶向分子。此处所述的“融合蛋白”不指C35多肽片段。
可与C35多肽融合的结构域的例子不但包括异源信号序列，还包括其它异源功能区。不一定需要直接融合，可以通过接头序列实现。在优选实施方案中，本发明的融合蛋白质包含至少一个C35肽的表位或C35肽表位类似物。在特别优选的实施方案中，本发明的融合蛋白包含相同C35肽表位或C35肽表位类似物的同聚体，以及不同C35肽表位和C35肽表位类似物的异聚体。
某些优选实施方案中，可构建包括另外的N端和/或C端氨基酸残基的C35融合多肽。特别是此处公开的任何N-端或C-端缺失的C35多肽，可以通过N-端包含另外的氨基酸残基而改变以制备C35融合多肽。此外，C35融合多肽可包括将另外的N端和/或C端氨基酸残基，与含有上述任何组合的N端和C端缺失的C35多肽融合。
此外，可以改造融合蛋白质，以改善C35多肽的特性。例如，另外的氨基酸区域，特别是带电荷的氨基酸，可以添加到C35多肽的N端，以改善在从宿主细胞中纯化或后续处理和保存期间的稳定性和持久性。C35多肽也可添加肽成分以协助纯化。在C35多肽最终制剂之前，除去这些区域。添加肽成分以便于多肽处理是本领域熟悉的常规技术。
此外，C35多肽，包括片段和特定表位，能与免疫球蛋白(IgG)恒定结构域的一部分结合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白质促进纯化，并且体内半衰期增加。一个报告的例子描述了由人CD4多肽的前两个结构域以及哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的各种结构域组成的嵌合蛋白质。(EP A 394,827；Traunecker等人，Nature 33184-86(1988).)具有二硫键连接的二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白质，与单体的分泌型蛋白质或单独的蛋白质片段相比，在结合并中和其它分子方面也更为有效。(Fountoulakis等人，J.Biochem.2703958-3964(1995).)
类似地，EP-A-0 464 533(加拿大副本2045869)公开了包含免疫球蛋白分子恒定区各部分连同另一种人类蛋白质或其部分的融合蛋白质。多数情况下，融合蛋白质的Fc部分有利于治疗和诊断，因此可以导致，例如改善的药物动力学特性。(EP-A 0232 262.)另外，在融合蛋白质表达、检测和纯化后，可能希望缺失Fc部分。例如，如果融合蛋白质用作免疫的抗原，Fc部分可能妨碍治疗和诊断。例如在药物研究中，已将人蛋白质如hIL-5，与Fc部分融合，目的是进行高通量筛选分析，以鉴定hIL-5的拮抗剂。(参见D.Bennett等人，J.MolecularRecognition 852-58(1995)；K.Johanson等人，J.Biol.Chem.2709459-9471(1995).)
此外，可将C35多肽融合标志序列，例如协助C35纯化的肽。优选的实施方案中，标志氨基酸序列是6个组氨酸的肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)提供的标记，其中许多是商品化的。例如Gentz等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)所述六聚组氨酸便于纯化融合蛋白质。用于纯化的另一肽标记，″HA″标签，对应于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位。(Wilson等人，Cell 37767(1984).)
因此，利用C35多核苷酸或C35多肽，能够制备上述任何融合体。
载体、宿主细胞和蛋白质制备
本发明也涉及包含C35多核苷酸的载体、宿主细胞和通过重组技术制备C35多肽。载体可以是，例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是复制活性的或复制缺陷的。后者情况下，通常病毒繁殖只发生在互补的宿主细胞中。
C35多核苷酸可与包含选择标志的载体相连，以在宿主中繁殖。质粒载体一般在沉淀(例如磷酸钙沉淀)或具有带电脂类的复合物中导入。如果载体是病毒，其可能利用合适的包装细胞系体外包装，然后转导到宿主细胞。
C35多核苷酸插入片段应该可操作地连接合适的启动子，例如噬菌体λPL启动子、E.coli lac、tip、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子，仅举几个例子。其它合适的启动子为熟练技术人员所知。表达构建体将另外包含转录起始、终止位点，以及转录区中用于翻译的核糖体结合位点。构建体表达的转录物编码部分优选包括开头的翻译起始密码子，以及在所翻译多肽末端适当位置的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如上表明，表达载体优选包括至少一个选择标志。这种标志包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，以及用于E.coli和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的典型例子包括而不限于细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，例如酵母细胞；昆虫细胞例如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞例如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件为本领域已知。
载体之中优选供细菌使用的载体，包括pHE-4(及其变体)；来自QIAGEN，Inc.的pQE70，pQE60和pQE-9；来自Stratagene CloningSystems，Inc.的pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及来自Pharmacia Biotech，Inc.的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS。优选的真核载体是来自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI和pSG；以及来自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合适的载体为熟练技术人员所易见。优选载体为痘病毒载体，特别是例如美国专利申请No.08/935,377所述的痘苗病毒载体，在此全文引入以供参考。
可利用磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、阳离子脂类介导转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，将构建体导入宿主细胞。许多标准实验手册描述了这些方法，例如Davis等人Basic Methods In MolecularBiology(1986)。
利用众所周知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析，从重组细胞培养物中回收并纯化C35多肽。最优选高效液相层析(″HPLC″)用于纯化。
C35多肽还可以回收自天然来源的纯化产物，包括体液、组织和细胞，不论是直接分离的还是培养的；化学合成方法的产物；以及利用重组技术从原核或真核宿主(包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)制备的产物。C35多肽根据重组制备方法所用的宿主，可以是糖基化或非糖基化。此外，C35多肽也可包括最初修饰的甲硫氨酸残基，有时是宿主介导加工的结果。因此，本领域公知，所有真核细胞中，翻译起始密码子编码的N端甲硫氨酸一般在翻译后从任何蛋白质中高效去除。而大多数原核生物也高效去除大部分蛋白质的N端甲硫氨酸，有些蛋白质原核去除过程的效率低，这取决于共价连接于N端甲硫氨酸的氨基酸的性质。
除了包含具有此处所述载体构建体的宿主细胞，本发明还包含初级、次级以及永生的脊椎动物特别是哺乳动物来源的宿主细胞，其已经改造以缺失或置换内源性遗传物质(例如C35编码序列)，和/或包括与本发明的C35多核苷酸可操作性连接的遗传物质(例如异源多核苷酸序列)，以及活化、改变和/或扩增内源性C35多核苷酸的遗传物质。例如，可用本领域已知的技术通过同源重组可操作地连接异源控制区(例如启动子和/或增强子)和内源性C35多核苷酸序列(参见例如美国专利No.5,641,670，1997年6月24日颁发；国际公开No.WO 96/29411，1996年9月26日公布；国际公开No.WO 94/12650，1994年8月4日公布；Koller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；以及Zijlstra等人，Nature 342435438(1989)，每个公开内容全文引入以供参考。)。
经一般描述本发明，并通过参考下列提供的实施例，将更容易理解本发明，下列实施例是用来说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1
人乳腺癌中C35的差异表达
本发明人已经鉴定了代表C35基因的全长cDNA，其在人乳腺癌和膀胱癌中差异表达(图1A)。利用poly-A RNA消减杂交，最初从来自同一原发浸润的乳腺导管癌病人的肿瘤和正常乳腺上皮细胞系分离到348bp C35 DNA片段。(Band，V.等人，Cancer Res.507351-7357(1990)。利用根据该序列及重叠的EST序列(登录号W57569)设计的引物，从SKBR3乳腺肿瘤细胞系(ATCC HTB-19)扩增和克隆包括全长C35编码序列的cDNA。除348bp编码序列之外，该C35 cDNA包括167bp 3′非翻译区。
图2A比较了来源于正常乳腺上皮、两株原发乳腺肿瘤结节以及大约一年后从同一患者分离的两株转移性肺肿瘤结节细胞系中的poly-ARNA的C35克隆表达水平，证明了C35序列的差异表达(Band，V.等人，Cancer Res.507351-7357(1990))。定量分析表明，该序列在肿瘤细胞的表达水平比正常乳腺上皮细胞高10倍以上。图2B Northern杂交结果证明图中其它正常组织中表达水平低。即使正常组织poly-A RNA上样量三倍于肿瘤细胞系，并同等曝光15小时，仍几乎没有检测到C35同源性RNA表达。只是在曝光延长96小时以后，在正常的脾和肾组织中才检测到低水平表达的某些同源序列。图2C所示来自不同患者的三个原发浸润的乳腺导管癌和正常乳腺上皮细胞样品poly-A RNA的C35同源序列的表达分析。与正常乳腺上皮细胞相比，三个原发乳腺肿瘤中的两个的C35同源性序列过表达45和25倍。
本发明人先前分析了在几个独立来源的鼠肿瘤中表达、而在正常小鼠组织中降低水平表达的免疫保护性肿瘤抗原。(参见2000年3月28日申请的美国专利，题为″Methods of Producing a Library and Methodsof Directly Selecting Cells Expressing Inserts of Interest″，此处全文引入以供参考)。在这种情况下，肿瘤和正常组织表达水平之间9倍的差异与诱导免疫保护性肿瘤特异应答有关。如上所述，某些人类乳腺癌的C35表达水平相对于正常组织超过9倍，提示在这些个体中C35也可能对乳腺癌是免疫保护性的。
实施例2
C35特异性CTL细胞溶解C35阳性的乳腺肿瘤细胞
尽管如同C35一样，某种基因产物可能在肿瘤细胞中过表达，但是只有在来源于该基因产物的肽能够被加工并与肿瘤细胞MHC分子联合被呈递时，其才在免疫学上相关。可以想象，对于任何给定的基因产物，可能在细胞降解过程中没有产生符合与肿瘤表达的MHC分子相结合的条件的肽，或者即使产生这种肽，转运缺陷或其它肿瘤肽对MHC分子的竞争会阻止呈递该特定基因产物的任何肽。即使相关肿瘤肽被加工并与肿瘤细胞的人类MHC联合被呈递，但是，在任何情况下，必须确定所有组成成分中是否充分展示与这些肽反应的人类T细胞，或者是否也许由于其它非同源性正常组织表达相同或相关抗原而使T细胞耐受。因此对于这两方面原因，有必要证实MHC限制性的人肿瘤抗原特异性T细胞能够由C35诱导，而且其确实与人肿瘤细胞交叉反应。利用重组C35或自身抗原呈递细胞呈递的重组C35肽体外刺激人T细胞应答，能够获得这方面的相关信息。
评价对重组基因产物的T细胞应答的主要技术问题在于，针对表达载体的强免疫应答可能阻断或隐藏重组体特异性的应答。对于可能需要多轮体外刺激的初级应答，这尤其是个问题。为使载体特异性应答减到最低程度，可利用由同一基因产物不同病毒载体重组体感染的抗原呈递细胞交替刺激。合适的载体包括逆转录病毒、腺病毒和痘病毒。
利用Ficoll-Paque纯化人PBMC，经唾液酸苷酶处理的羊红细胞玫瑰花结试验分离单核细胞(红细胞玫瑰花结阴性，ER-)和T淋巴细胞(ER+)。ER-组分在含rhGM-CSF(1000U/ml)和rhIL-4(1000U/ml)的新鲜培养基中培养7天(每隔一天补加细胞因子)，产生树突细胞。第7天，未成熟的树突细胞用表达人C35的逆转录病毒于polybrene(1ug/ml)存在下转导6小时。洗涤细胞，在12.5％单核细胞条件培养基、1000U/mlrhGM-CSF和1000rhU/ml IL-4以及1％自体血清存在下，于成熟条件下温育4天。此时，树突细胞与自体T淋巴细胞(冷冻保存的ER+组分)按1个DC∶50个T细胞比例温育14天。存活T细胞用经照射的自体EBV-BB细胞(在细胞因子IL-2(20U/ml)、IL-12(20U/ml)和IL-18(10ng/ml)存在下，用表达人C35的牛痘重组体按感染复数为1感染过夜(16小时)再刺激。细胞在IL-2和IL-7(10ng/ml)存在下，用携带C35的逆转录病毒感染的自体EBV-B细胞，另外再刺激两次。总共4次刺激后，利用5000个靶细胞/孔、测定4小时51Cr释放分析测定细胞毒活性。下表8所示结果证明，C35刺激的T细胞的特异性细胞毒活性针对C35表达水平相对提高的21NT乳腺肿瘤细胞，而不针对与未转化正常上皮细胞一样低水平表达C35的MDA-MB-231肿瘤细胞。
表8
C35特异性CTL细胞溶解C35阳性的乳腺肿瘤细胞 靶细胞 E∶T HLA单倍型 (效应子A2，A11；B8，B35) 20∶1 (特异性裂解％) 10∶1 自体 EBV-B A2，A11；B8，B35 2 1 MDA-MB-231 C35低(1x) A2；B8 3 1 21NT C35高(12x) A26，A31；B35，B38 22 10 K562 2 0
实施例3
乳腺癌细胞膜上的C35表达
为了确定C35多肽产物是否于肿瘤细胞表面表达，制备了C35特异性的抗血清。用编码人C35的逆转录病毒转导的同系Line 1小鼠肿瘤细胞免疫BALB/c小鼠。两次或多次免疫小鼠后，取血。利用免疫血清，通过流式细胞术检测C35蛋白质在三种乳腺肿瘤细胞系(代表Northern印迹中C35转录物的高(21NT)、中(SKBR3)和低(MDA-MB-231)表达水平)表面的表达(参见图4A-4C)。1×105乳腺肿瘤细胞用3.5μl C35特异性抗血清或放血前BALB/c对照血清染色。温育30分钟后，细胞用染色缓冲液(PAB)洗涤两次，与FITC-山羊抗小鼠IgG(1μg/样品)温育30分钟。洗涤样品，用EPICS Elite流式细胞仪分析。图4A-4C所示结果表明，特异性免疫血清识别的C35抗原细胞膜表达水平，在肿瘤细胞系21NT中较高(图4A)，肿瘤细胞系SKBR3中中等(图4B)，肿瘤细胞系MDA-MB-231中检测不到(图4C)。抗体与C35转录物表达水平提高的肿瘤细胞膜的高反应性提示，C35特异性抗体可作为过表达该基因产物的大量乳腺癌的有效免疫治疗剂(参见图2A-2C和3)。
实施例4
失调的编码共有鼠肿瘤排斥抗原的核糖体蛋白质L3基因
本发明人已经开发了抗原研究的新技术，其可以从构建在痘病毒中的cDNA文库中选择编码CTL表位的基因。本发明人已经利用该技术确定了一个共有的鼠肿瘤抗原，其由核糖体蛋白质L3基因的另一等位基因编码。在正常组织(包括胸腺)中，该免疫原性L3基因表达水平显著，虽然有所降低。用该免疫原性L3 cDNA的牛痘重组体免疫接种，诱导了抗肿瘤攻击的保护性免疫。令人特别感兴趣的是，看家基因的失调等位基因能作为免疫保护性抗原，并且胸腺表达不妨碍上调的肿瘤产物的免疫原性。这些结果强调，对自身蛋白质的耐受不是绝对的，而必须根据表达水平来确定的。所述核糖体蛋白质可代表一类肿瘤共有抗原，它们起源于自身蛋白质的表达失调，但不影响正常组织的免疫耐受。这种抗原可能适于重要器官癌症的免疫治疗。
方法
利用Perfect RNA Total RNA Isolation Kit(5 Prime 3 Prime，Inc.，Boulder，CO)分离BCA 39肿瘤细胞的总RNA。利用Dynabeads(Dynal，Lake Success，NY)从总RNA中分离Poly A+mRNA。利用Great LengthscDNA Synthesis Kit(Clontech，Palo Alto，CA)将2μg poly A+mRNA转变为双链cDNA。然后将该双链cDNA插入牛痘病毒载体v7.5/tk。
用照射过(6,500cGy)的2×106 BCA 34细胞腹膜内免疫Balb/cByJ(Jackson Labs)小鼠。两周以后，小鼠皮下注射照射的2×106BCA 34细胞，加强免疫。第二次免疫一周以后，收集脾细胞，分成12份，在12孔板中与照射(10,000cGy)的、经丝裂霉素C处理的BCA 34细胞(6×105/孔)培养。每周一次利用Lympholyte-M(Accurate Chemical，Westbury，NY)纯化存活的T细胞，在12孔板中培养(1.5×106T细胞/孔)。每孔还加入照射过(5000cGy)的4×106 Balb/c脾细胞，连同照射过的、经丝裂霉素C处理的6×105 BCA 34细胞。
将编码充分鉴定的、结合H-2Kb为免疫显性的卵清蛋白257-264肽(SIINFEKL)的特定牛痘重组体，用非重组病毒稀释，使其最初由0.2％、0.01％或0.001％的总病毒pfu组成。用该病毒混合物按m.o.i.＝1(大约5×105细胞/孔)感染贴壁的单层MC57G细胞(H-2b)。感染12小时以后，加入卵清蛋白肽特异性CTL(通过用免疫显性的SIINFEKL肽体外重复刺激已接触卵清蛋白的脾T细胞得到)。温育期间，特异性细胞毒性T细胞以被重组颗粒(表达卵清蛋白肽)感染的贴壁细胞为目标，进行细胞溶解事件，使其从单细胞层上释放。与CTL温育后，温和洗涤单细胞层，分别收集漂浮细胞和剩余的贴壁细胞。测定从各个细胞群体提取的病毒的滴度，确定重组(BRdU抗性)病毒pfu的频率。然后将从漂浮细胞提取的病毒用于与新鲜的贴壁MC57G细胞和卵清蛋白肽特异性CTL一起，注入另一富集周期。可以观察到富集以后的VVova超过病毒总数的10％，如果后续周期的m.o.i.从1减少到0.1，可以加速重组病毒的进一步富集。
利用牛痘BCA39 cDNA文库按moi＝1.0感染12孔板中长满的BCN单层细胞。感染12小时后，单细胞层用培养基洗涤3次，每孔加入250μl体积的2.5×106 CTL。T细胞和靶细胞37℃温育4小时。温育后收集上清，用250μl培养基温和洗涤单细胞层3次。通过冷冻/融化释放病毒，利用BSC1细胞噬斑分析确定滴度。在12孔板的一个孔中，选择的病毒群体(接受特异性T细胞的培养物中的漂浮细胞)用BSC1细胞扩增2天。然后收集病毒，测定滴度。此病毒原液经历另外三个富集周期。在下一个周期之前，选择的病毒群体不进行扩增。
将第四轮富集周期的病毒分成40份混合物，每份混合物5个pfu。在96孔板中用BSC1细胞扩增每份混合物，每孔1份混合物。4天后收集病毒(P1)，用于在96孔板中按moi＝5感染BCN单细胞层，每孔1份混合物。用vNotI/tk按moi＝5感染BCN单细胞层，作为对照(Merschlinsky等人，Virology 190522(1992))。感染5小时后，每孔加入2×104洗过的CTL。每孔终体积225μl。细胞37℃温育18小时。然后离心沉淀细胞，收集150μl上清液，ELISA检测IFNg。40份5pfu的混合物中，27份阳性，能够刺激CTL。Poisson分析提示，特定重组体的富集超过20％。从5份阳性混合物中挑选各个克隆，如上所述进行分析。
在6孔板中，用v7.5/tk、vF5.8或vH2.16按moi＝1.0感染B/C.N单细胞层。感染14小时后，收集细胞和对照靶细胞B/C.N、BCA 34和BCA 39。靶细胞用100uCi51Cr(Dupont，Boston，MA)37℃标记1小时，在96孔圆底板中每孔加入104细胞，一式四份。肿瘤特异性CTL按指定比例加入靶细胞中。细胞37℃温育4小时。收集上清液，测定51Cr释放量。将靶细胞与培养基单独温育，得到自发释放量。将靶细胞与5％ Triton×100温育，测定最大释放量。特异性溶解百分比计算公式为特异性溶解％＝((实验释放量-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量))×100。在每种情况下，上述公式使用四个孔的平均值。
利用dT引物和Superscript II Reverse Transcriptase(BRL，Gaithersburg，MD)，将2μg总RNA转变为cDNA。以cDNA为模板，利用L3特异性引物L3.F1.S(CGGCGAGATGTCTCACAGGA)和L3.F1.AS(ACCCCACCATCTGCACAAAG)、以及Klentaq DNA PolymeraseMix(Clontech)，在终体积20μl进行PCR。反应条件包括开始的变性步骤94℃ 3分钟，然后为94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 2分钟的30个循环。PCR产物包含L3位点3-1252的区域。PCR产物利用Centricon100柱(Amicon，Beverly，MA)纯化，用Sau3AI消化，3％琼脂糖/溴化乙锭凝胶分离。
成年雌性Balb/cByJ小鼠(每组两只小鼠)皮下注射5×106pfu的vH2.16或v7.5/tk进行免疫。免疫7天后，收集脾细胞，在12孔板中与1μM肽L348-56(I54)一同培养。7天后，利用Lympholyte-M纯化存活的T细胞，在12孔板每孔中加入1×106T细胞、1μM肽以及4×106照射(5000cGy)的Balb/c脾细胞。
成年雌性Balb/cByJ小鼠皮下注射10×106pfu的vH2.16、vPKIa、v7.5/tk或磷酸盐缓冲盐溶液，进行免疫。21天后进行继发免疫。免疫21天(只进行初级免疫)或14天后，皮下注射2×105 BCA 34细胞产生肿瘤激发小鼠。
结果和讨论
几种自身蛋白质能够被免疫T细胞识别为肿瘤抗原的事实推进了开发广泛有效的肿瘤疫苗的前景(Van den Eynde等人，J Exp.Med.1731373(1991)；M.B.Bloom等人，J Exp.Med.185453(1997)；Van Der Bruggen等人，Science 2541643(1991)；Gaugler等人，J.Exp.Med.179921(1994)；Boel等人，Immunity 2167(1995)；VanDen Eynde等人，J.Exp.Med.182689(1995)；Kawakami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913515(1994)；Kawakami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.916458(1994)；Brichard等人，J.Exp.Med.178489(1993))。这种正常、未突变的基因产物可作为不同个体中某些类型肿瘤的共同靶抗原。目前，用这种共有肿瘤抗原免疫接种后，诱导保护性免疫的临床证据很有限(Marchand等人，Int.J Cancer 80219(1999)；Rosenberg等人，Nat.Med.4321(1998)；Overwijk等人，Proc.Natl.Acad.Sci.962982(1999)；Brandle等人，Eur.J.Immunol.284010(1998))。此外，完全不清楚对这些自身蛋白质的T细胞应答是代表免疫耐受的意外故障，还是肿瘤细胞中自身蛋白质表达的质变或量变的结果。后一种情况下，能够保持正常组织的耐受性，并且疫苗诱导的对自身蛋白质(其在肿瘤中的表达被系统性改变)的免疫力，甚至可能适用于重要器官的癌症。
本发明人已经表明，在鼠多种肿瘤的转化过程中系统性失调的核糖体蛋白质等位基因是一种肿瘤排斥抗原，免疫原性的主要关联是相对于正常组织和胸腺，肿瘤中表达量的变化显著。
本发明人先前曾报道，在三个独立衍生的鼠肿瘤细胞系间可诱导交叉保护性免疫(Sahasrabudhe等人，J.Immunology 1516302(1993))。通过体外诱变独立传代培养的B/C.N细胞系(来源于Balb/c胚胎的克隆的、永生化的、贴壁依赖性的、接触抑制的、非致瘤性成纤维细胞系)得到上述肿瘤BCA 22、BCA 34和BCA 39(Collins等人，Nature 299169(1982)；Lin等人，JNCI741025(1985))。引人注目的是，用其中任何肿瘤细胞系(B/C.N除外)免疫接种，可提供针对同源肿瘤细胞攻击以及针对异源肿瘤细胞系攻击的保护。用三个肿瘤细胞系中的任何一个免疫以后，能够产生CD8+细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)系及克隆，它们在体外表现特异性针对这三个肿瘤的交叉反应性，而不针对衍生它们的非致瘤性B/C.N细胞。
为了从该肿瘤共有抗原的免疫学定义转到分子定义，本发明人开发了新的有效方法，用于鉴定编码CTL靶表位的基因。此方法中，在修饰的痘苗病毒表达载体中构建BCA 39肿瘤细胞系的cDNA文库。(Merchlinsky等人，Virology 238444(1997)；E.Smith等人，撰写中)。用该文库的500,000个噬斑形成单位(pfu)来感染抗原阴性的B/C.N细胞的单细胞层，感染复数(moi)为1。感染12小时以后，按照标准51Cr释放分析中引起大约50％溶解的效应细胞与靶细胞的比例，将BCA 34肿瘤特异性的CTL加入靶细胞单细胞层。使用异源BCA 34肿瘤细胞系特异性的CTL，以便于协助鉴定这两株肿瘤细胞系的共有抗原。因为贴壁是能量依赖性过程，可以预计，经历CTL介导的溶解事件的细胞将从单细胞层上脱落，并能够从上清液中回收。通过从发生细胞介导的淋巴细胞毒性(CML)的漂浮细胞中收获病毒，可富集使宿主细胞对溶解敏感的病毒重组体。该方法的基本特征是适于重复。一个富集周期后收获的病毒，能够用于利用新鲜的单细胞层和新鲜的CTL而进行另外的选择周期，直至达到所要求的富集水平。在利用已知重组体的特异性CTL的模型试验中，可证明在6个选择周期中，特异性重组体能够从最初的0.001％稀释度富集到大约20％(表9)。在此水平上，挑选单个噬斑做进一步性质鉴定是简单的事情。
表9
多周期富集VVova
对由野生型vNotl/tk(tk+)掺加指定浓度的VVova(tk-)组成的牛痘混合物进行CML选择(12) 富集 漂浮细胞中VVova％ 周期# 实验1 实验2 实验3moi＝1 0 0.2 0.01 0.001 1 2.1 0.3 nd 2 4.7 1.1 nd 3 9.1 4.9 nd 4 14.3 17.9 1.4 5 24.6 3.3 6moi＝0.1 5 48.8 39.3 18.6
％VVova＝(有BudR的滴度/没有BudR的滴度)×100
nd＝没有测定
用肿瘤特异性CTL对痘病毒表达文库进行4轮选择。选择的病毒重组体的各个噬斑经扩增，用于感染分离培养的B/C.N细胞。分析这些细胞刺激特异性CTL以分泌干扰素γ(IFN-γ)的能力(图5A)，或者分析对肿瘤特异性CTL溶解的致敏性(图5B)。分离10个病毒克隆，都赋予B/C.N刺激肿瘤特异性CTL系分泌IFN-γ的能力。全部10个克隆包含相同大小(1,300bp)的插入片段(Smith等人，未发表资料)。序列分析证实，克隆F5.8和H2.16包含相同的全长cDNA。因此看来全部10个克隆都是相同cDNA的重组体。经BCA 34免疫产生的总共6个CTL系中的6个表现了对该抗原的特异性。
检索GenBank显示，该eDNA与鼠核糖体蛋白质L3基因高度同源。(Peckham等人，Genes and Development 32062(1989))。对完整的H2.16克隆测序显示，与发表的L3基因序列相比，只有一个核苷酸置换，编码的氨基酸改变。该C170T置换引起54位氨基酸由苏氨酸置换为异亮氨酸。F5.8克隆也包含此核苷酸置换。
既然CTL识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原，鉴定由这些I类MHC限制性肿瘤特异性CD8+T细胞识别的肽表位是有意义的。认为CTL识别的肽中可能包括该改变的氨基酸(Ile 54)。只有H2.16前199bp(63个氨基酸)的痘苗病毒克隆重组体(vH2199)能够使B/C.N对肿瘤特异性CTL的溶解敏感的事实支持了该假说(Smith等人，未发表资料)。计算机筛选肽结合基序提示，此区域内编码的两种表位可与I类MHC分子Kd以高亲和力结合(图12)(Parker等人，J.Immunology 152163(1994))。合成这两种肽L345-54(I54)和L348-56(I54)，并检测其使B/C.N细胞对肿瘤特异性CTL的溶解敏感的能力。如图7A所示，肽L348-56(I54)使B/C.N对溶解敏感，而L345-54(I54)和野生型L348-56(T54)则不然。已经确定10nM L348-56(I54)足以使靶细胞对CTL溶解敏感，而100mM L348-56(T54)则不然(图7B)。这些结果表明，肽L348-56(I54)是肿瘤特异性CTL识别的靶表位。
为了分析不同L3基因产物的表达，以寡dT为引物，从肿瘤及衍生肿瘤的B/C.N细胞系的RNA合成cDNA。利用几乎扩增小鼠L3完整mRNA的一对引物，经PCR扩增cDNA第一链。该PCR产物的序列分析表明，B/C.N和BCB13的L3 cDNA在170位包含C(与发表序列相同)。BCB13是来源于B/C.N细胞系的肿瘤细胞系，但与BCA肿瘤细胞系不具有免疫学上的交叉保护性(Sahasrabudhe等人，J.Immunology 1516302(1993))。具有交叉反应性的肿瘤BCA 39、BCA 34和BCA 22的PCR产物序列分析提示，这些细胞系表达两种不同种类的L3mRNA。一种在170位包含C，而另一种在170位包含T，与H2.16克隆相同。除了这一个碱基替换，所有L3 cDNA的序列相同。
有两种可能的方式说明肿瘤细胞中新L3 RNA的起源。或者这些肿瘤中表达的L3(C170T)基因是野生型基因的体细胞突变体，或者有多种种系的L3等位基因，当肿瘤转化过程中失调时，其中至少一种产生免疫原性产物。我们认为第一种假说不太可能，因为具有交叉反应性的肿瘤BCA 39、BCA 34和BCA 22是独立得到的。如果在所有三个肿瘤中产生相同的突变表位，这太不寻常了。另一方面，BCA 39和B/C.N基因组DNA经不同限制性消化的Southern印迹提示，小鼠基因组中存在多拷贝的L3基因(Smith等人，未发表资料)。也有报道大鼠和牛的L3基因是复等位基因(Kuwano等人，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 18758(1992)；Simonic等人，Biochemica etBiophysica Acta 1219706(1994))。需要进一步分析，以验证假说种系中不同的L3等位基因在肿瘤和正常细胞中受到不同的调节。
发表的L3 168-171位核苷酸序列是GACC。H2.16在同一区域的序列是GATC(图8A)。这个新的回文序列是许多限制性内切酶(包括Sau3AI)的识别序列。如图8A的限制性图谱所示，Sau3A I消化的L3预期产生200、355、348、289和84bp的片段，而Sau3A I消化的H2.16将产生168bp片段，而不是200bp片段。Sau 3AI消化产物的差异证实三个BCA细胞系表达至少两种不同的L3等位基因。全部5个细胞系以及胸腺RNA的L3RT-PCR产物经Sau 3AI消化，用琼脂糖凝胶进行分析。如图8B所示，所有3个BCA细胞系都表达两种版本的L3。值得注意的是，当利用大量原材料重复该分析时，从B/C.N、BCB13和正常胸腺cDNA的消化产物中也检测到该168bp片段(Smith等人，未发表资料)。为了提高该分析的敏感性，利用P32末端标记的5′L3特异性引物重复进行PCR。放射性标记的PCR产物用Sau3AI消化，琼脂糖凝胶分离。如图8C所示，B/C.N、BCB 13和胸腺包含该168bp片段。定量分析表明，BCA肿瘤的200bp∶168bp片段比例为2∶1，而B/C.N、BCB13和胸腺中检测的相同片段比例大约为20∶1。分析肾脏、心脏和骨骼肌的RNA，也观察到该免疫原性L3等位基因的低水平表达(Smith等人，未发表资料)。这些结果提示，在交叉反应性肿瘤中，与转化过程有关的基因失调导致该种系L3(C170T)等位基因较高水平表达，该改变的L3基因并非通过L3基因(主要表达于正常组织)的体细胞突变产生。本发明人将该新的L3等位基因(C170T)命名为免疫原性L3等位基因(iL3)。
尤为引人注意的是，免疫原性L3等位基因也在正常胸腺中表达，尽管水平降低10倍。该表达水平显然不足以耐受对某些肿瘤中表达的失调的iL3水平具有功能性亲和力的全部T细胞。但是尽管B/C.N和BCB13都表达低水平的iL3，它们对肿瘤特异性CTL的溶解并不敏感，该结果提示较高亲和力的T细胞已经被耐受了。这似乎是胸腺中表达肿瘤抗原的首例报道。这些结果强调，对自我蛋白质的耐受不是绝对的，而必须相对于表达水平的量来确定(Targoni等人，J.Exp.Med.1872055(1998)；C.J.Harrington等人，Immunity 8571(1998))。
如果以肿瘤共有抗原的表达为基础开发广泛有效的疫苗，那么关键是证明该抗原是免疫保护性的。已经鉴定了人类肿瘤的大量共有抗原，但迄今为止，利用这些抗原的临床免疫治疗试验都无确定结果，部分原因是最佳接种策略的不确定性(Pardoll，D.M.，Nat.Med.4525(1998))。在小鼠中能够更彻底地研究免疫治疗策略，几乎没有鉴定到肿瘤共有抗原。因此，确定用iL3重组痘苗病毒免疫是否诱导肿瘤特异性CTL并保护小鼠免于肿瘤的攻击，具有重要意义。(Overwijk等人，Proc.Natl.Acad.Sci.962982(1999)；Moss，B.，Science 2521662(1991)；.Irvine等人，J.Immunology 1544651(1995)；McCabe等人，Cancer Research 551741(1995)；Estin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.851052(1988)；J.Kantor等人，JNCI84.1084(1992)；V.Bronte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.943183(1997))。用iL3基因(H2.16)的痘苗病毒重组体免疫Balb/c小鼠，产生的CTL能够体外溶解BCA 34和BCA 39肿瘤细胞，而不溶解B/C.N(图9A)。用iL3痘苗病毒重组体免疫两次乃至一次的小鼠，能够排斥BCA 34肿瘤细胞的攻击(图9B和9C)。用空的病毒载体或者cAMP-依赖性蛋白激酶抑制剂蛋白质(PKIa)的对照牛痘重组体免疫的小鼠不能排斥肿瘤的攻击(Olsen，S.R.和Uhler，M.D.，J.Biol.Chem.26611158(1991)；Mueller等人，撰写中)。这些结果证明，iL3自身蛋白质是免疫保护性肿瘤抗原。
本发明人基于CTL介导的筛选修饰的痘苗病毒载体的肿瘤cDNA文库(Merchlinsky等人，Virology 23 8444(1997)；E.Smith等人，撰稿中)，已经开发了鉴定编码CTL表位的基因的新策略。我们已经应用该策略鉴定了失调的看家基因，其编码由三个独立衍生的鼠肿瘤共有的肿瘤排斥抗原。该核糖体蛋白质可代表一大类免疫保护性肿瘤共有抗原，其由于自身蛋白质的表达失调而变得具有免疫原性，但不影响对正常组织的免疫耐受。这种抗原将特别适合于重要器官癌症的免疫治疗。
实施例5
C35肿瘤抗原的表达和免疫原性
与人正常组织的表达相比，在所检测的70％(12/17)人原发乳腺癌和50％(5/10)膀胱癌中，过表达新的C35肿瘤基因的RNA转录物。该全长基因编码功能未知的115个氨基酸的新蛋白质。选择单克隆抗体2C3，利用流式细胞术分析，对表达C35的细胞表面膜染色。此外，体外产生特异性溶解C35+乳腺肿瘤和膀胱肿瘤的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。从正常人类供者体外产生C35特异性CTL的能力提示缺少对该过表达蛋白质的耐受。C35在不同个体的肿瘤中过表达以及诱导体液和细胞免疫应答的能力，使其成为有希望的免疫治疗候选者。
材料和方法
细胞系人乳腺癌细胞系BT20、BT474、MCF7、MDA-MB231、SKBR3、T47D(ATCC提供)，在补加10％胎牛血清(Biofluids，Rockville，MD)的RPMI-1640(BioWhitaker，Walkersville，MD)中培养。衍生自正常乳腺上皮细胞的永生细胞系H16N2、两株转移瘤21-MT1和21-MT2、两株原发瘤21-NT和21-PT，全部来源于同一患者，在DFCI培养基中培养(Band，V.和Sager，R.，″Tumor Progression in Breast Cancer″，Neoplastic Transformation in Human Cell Culture，J.S.Rhim andA.Dritschilo eds.，The Human Press Inc.，Totowa，NJ..(1991)，pp.169-78)由Dr.Vimla Band，New England-Tufts Medical Center惠供。膀胱肿瘤细胞系ppT11A3衍生自永生的非致瘤细胞系SV-HUC。这些膀胱细胞系由Dr.Catherine Reznikoff，University of WisconsinClinical Cancer Center惠供，在每500ml补加1％ FBS、0.025U胰岛素、1μg氢化可的松、5μg转铁蛋白、2.7g葡萄糖、0.1μg非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、100U青霉素和100μg链霉素的F12培养基中培养。正常增殖的乳腺上皮细胞(MEC)购自Clonetics(BioWhittaker)，根据供应商的说明书维持生长。
RNA提取和Northern印迹分析大约80％铺满率时收获细胞系，提取RNA。收获细胞，在Qiagen RNAeasy kit的QG缓冲液中裂解。按制造商的操作规程提取总RNA，用GITC和酒精沉淀，-80℃保存。组织样品由Cooperative Human Tissue Network以速冻样品提供，在裂解缓冲液中匀浆，用于RNAeasy操作。为了Northern印迹，利用Dynal′s(Lake Success，NY)oligo-dT25磁珠从总RNA(30μg总RNA/孔)提取mRNA，用3％甲醛的0.8％ SeaKemLE(FMC Bioproducts)电泳。利用毛细吸印方法于10×SSC过夜，将mRNA印迹到GenescreenPlus(NEN)，然后80℃烘烤2小时。按照每个制造商的操作规程，在106cpm/ml Quickhyb液(Stratagene)中用随机引发的32P标记cDNA探针(Prime-It，Stratagene，LaJolla，CA)，68℃探测膜。印迹用X光胶片和/或磷光屏曝光过夜。所有印迹上的表达相对看家基因(例如GAPDH或β肌动蛋白)归一化。
消减杂交根据每个制造商的操作规程，使用基于Lisitsyn等人(Lisitsyn，N.和Wigler，N.M.，Science 259946-51(1993))首次描述的代表性差异分析方法的PCR Select cDNA SubtractionKit(Clontech，Palo Alto，CA)，产生与正常乳腺细胞系比较在肿瘤中过表达的基因富集的cDNA。简要地，以oligo-dT为引物，从肿瘤和正常细胞经DNase处理的2μg高质量mRNA合成双链cDNA。在短的平端(Rsal消化的)肿瘤序列连接衔接头，其与过量Rsal消化的正常片段杂交。杂交32小时后，以衔接头序列为引物，利用抑制型PCR(Clontech)优先扩增过表达的肿瘤序列。将PCR扩增产物克隆到pT7Blue3(Novagen，Madison，WI)，产生消减文库。克隆在96孔板中LB/氨苄青霉素(100μg/ml)中培养，从过夜培养物中PCR扩增插入片段，PCR产物利用BioDot歧管(BioRad，Hercules，CA)在Genescreen Plus上点样。然后双份的点印迹用随机引物标记的肿瘤或正常cDNA或正反向消减杂交的PCR产物进行探测。在肿瘤cDNA和正向消减(肿瘤减正常)中似乎过表达的克隆经Northern印迹(如上所述)分析，以确定差异基因表达。
cDNA文库和全长基因以Oligo-dT为引物，利用SMART cDNASynthesis(Clontech Laboratories)从SKBR3细胞系产生双链cDNA，然后用酚∶氯仿∶异戊醇抽提。具体地，根据从EST同源物(登录号#W57569)推断的开放阅读框架，合成引物(C35有义5′-GCGATGACGGGGGAGCC，和C35反义5′CCACGGAATCTTCTATTCTTTCT；Fisher Oligos，The Woodlands，TX)，扩增C35编码区。PCR产物克隆到pT7Blue 3(Novagen)中。
牛痘和逆转录病毒C35重组体C35编码序列从文库中按指定方向亚克隆到牛痘转移质粒pVTK0的BamHI/SalI位点。将pVTK0.C35连同NotI和ApaI消化的V7.5/TK病毒DNA，转染由禽痘病毒感染的BSC-1细胞，产生重组病毒。如别处所述(美国发明专利申请No.08/935,377；PCT/US98/24029；T Cells Specific for Target Antigens and VaccinesBased Thereon)，这是构建痘苗病毒重组体的有效方法。C35基因也克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，通过与假模标本(pseudotyping)pVSVg共转染293-GP细胞，产生病毒原液。48小时后收集包含感染性病毒的上清液。
C35特异性2C3单克隆抗体的产生和FACS分析用C35逆转录病毒感染Line1小鼠小细胞肺癌细胞，将103-2×104细胞注射给3只BALB/cByJ小鼠。21天后，眼眶后取血，收集血清，检测与已知C35 mRNA表达水平低(MDA-MB-231)或很高(21NT)的人肿瘤细胞的反应性。还收集脾，利用标准的小鼠杂交瘤技术，融合脾细胞和P3骨髓瘤细胞，制备杂交瘤。针对存在的Ig用ELISA筛选HAT抗性克隆。高产者经同型化、定量，用于通过流式细胞术筛选C35+和C35-细胞系。包含1μgIgG的杂交瘤克隆上清液在PAB中(PBS、1％BSA、0.1％叠氮化物)与106细胞冰浴30分钟，然后用PAB洗3次，与缀合FITC的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechnology，Birmingham，AL)冰浴30分钟。选择重复了免疫血清表面染色(图14A-14B)的一个杂交瘤克隆2C3，扩增并纯化抗体(BioExpress，West Lebanon，NY)。
人C 35特异性的T细胞系的产生将来源于健康女性供者(HLA A2，11，B35，44)的外周血，分为红细胞玫瑰花结阳性组分(总T淋巴细胞来源)和阴性组分(单核细胞来源)。冷冻保存T淋巴细胞以供后用，而单核细胞于产生树突细胞(DC)的条件下温育。如Bhardwaj及同事所述(Bender，A.等人，J.Immunol.Meth.196121-35(1996)；Reddy，A.等人，Blood 903640-46(1997)；Engelmayer，J.等人，J.Immunology1636762-68(1999))略加修改，诱导DC成熟。每隔一天添加hGM-CSF和hIL-4(1000U/ml)。第7天，未贴壁的未成熟DC在GM-CSF和IL-4存在下，与C35逆转录病毒重组体温育6小时。此时，洗掉逆转录病毒上清液，将未成熟的树突细胞置于另外包含GM-CSF、IL-4和12.5％单核细胞条件培养基(MCM)的成熟条件下。4天以后，用这些成熟的、表达C35的DC按1DC∶50T细胞的比例，刺激自体T细胞14天。制备新鲜的自体DC混合物，再刺激T细胞，但这次DC在MCM中成熟48小时后，用C35痘苗病毒重组体感染。加入细胞因子IL-2(20U/ml)、IL-12(20U/ml)和IL-18(10ng/ml)，并保持DC∶T细胞比例为1∶50。培养12天后，在添加IL-2(20U/ml)和IL-7(10ng/ml)条件下，用C35重组逆转录病毒感染的EBV-B细胞另外刺激T细胞7天。细胞因子全部购自R&DSystems(Minneapolis，MN)。此时，细胞90％以上是CD8+，利用标准51Cr释放分析检测其活性。简要地，106靶细胞与100uCi 51Cr温育、洗涤，然后在补加10％人AB血清(BioWhittaker)的RPMI-1640中与CTL效应细胞温育4小时。CTL活性表示为特异性溶解的百分率，测量为(标记的靶细胞经CTL溶解而释放到上清液的51Cr-自发的释放量)/(最大释放量-自发释放量)。
结果
C35的特性在人乳腺肿瘤细胞差异表达的C35克隆，其序列不与Genbank中已知的任何基因同源，但鉴定了其同源的EST序列(原型登录号#W57569)。NCI CGAP(Cancer Genome Anatomy Project)文库中存在同源的人EST片段，包括脑肿瘤、肺肿瘤和肾脏肿瘤(A#AA954696)、Soares卵巢肿瘤(A# AA285089)和甲状旁腺肿瘤(A# W37432)、子宫内膜肿瘤(A# AA337071)以及结肠癌(A# AA313422)。鉴定了编码115个氨基酸的蛋白质的开放阅读框架(图10A)。从乳腺腺癌细胞系SKBR3的cDNA文库中分离全长基因。对细胞系SKBR3、21MT2-D和H16N2的全长转录物测序证实，在cDNA中没有点突变；C35hi细胞系以及C35lo细胞系的转录物100％同源。C35基因定位于人类染色体17q12(A#AC040933)，小鼠染色体11(A# AC064803)。根据与cDNA EST序列的同源性推断外显子，并进行GRAIL预测。令人感兴趣的是，C35基因位于Her2/neu癌基因的1000bp区域内，以及生长因子受体结合蛋白质7(GRB7)(参与细胞周期活化的酪氨酸激酶，在食道癌中过表达)基因的2000bp区域内(Tanaka，S.等人，J.Clin.Invest.102821-27(1998))(图10B)。Her2/neu蛋白质过表达与30％乳腺肿瘤的基因增殖有关，并与临床预后不佳有关(Slamon，D.J.等人，Science 235177-82(1987))。
C35氨基酸序列中预测的蛋白质基序包括位于氨基酸38-41(TYLE)、76-79(SKLE)和97-100(SNGE)处的酪蛋白激酶II磷酸化位点；位于氨基酸60-65(GGTGAF)处的N-豆蔻酰化位点；以及位于氨基酸94-97(RRAS)的cAMP-和cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点。最后，C35蛋白质在COOH端氨基酸112-115(CVIL)处包含异戊二烯化基序。异戊二烯化，即与疏水性类异戊二烯部分共价连接，是一种翻译后修饰，其可促进膜结合，也似乎介导蛋白质-蛋白质相互作用(Fu，H.-W.和Casey，P.J.，Recent Progress in Hormone Research 54315-43(1999))。已经证明异戊二烯化为潜在的癌基因Ras家族蛋白质定位以及转化到细胞表面所必需(Jackson，J.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.873042-46(1990)；Hancock，J.F.等人，Cell 571167-77(1989))。已经证明异戊二烯化的抑制剂具有抗肿瘤活性，例如减缓肿瘤生长(Garcia，A.M.等人，J.Biol.Chem.26818415-18(1993))以及在动物模型中促进排斥反应(Kohl，N.E.等人，Nature Med.1792-97(1995))。利用NetOGlyc2.0预测了3个O-糖基化位点，位于氨基端或氨基端附近-thr8、ser2和ser9。
C35转录物在乳腺和膀胱癌中过表达肿瘤免疫治疗的理想靶抗原应当在许多独立的癌中大量表达，而在正常增殖的重要组织中不表达或表达水平极低。通过Northern印迹分析确认C35的差异表达。在7/10的人肿瘤细胞系中表达的C35水平，比正常的永生乳腺上皮细胞系H16N2水平高10-25倍(图11A)。重要的是，来源于单一患者的原发(21NT、21PT)和转移(21MT1、21MT2)病变的细胞系都表达C35，提示其表达可能与肿瘤转化过程中的早期事件有关。此外，在独立起源的人类乳腺癌细胞系(包括SKBR3、T47D和BT474)中，都有C35的过表达。令人感兴趣的是，在SKBR3、MDAMB231、H16N2以及来源于同一患者的肿瘤中，C35的表达模式与Her2/neu表达相关，这可能与这两个基因的基因组紧密接近以及Her2/neu基因扩增的发生率有关。
为研究来源于患者的肿瘤中的C35表达是否是临床相关的，以开发癌症疫苗，从速冻的人组织样品(自Cooperative Human TissueNetwork(CHTN)获得)提取mRNA。70％原发乳腺肿瘤样品过表达C35转录物(图11B)，35％(7/20)该乳腺腺癌过表达水平比正常乳腺高10-70倍。检测的原发膀胱癌样品中，50％也过表达C35(图12)，而20％(3/14)原发膀胱癌比正常膀胱表达水平高10倍以上。卵巢(0/7)、前列腺(0/5)或结肠(0/15)癌样品未检测到9倍或更高水平的C35过表达(数据未显示)。
2C3单克隆抗体与C35+细胞反应为了确认C35所编码的基因产物的差异表达，选择针对该共有肿瘤抗原的单克隆抗体。用经人C35逆转录病毒重组体转导的低免疫原性的BALB/cByJ肿瘤细胞系免疫小鼠，制备杂交瘤。根据对C35++的乳腺和膀胱肿瘤细胞系的染色能力，筛选杂交瘤克隆(图13A和13B)。非致瘤性乳腺H16N2和膀胱SV-HUC上皮细胞系与同型对照相比，荧光强度的变化不显著。相反，2C3单克隆抗体特异性染色C35+的乳腺肿瘤SKBR3和21-NT-D，以及膀胱肿瘤ppT11A3。对既不固定也不通透化的细胞进行染色，表明2C3抗体识别细胞表面分子。
用C35抗体抑制肿瘤生长
抗体是检测癌症诊断标志的有用工具，但其也可用于治疗应用。人源化的Her2/neu特异性抗体(Herceptin)已经成功用于治疗某些乳腺癌。Herceptin结合Her2/neu，并下调生长因子受体的信号转导。用C35特异性的2C3抗体进行生长抑制研究。21NT-D乳腺肿瘤和H16N2″正常″乳腺细胞系在体外于不同抗体浓度下培养。在72小时进行XTT分析，以评价细胞扩增。结果如图14A-14B所示，表明2C3在低至1μg/ml的浓度下，抑制21NT肿瘤细胞生长约50％。
C35 I类表位为HLA-A2限制型
自身耐受性的建立是基于自身蛋白质开发疫苗的主要障碍。然而，必须根据定量的表达水平确定耐受性。可能甚至高亲和力的抗原特异性T细胞是耐受的，而具有低亲和力受体(对低浓度抗原没有功能性亲和力)的T细胞逃避耐受诱导。然而，如果存在与靶抗原过表达有关的、显著提高的亲和力，这些同样的T细胞能够随之变得功能上非常重要。即使它们数量很少，该T细胞能够通过最基本的免疫学操作(疫苗接种)进行扩增。
C35是在人正常组织中低基础水平表达的自身蛋白质。因此，必须确定人T细胞是否耐受癌的特征性表达水平的C35。排除耐受的唯一方法是证明免疫应答，缺乏临床试验而证明免疫应答的唯一方法是体外刺激。人T细胞和自体树突细胞来源于正常供者的PBL。利用C35 cDNA的逆转录病毒或痘病毒重组体感染的自体树突细胞交替刺激，致敏T细胞。几个刺激周期后体外回收CTL，分析其裂解C35+肿瘤靶细胞(图15A和15B)或者响应抗原诱导的活化而分泌细胞因子(图16A和16B)的能力。靶细胞或者内源性表达C35和/或HLA-A2.1，或者经改造(通过C35重组哺乳动物表达载体的标准转染，或通过C35重组痘苗病毒感染)表达这些蛋白质。先前的研究已经证明，利用痘苗病毒表达蛋白质，是将肽靶向MHC-I加工途径的有效方法(Moss，B.，Science 2521662-67(1991)。
几轮刺激以后，选择混合T细胞系和T细胞克隆，在51Cr释放分析中，它们相对于C35lo H16N2正常乳腺上皮细胞系，可差异溶解C35+肿瘤细胞(图15A和B)。HLA-A2限制型C35特异性CTL克隆10G3，有效溶解HLA-A2转染的致瘤细胞系21-NT.A2(21-NT.A2的C35抗原表达水平比H16N2高15倍，可用2C3单克隆抗体染色)。HLA-A2+膀胱肿瘤细胞系ppT11A3比衍生它的非致瘤性膀胱细胞系SV-HUC，也是特异性裂解的(图15B)。该数据证明，CTL对表达高水平C35的肿瘤的敏感性，对C35lo非致瘤性永生细胞系的溶解最小。重要的是，同样的CTL与原代培养的非永生、非转化的HLA-A2+乳腺上皮细胞MEC(C35表达水平不显著)不反应。支持T细胞识别C35+肿瘤的进一步证据如图16A和16B所示。T细胞响应C35+、HLA-A2+刺激物而分泌IFN-γ和TNF-α。此外，非致瘤性C35lo细胞系H16N2.A2不诱导C35特异性T细胞分泌细胞因子。然而，用痘苗病毒C35重组体感染该细胞系，能使其能够活化T细胞。既然T细胞不响应无关蛋白质L3转导的H16N2.A2分泌IFN-γ或TNF-α，表明该应答特异性针对C35蛋白质表达(图16A和B)。
几轮刺激以后，选择混合T细胞系和T细胞克隆，在51Cr释放分析中，它们差异溶解C35+、HLA-A2+肿瘤细胞。C35特异性CTL不溶解HLA-A2转染的非致瘤性乳腺上皮细胞系H16N2.A2(图15A和15B)，尽管根据如图11A所示的Northern印迹数据，该细胞系确实低水平表达C35。然而，C35特异性CTL有效溶解HLA-A2转染的致瘤细胞系21-NT.A2(21-NT.A2的C35抗原表达水平比H16N2高15倍，可用2C3单克隆抗体染色)。膀胱肿瘤细胞系ppT11A3与衍生它的非致瘤性膀胱细胞系SV-HUC相比，也显示C35+肿瘤特异性的溶解。该数据证明，CTL对表达高水平C35的肿瘤的敏感性，对C35lo非致瘤性永生细胞系的裂解最小。重要的是，同样的CTL与原代培养的非永生、非转化的HLA-A2+乳腺上皮细胞MEC(C35表达水平不显著)不反应。支持T细胞识别C35+肿瘤的进一步证据如图16A和16B所示。T细胞响应C35+、HLA-A2+刺激物而分泌IFN-γ和TNF-α。此外，非致瘤性C35lo细胞系H16N2.A2不诱导C35特异性T细胞的细胞因子分泌。然而，用痘苗病毒C35重组体感染该细胞系，能使其能够活化T细胞。既然T细胞不响应无关蛋白质L3转导的H16N2.A2而分泌IFN-γ或TNF-α，表明该应答特异性针对C35蛋白质表达。
C35特异性T细胞从HLA单倍型A2、A11、B8、B35的供者产生。膀胱细胞系SV-HUC和ppT11A3来源于单倍型HLA-A2、B18、B44的供者。然而，由于H16N2永生化乳腺上皮细胞系以及21-NT和21-MT乳腺肿瘤细胞系来源于同一个HLA-A2阴性供者，这些细胞系必需用HLA-A2.1转染，以提供所需的MHC限制性元件，以供HLA-A2限制性10G3T细胞克隆识别(图16A和16B)。T细胞经表达C35和HLA-A2的乳腺细胞系强刺激而分泌淋巴因子(21-MT2与21-MT2.vvA2比较)。该数据表明，存在至少一个HLA-A2.1确定的C35表位。
构建C35编码区的缺失突变体，以鉴定编码CTL识别的肽表位的cDNA片段。图15A和15B表明，用全长C35或只包含前50个氨基酸的截短的突变体刺激T细胞，分泌几乎等量的IFN-γ和TNF-α。
讨论
C35是在乳腺癌和膀胱癌中过表达的新肿瘤抗原。该基因的特性使其成为有希望用于肿瘤免疫治疗的候选者。它在来源于不同个体的大量肿瘤中表达。在正常的重要组织的表达相对较低，降低了自身免疫应答的风险，并且同样重要的是，这使免疫细胞不大可能已经对该基因产物发生耐受。由于表达C35的树突细胞体外诱导肿瘤特异性的人自体细胞毒性T淋巴细胞，将C35表征为″肿瘤抗原″。
C35是新的功能未知的基因产物。然而，我们用单克隆抗体的研究已经使对蛋白质定位有了一定理解。来源于C35免疫小鼠的血清和单克隆抗体都能对表达C35的未固定(unfixed)细胞进行特异性染色。这提示该抗体识别肿瘤表面的膜蛋白质。尽管根据疏水性，该蛋白质序列不符合已知的跨膜基序，但在COOH末端存在的异戊二烯化位点提示该蛋白质插入膜中。异戊二烯化是翻译后的脂类修饰，其产生基本上更具疏水性、更高膜亲和力的蛋白质(Fu，H.-W.和Casey，P.J.，RecentProgress in Hormone Research 54315-43(1999))。包含异戊二烯化位点的其它蛋白质包括Ras癌基因家族。Ras GTP酶在MAPK信号转导级联中起作用，诱导细胞分裂和增殖。Ras蛋白质通过异戊二烯化锚定到质膜，但该蛋白质保持在膜的细胞质一侧。因此，有可能C35也保持在膜的细胞质一侧，但可能有足够数量转运到外表面，而被特异性抗体检测到。
C35特异性抗体是研究C35蛋白质表达的重要工具，以印证Northern印迹分析，并用于诸如Western印迹和免疫组织化学分析。此外，这些抗体可能具有治疗上的益处，如最近已经证明的Herceptin(Baselga，J.等人，J.Clin.Oncol.14737-44(1996)；Pegram，M.D.等人，J.Clin.Oncol.162659-71(1998))，它是肿瘤相关抗原HER2-neu(C-erbB-2)(Schechter，A.L.等，Nature312513-16(1984))的抗体。Herceptin的抗肿瘤效应包括结合表皮生长因子受体，这抑制肿瘤细胞生长，并激发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(Dillman，R.O.，Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals145-10(1999)。
实施例6
诱导特异性针对肿瘤靶抗原的细胞毒性T细胞
已经通过用自体肿瘤或由肿瘤裂解物脉冲的自体抗原呈递细胞刺激PBL，体外诱导人肿瘤特异性T细胞(van Der Bruggen，P.等人，Science 2541643-1647(1991)；Yasumura，S.等人，Cancer Res.531461-68(1993)；Yasumura，S.等人，Int.J.Cancer 57297-305(1994)；Simons，J.W.等人，Cancer Res.571537-46(1997)；Jacob，L.等人，Int.J.Cancer 71325-332(1997)；Chaux，P.等人，J.Immunol.1632928-2936(1999))。PBL来源于有意用肿瘤、经修饰以增强其免疫原性的肿瘤、或肿瘤提取物免疫的患者，或者只在自然病程中预先刺激的患者。通过用经体外感染、或者自然病程中接触传染物而体内感染的自体细胞对T细胞进行体外刺激，能够类似得到对传染物具有反应性的T细胞。在此条件或其它条件下选择的、对肿瘤细胞或由病毒、真菌或分枝杆菌感染的细胞特异性的CD4+和CD8+T细胞或抗体，或者对自身免疫性疾病的靶抗原特异性的T细胞或抗体，能够用于本发明的选择和筛选方法，以检测和分离编码这些靶抗原并已掺入典型cDNA文库的cDNA。
尽管证明了针对肿瘤和受感染细胞的多种抗原体外成功诱导了人T细胞应答，但不能肯定这代表了体内可被诱导的应答全部组成成分。由于安全考虑限制了人免疫接种实验的可能性，因此需要另外的动物模型以研究对人疾病抗原的免疫应答。开发这种模型的主要障碍是，人正常细胞表达的多数分子在其它物种中具有强烈的免疫原性。因此，必需设计一种方法，能够在另一物种中诱导对人正常抗原的耐受性，以便揭示对任何人疾病特异性抗原的免疫应答。现在认识到，活化抗原特异性T淋巴细胞需要两种信号，其中一种涉及呈递特异性抗原复合物到T细胞抗原受体，另一种是独立的共刺激信号，一般通过抗原呈递细胞表面的B7家族分子与T细胞膜上CD28分子的相互作用而介导。在缺少共刺激信号的情况下传递抗原特异性信号不仅未能诱导T细胞免疫，而且导致T细胞对后续刺激没有反应性(Lenschow，D.J.等人，Ann.Rev.Immunol.14233-258(1996))。其它研究揭示了在抗原呈递细胞上的CD40分子和T细胞上的CD40配基之间的另一对相互作用的关键作用。该相互作用引起B7共刺激分子上调(Roy，M.等人，Eur.J.Immunol.25596-603(1995))。体内或体外存在抗CD40配基抗体的情况下，与CD40的相互作用被阻断，B7共刺激物不上调，特异性抗原复合物的刺激引起T细胞耐受，而非T细胞免疫(Bluestone，J.A.等人，Immunol.Rev.1655-12(1998))。使CD40/CD40配基相互作用以及B7/CD28相互作用之一或两者都阻断的各种方法，已经显示可有效诱导移植耐受(Larsen，C.等人，Nature 381434-438(1996)；Kirk等人，Nature Medicine 5686-693(1999))。抗CD40配基抗体(抗-CD154)阻断鼠T细胞与特异性移植抗原反应性的效果的实例如图17A和17B所示。用107 C57B1/6(H-2b)脾细胞腹膜内免疫DBA/2(H-2d)小鼠，并在接种时以及两天后另外注射盐水或0.5mg单克隆抗CD40配基抗体(MR1，抗CD154，Pharmingen09021D)。免疫后第10天，取出这些小鼠的脾细胞，用C57B1/6或经照射(20Gy)的异源C3H(H-2k)对照脾细胞体外刺激。体外刺激5天后，利用特异性标记靶细胞的51Cr释放分析，按不同效应细胞靶细胞比例，分析C57B1/6和C3H特异性的溶细胞反应，在此情况下，用同源脾细胞裂解物脉冲C3H或C57B1/6树突细胞。图17A和17B中的结果表明，针对C3H同种抗原对照，在盐水和抗CD154处理的小鼠中都诱导显著的细胞毒性，而对于C57B1/6，只在盐水处理小鼠中诱导细胞毒性反应，而在抗CD154处理的小鼠中没有诱导细胞毒性反应。这表明，当CD40/CD40配基的相互作用被抗CD154阻断时，诱导了针对免疫刺激所用抗原的耐受性。
类似于上述的、单独使用抗CD154或者联合使用抗CD154和抗B7或抗CD28的耐受化方法，能够用于在用人肿瘤免疫之前，在小鼠中诱导对人正常异种抗原的耐受性。在一个实施方案中，在来源于相同个体和衍生肿瘤细胞系的组织的正常永生细胞上可表达正常抗原。在另一实施方案中，从同一个体正常和肿瘤组织的细胞裂解物得到正常抗原和肿瘤抗原，每一裂解物脉冲抗原呈递细胞，以在体内和体外呈递给同源小鼠的T细胞。在优选实施方案中，经体外诱变或者癌基因转化从永生的、接触抑制的、贴壁依赖性、非致瘤性细胞系产生肿瘤，因此可获得很匹配的非致瘤性细胞，用于耐受性诱导。
另外的耐受化方法是，在用肿瘤免疫之前缺失由正常抗原活化的T细胞。活化的T细胞瞬时表达CD69和CD25，刺激后24-48小时表达最高。在经正常细胞或正常细胞裂解物活化以后，能够利用与基质(例如磁珠)直接或间接偶联的抗CD69和抗CD25抗体排除表达这些标志的T细胞。然后用肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物在继承性转移后体外或体内免疫剩余的T细胞，将优先引起肿瘤特异性应答。
在一个实施方案中，将要耐受人正常细胞或裂解物并继之以肿瘤细胞或裂解物免疫的小鼠，是任何商品化的近交和远交品系。因为鼠的T细胞只限于识别与鼠MHC分子(而不是人细胞表达的MHC)结合的肽抗原，有效的耐受和刺激需要用鼠MHC分子转染人细胞，或者通过鼠抗原呈递细胞重新呈递人的正常和肿瘤抗原。特别优选树突细胞作为抗原呈递细胞，因为它们在I类和II类MHC途径中都能重新呈递抗原肽(Huang等人，Science 264961-965(1994)；Inaba等人，J.Exp.Med.1761702(1992)；Inaba等人，J.Exp.Med.178479-488(1993))。在另一实施方案中，利用转双基因(人HLA和人CD8或CD4)的小鼠。HLA转基因允许在小鼠胸腺中选择高亲和力、HLA限制性T细胞所有组成成分。此外需要人CD8或CD4转基因，因为鼠CD8和CD4不与同源的人I类或II类MHC分子有效相互作用。利用非转基因小鼠产生人肿瘤特异性T细胞，将会鉴定到能够与鼠MHC分子结合进行加工的任何人类肿瘤抗原。因为可获得具有不同MHC分子的多个鼠品系，这样可能包含各种各样的抗原。然而，必须利用自身抗原呈递细胞刺激人T细胞，来分别确定这些肿瘤特异性抗原是否也表达能够与人HLA联合加工和呈递的肽。这种肽可能与或不与起初检测到的鼠MHC分子结合的肽重叠，但可来源于同类蛋白质。通过利用HLA转基因小鼠，有可能更直接找到与人MHC相关的抗原肽。然而，不能肯定鼠和人的抗原呈递细胞对肽的加工是相同的。因此，必须证实HLA限制性的人肿瘤抗原特异性T细胞确实也与人肿瘤细胞交叉反应。最后，无论怎样进行联合人HLA的加工和呈递，在任何情况下，必须确定人类T细胞是否与鉴定的抗原反应，或者也许由于其它非同源性正常组织表达相同或相关抗原而是否使T细胞耐受。利用鉴定的抗原或自身抗原呈递细胞呈递的抗原肽体外刺激人T细胞应答，能够获得这方面的相关信息。理想地，抗原阳性肿瘤的患者，其与目的肿瘤特异性抗原反应的T细胞的频率提高。如Renner，C.等人，Science 264833-835(1994)所述，为证明诱导的人抗原特异性T细胞能够有效消灭肿瘤，选择的人T细胞可继承性转移到带有人肿瘤异种移植物的SCID小鼠中。然而，临床相关的确切证据将要等待人体临床试验的结果。
实施例2描述了体外刺激原发性人T细胞应答的条件，其对CD4+和CD8+应答都适用。所述诱导人肿瘤特异性的人T细胞或抗体应答的策略，同样适用于针对病毒、真菌或分枝杆菌感染的人细胞的靶抗原的T细胞或抗体应答的诱导。实际上，在此情况下，相同的未感染细胞群体可立即提供正常对照群体，用于诱导耐受并确认感染的特异性。
转基因小鼠的构建为本领域公知，例如Manipulating the MouseEnibroyAlaboratory Manual，Hogan等人，Cold Spring Harbor Press，second edition(1994)中的描述。可以利用LaFace等人，J.Exp.Med.1821315-25(1995)方法，构建人CD8转基因小鼠。将相应的人cDNA插入基于人CD2小基因的载体中，可以构建表达人CD8α和CD8β亚基的新品系转基因小鼠，在转基因小鼠中进行T细胞特异性表达。(Zhumabekov等人，J.Immunol.Methods 185133-140(1995))。可利用Chamberlain等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857690-7694(1988)或Bernhard等人，J.Exp.Med.1681157-1162(1988)或Vitiello等人，J.Exp.Med.1731007-1015(1991)或Barra等人，J.Immunol.1503681-3689(1993)的方法，构建HLA I类转基因小鼠。
通过构建包括2kb上游调节区以及前两个内含子(以前曾用于基因调节)(Kralova等人，1992，EMBO J.114591-4600)的H-2Kb盒，进行另外的HLA I类转基因小鼠的构建。从该区去除内源性翻译起始位点，在第三个外显子中引入供HLA cDNA插入的限制性位点，其后是polyA添加位点。通过在此构建体3′端加入另外的3kb H-2Kb基因组序列，在胚胎干细胞中能够以I类基因为目标在H-2kb基因座进行同源重组。好处在于，很可能在已知与鼠I类基因表达相容的指定位置进行转基因表达，并且通过在细胞膜表达H-2Kb，这些小鼠很可能欠缺潜在的竞争作用。据信这样将得到在相同构建体中引入的不同的人HLA I类cDNA的相对可重现性的表达。
实施例7
利用C35肽表位刺激的T细胞株系4诱导GM-CSF分泌
通过用自体树突细胞(DC)、然后用感染C35重组牛痘病毒的自体单核细胞刺激正常供体T细胞12天，得到T细胞株系4。每周利用异体PBL和感染HLA-A2/Kb(21NT-A2)的21NT肿瘤持续进行刺激。实验结果如图18所述。此处所述实验按每孔106T细胞，利用由1μg/ml C35肽9-17、77-85、104-112或105-113脉冲的5×104受照射(2500拉德)H16N2-A2/Kb以及每孔105受照射异体PBL连同处于AIM-V/5％人AB血清中的IL2(20U/ml)和IL-7(10ng/ml)，体外重复刺激T细胞。两(2)轮7天刺激以后，测试T细胞在与经或未经1μg/ml肽脉冲、或vvC35或vvWT按MOI＝1感染的不同刺激物温育后诱导GM-CSF分泌。T细胞(5000)与25000个不同的刺激细胞一式三份，在AIM-V/5％人AB血清中温育过夜。
如图18所示，利用HLA-A2/Kb(H16N2-A2)转染的正常乳腺上皮细胞未观察到GM-CSF刺激。然而，利用C35肽脉冲的相同细胞产生显著刺激(A16N2-A2+肽)。利用每种肽脉冲的细胞均观察到刺激，肽77-85显示最强的刺激。此外，利用HLA-A2/Kb转染但未经C35肽脉冲的21NT肿瘤细胞(21NT-A2)以及利用HLA-A2/Kb转染并利用C35重组牛痘病毒感染的正常乳腺上皮细胞(H16N2-A2 vvC35)观察到显著刺激。正如预期，利用HLA-A2/Kb转染并利用野生型牛痘病毒感染的正常乳腺上皮细胞未观察到刺激。
观察到未利用任何C35肽脉冲的H16N2-A2细胞最小刺激，而利用肽脉冲的相同细胞则观察到大量刺激，这一事实证明，测试的每个C35肽均结合HLA2。此外，21NT-A2肿瘤细胞即使未经任何C35肽脉冲也显示刺激，这一事实证明C35肽由肿瘤细胞产生(加工)。最后，利用C35重组牛痘病毒感染的H16N2-A2细胞观察到刺激，此事实证明重组引入的全长C35多肽在细胞中被加工。
实施例8
产生肽特异性CD8+T细胞
CD8+T细胞选择
使用抗凝人血的标准聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离方法收集PBMC。在50ml离心管中用HBSS(无Ca2+/Mg2+)2∶1稀释全血。然后在30ml血液上覆盖一层12ml fioll。将血液在18℃、400xg离心30分钟，制动器关闭。取出包含PBMC的界面层，用HBSS 2x洗涤。
利用Miltenyi Biotec，Auburn，CA制造的磁性活化细胞分选(MACS)，来选择CD8阳性细胞。具体而言，将PBMC沉淀，每107个总细胞重悬于80μl MACS缓冲液(除气、冰预冷的PBS pH7.2，补加0.5％BSA和2mM EDTA)。每107个细胞加入20μl MACS CD8微珠，混匀，6-12℃温育15分钟。然后加入12ml MACS缓冲液洗涤细胞，4℃、300xg离心10分钟，完全去除上清，将沉淀重悬于1-2ml MACS缓冲液。将阳性选择的VS+MACS柱置于分离器的磁场中。经3ml MACS缓冲液洗涤，准备好柱子。将细胞悬浮液加入柱中，让细胞完全进入柱子。然后用3×3ml MACS缓冲液漂洗柱子。
从分离器上取下柱子，放在收集管中。然后吸取5ml MACS缓冲液到柱子中，用提供的柱塞强力冲出细胞。通过流式细胞术验证CD8+细胞类型。将细胞在含10％人AB血清(Gemini Bioproducts，Woodland，CA)的AIM-V培养基中(Gibco，Carlsbad，CA)培养，或在10％ DMSO & 90％人AB血清中冻存于-80℃，以供后用。
树突细胞(DC)的产生与成熟
从PBMC中选择DC
将包含所有PBL或在CD8+和/或CD4+细胞选择之后的PBMC铺板。使用Miltenyi Biotec MACS CD4微珠，以CD8+细胞(上述)相同方式选择CD4+细胞。PBL的存在与否对DC选择没有差别。然后在6孔板的RPMI无血清培养基中按5-7×106/孔接种PBMC，37℃ 2小时。去除非贴壁细胞，用HBSS 3x洗涤贴壁层。将贴壁细胞在含1％人AB血清、1000U/mlGM-CSF和1000U/ml IL-4的StemSpan(StemCell Technologies，Vancouver，BC，Canada)中37℃、7％CO2温育7天，以产生未成熟DC。每隔一天重新补充培养基和细胞因子。
DC成熟
第7天通过收获非贴壁细胞来收集未成熟DC。将DC在含1％人AB血清、1000U/ml GM-CSF、1000U/ml IL-4、10ng/ml TNFα和1μg/mlCD40L的StemSpan中37℃、7％CO2温育24-48小时，使成熟。
利用肽脉冲APC的CD8+细胞刺激
利用肽脉冲的自体DC进行初次刺激。所用CD8+细胞是新鲜细胞或在刺激前最少24小时从-80℃恢复培养。将新鲜成熟DC按每孔1×104细胞接种于U底96孔板的AIM-V培养基中。每孔中加入10μg/ml肽和3g/ml β2-微球蛋白，37℃、7％CO2脉冲4小时。
合并各孔为所述肽脉冲DC的混合物。然后将细胞转移到15ml圆锥体管中，用AIM-V培养基使体积达到12ml。沉淀离心并重悬于AIM-V培养基，以2500拉德照射。第0天，在24孔板的2×106 CD8+细胞中，按20T细胞对1DC的比例加入1×105肽脉冲的DC，进行刺激。将细胞在含5％人AB血清和10ng/ml IL-7的AIM-V中培养。第1天，每孔中加入20IU/ml IL-2。然后将细胞在37℃、7％CO2中温育12天，必要时更新培养基。
第2和第3次刺激
第2和第3次刺激的程序除下述之外，类似于第1次刺激的程序。利用恢复培养并成熟的冷冻DC。利用1-10μg/ml肽(取决于实验)脉冲DC 2-4小时。2500拉德照射DC，省略洗涤步骤。因而，任何未结合的肽都保留在培养基中。在12或24孔板中按20∶1的比例(CD8∶DC)培养细胞，每孔接种1×106 CD 8+细胞。通过第3次刺激7-12天后的细胞毒性和/或细胞因子释放分析，来分析T细胞的靶细胞识别作用。
第4次刺激及其它
多种细胞类型可用作APC，即DC、单核细胞、EBV-B和肿瘤。以自体单核细胞为例。2500拉德照射PBMC，然后以4-6×106细胞/孔接种12孔板的RPMI中，37℃、7％CO2温育2小时。去除非贴壁细胞，用HBSS 2x洗涤贴壁的单核细胞。
然后利用1-10μg/ml的肽在AIM-V培养基中37℃、7％CO2脉冲单核细胞2小时。先前已经利用混合物中的肽脉冲APC刺激CD8+细胞，脉冲单核细胞时将肽混合到相同混合物中。每种肽加入1-10μg/ml。将CD8+细胞加入分别脉冲的单核细胞中，保持20∶1的比例。
第0天加入10ng/ml IL-7，第1天加入20IU/ml IL-2。然后将细胞在37℃、7％CO2中温育7天，必要时更新培养基。一般而言，通过每次刺激5-7天后的细胞毒性和/或细胞因子释放分析，来分析T细胞的靶细胞识别作用。
克隆性CD8+细胞群体
通过有限稀释克隆细胞。在U底96孔板的各孔中加入处于含5％人AB血清的AIM-V培养基中的1-10CD8+细胞、1×104混合照射的异体滋养细胞(2500拉德)、1000个肽脉冲的经照射自体EBV-B细胞(2500拉德)以及10ng/ml IL-7。第1天加入20IU/ml IL-2。每周更换50％培养基、加入新鲜细胞因子和照射的滋养细胞以及肽脉冲的B细胞，来更新克隆。从显示＜30％生长(表明有限稀释物的克隆形成能力)的平板中选择克隆进行靶细胞识别分析、细胞毒性和/或细胞因子释放，并扩增。
快速扩增方案
该方案用于显示溶解活性的克隆。(该方案通过私人通讯得自Dr.Steven Rosenberg(NCI)。)
第0天，照射(2500拉德)异体混合PBMC并加入含具有10％人AB血清的25ml AIM-V的25cm2培养瓶中(4×107细胞/瓶)。加入30ng/mlOKT3，然后加入1×105活的克隆性CD8+细胞。第2天，加入300Iu/mlIL-2。第5天，每瓶更换20ml培养基，加入300IU/ml新鲜IL-2。REP后8-11天，通过细胞毒性或细胞因子释放分析来测试免疫活性。
细胞毒性51Cr释放分析
筛选针对所选靶细胞活性的CD8+细胞。利用肽以及转导表达逆转录病毒或牛痘病毒的细胞、肿瘤、正常对照等来脉冲APC。从培养瓶中取出细胞到15ml圆锥体管中洗涤靶细胞，加入12ml HBSS重悬细胞并离心下来，然后倒出～200μl上清。其中加入100uCi 51Cr/1×106细胞。然后将靶细胞37℃、7％CO2中温育1小时，再2×12ml HBSS洗涤。
靶细胞重悬于含5％人AB血清的AIM-V，并加入U底96孔板的各个孔中。然后根据实验，在不同时间点使用1-20ug/ml肽脉冲靶细胞；加入51Cr之前或51Cr温育之后过夜。在含5％人AB血清的AIM-V中加入CD8+效应细胞。E∶T之比为5∶1-50∶1。样品一式三份，终体积200μl。对照包括自发释放51Cr的培养基、最大释放(与5％triton X100温育)以及未脉冲的靶细胞。微孔板于700RPM旋转5分钟，37℃、7％CO2中温育4-6小时。收获上清，通过γ计数器测定51Cr的释放。
测定GM-CSF或γIFN释放的细胞因子ELISA分析
所用Pharmingen(San Diego，CA)试剂盒可能不同，需要遵循厂商说明。一般程序如下
第1天，利用每孔100μl处于包被缓冲液(0.1M碳酸盐，pH9.5)中的稀释的捕获抗体包被ELISA板。然后密封微孔板，用箔片包裹，4℃温育过夜。然后在U底96孔板含5％AB血清的AIM-V培养基中，将靶细胞与CD8+细胞温育过夜。样品一式三份。
第2天，吸干ELISA板的各个孔，用300μl/孔洗涤缓冲液(PBS，0.05％ Tween 20)洗涤3x(Bio-Tek plate washer，Winooski，VT)。然后用200μl/孔的分析稀释剂封闭微孔板，室温温育1小时，用洗涤缓冲液洗涤微孔板3x。
将100μl标准或每个未知样品的培养上清加入各自孔中，室温温育2小时。
用洗涤缓冲液洗涤微孔板5x，每孔中加入100μl工作检测物，微孔板于室温温育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤微孔板7x，每孔中加入100μl底物溶液，将微孔板于黑暗中室温温育15-30分钟。每孔中加入50μl 2N H2SO4终止反应。然后在30分钟之内读取450nm，λ校正为570nm。
实施例9
C35肽介导的T细胞溶解作用
分析对C35肽表位脉冲的EBV细胞的T细胞活性。具体而言，从表达不同HLA特性的两个分别的人类供体中获得T细胞，与C35肽表位脉冲的EBV-B靶细胞温育。结果如表10所示。
表10
T细胞供体SB，HLA单体型A2、A3；B18、B44 ％溶解EBV-B靶细胞 T细胞克隆无肽+p72-86+p77-85#464.678.597.1 ％溶解EBV-B靶细胞 T细胞克隆无肽+p17-31+p22-30#7200.572.8#751.61.256.8#10406.4100.3
肽17-31 VEPGSGVRIVVEYAE
肽22-30 GVRIVVEYA
肽72-86 QLVFSKLENGGFPYE
肽77-85 KLENGGFPY
T细胞供体LE，HLA单体型A3、A66；B8、B41 ％溶解EBV-B靶细胞 T细胞克隆 无肽 +p67-75 +p81-89 A 104 54.9 B 3.2 40.3
肽67-75 IEINGQLVF
肽81-89 GGFPYEKDL
T细胞供体AH，HLA单体型A2、A11；B8、B35
参见由下列肽刺激的T细胞株系4所诱导的GM-CSF分泌
肽9-17(SVAPPPEEV)；77-85(KLENGGFPY)；104-112(KITNSRPPC)；105-113(ITNSRPPCV)
如表10所示，表达A2、A3、B18和B44 HLA单体型供体的T细胞克隆经对应C35的氨基酸残基72-86的15聚体或对应氨基酸77-85的9聚体刺激，显示对未经任何肽脉冲的EBV-B靶细胞的最小溶解活性。但利用任意肽脉冲的EBV-B细胞观察到高水平的溶解活性(肽72-86和肽77-85分别为78.5％和97.1％)。类似地，相同供体针对C35氨基酸22-30对应的9聚体产生的T细胞不溶解未经肽脉冲的靶细胞，但很有效溶解经肽脉冲的靶细胞。但值得注意的是，经C35氨基酸17-31对应的15聚体脉冲的靶细胞，尽管其中包含9聚体22-30，仍显示最小的溶解作用。表达A3、A66、B8和B41 HLA单体型的另一供体的T细胞克隆经C35氨基酸67-75和81-89对应的9聚体刺激，对经这些肽脉冲的EBV-B靶细胞显示中度溶解活性(分别为54.9％和40.3％)。
经9聚体p77-85或15聚体p72-86脉冲的EBV-B细胞观察到高水平溶解活性，证明在某些情况下，包含C35肽表位的大肽有效刺激T细胞应答，与利用实际表位所获的应答类似。然而，尽管包含引发显著溶解活性的C35肽表位p22-30，利用p17-31仍观察到最小的溶解作用，此事实证明并非在每种情况均能观察到所述效果。
实施例10
C35特异性单克隆抗体
免疫程序
为产生C35特异性单克隆抗体，使用三种方法之一免疫BALB/cByJ小鼠。
1.利用C35重组逆转录病毒感染细胞，使同源小鼠纤维肉瘤细胞系BCA34转导表达人C35。根据G418抗性选择稳定表达C35的细胞。每只小鼠注射2×106细胞，23天后取脾，利用本领域技术人员公知的方法与NS1小鼠骨髓瘤细胞融合。
2.如上文BCA34所述，低免疫原性的小鼠小细胞肺癌株系1转导表达C35。利用20,000个细胞免疫小鼠，20天后取脾，与NS1小鼠骨髓瘤细胞融合。
3.小鼠接受腹膜内注射10×106pfu的人C35重组牛痘病毒VV.hC35。15天后取脾，与NS1小鼠骨髓瘤细胞融合。
ELISA筛选杂交瘤克隆
使用ELISA分析来筛选每一融合的500-1000个杂交瘤克隆所分泌抗体对C35的反应性和特异性。使用C35蛋白质或阴性对照β半乳糖苷酶包被ELISA板。两种蛋白质均以类似方式在大肠杆菌中生成并纯化，包括切割选择标签。杂交瘤克隆的上清然后与包被板温育，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠抗体温育，利用OPD底物检测。选择与C35蛋白质强烈反应、但不与半乳糖苷酶反应的克隆进一步鉴定。将每一所选杂交瘤克隆亚克隆数次，以产生稳定的抗体生成细胞系。表11列出已确认具有C35特异性的克隆。在若干情况下，通过C35蛋白质胶的Western印迹或下述免疫组织化学染色来证实抗体特异性。克隆并测序3个C35特异性杂交瘤的免疫球蛋白重链和轻链基因，确定其中2个相同。
表11证明具有C35特异性的杂交瘤克隆 克隆 免疫 亚型 反应性 可变区基因 1B2 1B3* 1E11 1F2 3E9 3E10* KC5 11B10 BCA34.hC35 BCA34.hC35 BCA34.hC35 BCA34.hC35 BCA34.hC35 BCA34.hC35 Linel.hC35 VV.hC35 IgM IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgM IgM Western Western、IHC Western Western已克隆(与1F2相同) 已克隆(与1E11相同) 已克隆
*抗体1B3与抗体3E10的序列相同
图19显示典型的ELISA实验。所有克隆在至少3个独立情况下一式三份进行测试。
III.Western印迹免疫检测
利用所选杂交瘤克隆的上清进行Western印迹免疫检测。在此分析中，4种杂交瘤的抗体(1B3、1F2、3E10、11B10)与hC35蛋白质特异性反应。在这些实验中，18％ SDS聚丙烯酰胺凝胶的每一泳道加载100ng纯化的重组C35蛋白质或对照β-半乳糖苷酶。如本领域技术人员所公知，将凝胶转移至PVDF膜。利用包含Tween-20和5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液(TBS)封闭膜。每个印迹与作为一抗的不同稀释度的杂交瘤上清温育，然后与二抗缀合HRP的山羊抗小鼠IgG温育，并用化学发光底物ECL检测。图20所示为抗体1B3、1F2和3E10的结果。利用11B10获得类似结果(略)。
IV.免疫组织化学
ELISA和Western印迹数据显示，这些单克隆抗体与重组C35蛋白质反应。此外，单克隆抗体1F2显示可用于原发乳腺肿瘤切片的免疫组织化学染色。图21证明，单克隆抗体1F2可以检测人乳腺肿瘤中高水平的内源性C35表达，正常乳房组织很少或不染色。从1F2杂交瘤上清中亲和纯化抗体。用二甲苯将石蜡包埋的玻片去石蜡化，通过分级乙醇再水化。通过蒸气及高pH处理，完成靶物质修复。切片用正常血清封闭，与亲和纯化的1F2(5mg/ml)温育，然后与VectorABC通用检测试剂盒温育，利用DAB底物显色。玻片用苏木精复染，乙醇/二甲苯脱水并盖玻片。
图21证明患者01A6的侵袭性乳腺癌切片强着色，而该患者的正常乳房组织阴性。该抗体染色可与可溶性C35蛋白质竞争，但不与无关蛋白质β-半乳糖苷酶竞争(数据略)，证明染色具有C35特异性。
V.克隆单克隆抗体可变区基因
各个克隆的特异性一旦证实，杂交瘤克隆的细胞沉淀及融合配偶体NS1于-80℃速冻，用于后续克隆可变区基因。从细胞沉淀中提取RNA，使用Invitrogen′s Generacer试剂盒生成全长cDNA。简言之，将RNA 5′端去帽，然后连接Generacer 5′寡核苷酸。使用oligo-dT引物和逆转录酶生成反义链cDNA。使用gene racer oligo作为5′引物以及根据IgG1恒定区保守序列设计的3′引物，通过PCR扩增双链cDNA。PCR产物克隆并测序。与融合配偶体相比，克隆经鉴定具有独特序列。将序列提交NCBI数据库的IgBLAST，以定位可变区框架及互补决定区(CDR)。为证实这些V-基因具有C35特异性，已经生成这些序列编码的重组抗体并体外表达，利用ELISA和Western进行分析(数据略)。
两种独特单克隆抗体V-基因的序列如下所示。克隆1F2和1E11具有相同V-基因。黑体表示CDR区。下划线表示框架区。
1E11/1F2V基因
κ
αtggattttcaggtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcagaatgtccagaggacaaattgttctc
acccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatatcctgcagtgccagctcaagtgt
aagttacatgaactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatcacacatccaacctg
gcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggagg
ctgaagatgctgccacttattactgccaacagtatcatagttacccacccacgttcggaggggggaccaagct
ggaaataaaa
IGG1
αtgaaagtgttgagtctgttgtacctgttgacagccattcctggtatcctgtctgatgtacagcttcaggagtcagga
cctggcctcgtgaaaccttctcagtctctgtctctcacctgctctgtcactggctactccatcaccagtggttatttct
ggaactggatccggcagtttccagggaacaaactggaatggatgggctacataagctacgacggtagcaat
aactccaacccatctctcaaaaatcgaatctccttcactcgtgacacatctaagaaccagtttttcctgaagtttaa
ttctgtgactactgacgactcagctgcatattactgtacaagaggaactacggggtttgcttactggggccaagg
gactctggtcactgtctctgca
3E10V-基因
κ
Atgaggttccaggttcaggttctggggctccttctgctctggatatcaggtgcccactgtgatgtccagataaccca
gtctccatcttttcttgctgcatctcctggagaaaccattactattaattgcagggcaagtaagtacattagcaaa
catttagtctggtatcaggagaaacctggagaaactaaaaagcttcttatctactctggatccactttgcaatctg
gacttccatcaaggttcagtggcagtggatctggtacagatttcactctcaccatcagtagcctggagcctgaaga
ttttgcaatgtattactgtcaacagcataatgaatacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaa
IGG1
atgatggtgttaagtcttctgtacctgttgacagcccttccgggtatcctgtcagaggtgcagcttcaggagtcagg
acctagcctcgtgaaaccttctcagactctgtccctcacctgttctgtcactggcgactccatcaccagtggttact
ggaactggatccggaaattcccaggaaataaacttgaatacgtggggtacataagctacagtggtggcactta
ctacaatccatctctcaaaagtcgaatctccatcactcgagacacatccaagaaccactactacctgcagttga
attctgtgactactgaggacacagccacatattactgtgcaagaggtgcttactacgggggggccttttttcctta
cttcgatgtctggggcgctgggaccacggtcaccgtctcctca
实施例11
C35使正常乳腺上皮细胞的癌基因
C35是未知功能的基因，我们先前表明它在大部分人乳腺和膀胱肿瘤中过表达。C35抗体体外抑制C35阳性肿瘤细胞生长。这提示C35基因产物可能在肿瘤细胞膜的信号转导中起作用，引出C35是癌基因的可能性。软琼脂中集落生长是锚定不依赖性的公认测定方法，这是区分经历肿瘤转化的细胞与正常细胞的特性。为分析C35的癌基因活性，利用全长C35基因的pTag.hC35重组体、单独的空pTag载体(pCMV-tag哺乳动物表达载体，Stratagene Corporation，LaJolla，CA)或已知的癌基因ras转染永生化的非肿瘤原性乳腺上皮细胞(H16N2)。评价表示转化的软琼脂集落形成，并与21-MT1乳腺肿瘤细胞比较(参见下表12)。结果显示，C35转染后形成的软琼脂集落数目增加10倍。这与ras转染后的集落形成频率或在软琼脂中接种21-MT1肿瘤细胞的结果相当。
从软琼脂中挑出转化集落，尝试在24孔板的液体培养基中增殖。载体对照转染后回收的少量明显集落不能在液体培养中成功增殖。相比之下，从C35或ras转染后回收的集落已成功建立为细胞系。看来即使从软琼脂中回收的少量对照集落也表现为不能生长。
表12人乳腺上皮细胞的C35转化子 细胞系集落#增殖？ H16N2.pTag(载体对照) 14 否 H16N2.pTag-hC35 150 是 H16N2.ras(阳性对照) 250 是 21-MT1(转移肿瘤系，C35+) 94 是
C35有助于肿瘤细胞的转化表型，这一事实增强了基于C35的癌症疫苗或C35特异性抗体作为乳癌和膀胱癌治疗剂的潜在应用。如果保持肿瘤表型需要C35基因产物，通过下调肿瘤细胞中C35基因表达或下调肿瘤表面膜的C35表达而免疫逃避不可能是基于C35的成功免疫治疗的障碍。
实施例12
监控溶液中MHC肽相互作用的荧光极化(fluorescencepolarization)
荧光的特征在于吸收某一波长的外来射线、然后发射另一波长的射线的过程。G.G.Stokes(1852)以荧光Stokes规律的形式率先描述了这一行为，他在其中陈述，出现荧光(发射)的波长总是大于吸收(激发)射线波长。
A.Einstein(1905)使用普朗克量子假说成功解释了这种行为。带有Eexcit能量的传入光量子被荧光分子吸收，使其能量提高到Eexcit。迅速继之以该分子向下跃迁到基态的一种振荡水平Eemiss，带有光量子发射。
通过使用荧光染料标记小分子，可以使用荧光极化(FP)监控它与另一同等大小或较大分子的结合。FP根据小分子比大分子旋转快的原理起作用。如果分子由荧光团标记，可以通过利用水平偏振光激发该荧光团，然后利用平行或垂直于水平激发的起偏镜测定发射光，以确定它是否仍位于激发时相同平面，从而测定旋转。如果在小分子上标记荧光团，它将在激发和发射之间的时间内旋转，发射光将去极化。如果所标记分子与大分子结合(有效增加其总体大小)，该分子将不在激发和发射之间的时间内旋转，发射光将极化，引起游离和结合形式之间的极化改变。为方便起见，单位一般是1000mP＝P。
在100μM待测竞争性肽存在下，确定HLA-A*0201和特定荧光标记肽的结合动力学。结合随时间增加，直至平台，在Ymax处特异性结合达到平衡。如果加入的待测竞争物能够竞争，将较快达到平衡，但结合较少。如果系统经无关竞争物(0％)和相关竞争物(100％)校准，可以使用Ymax计算抑制％。在此情况下，无关竞争物是HLA-B*2705结合(非HLA-A*0201结合)的肽GRAFVTIGK，而相关竞争物是已知的HLA-A*0201结合肽KLGEFYNQMM。为获得Ymax，使用非线性回归将曲线拟和为单指数相关。
发现下列8肽(基于SEQ ID NO2的氨基酸序列)由结合相关竞争物的相对抑制反映出具有对HLA-A*0201的高至中等结合能力。
肽 ％抑制 S9-V17 96.9 I25-A33 94.9 S21-Y29 90.8 I105-V113 86.4 F65-L73 74.8 G22-A30 67 T38-V46 47.3 G61-169 46.5
利用荧光标记的HLA-B*0702结合标准以及合适的相关与无关肽来校准待测肽的结合抑制，进行结合可溶性HLA-B*0702的C35肽的类似分析。注意到在相同分析条件下，这些抑制值对MHC分子和特定荧光肽的选择和浓度敏感。但比较HLA-A*0201和HLA-B*0702的抑制值没有意义。如下所示，发现6种9氨基酸长度的C35来源肽具有对HLA-B*0702高或中等的相对结合亲和性。
肽 ％抑制 K104-A112 69.4(Ala取代112位Cys的类似物) N107-L115 68.2(Ala取代112位Cys的类似物) E4-P12 54.6 G63-G71 51.4 I105-V113 45.2(Ala取代112位Cys的类似物) T62-N70 38.8
实施例13
构建N端和/或C端缺失突变体
下列一般方法可用来克隆N端或C端缺失的C35缺失突变体。通常，两条大约15-25个核苷酸的寡核苷酸引物来源于SEQ ID NO1多核苷酸的5′和3′目的位置。根据目的C35多核苷酸片段确定引物的5′和3′位置。如有必要，5′和3′引物分别添加起始和终止密码子，以表达该多核苷酸片段编码的C35多肽片段。优选的C35多核苷酸片段编码候选的MHCI类和MHC II类结合肽(在本说明书上述″多核苷酸和多肽片段″一节中公开的)。
5′和3′引物序列也可添加包含限制性位点的另外核苷酸，以便于将C35多核苷酸片段克隆到目的载体。利用合适的PCR寡核苷酸引物以及此处所述或本领域已知的条件，从基因组DNA或cDNA克隆扩增C35多核苷酸片段。本发明的C35多核苷酸片段编码的C35多肽片段，可以按与全长多肽相同的一般方式表达和纯化，尽管由于特定片段和全长多肽之间存在化学及物理特性的差异而可能需要做常规的改变。
为例证而非限制本发明，编码C35多肽片段的多核苷酸如下扩增并克隆产生5′引物，包含限制性内切酶位点，后接起始密码子，其位于编码MHC结合肽表位(表1-6所列)N端部分的多核苷酸序列的框架内。产生互补3′引物，包含限制性内切酶位点，后接终止密码子，其位于编码C35 MHC结合肽表位(表1-6所列)C端部分的多核苷酸序列的框架内。
利用识别引物中位点的限制性内切酶，消化扩增的多核苷酸片段以及表达载体。然后将该消化的多核苷酸连接在一起。将C35多核苷酸片段插入到限制性酶切的表达载体中，优选方式为将C35多肽片段编码区置于启动子下游。利用标准方法并如此处实施例所述，将连接混合物转化E.coli感受态细胞。从抗性克隆分离质粒DNA，利用限制性分析、PCR和DNA测序确认克隆的DNA的身份。
实施例14
C35的蛋白质融合
优选地，C35多肽与其它蛋白质融合。这些融合蛋白质可用于多种应用。例如，C35多肽融合His-标记、HA-标记、蛋白质A、IgG结构域、以及麦芽糖结合蛋白可便于纯化。(参见实施例5；也参见EP A 394,827；Traunecker等人，Nature 33184-86(1988).)类似地，融合IgG-1、IgG-3以及白蛋白可延长体内半衰期。C35多肽融合核定位信号可靶向蛋白质到特定的亚细胞定位，而共价异二聚体或同二聚体可提高或降低融合蛋白质的活性。融合蛋白质还可以产生具有一种以上功能的嵌合分子。最后，融合蛋白质与非融合蛋白质相比，可提高该融合蛋白质的可溶性和/或稳定性。通过修改以下概述的多肽与IgG分子融合的方法，可产生上述所有类型的融合蛋白质。
简要地，利用跨越下述序列的5′和3′端的引物，可PCR扩增人IgG分子的Fc部分。这些引物也应具有适当的限制性内切酶位点，以便于克隆到表达载体，优选哺乳动物表达载体。
例如，如果使用pC4(登录号209646)，可将人Fc部分连接到BamHI克隆位点。注意，应该破坏3′BamHI位点。然后，包含人Fc部分的载体再经BamHI限制性酶切，线性化载体，并将按实施例1所述PCR方法分离的C35多核苷酸连接到该BamHI位点。注意，克隆的C35多核苷酸没有终止密码子，否则不能制备融合蛋白质。
如果使用天然存在的信号序列制备分泌蛋白质，pC4不需要另外的信号肽。另外，如果不使用天然存在的信号序列，载体可修改为包括异源信号序列。(例如参见WO 96/34891.)
人IgG Fc区
GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA
GCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA
GGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG
TAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG
GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG
TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATC
TCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC
CCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT
TCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC
AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA
CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT
GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCC
CTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ IDNO[84])
优选的融合产物是，C35肽融合MHC分子的氨基端，使肽自然地占据MHC肽结合槽。Kang，X.等人，Cancer Res.57202-5(1997)已经报道，这种融合蛋白质能够用于对刺激特异性T细胞特别有效的疫苗组合物。
实施例15
检测生物样品中C35水平异常的方法
可以检测生物样品中的C35多肽，并且如果检测到C35水平升高或降低，该多肽是特殊表型的标志。检测方法很多，因此，本领域技术人员应当理解，可以修改以下分析方法，以适合其特殊需要。
例如，抗体夹心ELISA用来检测样品中的C35，优选检测生物样品中的C35。用终浓度为0.2-10ug/ml的C35特异性抗体包被微量滴定板的孔。抗体是单克隆或多克隆抗体。将孔封闭，以降低C35与孔的非特异性结合。
然后将包被的孔与包含C35的样品室温温育2小时以上。优选应使用连续稀释的样品来验证结果。然后用盐水洗板三次，除去未结合的C35。
然后，加入50μl浓度为25-400ng的可识别C35抗原决定簇(其不与结合板上的抗体识别的抗原决定簇重叠)的特异性抗体-碱性磷酸酶缀合物，室温下温育2小时。用去离子水或蒸馏水再洗板三次，除去未结合的缀合物。
每孔加入75μl 4-甲基伞形酮酰磷酸盐(MUP)或对硝基苯基磷酸盐(NPP)底物溶液，室温下温育1小时。利用微量滴定板读数器测定反应。利用连续稀释的对照样品制备标准曲线，并以C35多肽浓度为X轴(对数刻度)、以荧光或吸光度为Y轴(线性刻度)。利用标准曲线内插计算样品中的C35浓度。
实施例16
配制多肽
按照符合良好的医疗实践的方式，并考虑患者个体的临床状况(特别是单独用C35多肽治疗的副作用)、输送位置、给药方法、给药时间表及其它为专业人员所知的因素，配制C35组合物并确定剂量。因而根据这些考虑确定此处所用的″有效量″。
一般主张，每剂非肠道给药C35的药物总有效量介于大约1μg/kg/天-10mg/kg/天的患者体重，尽管如上所述，这也要经过治疗判断。更优选剂量至少0.01mg/kg/天，人用最优选剂量大约0.01-1mg/kg/天。如果连续给药，一般给予C35的剂量速率为大约1-50μg/kg/小时，每天注射1-4次或通过连续的皮下输注，例如利用小泵。也可使用静脉注射袋装溶液。观察到变化需要的治疗时间长短以及治疗后到发生反应的间隔时间似乎取决于预期效果。
包含C35的药物组合物经口服、直肠、非肠道、脑池内、阴道内、腹腔内、局部(通过粉末、软膏、凝胶、滴剂或透皮片)、口腔(bucally)，或者口喷或鼻喷给药。″药物可接受的载体″是指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释剂、胶囊物质或任何类型的剂型助剂。此处所用术语″非肠道″是指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下以及关节内注射和输注的给药方式。
C35也适于通过缓释(sustained-rebease)系统给药。合适的缓释组合物例子包括有形物品形式的半渗透聚合物基质，例如薄膜或微囊。缓释基质包括polyactides(美国专利No.3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物(Sidman，U.等人，Biopolymers 22547-556(1983))，聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)(R.Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)以及R.Langer，Chem.Tech.1298-105(1982))，乙烯乙酸乙烯酯(R.Langer等人)或聚D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。缓释组合物也包括脂质体包载的C35多肽。包含C35的脂质体按本来已知的方法制备DE3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利Nos.4,485,045和4,544,545；以及EP102,324。脂质体通常是小(大约200-800埃)的单层类型，其中脂类内容物是大于约30摩尔百分比的胆固醇，调整选择的比例以优化分泌型多肽的治疗。
至于非肠道给药，在一个实施方案中，一般以单位剂量的注射形式(溶液、悬浮液或乳液)，按所要求纯度，与药物可接受的载体(即，在使用的剂量和浓度下对受者无毒，并与该制剂的其它成分相容)混合，配制C35。例如，优选制剂不包括氧化剂及其它已知对多肽有害的化合物。
通常，通过将C35与液体载体或精细粉碎的固体载体或两者都均一并紧密地接触而制备制剂。如有必要，该产物然后做成所要求制剂的形状。优选载体是非肠道载体，更优选与受者血液等渗的溶液。该载体的例子包括水、盐水、Ringer′s液和葡萄糖溶液。此处也用非水载体诸如不挥发油和油酸乙酯，以及脂质体。
载体适当地包含小量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。该物质在使用的剂量和浓度下对受者无毒，并包括缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸，及其它有机酸或其盐；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(小于大约10个残基)的多肽，例如多聚精氨酸或三肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如聚山梨酸酯、聚羟体或PEG。
一般在这种载体中配制C35，浓度大约0.1-100mg/ml，优选1-10mg/ml，pH大约3-8。应当理解，利用上述的某些赋形剂、载体或稳定剂，将导致形成多肽盐。
用来治疗性给药的C35可无菌。利用通过无菌过滤膜(例如0.2微米膜)过滤，可轻易实现无菌。治疗性多肽组合物通常放入具有无菌入口的容器中，例如静脉注射液袋子或带有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。
C35多肽通常以水溶液或用于重建的冻干制剂，保存在单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿或小瓶。冻干制剂例如，10ml小瓶中充有5ml无菌过滤的1％(w/v)C35多肽水溶液，将获得的混合物冻干。利用注射用抑菌水重建冻干的C35多肽，制备输注液。
本发明还提供包含一种或多种容器的药物包装或试剂盒，其中装有一种或多种本发明的药物组合物成分。该容器带有按管理药品或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定形式的通知，其反映该机构批准生产、使用或销售，供人类药用。此外，C35可与其它的治疗化合物联合使用。
实施例17
C35肽介导的细胞溶解作用
分析了对各种细胞系的T细胞活性。具体而言，将利用肽脉冲DC刺激的得自人类供体的T细胞与不同细胞系靶细胞温育。结果如表13和14所示。
如实施例8所述，使用DC以及脉冲的自体DC刺激CD8+细胞。利用C35 K104-V113肽片段和保护肽所含半胱氨酸的还原剂TCEP脉冲DC(K104-V113)。还利用包含丙氨酸或丝氨酸取代112位氨基酸的K104-V113肽片段脉冲DC(K104-V113-Ala和K104-V113-Ser)。还利用包含半胱氨酰化的112位氨基酸半胱氨酸的C35K104-V113肽片段脉冲DC(K104-V113-cys-cys)。
本实验使用的靶细胞如下HLA-A2阳性并具有低水平C35表达的正常乳腺内皮细胞系(H16.A2)；HLA-A2阴性并具有高水平C35表达的乳腺肿瘤细胞系(21NT)；HLA-A2阳性并具有高水平C35表达的乳腺肿瘤细胞系(21NT.A2)；对NK细胞的非特异性杀伤敏感的细胞系(K562)；HLA-A2阳性并不表达C35的头颈癌细胞系(PCI-13)；以及利用具有112位氨基酸取代为丝氨酸的C35 104-113肽片段脉冲的PCI-13细胞系(PCI-13 K104-V113-Ser)。
在实施例8所述细胞毒性51Cr释放分析中测定细胞溶解作用。从本实验所用靶细胞上清测定的原始铬值，如表13所示。自发值来自与不加CD8+细胞的培养基温育的靶细胞。最大值来自在HCl中温育的靶细胞，以致所有细胞都被溶解了。细胞溶解百分比数据如表14所示。
表13
T细胞供体SB，HLA单体型A2、A3；B18、B44
原始铬值 体外刺激 H16.A2 21NT 21NT.A2 K562 PCI-13 PCI-13 K104-V113- Ser DC 466 177 732 453 691 673 K104-V113-Ala 479 155 763 246 468 746 K104-V113-Ser 584 185 3228 323 581 2588 K104-V113- cys-cys 440 171 1329 287 486 1772 K104-V113 483 137 1429 311 804 1403 自发 425 173 440 267 543 538 最大 6628 2654 4853 2481 3962 4029 ％自发 6.4 6.5 9.1 10.8 13.7 13.4
表14
T细胞供体SB，HLA单体型A2、A3；B18、B44
溶解靶细胞百分比 体外刺激 H16.A2 21NT 21NT.A2 K562 PCl-13 Pcl-13 K104-V113- Ser DC 0.7 0.2 6.6 8.4 4.3 3.9
K104-V113-Ala 0.9 -0.7 7.3 -0.9 -2.2 6.0 K104-V113-Ser 2.6 0.5 63.2 2.5 1.1 58.7 K104-V113- cys-cys 0.2 -0.1 20.1 0.9 -1.7 35.3 K104-V113 0.9 -1.5 22.4 2.0 7.6 24.8
利用上述及实施例8所述C35肽体外刺激得到的相同CD8+细胞，复进行细胞毒性51Cr释放分析。除上述细胞系之外，还使用由包含丝氨酸取代112位氨基酸的K104-V113 C35肽片段脉冲的21NT.A2乳腺肿瘤细胞系(21NT.A2-Ser)。也使用各种黑色素瘤细胞系作为靶细胞。黑色素瘤细胞系1700(Mel 1700)、501(Mel 501)和F002(Mel F002)为HLA-A2阳性并表达C35。黑色素瘤细胞系1359(Mel 1359)为HLA-A2阴性并表达C35。此实验的效应细胞与靶细胞之比为30∶1。此实验所用CD8+细胞已于第4次刺激后在IL-2中培养12天。从本实验所用靶细胞上清测定的原始铬值，如表15所示。溶解细胞百分比如表16所示。
表15
T细胞供体SB，HLA单体型A2、A3；B18、B44
原始铬值 体外刺激 H16.A2 21NT.A2 21NT.A2-Ser K562 DC 916 2383 2470 1403 K104-V113-Ala 829 1365 2423 815 K104-V113-Ser 1018 4957 4762 974 K104-V113- cys-cys 1024 2337 4474 1713 K104-V113 948 2753 3729 1156 自发 729 875 855 619 最大 5848 8521 7830 7356
体外刺激 Mel 1700 Mel 1359 Mel 501 Mel F002 DC 1743 2443 2470 1403 K104-V113-Ala 1543 3050 2423 815 K104-V113-Ser 2951 2357 4762 974 K104-V113- cys-cys 1857 2299 4474 1713 K104-V113 1964 2758 3729 1156 自发 1387 2050 1637 1716 最大 7887 12157 8953 8003
表16
T细胞供体SB，HLA单体型A2、A3；B18、B44
溶解靶细胞百分比 体外刺激 H16.A2 21NT.A2 21NT.A2-Ser K562 DC 3.7 19.7 23.2 11.6
K104-V113-Ala 2.0 6.4 22.5 2.9 K104-V113-Ser 5.6 53.4 56.0 5.3 K104-V113- cys-cys 5.8 19.1 51.9 16.2 K104-V113 4.3 24.6 41.5 8.0 体外刺激 Mel 1700 Mel 1359 Mel 501 Mel F002 DC 5.5 3.9 15.8 11.5 K104-V113-Ala 2.4 9.9 11.1 7.6 K104-V113-Ser 24.1 3.0 45.3 15.1 K104-V113- cys-cys 7.2 2.5 21.2 11.2 K104-V113 8.9 7.0 36.0 15.7
显然，可以不同于上述说明书和实施例中的特别描述而实施本发明。根据上述教导，能够对本发明进行大量修改和变动，因此，在所附权利要求书的范围内，可以不同于其特别描述而实施本发明。
在本发明的背景、详述、实施例和序列表中引用的每个文件(包括专利、专利申请、期刊文章、摘要、实验手册、著作或其它公开物)的所有公开物，在此引入作为参考。
关于保藏的微生物的说明
(PCT实施细则第13条之二)A.以下所作的说明涉及说明书第17页第12-17行所指的微生物。B.保藏物标识 更多的保藏物标识见附页保藏单位名称美国典型培养物保藏中心保藏单位地址(包括邮政编码和国家)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209United States of America保藏日期2000年8月1日保藏编号PTA-2310C.其它说明(如果不适用则留空) 该信息续在附页上人质粒C35D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)E.单独提交的说明(如果不适用则留空)以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)
PCT/RO/134表
关于保藏的微生物的说明
(PCT实施细则第13条之二)A.以下所作的说明涉及说明书第17页第12-17行所指的微生物。B.保藏物标识 更多的保藏物标识见附页保藏单位名称美国典型培养物保藏中心保藏单位地址(包括邮政编码和国家)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209United States of America保藏日期2000年8月1日 保藏编号PTA-2310C.其它说明(如果不适用则留空) 该信息续在附页上人质粒C35D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)E.单独提交的说明(如果不适用则留空)以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)
PCT/RO/134表
序列表
<110>Vaccinex，Inc.
<120>在乳腺和膀胱癌中差异表达的基因及编码的多肽
<130>1821.004PC05
<150>US 60/386,738
<151>2002-06-10
<150>US 60/432,241
<151>2002-12-11
<150>US 60/464,650
<151>2003-04-23
<160>160
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>354
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(7)..(354)
<400>1
gccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc48
Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro
1 5 10
gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt 96
Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys
15 20 25 30
gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg 144
Glu Pro Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val
35 40 45
aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca 192
Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr
50 55 60
ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg 240
Gly Ala Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu
65 70 75
gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga 288
Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg
80 85 90
aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct 336
Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro
95 100 105 110
ccc tgc gtc atc ctg tga 354
Pro Cys Val Ile Leu
115
<210>2
<211>115
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro Glu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys Glu Pro
20 25 30
Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val Lys Glu
35 40 45
Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala
50 55 60
Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu Glu Asn
65 70 75 80
Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg Arg Ala
85 90 95
Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Cys
100 105 110
Val Ile Leu
115
<210>3
<211>518
<212>DNA
<213>人
<400>3
gggccgcgat gagcgtagcc ggggcagacg tccgtagcgc cccctcccga ggaggtcgag 60
ccgggcagtg gggtccgcat cgtggtggag tactgtgaac cctgcggctt cgaggcgacc 120
tacctggagc tggccagtgc tgtgaaggag cagtatccgg gcatcgagat cgagtcgcgc 180
ctcgggggca caggtgcttt gagatagaga taaatggaca gctggtgttc tccaagctgg 240
agaatggggg ctttccctat gagaaagatc tcattgaggc catccgaaga gccagtaatg 300
gagaaaccct agaaaagatc accaacagcc gtcctccctg cgtcatcctg tgactgcaca 360
ggactctggg ttcctgctct gttctggggt ccaaaccttg gtctcccttt ggtcctgctg 420
ggagctcccc tgcctctttc acctacttag ctccttagca aagagacact ggcctccact 480
ttgccctttg ggtacaaaga aggaatagaa gattccgt 518
<210>4
<211>621
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(14)..(15)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(24)..(24)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(28)..(28)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(31)..(31)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(33)..(33)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(491)..(491)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(535)..(535)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(557)..(557)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(565)..(565)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(574)..(574)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(588)..(588)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(595)..(595)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(606)...(606)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>4
ggggcccgag cggnngccag cgantgangg nangccggga cagacgtccg tagcgccccc 60
tcccgaggag gtcgagccgg gcagtggggt ccgcatcgtg gtggagtact gtgaaccctg 120
cggcttcgag gctacctacc tggagctggc cagtgctgtg aaggagcagt atccgggcat 180
cgagatcgag tcgcgcctcg ggggcacagg tgctttgaga tagagataaa tggacagctg 240
gtgttctcca agctggagaa tgggggcttt ccctatgaga aagatctcat tgaggccatc 300
cgaagagcca gtaatggaga aaccctagaa aagatcacca acaagcccgt cctcccttgc 360
gtcatcctgt gacttgcaca ggactctggg gttcctgctc tgttctgggg gtccaaacct 420
tggtctccct ttggtcctgc tgggaagctc cccctgcctc tttcccctaa ttagctctta 480
agcaaagaga ncctggcctc caatttgccc tttgggtaca aagaaggaat agaanatccg 540
tggccttggg gaagganaaa aaatntccat aaanttttca ggcaactnaa acccnttcca 600
ggtaantccc agaaaaccaa t 621
<210>5
<211>683
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(608)..(608)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>5
gagccggggc agacgtccgt agcgccccct cccgaggagg tcgagccggg cagtggggtc 60
cgcatcgtgg tggagtactg tgaaccctgc ggcttcgagg cgacctacct ggagctggcc 120
agtgctgtga aggagcagta tccgggcatc gagatcgagt cgcgcctcgg gggcacaggt 180
gcctttgaga tagagataaa tggacagctg gtgttctcca agctggagaa tgggggcttt 240
ccctatgaga aagatctcat tgaggccatc cgaagagcca gtaatggaga aaccctagaa 300
aagatcacca acagccgtcc tccctgcgtc atcctgtgac tgcacaggac tctgggttcc 360
tgctctgttc tggggtccaa accttggtct ccctttggtc ctgctgggag ctccccctgc 420
ctctgtcccc tacttagctc cttagcaaag agaccctggc ctccactttg ccctttgggt 480
acaaagaagg aatagaagat tccgtggcct tgggggcagg agagagacac tctccatgaa 540
cacttctcca gccacctcat acccccttcc cagggtaagt gcccacgaaa gcccagtcca 600
ctcttcgnct cggtaatacc tgtctgatgc cacagatttt atttattctc ccctaaccca 660
gggcaatgtc agctattgcc agt 683
<210>6
<211>490
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(12)..(12)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(17)..(17)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(23)..(24)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(65)..(67)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(432)..(432)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(454)..(454)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(461)..(461)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(490)..(490)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>6
gattcggcac gngggcnagg gannggggca gacgtccgta gcgccccctc ccgaggaggt 60
cgagnnnggc agtggggtcc gcatcgtggt ggagtactgt gaaccctgcg gcttcgaggc 120
gacctacctg gagctggcca gtgctgtgaa ggagcagtat ccgggcatcg agatcgagtc 180
gcgcctcggg ggcacaggtg ctttgagata gagataaatg gacagctggt gttctccaag 240
ctggagaatg ggggctttcc ctatgagaaa gatctcattg aggccatccg aagaagccag 300
taatggagaa accctagaaa agatcaccaa caagcccgtc ctccctgcgt catcctgtga 360
ctgcacagga ctctgggttc ctgctctgtt ctggggtcca aaccttggtc tccctttggt 420
cctgctggga gntccccctg cctctttccc ctanttagct ncttagcaaa gagaccctgg 480
cctccacttn490
<210>7
<211>557
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(28)..(28)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(504)..(504)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(527)..(527)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(545)..(545)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>7
cgtccgtagc gccccctccc gaggaggnct gagccgggca gtggggtccg catcgtggtg 60
gagtactgtg aaccctgcgg cttcgaggcg acctacctgg agctggccag tgctgtgaag 120
gagcagtatc cgggcatcga gatcgagtcg cgcctcgggg gcacaggtgc tttgagatag 180
agataaatgg acagctggtg ttctccaagc tggagaatgg gggctttccc tatgagaaag 240
atctcattga ggccatccga agagccagta atggaagaaa ccctagaaaa gatcaccaac 300
agccgtcctc ccttgcgtca tcctgtgact tgcacaggac tctgggttcc tgctctgttc 360
ttggggtcca aacctttggt ctccctttgg tcctgctggg aagctccccc tgcctctttt 420
cccctactta agctccttta gcaaagaaga acctgggcct tccacttttg cccttttggg 480
gtacaaaaga aggaattaga aganttccgt gggcctttgg gggcaangaa gaagagaaac 540
tcttnccatt gaacaat557
<210>8
<211>508
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(12)..(13)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(19)..(20)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(23)..(23)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(27)..(27)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(31)..(31)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(33)..(33)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(44)..(44)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(442)..(442)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>8
ggcccgagcg gnngccagnn gantgangag nangccgggg cagncgtccg tagcgccccc 60
tcccgaggag gtcgagccgg gcagtggggt ccgcatcgtg gtggagtact gtgaaccctg 120
cggcttcgag gcgacctacc tggagctggc cagtgctgtg aaggagcagt atccgggcat 180
cgagatcgag tcgcgcctcg ggggcacagg tgcctttgag atagagataa atggacagct 240
ggtgttctcc aagctggaga atgggggctt tccctatgag aaagatctca ttgaggccat 300
ccgaagagcc agtaatggag aaaccctaga aaagatcacc aacagccgtc ctccctgcgt 360
catcctgtga ctgcacagga ctctgggttc ctgctctgtt ctggggtcca aaccttggtc 420
tccctttggt cctgctggga gntccccctg gctcttttcc cctacttaag ctccttaagc 480
aaagaagacc ctggcctcca attttgtt508
<210>9
<211>418
<212>DNA
<213>人
<400>9
cgtccgtagc gccccctccc gaggaggtcg agccgggcag tggggtccgc atcgtggtgg 60
agtactgtga accctgcggc ttcgaggcga cctacctgga gctggccagt gctgtgaagg 120
agcagtatcc gggcatcgag atcgagtcgc gcctcggggg cacaggtgcc tttgagatag 180
agataaatgg acagctggtg ttctccaagc tggagaatgg gggctttccc tatgagaaag 240
atctcattga ggccatccga agagccagta atggagaaac cctagaaaag atcaccaaca 300
gccgtcctcc ctgcgtcatc ctgtgactgc acaggactct gggttcctgc tctgttctgg 360
ggtccaacct tggtctccct ttggtcctgc tgggagctcc cctgcctctt tccctact 418
<210>10
<211>411
<212>DNA
<2l3>人
<400>10
cgcatcgtgg tggagtactg tgaaccctgc ggcttcgagg cgacctacct ggagctggcc 60
agtgctgtga aggagcagta tccgggcatc gagatcgagt cgcgcctcgg gggcacaggt 120
gctttgagat agagataaat ggacagctgg tgttctccaa gctggagaat gggggctttc 180
cctatgagaa agatctcatt gaggccatcc gaagagccag taatggagaa accctagaaa 240
agatcaccaa cagccgtcct ccctgcgtca tcctgtgact gcacaggact ctgggttcct 300
gctctgttct ggggtccaaa ccttggtctc cctttggtcc tgctggggag ctccccctgc 360
ctctttcccc tacttagctc cttagcaaag agacctgggc ctccattttg c 411
<210>11
<211>397
<212>DNA
<213>人
<400>11
tcgagccggg cagtggggtc cgcatcgtgg tggagtactg tgaaccctgc ggcttcgagg 60
cgacctacct ggagctggcc agtgctgtga aggagcagta tccgggcatc gagatcgagt 120
cgcgcctcgg gggcacaggt gcctttgaga tagagataaa tggacagctg gtgttctcca 180
agctggagaa tgggggcttt ccctatgaga aagatctcat tgaggccatc cgaagagcca 240
gtaatggaga aaccctagaa aagatcacca acagccgtcc tccctgcgtc atcctgtgac 300
tgcacaggac tctgggttcc tgctctgttc tggggtccaa accttggtct ccctttggtc 360
ctgctgggag ctccccctgc ctctttcccc tacttag 397
<210>12
<211>389
<212>DNA
<213>人
<400>12
ggcagacgtc cgtagcgccc cctcccgagg aggtcgagcc gggcagtggg gtccgcatcg 60
tggtggagta ctgtgaaccc tgcggcttcg aggcgaccta cctggagctg gccagtgctg 120
tgaaggagca gtatccgggc atcgagatcg agtcgcgcct cgggggcaca ggtgcctttg 180
agatagagat aaatggacag ctggtgttct ccaagctgga gaatgggggc ttccctatga 240
gaaagatctc attgaggcca tccgaagagc cagtaatgga gaaaccctag aaaagatcac 300
caacagccgt cctccctgcg tcatcctgtg actgcacagg actctgggtt cctgctctgt 360
tctggggtcc aaaccttggt ctccctttg 389
<210>13
<211>469
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(407)..(407)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(416)..(416)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(427)..(427)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(446)..(446)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(461)..(461)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>13
ccggagcaga cgtccgtagc gccccctccc gaggaggtcg agccgggcag tggggtccgc 60
atcgtggtgg agtactgtga accctgcggc ttcgaggcga cctacctgga gctggccagt 120
gctgtgaagg agcagtatcc gggcatcgag atcgagtcgc gcctcggggg cacaggtgcc 180
tttgagatag agataaatgg acagctggtg ttctccaagc tggagaatgg gggctttccc 240
tatgagaaag atctcattga ggccatccga agagccagta atggagaaac cctagaaaag 300
atcaccaaca gccgtcctcc ctgcgtcatc ctgttgactt gcacaggact ttgggttcct 360
gctctgttct tggggtccaa acctttggtc ttcccttttg ttcctgnttg gggagntccc 420
ccttgcnttt ttcccttatt taggtncttt agcaaagaga ncttggctt 469
<210>14
<211>608
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(15)..(16)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(26)..(26)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(31)..(31)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(34)..(34)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(523)..(523)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(525)..(525)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(597)..(597)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(599)..(599)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(605)..(605)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>14
caggggccga gcggnngcca gcgachgacg ngangccggg gcagacgtcc gtagcgcccc 60
ctcccgagga ggtcgagccg ggcagtgggg tccgcatcgt ggtggagtac tgtgaaccct 120
gcggcttcga ggcgacctac ctggagctgg ccagtgctgt gaaggagcag tatccgggca 180
tcgagatcga gtcgcgcctc gggggcacag gtgcctttga gatagagata aatggacagc 240
tggtgttctc caagctggag aatgggggct ttccctatga gaaagatctc attgaggcca 300
tccgaagagc caagtaatgg agaaacccta gaaaagatca ccaacaagcc cgtcctccct 360
gcgtcatcct gtgactgcac agggactctg ggttcctgct ctcccggatc tgtctccttc 420
ctctagccag cagtatggac agctggaccc cctgaaactt tcctctcctc ttaactgggc 480
agagtgttgt ctctccccaa atttattaaa actaaaaatg gantncattc ctctgaaagc 540
aaaacaaatt cataattggg tgatattaat agagagggtt ttcggaagca gatttgntna 600
tatgnaat 608
<210>15
<211>411
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(3)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(9)..(9)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(13)..(13)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(18)..(21)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(23)..(23)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(63)..(63)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(365)..(365)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(382)..(382)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(408)..(408)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>15
ggncgccgnc gantgagnnn nangccgggg cagacgtccg tagcgccccc tcccgaggag 60
ttngagccgg gcagtggggt ccgcatcgtg gtggagtact gtgaaccctg cggcttcgag 120
gcgacctacc tggagctggc cagtgctgtg aaggagcagt atccgggcat cgagatcgag 180
tcgcgcctcg ggggcacagg tgcttttgag atagagataa atggacagct ggtgttctcc 240
aagctggaga atgggggctt tccctatgag aaagatctca ttgaggccat ccgaagagcc 300
agtaatggag aaaccctaga aaagatcacc aacacccgtt cctccctgcg tcatcctgtg 360
actgncacag gactctgggt tncctgctct gtttctgggg tccaaacntt g 411
<210>16
<211>420
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(6)..(6)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(17)..(17)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(33)..(33)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(386)..(386)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(412)..(412)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>16
gcgcgnattg agcgtangcc ggggcagacg tcngtagcgc cccctcccga ggagttcgag 60
ccacgcagtg gggtccgcat cgtggtggag tactgtgaac cctgcggctt cgaggcgacc 120
tacctggagc tggccagtgc tgtgaaggag cagtatccgg gcatcgagat cgagtcgcgc 180
ctcgggggca caggtgcttt gagatagaga taaatggaca gctggtgttc tccaagctgg 240
agaatggggg ctttccctat gagaaagatc tcattgaggc catccgaaga gccagtaatg 300
gagaaaccct agaaaagatc accaacagcc gtcctccctg gcgttcatcc tgtggactgg 360
cacaggactt ctgggtttcc tgctcnggtt tctggggttc caaaccttgg tntccctttt 420
<210>17
<211>447
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(8)..(8)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(11)..(11)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(20)..(20)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(22)..(22)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(48)..(48)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(253)..(253)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(357)..(357)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(409)..(409)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(415)..(415)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(420)..(420)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(431)..(431)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(441)..(441)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>17
gcggcggncc ncgatgaggn gnagccgggg cagacgtccg tagcgccncc tcccgaggag 60
gtcgagccgg gcagtggggt ccgcatcgtg gtggagtact gtgaaccctg cggcttcgag 120
gcgacctacc tggagctggc cagtgctgtg aaggagcagt atccgggcat cgagatcgag 180
tcgcgcctcg ggggcacagg tgcctttgag atagagataa atggacagct ggtgttctcc 240
aagctggaga atnggggctt tccctatgag aaagatctca ttgaggccat ccgaagagcc 300
agtaatggag aaaccctaga aaagatcacc aacagccgtc ctccctgcgt catcctntga 360
ctgcacagga cttttgggtt tcctgctctg tttctggggg ttccaaacnt tggtnttccn 420
tttgtccctg nttgggagct ncccctt 447
<210>18
<211>326
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(16)..(16)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>18
gcgaccggat gggagnagcc ggggcagacg tccgtagcgc cccctcccga ggaggtcgag 60
ccgggcagtg gggtccgcat cgtggtggag tactgtgaac cctgcggctt cgaggcgacc 120
tacctggagc tggccagtgc tgtgaaggag cagtatccgg gcatcgagat cgagtcgcgc 180
ctcgggggca caggtgcttt gagatagaga taaatggaca gctggtgttc tccaagctgg 240
agaatggggg ctttccctat gagaaagatc tcattgaggc catccgaaga gccagtaatg 300
gagaaaccct agaaaagatc accaac 326
<210>19
<211>584
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(7)..(7)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>19
tagcgcnggc ggggagccgg ggcagacgtc cgtagcgccc cctcccgagg aggtcgagcc 60
gggcagtggg gtccgcatcg tggtggagta ctgtgaaccc tgcggcttcg aggcgaccta 120
cctggagctg gccagtgctg tgaaggagca gtatccgggc atcgagatcg agtcgcgcct 180
cgggggcaca ggtgcctttg agatagagat aaatggacag ctggtgttct ccaagctgga 240
gaatgggggc tttccctatg agaaagatct cattgaggcc atccgaagag ccagtaatgg 300
agaaacccta gaaaagatca ccaacagccg tcctccctgc gtcatcctgt gactgcacag 360
gactctgggt tcctgctctg ttctggggtc caaaccttgg tctccctttg gtcctgctgg 420
gagctccccc tgcctctttc ccctacttag ctccttagca aagagaccct ggcctccact 480
ttgccctttg ggtacaaaga aggaatagaa gattccgtgg ccttgggggc aggagagaga 540
cactctccat gaacacttct ccagccacct cataccccct tccc 584
<210>20
<211>488
<212>DNA
<213>人
<400>20
cacgaggcga gcggagccgg ccgcgatgag cggggagccg gggcagacgt ccgtagcgcc 60
ccctcccgag gaggtcgagc cgggcagtgg ggtccgcatc gtggtggagt actgtgaacc 120
ctgcggcttc gaggcgacct acctggagct ggccagtgct gtgaaggagc agtatccggg 180
catcgagatc tactcgcgcc tcgggggcac aggtgccttt gagatagaga taaatggaca 240
gctggtgttc tccaagctgg agaatggggg ctttccctat gagaaagatc tcattgaggc 300
catccgaaga gccagtaatg gagaaaccct agaaaagatc accaacagcc gtcctccctg 360
cgtcatcctg tgactgcaca ggactctggg ttcctgctct gttctggggt ccaaaccttg 420
gtctcccttt ggtcctgctg ggagctcccc ctgcctcttt cccctactta gctccttagc 480
aaagagac 488
<210>21
<211>420
<212>DNA
<213>人
<400>21
cacgagggcg ccccctcccg aggaggtcga gccgggcagt ggggtccgca tcgtggtgga 60
gtactgtgaa ccctgcggct tcgaggcgac ctacctggag ctggccagtg ctgtgaagga 120
gcagtatccg ggcatcgaga tcgagtcgcg cctcgggggc acaggtgcct ttgagataga 180
gataaatgga cagctggtgt tctccaagct ggagaatggg ggctttccct atgagaaaga 240
tctcattgag gccatccgaa gagccagtaa tggagaaacc ctagaaaaga tcaccaacag 300
ccgtcctccc tgcgtcatcc tgtgactgca caggactctg ggttcctgct ctgttctggg 360
gtccaaacct tggtctccct ttggtcctgc tgggagctcc ccctgcctct ttcccctact 420
<210>22
<211>429
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(43)..(43)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>22
tgggtaattg gattctcacc cctccgccct acgcactgca ctncgactct tagagatccc 60
cggacgagcc gcagtcagac gtccgtagcg ccccctcccg aggaggttta gccgggcagt 120
ggggtccgca tcgtggtgga gtactgtgaa ccctgcggct tcgaggcgac ctacctggag 180
ctggccagtg ctgtgaagga gcagtatccg ggcatcgaga tcgagtcgcg cctcgggggc 240
acaggtgcct ttgagataga gataaatgga cagctggtgt tctccaagct ggagaatggg 300
ggctttccct atgagaaaga tctcattgag gccatccgaa gagccagtaa tggagaaacc 360
ctagaaaaga tcaccaacag ccgtcctccc tgcgtcatcc tgtgactgca caggactctg 420
ggttcctgc 429
<210>23
<211>343
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(13)..(13)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(18)..(18)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(23)..(23)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(28)..(29)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(33)..(33)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(304)..(304)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(327)..(327)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>23
gggcccgagc ggncgccngc gantgagnng tangccgggg cagacgtccg tagcgccccc 60
tcccgaggag tcgagccggg cagtggggtc cgcatcgtgg tggagtactg tgaaccctgc 120
ggcttcgagg cgacctacct ggagctggcc agtgctgtga aggagcagta tccgggcatc 180
gagatcgagt cgcgcctcgg gggcacaggt gctttgagat agagataaat ggacagctgg 240
tgttctccaa gctggagaat gggggctttc cctatgagaa agatctcatt gaggccatcc 300
gaanagccag taatggagaa accctanaaa agatcaccaa cag 343
<210>24
<211>436
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(16)..(16)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(19)..(19)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(28)..(28)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(30)..(30)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(45)..(47)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(68)..(68)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(77)..(77)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(389)..(389)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(436)..(436)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>24
atttcggcac agggcncgna ttgagcgnan gccggggcag acgtnnntag cgccccctcc 60
cgaggagntc gagccgncca gtggggtccg catcgtggtg gagtactgtg aaccctgcgg 120
cttcgaggcg acctacctgg agctggccag tgctgtgaag gagcagtatc cgggcatcga 180
gatcgagtcg cgcctcgggg gcacaggtgc ttttgagata gagataaatg gacagctggt 240
gttctccaag ctggagaatg ggggctttcc ctatgagaaa gatctcattg aggccatccg 300
aagagccagt aatggagaaa ccctagaaaa gatcaccaac agccgtcctc cctgcgtcat 360
cctgtggact gcacaggaac tctgggttnc ctgtcttctg tttctggggg tccaaacctt 420
ggttttccct ttggtn 436
<210>25
<211>323
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(121)..(121)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(229)..(229)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(319)..(319)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>25
ccgaggcaga cgtccgtagc gccccctccc gaggaggtcg agccgggcag tggggtccgc 60
atcgtggtgg agtactgtga accctgcggc ttcgaggcga cctacctgga gctggccagt 120
nctgtgaagg agcagtatcc gggcatcgag atcgagtcgc gcctcggggg cacaggtgcc 180
tttgagatag agataaatgg acagctggtg ttctccaagc tggagaatng gggctttccc 240
tatgagaaag atctcattga ggccatccga agagccagta atggagaaac cctagaaaag 300
atcaccaaca gccgtcctnc ctg 323
<210>26
<211>389
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(4)..(4)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(55)..(55)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(365)..(365)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>26
gccnggagca gacgtccgta gcgccccctc ccgaggaggt cgagccgggc agtcngggtc 60
cgcatcgtgg tggagtactg tgaaccctgc ggcttcgagg cgacctacct ggagctggcc 120
agtgctgtga aggagcagta tccgggcatc gagatcgagt cgcgcctcgg gggcacaggt 180
gcctttgaga tagagataaa tggacagctg gtgttctcca agctggagaa tgggggcttt 240
ccctatgaga aagatctcat tgaggccatc cgaagagcca gtaatggaga aaccctagaa 300
aagatcacca acagccgtcc tccctgcgtt catcctgttg actgcacagg acttctgggt 360
tcctngttct gttcttgggg ttccaaact389
<210>27
<211>460
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(3)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(337)..(337)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(393)..(393)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<221>misc_特征
<222>(418)..(418)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(428)..(428)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(440)..(440)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(446)..(446)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>27
agntcgagcc gggcagtggg gtccgcatcg tggtggagta ctgtgaaccc tgcggcttcg 60
aggcgaccta cctggagctg gccagtgctg tgaaggagca gtatccgggc atcgagatcg 120
agtcgcgcct cgggggcaca ggtgcttttg agatagagat aaatggacag ctggtgttct 180
ccaagctgga gaatgggggc tttccctatg agaaagatct cattgaggcc atccgaagag 240
ccagtaatgg agaaacccta gaaaagatca ccaacagccg tcctccctgc gtcatcctgt 300
gactgcacag gactctgggg tcctgcttct ggttctnggg gtccaaaact tgggtcttcc 360
ttttgggcct gcttgggact ttcccctggc tcnttttccc caatttagct cccttagnca 420
aaaagaanct tgggcttcan atttgncctt ttgggaaaag460
<210>28
<211>436
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(278)..(278)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(376)..(376)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(405)..(405)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(417)..(417)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(434)..(434)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>28
aagaaagtga accctgcggc ttcgaggcga cctacctgga gctggccagt gctgtgaagg 60
agcagtatcc gggcatcgag atcgagtcgc gcctcggggg cacaggtgct ttgagataga 120
gataaatgga cagctggtgt tctccaagct ggagaatggg ggctttccct atgagaaaga 180
tctcattgag gccatccgaa gagccagtaa tggagaaacc ctagaaaaga tcaccaacag 240
ccgtcctccc tgcgtcatcc tgtgactgca caggactnac tctgggttcc tgctctgttc 300
tggggtccaa accttgggtc tcactttggt cctgctggga agctccccct gcctcttttc 360
ccctacttaa gctcchtaag caaaagagaa ccttgggcct ccaantttgg ccctttnggt 420
acaaaaagaa aggnat 436
<210>29
<211>391
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(7)..(7)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(22)..(22)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(24)..(24)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(209)..(209)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(254)..(254)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc特征
<222>(309)..(309)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(354)..(354)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(364)..(364)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc特征
<222>(369)..(369)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>29
cggcacncgc ggattgaggtgnangccggg gcagacgtcc gtagcgcccc ctcccgagga 60
gttcgagccg ggcagtgggg tccgcatcgt ggtggagtac tgtgaaccct gcggcttcga 120
ggcgacctac ctggagctgg ccagtgctgt gaaggagcag tatccgggca tcgagatcga 180
gtcgcgcctc gggggcacag gtgcttttna gatagagata aatggacagc tggtgttctc 240
caagctggag aatnggggct ttccctatga gaaagatctt cattgaggcc atccgaagag 300
ccagtaatng agaaacccta gaaaagatca ccaacagccg tccttccttg cgtncatcct 360
gttnacttnc acaaggattc ttgggtttcc t 391
<210>30
<211>386
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(13)..(13)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(53)..(53)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(378)..(378)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>30
gcggggagcg ggngcagacg tccgtagcgc cccctcccga ggaggtcgag ccnggcagtg 60
gggtccgcat cgtggtggag tactgtgaac cctgcggctt cgaggcgacc tacctggagc 120
tggccagtgc tgtgaaggag cagtatccgg gcatcgagat cgagtcgcgc ctcgggggca 180
caggtgcttt gagatagaga taaatggaca gctggtgttc tccaagctgg agaatggggg 240
ctttccctat gagaaagatc ttcattgagg ccatccgaag agccagtaat gggagaaacc 300
cttagaaaag attcaccaac agccgttcct ccctggcgtt cattccttgt tgaattgcac 360
agggattttg gggtttcntg ttttgt 386
<210>31
<211>348
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(226)..(226)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(315)..(315)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(336)..(336)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>31
gcgcatcgtg gtggagtact gtgaaccctg cggcttcgag gcgacctacc tggagctggc 60
cagtgctgtg aaggagcagt atccgggcat cgagatcgag tcgcgcctcg ggggcacagg 120
tgctttgaga tagagataaa tggacagctg gtgttctcca agctggagaa tgggggcttt 180
ccctatgaga aagatctcat tgaggccatc cgaagagcca gtaatngaga aaccctagaa 240
aagatcacca acagccgtcc tcccttgcgt catcctgtga ctgcacaggg attctgggtt 300
ccttgttctg ttctnggggt tcaaaccttt gggttncctt ttggtcct 348
<210>32
<211>344
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(27)..(28)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(56)..(57)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc特征
<222>(110)..(110)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(157)..(157)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(215)..(215)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(305)..(305)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>32
cccgagcgga gcggccgcga tgagcgnnga gccggggcag acgtccgtag cgcccnntcc 60
cgaggaggtc gagccgggca gtggggtccg catcgtggtg gagtactgtn aaccctgcgg 120
cttcgaggcg acctacctgg agctggccag tgctgtnaag gagcagtatc cgggcatcga 180
gatcgagtcg cgcctcgggg gcacaggtgc ctttnagata gagataaatg gacagctggt 240
gttctccaag ctggagaatg gggggctttc cctatgagaa agatctcatt gaggccatcc 300
gaagngccag taaatggaga aaccctagaa aagatcacca acag 344
<210>33
<211>532
<212>DNA
<213>人
<400>33
tttagtgttt gtagcgccac tttactgcca atagctgaca ttgccctggg ttaggggaga 60
ataaataaaa tctgtggcat cagacaggta ttaccgaggc gaagagtgga ctgggctttc 120
gtgggcactt accctgggaa gggggtatga ggtggctgga gaagtgttca tggagagtgt 180
ctctctcctg cccccaaggc cacggaatct tctattcctt ctttgtaccc aaagggcaaa 240
gtggaggcca gggtctcttt gctaaggagc taagtagggg aaagaggcag ggggagctcc 300
cagcaggacc aaagggagac caaggtttgg accccagaac agagcaggaa cccagagtcc 360
tgtgcagtca caggatgacg cagggaggac ggctgttggt gatcttttct agggtttctc 420
cattactggc tcttcggatg gcctcaatga gatctttctc atagggaaag cccccattct 480
ccagcttgga gaacaccagc tgtccattta tctctatctc aaaggcacct gt 532
<210>34
<211>309
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(10)..(10)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(225)..(225)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(230)..(230)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(289)..(289)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(293)..(293)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>34
gcggagcgcn ccgcgatgag cggcgagccg gggcagacgt ccgtagcgcc ccctcccgag 60
gaggtcgagc cgggcagtgg ggtccgcatc gtggtggagt actgtgaacc ctgcggcttc 120
gaggcgacct acctggagct ggccatgctg tgaaggagca gtatccgggc atcgagatcg 180
agtcgcgcct cgggggcaca ggtgcctttg agatagagat aaatngacan ctggtgttct 240
tcaagctgga gaatgggggc tttccctatg agaaagatct cattgaggnc atncgaagag 300
ccataatgg 309
<210>35
<211>571
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(393)..(393)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(482)..(482)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(503)..(503)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(520)..(520)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>35
agtgtttgta gcgccacttt actgccaata gctgacattg ccctgggtta ggggagaata 60
aataaaatct gtggcatcag acaggtatta ccgaggcgaa gagtggactg ggctttcgtg 120
ggcacttacc ctgggaaggg ggtatgaggt tggctggaga agtgttcatg gagagtgtct 180
ctctcctgcc cccaaggcca cggaatcttc tattccttct ttgtacccaa agggcaaagt 240
ggaggccagg gtctctttgc taaggagcta agtaggggaa agaggcaggg ggagctccca 300
gcaggaccaa agggagacca aggtttggac cccagaacag agcaggaacc cagagtcctg 360
tgcagtcaca ggatgacgca gggaggacgg ctnttggtga tcttttctag ggtttctcca 420
ttactggctc ttcggatggc ctcaatgaga tctttctcag gggaaagccc cattctccag 480
cntggagaac accagctgtc canttatctc tatctcaaan gcacctgtgc cccgaagcgc 540
gactcgattt tcgatgcccg gatactgctc c 571
<210>36
<211>263
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(17)..(17)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>36
ggggcagacg tccgtancgc cccctcccga ggaggtcgag ccgggcagtg gggtccgcat 60
cgtggtggag tactgtgaac cctgcggctt cgaggcgacc tacctggagc tggccagtgc 120
tgtgaaggag cagtatccgg gcatcgagat cgagtcgcgc ctcgggggca caggtgcttt 180
gagatagaga taaatggaca gctggtgttc tccaagctgg agaatggggg ctttcccctg 240
agaaagatct catttaggcc cat 263
<210>37
<211>528
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(299)..(299)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(387)..(387)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(520)..(520)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>37
ntttttagtg tttgtagcgc cactttactg ccaatagctg acattgccct gggttagggg 60
agaataaata aaatctgtgg catcagacag gtattaccga ggcgaagagt ggactgggct 120
ttcgtgggca cttaccctgg gaagggggta tgaggtggct ggagaagtgt tcatggagag 180
tgtctctctc ctgcccccaa ggccacggaa tcttctattc cttctttgta cccaaagggc 240
aaagtggagg ccagggtctc tttgctaagg agctaagtag gggaaagagg caggggganc 300
tcccagcagg accaaaggga gaccaaggtt tggaccccag aacagagcag gaacccagag 360
tccttgtgca gtcacaggat gacgcangga ggacggctgt tggtgatctt ttctagggtt 420
tctccattac tggctcttcg gatggcctca atgagatctt tctcataggg aaagccccca 480
ttctccagct tggagaacac cagctgtcca attatctccn tctcaaaa 528
<210>38
<211>290
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(11)..(11)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(29)..(29)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(158)..(158)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(188)..(188)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(254)..(254)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(270)..(270)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>38
cccgagcgga ncggccgcga tgagcgagng agccggggca gacgtccgta gcgccccctc 60
ccgaggaggt cgagccgggc agtggggtcc gcatcgtggt ggagtactgt aaaccctgcg 120
gcttcgaggc gacctacctg gagctggcca gtgctgtnaa ggagcagtat ccgggcatcg 180
agatcgantc gcgcctcggg ggcacaggtg cctttaagat agagataaat ggacagctgg 240
tgttctccaa gctngagaat gggggctttn cctatgagaa agatctcatt 290
<210>39
<211>320
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(101)..(101)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(113)..(113)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(172)..(172)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(256)..(256)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(285)..(285)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(292)..(292)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(297)..(297)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(308)..(308)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>39
ggtggagtac tgtgaaccct gcggcttcga ggcgacctac ctggagctgg ccagtgctgt 60
gaaggagcag tatccgggca tcgagatcga gtcgcgcctc nggggcacag gtnctttgag 120
atagagataa atggacagct ggtgttctcc aagctggaga atgggggctt tncctatgag 180
aaagatctca ttgaggccat ccgaagagcc agtaatggag aaacctagaa aagttcacca 240
acagccgtcc ttcctncgtc attctattga ctgcacagga ttctnggttt cntgctntgt 300
ttttgggntc caaacctttg 320
<210>40
<211>321
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(154)..(154)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(258)..(258)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(267)..(267)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(275)..(275)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(282)..(282)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(310)..(310)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
ggagcagtat ccgggcatcg agatcgagtc gcgcctcggg ggcacaggtg ctttgagata 60
gagataaatg gacagctggt gttctccaag ctggagaatg ggggctttcc ctatgagaaa 120
gatctcattg aggccatccg aagagccagt aatnggagaa accctagaaa agatcaccaa 180
cagccgtcct acctgcgtca tcctgtgact gcacaggact ctgggttcct gctctgttct 240
gggggtccaa accttggnct tcctttnggt ccctnttggg angttcccct tgcttttttt 300
ccctaattan gttcctagga a321
<210>41
<211>456
<212>DNA
<213>人
gcggggagcg gggcagacgt ccgtagcgcc ccctcccgag gaggtcgagc tgctgcagtg 60
gggtccgcat cgtggtggag tactgtgaac cctgcggctt cgaggcgacc tacctggagc 120
tggccagtgc tgtgaaggag cagtatccgg gcatcgagat cgagtcgcgc ctcgggggac 180
aggtgctttg agatagagat aaatggacag ctggtgttct ccaagctgga gaatgggggc 240
ttccctatga gaaagatgtg agtatttaca gcgttgggag gacctcttgg tcaccctacc 300
ccaacagtgc atcatcctgt cattccactc ctctagctca ttgaggccat ccgaagagcc 360
agtaatggag aaaccctaga aaagatcacc aacagccgtc ctccctgcgt catcctgtga 420
ctgcacagac tctgggttct gctctgttct ggggtc456
<210>42
<211>458
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(63)..(63)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(69)..(69)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(316)..(316)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(348)..(348)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(368)..(368)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(425)..(425)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(452)..(452)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>42
ccaatagctg acattgccct gggttagggg agaataaata aaatctgtgg catcagacag 60
gtnttaccna ggcgaagagt ggactgggct ttcgtgggca cttaccctgg gaagggggta 120
tgaggtggct ggagaagttt tcatggagag tgtctctctc ctgcccccaa ggccacggaa 180
tcttctattc cttctttgta cccaaagggc aaagtggagg ccagggtctc tttgctaagg 240
agctaagtag gggaaagagg cagggggagc tcccagcagg accaaaggga gaccaaggtt 300
tggaccccag aacagngcag gaacccagag tcctgtgcag tcacaggntg acgcagggag 360
gacggctntt tggtgatctt ttctagggtt tctccttact ggctcttcgg atggcctcaa 420
tgagnttttc tcatagggaa agcccccttt tncagttt 458
<210>43
<211>452
<212>DNA
<213>人
<400>43
ttgtgtttgt agcgccactt tactgccaat agctgacatt gccctgggtt aggggagaat 60
aaataaaatc tgtggcatca gacaggtatt accgaggcga agagtggact gggctttcgt 120
gggcacttac cctgggaagg gggtatgagg tggctggaga agtgttcatg gagagtgtct 180
ctctcctgcc cccaaggcca cggaatcttc tattccttct ttgtacccaa agggcaaagt 240
ggaggccagg gtctctttgc taaggagcta agtaggggaa agaggcaggg ggagctccca 300
gcaggaccaa agggagacca aggtttggac cccagaacag aacaggaccc cagagtcctg 360
tgcagtcaca ggatgacgca gggaggacgg ctgttggtga tcttttctag ggtttctcca 420
ttactggctc ttcggatggc ctcaatgagc ta452
<210>44
<211>444
<212>DNA
<213>人
<400>44
agtgtttgta gcgccacttt actgccaata gctgacattg ccctgggtta ggggagaata 60
aataaaatct gtggcatcag acaggtatta ccgaggcgaa gagtggactg ggctttcgtg 120
ggcacttacc ctgggaaggg ggtatgaggt ggctggagaa gtgttcatgg agagtgtctc 180
tctcctgccc ccaaggccac ggaatcttct attccttctt tgtacccaaa gggcaaagtg 240
gaggccaggg tctctttgct aaggagctaa gtaggggaaa gaggcagggg gagctcccag 300
caggaccaaa gggagaccaa ggtttggacc ccagaacaga gcaggaaccc agagtcctgt 360
gcagtcacag gatgacgcag ggaggacggc tgttggtgat cttttctagg gtttctccat 420
tactggctct tcggatggcc tcaa444
<210>45
<211>232
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(13)..(13)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(23)..(23)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(147)..(147)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(182)..(182)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>45
ggagccggcc gcnatgagcg ggngagccgg ggcagacgtc cgtagcgccc cctcccgagg 60
aggtcgagcc gggcagtggg gtccgcatcg tggtggagta ctgtaaaccc tgcggcttcg 120
aggcgaccta cctggagctg gccagtnctg tgaaggagca gtatccgggc atcgagatcg 180
antcgcgcct cgggggcaca ggtgccttta agatagagat aaatggacag ct 232
<210>46
<211>456
<212>DNA
<213>人
<400>46
ttttttttta gtgtttgtag cgccacttta ctgccaatag ctgacattgc cctgggttag 60
gggagaataa ataaaatctg tggcatcaga caggtattac cgaggcgaag agtggactgg 120
gctttcgtgg gcacttaccc tgggaagggg gtatgaggtg gctggagaag tgttcatgga 180
gagtgtctct ctcctgcccc caaggccacg gaatcttcta ttccttcttt gtacccaaag 240
ggcaaagtgg aggccagggt ctctttgcta aggagctaag taggggaaag aggcaggggg 300
agctcccagc aggaccaaag ggagaccaag gtttggaccc cagaacagag caggaaccca 360
gagtcctgtg cagtcacagg atgacgcagg gaggacggct gttggtgatc ttttctaggg 420
tttctccatt actggctctt cggatggctc aatgag 456
<210>47
<211>556
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(430)..(430)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(488)..(488)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(527)..(527)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(535)..(535)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(543)..(543)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>47
gtatgcattt tatgcctcaa taaaaagttt agggaaaaaa acctcttatt cttgtacaga 60
atccatggtt gttctctata tggaacagtt agtaaagttc tgggagtcct aagatctaaa 120
aaaagaaatc taaccatcca acaccaccta aagccatcac tcagatggag gggccatcac 180
gaaaggatac ttttggaggt ggtctgcaaa gaaaaaactt ctagaaaaag acaacaaaat 240
cggccaggtg tggtggctca cgcctgtaat cccagcgctt tgggaggccg aggcgggcag 300
atcacgaggt caagagttcg agaccagcct gaccaacata gtggaaaccc tggtctccac 360
ttaaaaatta caaaaaatta actggggcgt ggttggccgc gcacctggta atcccagcta 420
cttttgggan ggcttggggg caggaagaat cgctttgaac ctgggaaggt tggaggttgc 480
agttgaancc gaggttcgca ccactgcatt tccagccttg ggggaanagg gcganactcc 540
gtntccaaaa aataat 556
<210>48
<211>461
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(6)..(6)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(371)..(371)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(393)..(393)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>48
tttagngttt gtagcgccac tttactgcca atagctgaca ttgccctggg ttaggggaga 60
ataaataaaa tctgtggcat cagacaggta ttaccgaggc gaagagtgga ctgggctttc 120
gtgggcactt accctgggaa ggggtatgag gtggctggag aagtgttcat ggagagtgtc 180
tctctcctgc ccccaaggcc acggaatctt ctattccttc tttgtaccca aaggcaaagt 240
ggaggccagg gtctctttgc taaggagcta agtaggggaa aaaggcaggg ggagctccca 300
gcaggaccaa agggagacca aggtttggac cccagaacag agcaggaacc cagagtcctg 360
tgcagtcaca ngatgacgca gggaggacgg ctnttggtga tcttttctag ggtttctcca 420
ttacttgctc ttcggatggc ctcaatgaga tctttctcat a 461
<210>49
<211>434
<212>DNA
<213>人
<400>49
gtttgtagcg ccactttact gccaatagct gacattgccc tgggttaggg gagaataaat 60
aaaatctgtg gcatcagaca ggtattaccg aggcgaagag tggactgggc tttcgtgggc 120
acttaccctg ggaagggggt atgaggtggc tggagaagtg ttcatggaga gtgtctctct 180
cctgccccca aggccacgga atcttctatt ccttctttgt acccaaaggg caaagtggag 240
gccagggtct ctttgctaag gagctaagta ggggaaagag gcagggggag ctcccagcag 300
gaccaaaggg agaccaaggt ttggacccca gaacagagca ggaacccaga gtcctgtgca 360
gtcacaggat gacgcaggga ggacggctgt tggtgatctt ttctagggtt tctccattac 420
tggctcttcg gatg 434
<210>50
<211>434
<212>DNA
<213>人
<400>50
gtttgtagcg ccactttact gccaatagct gacattgccc tgggttaggg gagaataaat 60
aaaatctgtg gcatcagaca ggtattaccg aggcgaagag tggactgggc tttcgtgggc 120
acttaccctg ggaagggggt atgaggtggc tggagaagtg ttcatggaga gtgtctctct 180
cctgccccca aggccacgga atcttctatt ccttctttgt acccaaaggg caaagtggag 240
gccagggtct ctttgctaag gagctaagta ggggaaagag gcagggggag ctcccagcag 300
gaccaaaggg agaccaaggt ttggacccca gaacagagca ggaacccaga gtcctgtgca 360
gtcacaggat gacgcaggga ggacggctgt tggtgatctt ttctagggtt tctccattac 420
tggctcttcg gatg 434
<210>51
<211>459
<212>DNA
<213>人
<400>51
tcagacctca ttgaggccat ccgaagagcc aataatggag aaaccctaga aaagatcacc 60
aacagccgtc ctccctgcgt catcctgtga ctgcacagga ctctgggttc ctgctctgtt 120
ctggggtcca aaccttggtc tccctttggt cctgctggga gctccccctg cctctttccc 180
ctacttagct ccttagcaaa gagaccctgg cctccacttt gccctttggt acaaagaagg 240
aatagaagat tccgtggcct tgggggcagg agagagacac tctccatgaa cacttctcca 300
gccacctcat acccccttcc cagggtaagt gcccacgaaa gcccagtcca ctcttcgcct 360
cggtaatacc tgtctgatgc cacagatttt atttattctc cctaacccag ggcaatgtca 420
gctattggca gtaaagtggc gctacaaaca ctaaaaaaa459
<210>52
<211>451
<212>DNA
<213>人
<400>52
tttttttttt ttagtgtttg tagcgccact ttactgccaa tagctgacat tgccctgggt 60
taggggagaa taaataaaat ctgtggcatc agacaggtat taccgaggcg aagagtggac 120
tgggctttcg tgggcactta ccctgggaag ggggtatgag gtggctggag aagtgttcat 180
ggagagtgtc tctctcctgc ccccaaggcc acggaatctt ctattccttc tttgtaccca 240
aaggggcaaa gtggaggcca gggtctcttt gctaaggagc taagtagggg aaagaggcag 300
ggggagctcc cagcaggacc aaagggagac caaggtttgg accccagaac agagcaggaa 360
cccagagtcc tgtgcagtca caggatgacg cagggaggac ggctgttggt gatcttttct 420
agggtttctc cattactggc tcttcggatg g451
<210>53
<211>447
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(244)..(245)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(378)..(378)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>53
tttttagtgt ttgtagcgcc actttactgc caatagctga cattgccctg ggttagggga 60
gaataaataa aatctgtggc atcagacagg tattaccgag gcgaagagtg gactgggctt 120
tcgtgggcac ttaccctggg aagggggtat gaggtggctg gagaagtgtt catggagagt 180
gtctctctcc tgcccccaag gccacggaat cttctattcc ttctttgtac ccaaaggcaa 240
agtnnaggcc agggtctctt tgctaaggag ctaagtaggg gaaagaggca gggggagctc 300
ccagcaggac caaagggaga ccaaggtttg gaccccagaa cagagcagga acccagagtc 360
ctgtgcagtc acaggatnac gcagggagga cggctgttgg tgatcttttc tagggtttct 420
ccattactgg ctcttcggat ggcctca 447
<210>54
<211>473
<212>DNA
<213>人
<400>54
tagtgtttgt agcgccactt tactgccaat agctgacatt gccctgggtt aggggagaat 60
aaataaaatc tgtggcatca gacaggtatt accgaggcga agagtggact gggctttcgt 120
gggcacttac cctgggaagg gggtatgagg tggctggaga agtgttcatg gagagtgtct 180
cactcctgcc cccaaggcca cggaatcttc tattccttct ttgtacccaa aggcaaagtg 240
gaggccaggg tctctttgct aaggagctaa gtaggggaaa gaggcagggg gagctcccag 300
caggaccaaa gggagaccaa ggtttgggac cccagaacag agcaggaacc cagagtcctg 360
ttgcagtcac aggatgacgc agggaggacg gctgttggtg atcttttctt agggtttctc 420
cattacttgc tctttcggat ggcctcaatg agatcttttc tcatagggga aat473
<210>55
<211>454
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(373)..(373)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(445)..(445)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>55
tagtgtttgt agcgccactt tactgccaat agctgacatt gccctgggtt aggggagaat 60
aaataaaatc tgtggcatca gacaggtatt accgaggcga agagtggact gggctttcgt 120
gggcacttac cctgggaagg gggtatgagg tggctggaga agtgttcatg gagagtgtct 180
ctctcctgcc cccaaggcca cggaatcttc tattccttct ttgtacccaa agggcaaagt 240
ggaggccagg gtctctttgc taaggagcta agtaggggaa agaggcaggg ggagctccca 300
gcaggaccaa agggagacca aggtttggac cccagaacag agcaggaacc cagagtcctg 360
tgcagtcaca ggnttgaccg cagggaggac cggctgttgg tgatcctttt ctagggtttc 420
tccattactg gctcttccgg atggnctcaa tgag 454
<210>56
<211>394
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(390)..(390)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>56
tgacattgcc ctgggttagg ggagaataaa taaaatctgt ggcatcagac aggtattacc 60
gaggcgaaga gtggactggg ctttcgtggg cacttaccct gggaaggggg tatgaggtgg 120
ctggagaagt gttcatggag agtgtctctc tcctgccccc aaggccacgg aatcttctat 180
tccttctttg tacccaaagg gcaaagtgga ggccagggtc tctttgctaa ggagctaagt 240
aggggaaaga ggcaggggga gctcccagca ggaccaaagg gagaccaagg tttggacccc 300
agaacagagc aggaacccag agtcctgtgc agtcacagga tgacgcaggg aggacggctg 360
ttggtgatct tttctagggt ttccccattn actg 394
<210>57
<211>427
<212>DNA
<213>人
<400>57
tttttttttt gtttgtagcg ccactttact gccaatagct gacattgccc tgggttaggg 60
gagaataaat aaaatctgtg gcatcagaca ggtattaccg aggcgaagag tggactgggc 120
tttcgtgggc acttaccccg ggaagggggt atgaggtggc tggagaagtg ttcatggaga 180
gtgtctctct cctgccccca aggccacgga atcttctatt ccttctttgt acccaaaggg 240
caaagtggag gccagggtct ctttgctaag gagctaagta ggggaaagag gcagggggag 300
ctcccagcag gaccaaaggg agaccaaggt ttgtacccca gaacagagca ggaacccaga 360
gtcctgtgca gtcacaggat gacgcaggga ggacggctgt tggtgatctt ttctagggtt 420
tctccat 427
<210>58
<211>421
<212>DNA
<213>人
<400>58
tttttagtgt ttgtagcgcc actttactgc caatagctga cattgccctg ggttagggga 60
gaataaataa aatctgtggc atcagacagg tattaccgag gcgaagagtg gactgggctt 120
tcgtgggcac ttaccctggg aagggggtat gaggtggctg gagaagtgtt catggagagt 180
gtctctctcc tgcccccaag gccacggaat cttctattcc ttctttgtac ccaaagggca 240
aagtggaggc cagggtctct ttgctaagga gctaagtagg ggaaagaggc agggggagct 300
cccagcagga ccaaagggag accaaggttt ggaccccaga acagagcagg aacccagagt 360
cctgtgcagt cacaggatga cgcagggagg acggctgttg gtgatctttt ctagggtttc 420
t 421
<210>59
<211>419
<212>DNA
<213>人
<400>59
tttttttagt gtttgtagcg ccactttact gccaatagct gacattgccc tgggttaggg 60
gagaataaat aaaatctgtg gcatcagaca ggtattaccg aggcgaagag tggactgggc 120
tttcgtgggc acttaccctg ggaagggggt atgaggtggc tggagaagtg ttcatggaga 180
gtgtctctct cctgccccca aggccacgga atcttctatt ccttctttgt acccaaaggg 240
caaagtggag gccagggtct ctttgctaag gagctaagta ggggaaagag gcagggggag 300
ctcccagcag gaccaaaggg agaccaaggt ttggacccca gaacagagca ggaacccaga 360
gtcctgtgca gtcacaggat gacgcaggga ggacggctgt tggtgatctt ttctagggt 419
<210>60
<211>434
<212>DNA
<213>人
<400>60
tgtttgtagc gccactttac tgccaatagc tgacattgcc ctgggttagg ggagaataaa 60
taaaatctgt ggcatcagac aggtattacc gaggcgaaga gtggactggg ctttcgtggg 120
cacttaccct gggaaggggg tatgaggtgg ctggagaagt gttcatggag agtgtctctc 180
tcctgccccc aaggccacgg aatcttctat tccttctttg tacccaaagg gcaaagtgga 240
ggccagggtc tctttgctaa ggagctaagt agggggaaag aggcaggggg agctcccagc 300
aggaccaaag ggagaccaag gtttggaccc cagaacagag caggaaccca gagtcctgtg 360
cagtcacagg attgacgcag ggaggaccgg ctgttggtga tcttttctaa gggtttctcc 420
attactgggc tctt 434
<210>61
<211>418
<212>DNA
<213>人
<400>61
agcattagtg tttgtagcgc cactttactg ccaatagctg acattgccct gggttagggg 60
agaataaata aaatctgtgg catcagacag gtattaccga ggcgaagagt ggactgggct 120
ttcgtgggca cttaccctgg gaagggggta tgaggtggct ggagaagtgt tcatggagag 180
tgtctctctc ctgcccccaa ggccacggaa tcttctattc cttctttgta cccaaagggg 240
caaagtggag gccagggtct ctttgctaag gagctaagta ggggaaagag gcagggggag 300
ctcccagcag gaccaaaggg agaccaaggt ttggacccca gaacagagca ggaacccaga 360
gtcctgtgca gtcacaggat gacgcaggga ggacggctgt tggtgatctt ttctaggg 418
<210>62
<211>403
<212>DNA
<213>人
<400>62
tagtgtttgt agcgccactt tactgccaat agctgacatt gccctgggtt aggggagaat 60
aaataaaatc tgtggcatca gacaggtatt accgaggcga agagtggact gggctttcgt 120
gggcacttac cctgggaagg gggtatgagg tggctggaga agtgttcatg gagagtgtct 180
ctctcctgcc cccaaggcca cggaatcttc tattccttct ttgtacccaa agggcaaagt 240
ggaggccagg gtctctttgc taaggagcta agtaggggaa agaggcaggg ggagctccca 300
gcaggaccaa agggagacca aggtttggac cccagaacag agcaggaacc cagagtcctg 360
tgcagtcaca ggatgacgca gggaggacgg ctgttggtga tct 403
<210>63
<211>401
<212>DNA
<213>人
<400>63
gtttgtagcg ccactttact gccaatagct gacattgccc tgggttaggg gagaataaat 60
aaaatctgtg gcatcagaca ggtattaccg aggcgaagag tggactgggc tttcgtgggc 120
acttaccctg ggaagggggt atgaggtggc tggagaagtg ttcatggaga gtgtctctct 180
cctgccccca aggccacgga atcttctatt ccttctttgt acccaaaggg caaagtggag 240
gccagggtct ctttgctaag gagctaagta ggggaaagag gcagggggag ctcccagcag 300
gaccaaaggg agaccaaggt ttggacccca gaacagagca ggaacccaga gtcctgtgca 360
gtcacaggat gacgcaggag gacggctgtt ggtgatcttt t 401
<210>64
<211>432
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(123)..(124)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(349)..(349)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(399)..(399)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>64
actgccaata gctgacattg ccctgggtta ggggagaata aataaaatct gtggcatcag 60
acaggtatta ccgaggcgaa gagtggactg ggctttcgtg ggcacttacc ctgggaaggg 120
ggnnatgagg tggctggaga agtgttcatg gagagtgtct ctctcctgcc cccaaggcca 180
cggaatcttc tattccttct ttgtacccaa agggcaaagt ggaggccagg gtctctttgc 240
taaggagcta agtaggggaa agaggcaggg ggagctccca gcaggaccaa agggagacca 300
aggtttggac cccaggaaca gagcaggaac ccagagtcct gtggcagtnc acaggatgga 360
cgcagggagg gacggctgtt cggtgaactt ttctagggnt tcccccatta accggctctt 420
cggatggcct ct 432
<210>65
<211>501
<212>DNA
<213>人
<400>65
ttagtgtttg tagcgccact ttactgccaa tagctgacat tgccctgggt taggggagaa 60
taaataaaat ctgtggcatc agacaggtat taccgaggcg aagagtggac tgggctttcg 120
tgggcactta ccctgggaag ggggtatgag gtggctggag aagtgttcat ggagagtgtc 180
tctctcctgc ccccaaggcc acggaatctt ctattacttc tttgtaccca aagggcaaag 240
tggaggccag ggtctctttg ctaaggagct aagtagggga aagaggcagg gggagctccc 300
agcaggacca aagggagacc aaggtttgga ccccagaaca gagcaggaac ccagagtcct 360
gtgcaatcac aggatgacgc agggaggacg gctgttggtg atcttttcta gggtttctcc 420
attactggct cttcggatgg cctcaatgag atctttctca tagggaaagc ccccattctc 480
cagcttggag aacaccagct g 501
<210>66
<211>792
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(2)..(2)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(21)..(21)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(73)..(73)
<223>In是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(106)..(106)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(116)..(117)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(232)..(232)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(246)..(246)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(263)..(263)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(295)..(295)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(304)..(304)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(311)..(311)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(321)..(321)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(325)..(325)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(328)..(328)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸1
<220>
<221>misc_特征
<222>(332)..(332)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(343)..(343)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(345)..(345)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(349)..(349)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(371)..(371)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(379)..(379)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(421)..(421)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(427)..(427)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(430)..(430)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(438)..(438)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(451)..(451)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<221>misc_特征
<222>(461)..(461)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(486)..(486)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(488)..(488)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(496)..(497)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(516)..(516)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(524)..(524)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(527)..(527)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(538)..(538)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(548)..(548)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(551)..(551)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(564)..(564)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc特征
<222>(567)..(567)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(571)..(571)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(573)..(573)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(581)..(581)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(586)..(587)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(594)..(594)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(603)..(603)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc特征
<222>(608)..(608)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(617)..(617)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(620)..(620)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(624)..(624)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc特征
<222>(632)..(632)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(635)..(636)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc特征
<222>(643)..(643)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(645)..(645)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(647)..(648)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(654)..(654)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(668)..(668)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(672)..(672)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(679)..(680)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(687)..(687)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(692)..(692)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(696)..(696)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(699)..(699)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(702)..(702)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(708)..(708)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(711)..(711)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(714)..(714)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(716)..(717)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(719)..(719)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(723)..(723)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc特征
<222>(726)..(726)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(728)..(728)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(734)..(734)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(737)..(737)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(746)..(746)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(749)..(749)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(752)..(752)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(761)..(761)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<221>misc_特征
<222>(770)..(771)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(775)..(775)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(777)..(777)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(789)..(789)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(792)..(792)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>66
cnggctgagg aattcggacg ngggcagtac tgtgaaggag cagtatccgg gcatcgagat 60
cgagtcgcgc ctngggggca caggtgcttt gagatagaga taaatngaca gctggnnttc 120
tccaagctgg agaatggggg ctttccctat gagaaagatc tcattgaggc catccgaaga 180
gccagtaatg gagaaaccct agaaaagatc accaacagcc gtcctccctg cntcatcctg 240
tgactncaca ggactctggg ttnctgctct gttctggggt ccaaaccttg gtctnccttt 300
ggtnctgctt nggagctccc nctgnctntt tnccctactt agntncttna gcaaagagga 360
cccttggcct ncactttanc ccttttgggg tacaaaagga agggaattag gaagatttcc 420
nttggcnttn gaggggcnaa ggaagatgag ncaattttcc nattaaacaa ctttttcaag 480
caaacntnaa tacccnnttt ccccaggggt aaggtncccc acgnaanagc ccaagtcnac 540
attttttngc nttgggaaat accntanttt nantccaaaa nttttnnttt aatntttccc 600
canaaccnaa gggaaanttn aagnaatttg gnaannaaag ttngngnntc aaancacaag 660
ataaaaanaa anaaaaaann tttgagnggg gncccnganc cnaatttngc ncantnngng 720
ggnggntnaa aaancanatt tgcagnggnt tnaaaacagt ntgagctttn naaancntgg 780
gtttccaana an 792
<210>67
<211>474
<212>DNA
<213>人
<400>67
tttttttttt tgtttgtagc gccactttac tgccaatagc tgacattgcc ctgggttagg 60
ggagaataaa taaaatctgt ggcatcagac aggtattacc gaggcgaaga gtggactggg 120
ctttcgtggg cacttaccct gggaaggggg tatgaggtgg ctggagaagt gttcatggag 180
agtgtctctc tcctgccccc aaggccacgg aatcttctat tccttctttg tacccaaagg 240
gcaaagtgga ggccagggtc tctttgctaa ggagctaagt aggggaaaga ggcaggggga 300
gctcccagca ggaccaaagg gagaccaagg tttggacccc agaacagagc aggaacccag 360
agtcctgtgc agtcacagga tgacgcaggg aggacggctg ttggtgatct tttctagggt 420
ttctccatta ctggctcttc ggatggcctc aatgagatct ttctcatagg gaaa474
<210>68
<211>483
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(248)..(248)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>68
agtgtttgta gcgccacttt actgccaata gctgacattg ccctgggtta ggggagaata 60
aataaaatct gtggcatcag acaggtatta ccgaggcgaa gagtggactg ggctttcgtg 120
ggcacttacc ctgggaaggg ggtatgaggt ggctggagaa gtgttcatgg agagtgtctc 180
tctcctgccc ccaaggccac ggaatcttct attccttctt tgtacccaaa gggcaaagtg 240
gaggccangg tctcttttgc taaggagcaa ataagggaaa gaggcagggg gagctcccag 300
caagaccaaa gggagaccaa ggtttggacc ccagaacaga gcaggaaccc agagtcctgt 360
gcagtcacag gatgacgcag ggaggacggc tgttggtgat cttttctagg gtttctccat 420
tactggctct tcggatggcc tcaatgagat ctttctcata gggaaagccc ccattctcca 480
gct483
<210>69
<211>449
<212>DNA
<213>人
<400>69
ttttagtgtt tgtagcgcca ctttactgcc aatagctgac attgccctgg gttaggggag 60
aataaataaa atctgtggca tcagacaggt attaccgagg cgaagagtgg actgggcttt 120
cgtgggcact taccctggga agggggtatg aggtggctgg agaagtgttc atggagagtg 180
tctctctcct gcccccaagg ccacggaatc ttctatttct tttttgtacc caaagggcaa 240
agtggaggcc agggtctctt tgctaaggag ctaagtaggg gaaagaggca gggggagctc 300
ccagcaggac caaagggaga ccaaggtttg gaccccagaa cagagcagga acccagagtc 360
ctgtgcagtc acaggatgac gcagggagga cggctgttgg tgatcttttc tagggtttct 420
ccattactgg ctcttcggat ggcctcaat449
<210>70
<211>594
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(385)..(385)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>70
tagtgtttgt agcgccactt tactgccaat agctgacatt gccctgggtt aggggagaat 60
aaataaaatc tgtggcatca gacaggtatt accgaggcga agagtggact gggctttcgt 120
gggcacttac cctgggaagg gggtatgagg tggctggaga agtgttcatg gagagtgtct 180
ctctcctgcc cccaaggcca cggaatcttc tattccttct ttgtacccaa agggcaaagt 240
ggaggccagg gtctctttgc taaggagcta agtaggggaa agaggcaggg ggagctccca 300
gcaggaccaa agggaaccaa ggtttggacc ccagaacaga gcaggaccca gagtcctgtg 360
cagtcacagg atgacgcagg gagcnggctg tgggtgatct ttctaggggt ttctccatta 420
ctggctcttc cgatgcctca ctgagatctt tctcataggg aaagccccca ttctccagct 480
ttgagacgca agctgtcatt tatctctatc tcaaggcacc ctgtgccccc gaggcgaatt 540
catctcgagc cccgatactg ctccttcaca gactggcagt tcaaggaagt cgcc594
<210>71
<211>389
<212>DNA
<213>人
<400>71
tttttagtgt ttgtagcgcc actttactgc caatagctga cattgccctg ggttagggga 60
gaataaataa aatctgtggc atcagacagg tattaccgag gcgaagagtg gactgggctt 120
tcgtgggcac ttaccctggg aagggggtat gaggtggctg gagaagtgtt catggagagt 180
gtctctctcc tgcccccaag gccacggaat cttctattcc ttctttgtac ccaaagggca 240
aagtggaggc cagggtctct ttgctaagga gctaagtagg ggaaagaggc agggggagct 300
cccagcagga ccaaagggag accaaggttt ggaccccaga acagagcagg aacccagagt 360
cctgtgcagt cacaggatga cgcagggag389
<210>72
<211>405
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(334)..(334)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(361)..(361)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(374)..(374)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>72
agtgtttgta gcgccacttt actgccaata gctgacattg ccctgggtta ggggagaata 60
aataaaatct gtggcatcag acaggtatta ccgaggcgaa gagtggactg ggctttcgtg 120
ggcacttacc ctgggaaggg ggtatgaggt ggctggagaa gtgttcatgg agagtgtctc 180
tctcctgccc ccaaggccac ggaatcttct attccttctt tgtacccaaa gggcaaagtg 240
gaggccaggg tctctttgct aaggagctaa gtaggggaaa gaggcagggg gagctcccag 300
caggaccaaa gggagaccaa ggtttggacc ccanaacaga gcaggaaccc agagtcctgt 360
ncagtcacag gatnacgcag ggaggacggc tgttggtgat ctttt 405
<210>73
<211>396
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(233)..(233)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>73
tttttttttt gtttgtagcg ccactttact gccaatagct gacattgccc tgggttaggg 60
gagaataaat aaaatctgtg gcatcagaca ggtattaccg aggcgaagag tggactgggc 120
tttcgtgggc acttaccctg ggaagggggt atgaggtggc tggagaagtg ttcatggaga 180
gtgtctctct cctgccccca aggccacgga atcttctatt ccttctttgt acnccaaagg 240
gcaaagtgga ggccagggtc tctttgctaa ggagctaagt aggggaaaga ggcaggggga 300
gctcccagca ggaccaaagg gagaccaagg tttggacccc agaacagagc aggaacccag 360
agtcctgtgc agtcacagga tgacgcaggg aggacg396
<210>74
<211>392
<212>DNA
<213>人
<400>74
tttttagtgt ttgtagcgcc actttactgc caatagctga cattgccctg ggttagggga 60
gaataaataa aatctgtggc atcagacagg tattaccgag gcgaagagtg gactgggctt 120
tcgtgggcac ttaccctggg aagggggtat gaggtggctg gagaagtgtt catggagagt 180
gtctctctcc tgcccccaag gccacggaat cttctattcc ttctttgtac ccaaagggca 240
aagtggaggc cagggtctct ttgctaagga gctaagtagg ggaaagaggc agggggagct 300
cccagcagga ccaaagggag accaaggttt ggaccccaga acagagcatg aacccagagt 360
cctgtgcagt cacaggatga cgcagggagg ac392
<210>75
<211>372
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(362)..(362)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>75
ctgccaatag ctgacattgc cctgggttag gggagaataa ataaaatctg tggcatcaga 60
caggtattac cgaggcgaag agtggactgg gctttcgtgg gcacttaccc tgggaagggg 120
gtatgaggtg gctggagaag tgttcatgga gagtgtctct ctcctgcccc caaggccacg 180
gaatcttcta ttccttcttt gtacccaaag gcaaagtgga ggccagggtc tctttgctaa 240
ggagctaagt aggggaaaga ggcaggggga gctcccagca ggaccaaagg gagaccaagg 300
tttggacccc agaacagagc aggaacccag agtcctgtgc agtcacagga tgacgcaggg 360
angaccggct tt 372
<210>76
<211>380
<212>DNA
<213>人
<400>76
ttttagtgtt tgtagcgcca ctttactgcc aatagctgac attgccctgg gttaggggag 60
aataaataaa atctgtggca tcagacaggt attaccgagg cgaagagtgg actgggcttt 120
cgtgggcact taccctggga agggggtatg aggtggctgg agaagtgttc atggagagtg 180
tctctctcct gcccccaagg ccacggaatc ttctattcct tctttgtacc caaagggcaa 240
agtggaggcc agggtctctt tgctaaggag ctaagtaggg gaaagaggca gggggagctc 300
ccagcaggac caaagggaga ccaaggtttg gaccccagaa cagagcagga acccagagtc 360
ctgtgcagtc acaggatgac 380
<210>77
<211>374
<212>DNA
<213>人
<400>77
gtttgtagcg ccactttact gccaatagct gacattgccc tgggttaggg gagaataaat 60
aaaatctgtg gcatcagaca ggtattaccg aggcgaagag tggactgggc tttcgtgggc 120
acttaccctg ggaaggtggt atgaggtggc tggagaagtg ttcatggaga gtgtctctct 180
cctgccccca aggccacgga atcttctatt ccttctttgt acccaaaggt caaagtggag 240
gccagggtct ctttgctaag gagctaagta ggggaaagag gcagggggag ctcccagcag 300
gaccaaaggg agaccaaggt ttggacccca gaacagagca ggaacccaga gtcctgtgca 360
gtcacaggat gacg374
<210>78
<211>386
<212>DNA
<213>人
<400>78
tttttttttt tttttttttt agtgtttgta gcgccacttt actgccaata gctgacattg 60
ccctgggtta ggggagaata aataaaatct gtggcatcag acaggtatta ccgaggcgaa 120
gagtggactg ggctttcgtg ggcacttacc ctgggaaggg ggtatgaggt ggctggagaa 180
gtgttcatgg agagtgtctc tctcctgccc ccaaggccac ggaatcttct attccttctt 240
tgtacccaaa gggcaaagtg gaggccaggg tctctttgct aaggagctaa gtaggggaaa 300
gaggcagggg gagctcccag caggaccaaa gggagaccaa ggtttggacc ccagaacaga 360
gcaggaaccc agagtcctgt gcagtc 386
<210>79
<211>451
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(427)..(427)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>79
tgtttgtagc gccactttac tgccaatagc tgacattgcc ctgggttagg ggagaataaa 60
taaaatctgt ggcatcagac aggtattacc gaggcgaaga gtggactggg ctttcgtggg 120
cacttaccct gggaaggggg tatgaggtgg ctggagaagt gttcatggag agtgtctctc 180
tcctgccccc aaggccacgg aatcttctat tccttctttg tacccaaagg caaagtggag 240
gccagggtct ctttgctaag gagctaagta ggggaaagag gcagggggat ctcccagcag 300
gaccaaaggg agaccaaggt ttggacccca gaacagagca aggaacccag agtcctgtgc 360
agtcacagga ttgacgcagg gaggaccggc ttgtttggtg atcctttcct agggtttctc 420
ccattanttg gctctttccg attggcctca a 451
<210>80
<211>311
<212>DNA
<213>人
<400>80
ataaataaaa tctgtggcat cagacaggta ttaccgaggc gaagagtgga ctgggctttc 60
gtgggcactt accctgggaa gggggtatga ggtggctgga gaagtgttca tggagagtgt 120
ctctctcctg cccccaaggc cacggaatct tctattcctt ctttgtaccc aaagggcaaa 180
gtggaggcca gggtctcttt gctaaggagc taagtagggg aaagaggcag ggggagctcc 240
cagcaggacc aaagggagac caaggtttgg accccagaac atagcaggaa ccagagtcct 300
gtgcagtcac a 311
<210>81
<211>412
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(126)..(126)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(349)..(349)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(390)..(390)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>81
cactttactg ccaatagctg acattgccct gggttagggg agaataaata aaatctgtgg 60
catcagacag gtattaccga ggcgaagagt ggactgggct ttcgtgggca cttaccctgg 120
gaaggnggtt atgaggtggc tggagaagtg ttcatggaga gtgtctctct cctgccccca 180
aggcacggaa tcttctattc cttctttgta cccaaagggc aaagtggagg ccagggtctc 240
tttgctaagg agctaagtag gggaaagagg cagggggagc tcccagcagg accaaaggga 300
gaccaaggtt tgggacccca gaacagagca ggaacccaga gtcctgttnc agttcacagg 360
atgacggcag gggagggacg gcttttggtn atcttttttt agggtttttt cc 412
<210>82
<211>372
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(73)..(73)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(210)..(210)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(219)..(219)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(306)..(306)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(322)..(322)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(327)..(327)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(365)..(365)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>82
actgccaata gctgacattg ccctgggtta ggggagaata aataaaatct gtggcatcag 60
acaggtatta ccnaggcgaa gagtggactg ggctttcgtg ggcacttacc ctgggaaggg 120
ggtatgaggt ggctggagaa gtgttcatgg agagtgtctc tctcctgtcc ccaaggccac 180
ggaatcttct attccttctt tgtacccaan gggcaaagng gaggccaggg tctctttgct 240
aaggagctaa gtaggggaaa gaggcagggg gagctcccag caggaccaaa gggggaccaa 300
ggtttnggac cccagaacag ancaggnacc cagagtcctt tgcagtcaca gggatgacgc 360
agggnggacg gc 372
<210>83
<211>401
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(328)..(328)
<223>n是a、t、g或c的任意核苷酸
<400>83
tttttttttt tttttttttt ttttttttag ggtttgtagc gccactttac tgccaatagc 60
tgacattgcc ctgggttagg ggagaataaa taaaatctgg ggcatcaaac aggttttacc 120
gaggcgaaaa gtggactggg ctttcgtggg cacttaccct gggaaggggg tatgaggggg 180
ctggaaaagt gttcatggag agtgtctctc tcctgccccc aaggccacgg aatcttttat 240
tccttctttg tacccaaagg gcaaagtgga ggccagggtc tttttgctaa ggagctaaat 300
aggggaaaga ggcaggggga gctcccanca ggaccaaagg gagaccaagg tttggacccc 360
aaaacaaagc aggaacccaa agtcctgtgc agtcacagga t 401
<210>84
<211>733
<212>DNA
<213>人
<400>84
gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60
aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120
tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180
tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240
aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300
ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360
agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420
catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480
atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540
ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600
acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660
acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720
gactctagag gat733
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>85
Ser Thr Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val
1 5
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>86
Ser Thr Glu Pro Gly Gln Ile Ser Tyr
1 5
<210>87
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>87
Gly Thr Glu Pro Ser Arg Leu Gly Tyr
1 5
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>88
Phe Leu Ile Glu Ile Asn Trp Tyr Leu
1 5
<210>89
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>89
Phe Leu Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala
1 5 10
<210>90
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>90
Phe Leu Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Val
1 5 10
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>91
Gly Val Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu
1 5
<210>92
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>92
Cys Val Glu Phe Ala Thr Tyr Leu Glu Leu
1 5 10
<210>93
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>93
Phe Val Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala
1 5 10
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>94
Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Leu
1 5
<210>95
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>95
Ile Tyr Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu
1 5 10
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>96
Lys Leu Glu Asn Gly Gly Phe Pro Lys
1 5
<210>97
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>97
Ile Leu Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys
1 5
<210>98
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>98
Leu Leu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys
1 5 10
<210>99
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>99
Ile Val Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys
1 5
<210>100
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>100
Leu Val Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys
1 5 10
<210>101
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>101
Lys Ile Leu Ile Glu Ala Ile Arg Arg
1 5
<210>102
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>102
Tyr Val Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg
1 5
<210>103
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>103
Glu Val Val Glu Pro Gly Ser Gly Arg
1 5
<210>104
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>104
Ser Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala Leu
1 5
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>105
Glu Arg Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Leu
1 5 10
<210>106
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>106
Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Leu
1 5
<210>107
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>107
Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Leu
1 5 10
<210>108
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>108
Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Leu
1 5
<210>109
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>109
Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Leu
1 5 10
<210>110
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>110
Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Val
1 5
<210>111
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>111
Lys Glu Leu Ile Glu Ala Ile Arg Arg Val
1 5 10
<210>112
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>112
Glu Gln Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr
1 5
<210>113
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>113
Glu Gln Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala Phe
1 5 10
<210>114
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>114
Gly Gln Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr
1 5 10
<210>115
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>115
Asn Pro Arg Pro Pro Cys Val Ile Leu
1 5
<210>116
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>116
Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Leu
1 5 10
<210>117
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>117
Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Leu
1 5
<210>118
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>118
Glu Ala Ile Arg Arg Ala Ser Leu
1 5
<210>119
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>119
Ile Ala Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu
1 5 10
<210>120
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>120
Arg Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Phe
1 5
<210>121
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>121
Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys Glu Tyr
1 5 10
<210>122
<21l>9
<212>PRT
<213>人
<400>122
Ile Arg Arg Ala Ser Asn Gly Glu Leu
1 5
<210>123
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>123
Arg Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Leu
1 5 10
<210>124
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>124
Phe Pro Lys Leu Glu Asn Gly Gly Met
1 5
<210>125
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>125
Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Met
1 5 10
<210>126
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>126
Phe Asp Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu
1 5
<210>127
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>127
Phe Asp Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Ile
1 5 10
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>128
Gly His Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu
1 5
<210>129
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>129
Ala His Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu
1 5 10
<210>130
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>130
Arg His Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu
1 5
<210>131
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>131
Cys His Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu
1 5 10
<210>132
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>132
Asn Lys Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu
1 5
<210>133
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>133
Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Tyr
1 5
<210>134
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>134
Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Tyr
1 5 10
<210>135
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>135
Leu Pro Gly Thr Gly Ala Phe Glu Ile
1 5
<210>136
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>136
Ser Pro Val Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile
1 5 10
<210>137
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>137
Gly Pro Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Ile
1 5
<210>138
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>138
Ser Pro Val Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile
1 5 10
<210>139
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>139
Leu Ala Phe Thr Gly Ala Phe Glu Ile
1 5
<210>140
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>140
Glu Ala Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val
1 5 10
<210>141
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>141
Leu Gln Ile Asn Gly Gln Leu Val Ile
1 5
<210>142
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>142
Val Gln Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val
1 5 10
<210>143
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>143
Phe Ser Lys Leu Glu Asn Gly Gly Trp
1 5
<210>144
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>144
Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Trp
1 5 10
<210>145
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>145
Ser Ala Val Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Leu
1 5 10
<210>146
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>146
Glu Phe Cys Gly Phe Glu Ala Thr Leu
1 5
<210>147
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>147
Val Phe Ser Lys Leu Glu Asn Gly Gly Leu
1 5 10
<210>148
<211>384
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>1E11/1F2V基因(κ)的cDNA
<400>148
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cagaatgtcc 60
agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag120
gtcaccatat cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag180
ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat cacacatcca acctggcttc tggagtccct240
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag300
gctgaagatg ctgccactta ttactgccaa cagtatcata gttacccacc cacgttcgga360
ggggggacca agctggaaat aaaa 384
<210>149
<211>402
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>1E11/1F2V基因的cDNA(IgG1)
<400>149
atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctgatgta 60
cagcttcagg agrcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc120
tctgtcactg gctactccat caccagtggt tatttctgga actggatccg gcagtttcca180
gggaacaaac tggaatggat gggctacata agctacgacg gtagcaataa ctccaaccca240
tctctcaaaa atcgaatctc cttcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag300
tttaattctg tgactactga cgactcagct gcatattact gtacaagagg aactacgggg360
tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca 402
<210>150
<211>381
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3E10V基因(κ)的cDNA
<400>150
atgaggttcc aggttcaggt tctggggctc cttctgctct ggatatcagg tgcccactgt 60
gatgtccaga taacccagtc tccatctttt cttgctgcat ctcctggaga aaccattact120
attaattgca gggcaagtaa gtacattagc aaacatttag tctggtatca ggagaaacct180
ggagaaacta aaaagcttct tatctactct ggatccactt tgcaatctgg acttccatca240
aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct300
gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat acccgctcac gttcggtgct360
gggaccaagc tggagctgaa a 381
<210>151
<211>420
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3E10 V基因的cDNA(IgG1)
<400>151
atgatggtgt taagtcttct gtacctgttg acagcccttc cgggtatcct gtcagaggtg 60
cagcttcagg agtcaggacc tagcctcgtg aaaccttctc agactctgtc cctcacctgt120
tctgtcactg gcgactccat caccagtggt tactggaact ggatccggaa attcccagga180
aataaacttg aatacgtggg gtacataagc tacagtggtg gcacttacta caatccatct240
ctcaaaagtc gaatctccat cactcgagac acatccaaga accactacta cctgcagttg300
aattctgtga ctactgagga cacagccaca tattactgtg caagaggtgc ttactacggg360
ggggcctttt ttccttactt cgatgtctgg ggcgctggga ccacggtcac cgtctcctca420
<210>152
<211>310
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(173)..(173)
<223>n是a，t，g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(173)..(173)
<223>n是a，t，g或c的任意核苷酸
<400>152
acacacccgg aagcaggggc ccgagsggas cggccgcgat gagcggggag ccggggcaga 60
cgtccgtagc gccccctccc gaggaggtcg akccgggcag tggggtccgc atcgtggtgg120
agtactgtga accctgcggc ttcgaggcga cctacctgga gctggccagt gcnstgaagg180
agcagtatcc gggcatcgag atcgagtcgc gcctcggggg cacaggtgcc tttgagatag240
agataaatgg acagctsggt gttctccarg stggagaatg gggstttccc tatgagaaag300
atgtgagtct 310
<210>153
<211>90
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_特征
<222>(18)..(18)
<223>Xaa是未知氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(46)..(46)
<223>Xaa是未知氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(78)..(78)
<223>Xaa是未知氨基酸
<400>153
Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro Glu Glu
1 5 10 15
Val Xaa Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys Glu Pro
20 25 30
Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Xaa Lys Glu
35 40 45
Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala
50 55 60
Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Gly Val Leu Gln Xaa Gly Glu
65 70 75 80
Trp Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Val Ser
85 90
<210>154
<211>845
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(823)..(823)
<223>n是a，t，g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(825)..(825)
<223>n是a，t，g或c的任意核苷酸
<400>154
ggcagaggtt cacacccgga agcaggggcc cgaggcggag ccggccgcga tgagcgggga 60
gccggggcag acgtccgtag cgccccctcc cgaggaggtc gagccgggca gtggggtccg120
catcgtggtg gagtactgtg aaccctgcgg cttcgaggcg acctacctgg agctggccag180
tgctgtgaag gagcagtatc cgggcatcga gatcgagtcg cgcctcgggg gcacaggtgc240
ctttgagata gagataaatg gacagctggt gttctccaag ctggagaatg ggggctttcc300
ctatgagaaa gatctcattg aggccatccg aagagccagt aatggagaaa ccctagaaaa360
gatcaccaac agccgtcctc cctgcgtcat cctgtgactg cacaggactc tgggttcctg420
ctctgttctg gggtccaaac cttggtctcc ctttggtcct gctgggagct ccccctgcct480
ctttccccta cttagctcct tagcaaagag accctggcct ccactttgcc ctttgggtac540
aaagaaggaa tagaagattc cgtggccttg ggggcaggag agagacactc tccatgaaca600
cttctccagc cacctcatac ccccttccca gggtaagtgc ccacgaaagc ccagtccact660
cttcgcctcg gtaatacctg tctgatgcca cagattttat ttattctccc ctaacccagg720
gcaatgtcag ctattggcag taaagtggcg ctacaaacac taaaaaaaaa aaaaaaaaaa780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atntnggggg ggggcccccc840
ccccc845
<210>155
<211>131
<212>PRT
<213>人
<400>155
Ala Glu Val His Thr Arg Lys Gln Gly Pro Glu Ala Glu Pro Ala Ala
1 5 10 15
Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro Glu Glu
20 25 30
Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys Glu Pro
35 40 45
Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val Lys Glu
50 55 60
Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala
65 70 75 80
Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu Glu Asn
85 90 95
Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg Arg Ala
100 105 110
Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Cys
115 120 125
Val Ile Leu
130
<210>156
<211>404
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(14)..(14)
<223>n是a，t，g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(17)..(17)
<223>n是a，t，g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(21)..(21)
<223>n是a，t，g或c的任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(23)..(23)
<223>n是a，t，g或c的任意核苷酸
<400>156
actgtgaacc ctgnggnttc nangcgacct acctggagct ggccagtgct gtgaaggagc 60
agtatccggg catcgagatc gagtcgcgcc tcgggggcac aggtgccttt gagatagaga120
taaatggaca gctggtgttc tccaagctgg agaatggggg ctttccctat gagaaagatc180
tcattgaggc catccgaaga gccagtaatg gagaaaccct agaaaagatc accaacagcc240
gtcctccctg cgtcatcctg tgactgcaca ggactctggg ttcctgctct gttctggggt300
ccaaaccttg gtctcccttt ggtcctgctg ggagctcccc ctgcctcttt cccctactta360
gctccttagc aaagagaccc tggcctccac tttgcccttt gggt 404
<210>157
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>157
Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Ser Val
1 5 10
<210>158
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>158
Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Ser Val
1 5
<210>159
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>159
Ile Leu Asn Ser Arg Pro Pro Ser Val
1 5
<210>160
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>160
Ile Met Asn Ser Arg Pro Pro Ser Val
1 权利要求
1.分离的多肽，其包含含有两个或多个C35肽表位的肽，其中该肽选自SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113、SEQ ID NO 2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ IDNO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ ID NO2的L59-V113，并且其中所述分离的多肽不是SEQ ID NO2、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155或SEQ IDNO2的氨基酸E100-R109。
2.分离的多肽，其包含至少一个C35肽表位类似物，其中该C35肽表位类似物选自对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位G22-C30，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I25-C33，具有取代第6个氨基酸残基和/或第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K77-Y85，具有取代第9个氨基酸残基处酪氨酸的缬氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-C112，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-V113，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I105-V133，具有取代第2个氨基酸残基处苏氨酸的亮氨酸或甲硫氨酸和/或取代第8个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸的类似物；以及对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位N107-L115，具有取代第6个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物。
3.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113。
4.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸E100-V113。
5.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113。
6.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸I93-V113。
7.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸D88-V113。
8.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113。
9.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113。
10.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113。
11.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸F65-V113。
12.权利要求1的分离的多肽，其中所述肽是SEQ ID NO2的氨基酸L59-V113。
13.权利要求2的分离的多肽，其中所述C35肽表位类似物是，对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位G22-C30，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物。
14.权利要求2的分离的多肽，其中所述C35肽表位类似物是，对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I25-C33，具有取代第6个氨基酸残基和/或第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物。
15.权利要求2的分离的多肽，其中所述C35肽表位类似物是，对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K77-Y85，具有取代第9个氨基酸残基处酪氨酸的缬氨酸的类似物。
16.权利要求2的分离的多肽，其中所述C35肽表位类似物是，对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-C112，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物。
17.权利要求2的分离的多肽，其中所述C35肽表位类似物是，对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-V113，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或亮氨酸的类似物。
18.权利要求2的分离的多肽，其中所述C35肽表位类似物是，对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I105-V113，具有取代第2个氨基酸残基处苏氨酸的亮氨酸或甲硫氨酸和/或取代第8个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸的类似物。
19.权利要求2的分离的多肽，其中所述C35肽表位类似物是，对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位N107-L115，具有取代第6个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物。
20.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过100个氨基酸。
21.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过95个氨基酸。
22.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过90个氨基酸。
23.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过85个氨基酸。
24.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过80个氨基酸。
25.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过75个氨基酸。
26.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过70个氨基酸。
27.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过65个氨基酸。
28.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过60个氨基酸。
29.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过55个氨基酸。
30.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过50个氨基酸。
31.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过45个氨基酸。
32.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过40个氨基酸。
33.权利要求1-12中任一项的分离的多肽，其长度不超过35个氨基酸。
34.融合蛋白质，其包含含有两个或多个C35肽表位的分离的肽，其中所述分离的肽选自SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113、SEQ IDNO 2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ ID NO2的L59-V113。
35.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113。
36.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸E100-V113。
37.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113。
38.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸I93-V113。
39.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸D88-V113。
40.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113。
41.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113。
42.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113。
43.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸F65-V113。
44.权利要求34的融合蛋白质，其中所述分离的肽是SEQ ID NO2的氨基酸L59-V113。
45.权利要求34的融合蛋白质，其包含所述分离的肽的同聚物。
46.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113的同聚物。
47.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸E100-V113的同聚物。
48.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113的同聚物。
49.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸I93-V113的同聚物。
50.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸D88-V113的同聚物。
51.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113的同聚物。
52.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113的同聚物。
53.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113的同聚物。
54.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸F65-V113的同聚物。
55.权利要求45的融合蛋白质，其中所述同聚物是SEQ ID NO2的氨基酸L59-V113的同聚物。
56.权利要求34的融合蛋白质，其包含所述分离的肽的异聚物。
57.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQNO2的L59-V113。
58.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸E100-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸 SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ IDNO2的L59-V113。
59.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ IDNO2的L59-V113。
60.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸I93-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ IDNO2的L59-V113。
61.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸D88-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ IDNO2的L59-V113。
62.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ IDNO2的L59-V113。
63.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ IDNO2的L59-V113。
64.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ IDNO2的L59-V113。
65.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸F65-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113和SEQ IDNO2的L59-V113。
66.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ IDNO2的L59-V113。
67.权利要求56的融合蛋白质，其中所述异聚物是SEQ ID NO2的氨基酸L59-V113与至少一个其它分离的肽相连的异聚物，该其它分离的肽选自氨基酸SEQ ID NO 2的T101-V113、SEQ ID NO2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ ID NO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113和SEQ IDNO2的F65-V113。
68.权利要求34的融合蛋白质，其与T辅助肽融合。
69.权利要求34的融合蛋白质，其与载体融合。
70.权利要求34的融合蛋白质，其与脂质连接。
71.由两个或多个C35肽表位组成的分离的多肽，其中所述分离的多肽选自SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113、SEQ ID NO 2的E100-V113、SEQ ID NO2的G99-V113、SEQ ID NO2的I93-V113、SEQ ID NO2的D88-V113、SEQ ID NO2的P84-V113、SEQ IDNO2的K77-V113、SEQ ID NO2的Q72-V113、SEQ ID NO2的F65-V113和SEQ ID NO2的L59-V113，并且其中所述分离的多肽不是SEQ ID NO2、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155或SEQ IDNO2的氨基酸E100-R109。
72.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸T101-V113。
73.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸E100-V113。
74.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸G99-V113。
75.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸I93-V113。
76.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸D88-V113。
77.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸P84-V113。
78.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸K77-V113。
79.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸Q72-V113。
80.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸F65-V113。
81.权利要求71的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2的氨基酸L59-V113。
82.分离的多肽，其包含含有至少一个C35肽表位类似物的肽，其中所述肽选自具有取代第12个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽T101-V113的类似物、具有取代第13个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽E100-V113的类似物、具有取代第14个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽G99-V113的类似物、具有取代第20个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽I93-V113的类似物、具有取代第25个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽D88-V113的类似物、具有取代第29个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ IDNO2的肽P84-V113的类似物、具有取代第36个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽K77-V113的类似物、具有取代第41个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽Q72-V113的类似物、具有取代第48个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽F65-V113的类似物以及具有取代第54个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽L59-V113的类似物。
83.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第12个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽T101-V113的类似物。
84.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第13个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽E100-V113的类似物。
85.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第14个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽G99-V113的类似物。
86.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第20个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽I93-V113的类似物。
87.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第25个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽D88-V113的类似物。
88.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第29个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽P84-V113的类似物。
89.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第36个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽K77-V113的类似物。
90.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第41个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽Q72-V113的类似物。
91.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第48个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽F65-V113的类似物。
92.权利要求82的分离的多肽，其中所述包含至少一个C35肽表位类似物的肽是具有取代第54个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽L59-V113的类似物。
93.融合蛋白质，其包含含有至少一个C35肽表位类似物的肽，其中所述肽选自对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位G22-C30，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I25-C33，具有取代第6个氨基酸残基和/或第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K77-Y85，具有取代第9个氨基酸残基处酪氨酸的缬氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-C112，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位K104-V113，具有取代第9个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或亮氨酸的类似物；对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位I105-V133，具有取代第2个氨基酸残基处苏氨酸的亮氨酸或甲硫氨酸和/或取代第8个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸的类似物；以及对于SEQ ID NO2和图1B的肽表位N107-V113，具有取代第6个氨基酸残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的类似物、具有取代第12个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽T101-V113的类似物、具有取代第13个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ IDNO2的肽E100-V113的类似物、具有取代第14个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽G99-V113的类似物、具有取代第20个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽I93-V113的类似物、具有取代第25个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽D88-V113的类似物、具有取代第29个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽P84-V113的类似物、具有取代第36个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ IDNO2的肽K77-V113的类似物、具有取代第41个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽Q72-V113的类似物、具有取代第48个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽F65-V113的类似物以及具有取代第54个残基处半胱氨酸的丙氨酸或甘氨酸的SEQ ID NO2的肽L59-V113的类似物。
94.权利要求93的融合蛋白质，其包含含有至少一个C35肽表位类似物的所述肽的同聚物。
95.权利要求93的融合蛋白质，其包含含有至少一个C35肽表位类似物的所述肽的异聚物。
96.包含权利要求1-33或71-92任一项的分离的多肽以及药物可接受载体的组合物。
97.包含权利要求34-70或93-95任一项的融合蛋白质以及药物可接受载体的组合物。
98.包含至少一个C35肽表位类似物的分离的多肽，其中所述肽表位类似物是SEQ ID NO2和图1B的K104-V113，其中第9个氨基酸残基处的半胱氨酸被半胱氨酰化。
99.包含至少一个C35肽表位类似物的分离的多肽，其中所述肽表位类似物是SEQ ID NO2和图1B的I105-V113，其中第8个氨基酸残基处的半胱氨酸被半胱氨酰化。
全文摘要
本发明涉及在人癌中差异表达的人新基因。更具体而言，本发明涉及编码在人乳腺癌和膀胱癌中过表达的名为C35的人新多肽的多核苷酸。本发明还涉及C35多肽、特别是C35肽表位和C35肽表位类似物，以及载体、宿主细胞、针对C35多肽的抗体和制备它们的重组方法。本发明另外涉及检测癌包括人乳腺癌的诊断方法。本发明另外涉及C35基因及多肽特别是C35肽表位和C35肽表位类似物在免疫原性组合物或疫苗中的组成或用途，以针对表达C35基因的靶细胞例如肿瘤细胞，诱导抗体或细胞介导的免疫。本发明另外涉及用于鉴定C35活性的激动剂和拮抗剂的筛选方法。
文档编号C12N1/15GK1684700SQ03816228
公开日2005年10月19日 申请日期2003年6月10日 优先权日2002年6月10日
发明者M·扎德尔, E·E·埃文斯, M·A·博雷洛 申请人:瓦西尼斯公司, 罗切斯特大学