类胡萝卜素的生物转化方法

专利名称：类胡萝卜素的生物转化方法
技术领域：
本发明涉及使用具有细胞色素P450单加氧酶活性的酶生物转化类胡萝卜素的方法，方法中用到的酶特别是来自嗜热细菌尤其是栖热菌(Thermus sp.)属的单加氧酶，并且本发明还涉及可用于此类方法的微生物和表达构建体。
现有技术胡萝卜醇如玉米黄质和隐黄素为含氧的类胡萝卜素，并且作为色素或用作维生素A衍生物的前体，对于人类或动物饮食是重要的添加剂。胡萝卜醇也有助于促进健康。它们能够增强免疫反应，并且由于它们的抗氧化特性，它们也具有防癌作用，这使它们具有作为营养保健品(nutraceuticals)的价值。
细胞色素P450单加氧酶能够催化工业目的的氧化反应，因此已对其进行了一段时间的深入研究。例如，已经从巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)分离并表征了细胞色素P450单加氧酶BM-3，并且现在可通过重组方法获得(参见例如，DE-A-199 35 115)。
细胞色素P450单加氧酶通常催化长链饱和脂肪酸和其相应的酰胺及醇类的近端羟基化作用，或者催化不饱和长链脂肪酸或中等链长饱和脂肪酸的环氧化作用。饱和脂肪酸链的最佳链长为14-16个碳原子。
通过X-射线结构分析已经确定P450 BM-3的血红素结构域的结构。底物结合位点为长管状口形状，其从分子表面延伸至血红素分子，并且几乎专门通过疏水性氨基酸残基结合。血红素结构域表面仅有的带电残基是残基Arg47和Tyr51。据推测它们是通过形成氢键而参与结合底物的羧基。现在通过靶向诱导点突变扩大所述酶的底物范围也已成为可能。因此，现在用所述酶催化较短链和较长链的羧酸、烷烃、烯烃、环烷烃、环烯烃和多种芳族化合物氧化也是可能的(参见DE-A-199 35 115，199 55 605，100 11 723和100 14 085)。
WO-A-02/33057公开了嗜热细菌来源的适于生物转化多种有机底物的细胞色素P450单加氧酶。类胡萝卜素如β-胡萝卜素在其中未提及可作为细胞色素P450单加氧酶的潜在底物。
DE-A-199 16 140描述了来自绿藻雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的胡萝卜素羟化酶，其尤其催化β-胡萝卜素转化为玉米黄质和隐黄素。没有提及在β-胡萝卜素的生物转化过程中细胞色素P450单加氧酶的可能用途。
为了进一步改善这类细胞色素P450单加氧酶的工业用途，希望找到其应用的新领域。
发明简述本发明的一个目的在于提供细胞色素P450单加氧酶应用的新领域。
我们发现通过提供氧化类胡萝卜素的方法已经达到本发明目的，该方法包括在具有细胞色素P450单加氧酶活性和额外具有氧化类胡萝卜素能力的酶存在下反应胡萝卜素，还包括分离氧化产物。
根据本发明，具有细胞色素P450单加氧酶活性和额外具有氧化类胡萝卜素能力的酶具有在β-紫罗酮环的第3位碳原子或4-酮-β-紫罗酮环的第3位碳原子上引入羟基的作用。
合适的类胡萝卜素的例子为β，β-胡萝卜素(下文中称为β-胡萝卜素)、β，ε-胡萝卜素或者角黄素。
在本发明所指的意思中胡萝卜素的氧化包括胡萝卜素的单羟基化或多羟基化。
根据本发明得到的氧化产物优选地包含玉米黄质、隐黄素、金盏花玉红质(adonirubin)、虾青素、叶黄素或其混合物。
详细描述下面本发明参照附图进行详细解释。


图1显示嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)来源的P450和巨大芽孢杆菌来源的P450 BM3的血红素结构域序列比较。血红素结合位点用双下划线表示(P450BM3中的Cys400为与辅基中的铁原子相互作用的半胱氨酸残基)。与脂肪酸链的T-末端接触的区域用单下划线表示。一致性程度用不同的符号表示(“*”＝相同的残基；“:”和“.”＝相似的残基)。
图2显示了测定P450 BM3和栖热菌来源的P450热稳定性的比较试验结果。在波长范围400-500nm之间用分光光度计测定血红素基团的含量来确定其热稳定性。
图3显示由β-胡萝卜素根据本发明生物转化为隐黄素和玉米黄质的反应模式图。
图4显示含有β-胡萝卜素、玉米黄质和隐黄素的标准样品的HPLC洗脱图。
图5阐述了用重组大肠杆菌(E.coli)菌株进行生物转化实验的结果，其中所述重组细菌除了胡萝卜素形成基因(carotenogenic)crtE、crtB、crtI和crtY(图5A)外，用根据本发明的构建体pKK_CYP转化(图5B)；图中可以看出在存在pKK_CYP的情况下玉米黄质和隐黄素的产量显著增加。
a)氧化类胡萝卜素的方法本发明的第一个方面特别涉及氧化类胡萝卜素如β-胡萝卜素的方法，其中a1)可产生具有细胞色素P450单加氧酶活性的酶的重组微生物在有外源性类胡萝卜素或作为中间体形成的类胡萝卜素存在的培养基中培养；或a2)将含有类胡萝卜素的反应培养基与具细胞色素P450单加氧酶活性的酶培养；以及b)从培养基中分离所形成的氧化产物或其次要产物。
本发明中的方法是在这样的条件下实施的，所述条件为优选地促进但至少不阻止或甚至抑制类胡萝卜素如β-胡萝卜素的氧化。氧化作用优选地在氧存在下、培养温度至少约20℃如20-40℃、pH约6-9的条件下通过培养重组微生物而进行。
优选使用的微生物是那些能通过异源互补作用产生类胡萝卜素如β-胡萝卜素并且可额外表达具有细胞色素P450单加氧酶活性的酶的微生物。例如，在上述的DE-A-199 16 140中描述了具有异源互补作用的大肠杆菌菌株和能够以类似方式将根据本发明的P450单加氧酶活性(具有氧化类胡萝卜素活性)掺入其中的其他微生物，该专利此处引用作为参考。
在另一个优选的改变形式中，将类胡萝卜素如β-胡萝卜素作为外源底物加入到培养基中，且氧化作用是在有氧、培养温度至少约20℃、pH约6-9时于含有底物的培养基中通过酶促反应进行，含底物的培养基中可额外包含以底物为基准的大约10-100倍摩尔的过量还原等同物。
以上的方法优选地在生物反应器中进行。本发明因此涉及包含至少一种本发明的单加氧酶或者至少一种本发明的重组微生物的此类生物反应器，根据需要，在每一情况下为固定化形式。
如果反应是使用重组微生物实施的，那么重组微生物的培养优选地首先在有氧、培养温度约20℃或更高、pH约6-9时于复合培养基如TB或LB培养基中培养直至达到足够的细胞密度。为了能更好地控制氧化反应，优选地使用诱导型启动子。例如，培养在诱导产生单加氧酶之后于有氧条件下持续12小时至3天。
另一方面，如果根据本发明的反应是使用经纯化或经富集的酶实施的，那么将本发明的酶溶于或者溶解于含外源底物(大约0.01-10mM或者0.05-5mM)的培养基中，且反应优选地在有氧、温度大约10℃或更高、pH约6-9(如用100-200mM的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液调节)、存在还原剂、可额外包含超出以被氧化底物为基准大约10-100倍摩尔的过量还原等同物(电子供体)的含底物培养基中进行。优选的还原剂是NADPH.
在本发明的底物氧化方法中，存在于反应培养基中或加入到反应培养基中的氧会发生还原性酶促裂解。必需的还原等同物可通过加入还原剂(电子供体)来获得。
形成的氧化产物然后从培养基中取出并用常规方式如提取和/或色谱法加以纯化。合适的方法对于技术人员是已知的，因此无需专门解释。
特别优选的方法是这样的方法，其中使用的细胞色素P450单加氧酶所具有的氨基酸序列包含如SEQ ID NO2所示的从氨基酸残基Pro328到G1u345的部分序列；并且，根据需要，其还额外包含如SEQ ID NO2所示的从氨基酸残基Val216到Ala227的部分序列。
特别优选的方法是这样的方法，其中使用的单加氧酶所具有的氨基酸序列包含至少一种其它的部分序列，其中所述其它的部分序列选自如SEQID NO2所示的从氨基酸残基Met1到Phe327和从Gly346到Ala389的指定序列区域的至少10个连续氨基酸的部分序列，并且，尤其是那些使用具有基本对应于SEQ ID NO2的氨基酸序列的单加氧酶的方法。
本发明中借助微生物的实施方法有必要培养携带有这样的表达构建体的重组微生物，其中所述表达构建体包含在调节性核苷酸序列调控下的上述细胞色素P450单加氧酶的编码序列。
本发明的另一方面涉及上述细胞色素P450单加氧酶的用途，或者涉及编码其的核苷酸序列的用途，用于微生物氧化类胡萝卜素如β-胡萝卜素。
b)用于实施所述方法的重组微生物本发明还涉及不仅能通过异源互补作用产生类胡萝卜素如β-胡萝卜素，还能额外表达具有细胞色素P450单加氧酶活性的酶的重组微生物。此类微生物优选地用类胡萝卜素形成基因如crtE、crtB、crtI和crtY进行异源互补。这些微生物特别是来源于埃希氏菌属的细菌，如大肠杆菌，尤其是大肠杆菌JM 109。
本发明的微生物特别是用这样的表达载体转化，所述表达载体包含在调节性核苷酸序列调控下的上述细胞色素P450单加氧酶的编码序列。
包含上述细胞色素P450单加氧酶编码序列的优选表达载体包含可操作连接的位于其上游的强tac启动子和其下游的强rrnB核糖体终止子。
例如，在DE-A-199 16 140(此处引用作为参考)中公开了用于实施本发明方法时可使用的其他微生物和其产物。
本发明也涉及具有本发明的氧化类胡萝卜素尤其是β-胡萝卜素活性的P450酶或编码其的核酸序列的用途，用于产生遗传修饰的生物体，特别是用于实施本发明的方法。
本发明还涉及这样的已经过相应遗传修饰的生物体，其中当起始生物体包含根据本发明使用的基因时，本发明氧化类胡萝卜素尤其是β-胡萝卜素活性的基因在生物体内的表达与野生型相比增加，或者当起始生物体不含有根据本发明使用的基因的情况下，通过遗传修饰本发明氧化类胡萝卜素尤其是β-胡萝卜素活性的基因在生物体内的表达与野生型相比增加。
遗传修饰的生物体是指优选地通过这里提到的方法之一已将本发明的P450基因或核酸构建体插入其中的生物体。
遗传修饰的生物体包含至少一种本发明的氧化类胡萝卜素尤其是β-胡萝卜素的基因或至少一种本发明的核酸构建体。根据起始生物体，所述核酸可存在于生物体的染色体中或染色体外。
遗传修饰生物体与野生型相比优选地呈现改变的类胡萝卜素的代谢。
合适的遗传修饰生物体原则上是能够合成类胡萝卜素或胡萝卜醇的所有生物体。
优选的起始生物体是那些能天然合成胡萝卜醇的生物体。然而，由于导入了类胡萝卜素生物合成基因而能合成胡萝卜醇的起始生物体也是合适的。
起始生物体是指原核生物体或者真核生物体，如微生物或植物。优选的微生物有细菌、酵母、藻类或真菌。
可使用的细菌为由于导入了产生类胡萝卜素的生物体中的类胡萝卜素生物合成基因而能合成胡萝卜醇的细菌，如包含例如来自欧文氏菌crt基因的埃希氏菌属；还可以为自身能合成胡萝卜醇的细菌，如欧文氏菌属(Erwinia)、农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)或蓝细菌中的集胞藻属(Synechocystis)。优选的细菌有大肠杆菌(Escherichia coli)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、嗜夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)、橙黄农杆菌(Agrobacteriumaurantiacum)、产碱菌PC-1(Alcaligenes sp.PC-1)、黄杆菌R1534株(Flavobacterium sp.strain R1534)、蓝细菌集胞藻PCC6803(cyanobacterium Synechocystis sp.PCC6803)、Paracoccus marcusu或Paracoccus carotinifaciens。
优选的酵母菌有假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、汉森酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)。
优选的真菌有曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、阿舒囊霉属(Ashbya)、脉孢菌属(Neurospora)、布拉霉属(Blakeslea)、须霉属(Phycomyces)、镰孢霉属(Fusarium)或在Indian Chem.Engr.Section B.Vol.7，No.1，2(1995)第15页的表6中描述的其他真菌。
优选的藻类是绿藻如红球藻属(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、团藻(Volvox)或杜氏藻(Dunaliella)。特别优选的藻类是雨生红球藻或巴德威杜氏藻(Dunaliella bardawil)。
在优选的实施方案中，植物可用作起始生物体，如前所述也可作为遗传修饰生物体。优选的植物的实例有万寿菊、向日葵、拟南芥、烟草、红辣椒、大豆、番茄、桔子、红椒、胡萝卜、马铃薯、谷物、莴苣和芸苔属种、燕麦、黑麦、小麦、黑小麦、粟、水稻、苜蓿、亚麻、芸苔如油菜籽、卡诺拉(canola)、甜菜、甘蔗或木本植物如白杨或紫杉。
特别优选的是上面给出的拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)、万寿菊(Tagetes erecta)、油菜籽、卡诺拉、马铃薯、油籽和一般的产类胡萝卜素的植物如大豆、向日葵、辣椒、胡萝卜、辣椒或谷物。
c)酶、多核苷酸和构建体根据本发明使用的细胞色素P450单加氧酶特别能从嗜热细菌中分离出来，优选栖热菌属如嗜热栖热菌HB27株(保藏于DSM，保藏号为DSM7039)。根据本发明的“嗜热”细菌满足H.G.Schlegel，Allgemeine Mikrobiologie，Thieme Verlag Stuttgart，第五版，第173页用于嗜热的和极端嗜热生物体的耐热性标准(即最适生长温度高于40℃)。
根据本发明优选使用的单加氧酶的优选的特征是热稳定性的增加。此特征通过在升高温度下(如温度范围30-60℃，pH 7.5，25mM Tris/HCI)活性的丢失加以证明，所述活性丢失低于巨大芽孢杆菌来源的P450 BM-3。
在一个优选的实施方案中，根据本发明使用嗜热栖热菌的嗜热细菌来源的细胞色素P450单加氧酶。此蛋白质为分子量是约44kDa(通过SDS凝胶电泳测定)，可溶性分子，在还原态、氧化态及作为羰基加成物显示与其他的P450酶类似的吸收光谱。将本发明的此种嗜热栖热菌的酶和其他已知的P450酶的序列比较确定了下面的同一性P450 BM3，32％同一性；CYP119，29％同一性；P450eryF，31％同一性。本发明的酶显示出特别的热稳定性，图示熔解温度大约85℃，比P450cam的熔解温度值高出约30℃。
本发明的另一方面涉及在氧化β-胡萝卜素的方法中编码细胞色素P450单加氧酶，尤其是栖热菌属来源的细胞色素P450单加氧酶的多核苷酸的用途。
优选的多核苷酸是那些基本上具有如SEQ ID NO1所示的核酸序列以及与其互补和来源于其的核苷酸。
本发明另一方面涉及表达盒或重组载体的用途，用于产生本发明反应中使用的重组微生物。
本发明同样也包括特别公开的用于本发明反应中的新P450单加氧酶的“功能等同物”的用途。
对于本发明的目的，“功能等同物”或特别公开的单加氧酶的类似物是这样的一些酶类，所述的酶类其来源不同但在上面确定的氧化反应范围内仍具有所需的底物特异性，和/或具有与P450 BM3比较增加的热稳定性，如在温度范围约30-60℃并且，根据需要，经25mM Tris/HCl处理30分钟后更高的温度内。
根据本发明，“功能等同物”特别指这样的突变体，所述突变体具有的氨基酸在至少一个上述的序列位点上不同于上述特别提到的氨基酸，但仍然能催化一种上述的氧化反应。“功能等同物”因而包括通过一个或更多，如1-30或1-20或1-10个氨基酸添加、替换、缺失、和/或倒位得到的突变体。只要它们能导致具有本发明特性谱的突变，所述的修饰可发生在任何序列位点。当反应性模式中突变体和未修饰酶之间存在质的一致性时，功能等同物也特别可以存在，即，例如它们对同一底物的转化速率有所差异。
根据本发明包括的“功能等同物”具有的氨基酸序列在至少一个位点不同于如SEQ ID NO2所示的序列，该氨基酸序列的修饰优选地仅轻微地改变单加氧酶的活性，也就是说不超过约±90％、尤其是不超过±50％或不超过±30％。这种改变能够通过在标准条件下(如0.1-0.5M的底物，pH 6-8，尤其是7；T＝30-70℃)使用参考底物如β-胡萝卜素测定。
“功能等同物”在上面的意思中也指描述的多肽前体以及多肽的功能衍生物和多肽的盐类。术语“盐”是指含有本发明的蛋白质分子的羧基基团的盐和氨基基团的酸加成盐。含羧基基团的盐类可通过本来已知的方式来制备，并且包括无机盐如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐、锌盐以及含有机碱的盐，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等。酸加成盐如与无机酸如盐酸或硫酸形成的盐，和与有机酸如醋酸和草酸形成的盐也是本发明的一方面。
本发明中多肽的“功能衍生物”也可以通过已知的技术在功能性氨基酸侧链基团或其N-末端或C末端上制备。此类型衍生物包括如含羧基的脂肪族酯类，通过与氨或者伯胺或仲胺反应获得的含羧基的酰胺化合物；以及与酰基反应得到的游离氨基的N-酰基衍生物；或者与酰基反应得到的游离羟基的O-酰基衍生物。
根据本发明包括的“功能等同物”是特别公开的蛋白质的同源物(homologs)。它们与一种特别公开序列的同源性至少为60％，优选至少75％，尤其至少85％，例如90％，95％，99％，这是通过Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448)算法得到的结果。
本发明蛋白质或多肽的同源物能通过诱变如蛋白质的点突变或截短产生。
本发明中的蛋白质的同源物可通过突变体如截短突变体的组合库筛选来鉴定。例如，通过在核苷酸水平的组合诱变，如通过合成的寡核苷酸混合物的酶促连接，产生蛋白质变体的多样库是可能的。大量的方法可用于产生来自简并寡核苷酸序列的同源库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中实施，并且合成的基因随后可以连接入合适的表达载体。此简并系列基因的使用使提供能在一种混合物中编码所需的一组潜在蛋白质序列的所有序列成为可能。合成简并寡核苷酸的方法对于技术人员是已知的(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人(1984)Science 1981056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11477)。
“功能等同物”当然也包含从其它生物体，如从非此处特别提及的细菌和天然存在的变体中得到的P450单加氧酶。例如，同源性序列区域能够通过序列比较发现，而且等同的酶能在本发明特殊要求的基础上确定。
本发明也涉及能编码用于实施上述方法的上述单加氧酶和它们的功能等同物之一的核苷酸序列(单链和双链DNA与RNA序列)。本发明另外的核酸序列衍生自SEQ ID NO1，且经过一个或多个核苷酸的添加、替换、插入或缺失而获得的序列，但其仍能编码具有所需特性的单加氧酶。
此处提到的所有核酸序列能以本来已知的方式从核苷酸结构单元通过化学合成，如通过双螺旋的分别重叠、互补的核苷酸结构单元进行片段缩合制备。例如，寡核苷酸的化学合成能以已知的方式通过氨基磷酸酯法(phosphoramidite)(Voet，Voet，Biochemie，第2版，Wiley Press NewYork，第896-897页)进行。在Sambrook等人(1989)，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述了合成寡核苷酸的退火和用DNA聚合酶的Klenow片断填补缺口，以及连接反应和一般的克隆方法。
本发明也包括与特定提到的序列相比较根据特定来源或宿主生物体的密码子使用而包含所谓的沉默突变或经修饰的核酸序列，并包括其天然存在的变体，如其剪接变体。本发明也涉及通过保守核酸序列替换(即用相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸替换相应的氨基酸)获得的序列。
本发明额外包括与上述编码序列杂交或互补的核酸序列。这些多核苷酸能通过筛选基因组文库或cDNA文库发现，并且，根据需要，通过使用合适的引物进行PCR的方法使之扩增，然后，例如，再使用合适的探针进行分离。另一种可能性是使用本发明的多核苷酸或载体转化合适的微生物，繁殖微生物因而扩增多核苷酸，然后将它们分离出来。额外的可能性是通过化学方法合成本发明的多核苷酸。
能够和多核苷酸杂交的特性是指多核苷酸或寡核苷酸在严格的条件下结合至几乎互补的序列的能力，而非互补的部分之间在这些条件下没有非特异的结合。为了该目的，序列之间应该有70-100％，优选90-100％的互补性。互补序列能够特异性结合另一序列的特性可用于例如在有引物结合的情况下使用Northern印迹或Southern印迹技术或PCR或RT-PCR。长度为30个或更多碱基对的寡核苷酸通常用于此目的。严格的条件是指例如Northern印迹技术中在50-70℃优选60-65℃下用洗液，如含0.1％SDS的0.1xSSC缓冲液(20xSSC3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)洗脱非特异杂交的cDNA探针或寡核苷酸。在此情况下，如上所述，只有具有高度互补性的核酸才能保留结合在另一核苷酸上。
此类核酸优选地掺入这样的表达构建体和包含至少一种此类表达构建体的载体中，其中所述的表达构建体含有在调节性核苷酸序列的基因调控下的编码本发明酶的核酸序列。本发明的此类构建体优选地包含特定编码序列5′-上游的启动子及其3′-下游的终止子序列，并且根据需要，还包含常用的调控元件，特别是可操作地连接编码序列的每一调控元件。“可操作的连接”是指启动子、编码序列、终止子，以及根据需要其他的调控元件的以某种方式排序，在此方式下每一调控元件能够与其用于表达编码序列的功能相一致。可操作连接的序列的实例有靶向序列和翻译增强子、聚腺苷酸化信号等。其他的调控元件包括选择性标志、扩增信号、复制起点等。
除了人工的调控序列外，在真正的结构基因的前面仍可能存在天然的调控基因。根据需要，此类天然的调控能通过遗传修饰而关闭，从而基因的表达会增加或减少。然而，基因构建体也可以具有较简单的结构，也就是说没有额外的调控信号插入结构基因的前面而且用此调控的天然启动子没有缺失。相反地，天然的调控序列发生突变导致调控不再发生，基因表达就会加强或消失。此类核酸序列在基因构建体中可以存在一个或多个拷贝。
可用的启动子的实例有cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-Iac，laclq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL启动子，它们有利地用在革兰氏阴性细菌中；革兰氏阳性细菌的启动子amy和SP02，酵母启动子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH或者植物启动子CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，not或泛素或菜豆蛋白启动子。诱导型启动子的使用是特别优选的，例如，光诱导和尤其温度诱导的启动子如PrPL启动子。
含有调控序列的所有天然启动子原则上都可应用。另外，使用合成启动子也可能是有利的。
所述的调控序列是用来使核苷酸序列的特定表达和蛋白质表达成为可能。这也意味着，例如，依赖宿主生物体，基因只有在诱导后表达或过量表达，或者意味着立即表达和/或过量表达。
调控序列或因子此外可优选地正向影响表达，并从而增加或减少表达。因此，调控元件的增强有利地在转录水平通过使用强的转录信号如启动子和/或增强子进行。然而，通过如改善mRNA的稳定性加强翻译也是可能的。
表达盒可通过融合合适的启动子和合适的单加氧酶核苷酸序列以及终止子信号或多聚腺苷酸信号产生。重组和克隆的常规技术可用于此目的，例如，在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)和在T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，融合基因的表达，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)和在Ausubel，F.M.等人，分子生物学最新方法，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience(1987)中有所描述。
为了在合适生物体中表达，重组核酸构建体或基因构建体有利地插入到能够在可能的宿主里得到最佳表达的宿主特异性载体中。载体已为技术人员所熟知，并且能在例如“克隆载体”(Pouwels P.H.等人编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。载体不仅有质粒，而且还有技术人员已知的所有其它载体，例如噬菌体、病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体在宿主生物体内能够进行自主复制或通过染色体复制。
可提及的合适的表达载体实例有常用的融合表达载体如pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 6731-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT 5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们在重组靶蛋白中分别融合了谷胱甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E-结合蛋白和蛋白A。
非融合蛋白表达载体如pTrc(Amann等人，(1988)基因69301-315)和pET 11d(Studier等人，基因表达技术酶学方法185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。
在酿酒酵母(S.cerevisiae)中用于表达的酵母表达载体，如pYepSecl(Baldari等人，(1987)Embo J.6229-234)，pMFα(Kurjan undHerskowitz(1982)细胞30933-943)，pJRY88(Schultz等人，(1987)基因54113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。适用于其它真菌类如丝状真菌中的载体和构建载体的方法包括那些在vanden Handel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)″丝状真菌中基因转移系统和载体的发展″(真菌中的应用分子遗传学，J.F.Peberdy等人编辑)1-28页，Cambridge University PressCambridge中详细描述的载体和构建方法。
在培养的昆虫细胞中用于表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，(1983)Mol.Cell BioI.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
植物表达载体如那些在Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“具有位于接近左边界的选择性标志的新植物双元载体”，Plant Mol.BioI.201195-1197和Bevan，M.W.(1984)“用于植物转化的双元农杆菌属载体”，Nucl.Acids Res.128711-8721中有详细描述的植物表达载体。
哺乳动物表达载体如pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBO J.6187-195)。
用于原核细胞和真核细胞的另外合适的表达系统在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，分子克隆实验室手册，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989第16和17章中有描述。
本发明的表达构建体和载体能用于产生如使用至少一种本发明的载体转化的重组微生物，并且用于产生根据本发明使用的酶和/或用于实施本发明的方法。上述本发明的重组构建体有利地导入合适的宿主系统并加以表达。技术人员熟知的克隆和转染方法，如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、反转录病毒转染等，优选地用来引起特定表达系统中的所述核苷酸的表达。例如，在Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等人编辑，Wiley Interscience，New York 1997中描述了合适的系统。
合适的宿主生物体原则上是能表达本发明的核酸及其等位基因变体、功能等同物或衍生物的所有生物体。宿主生物体是指，例如细菌、真菌、酵母、植物或动物细胞。优选的生物体是细菌如埃希氏菌属的那些细菌，例如，大肠杆菌、链霉菌、芽孢杆菌或假单胞菌，真核微生物如酿酒酵母、曲霉属、布拉霉属、须霉属，来自动物或植物的高等真核细胞，例如Sf9或CHO细胞。
成功转化的生物体可通过同样存在于载体或表达盒中的标志基因筛选出来。此类标志基因的实例有抗生素抗性基因和催化可引起转化细胞染色的颜色形成反应的酶的基因。此类基因能通过自动细胞分类筛选出来。使用载体已成功转化并具有合适的抗生素抗性基因(例如G418或潮霉素)的微生物能够通过合适的含抗生素的培养基或营养培养基筛选出来。细胞表面存在的标志蛋白质可用亲和层析法筛选。
宿主生物体和与之相适应的载体结合构成表达系统，其中所述的载体例如质粒、病毒或噬菌体，例如，具有RNA聚合酶/启动子系统的质粒、λ或μ噬菌体或者温和噬菌体或转座子和/或其他有利的调控序列。术语“表达系统”是指例如哺乳动物细胞如CHO细胞与适合哺乳动物细胞的载体如pcDNA3neo载体结合。
如果需要的话，基因产物也能在转基因生物体如转基因动物，例如，尤其小鼠或绵羊，或转基因植物中表达。
在这种情况下也可能得到根据本发明使用的单加氧酶的重组产物，此情况是指培养产单加氧酶的微生物，根据需要，诱导表达单加氧酶，并从培养物中分离单加氧酶。因此，如果需要的话，单加氧酶能以工业模式产生。
重组微生物能够培养并通过已知的方法发酵。细菌能够在例如TB或LB培养基和温度20-40℃以及pH 6-9条件下生长。例如，T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)描述了合适的培养条件的详细资料。
如果单加氧酶没有分泌入培养基，那么将细胞破裂，此酶就可以从裂解物中通过已知的分离方法获得。这些细胞可以备选地通过高频超声，通过高压如在French压力室，通过渗压裂解，通过暴露于去垢剂、裂解酶或有机溶剂，通过匀浆器或通过联合使用所述的多种方法加以破碎。
单加氧酶能通过已知的层析方法加以纯化，如分子筛层析法(凝胶过滤)，例如Q-琼脂糖层析，离子交换层析，疏水层析，或通过其他常用的方法如超滤作用，结晶作用，盐析作用，透析及非变性凝胶电泳。例如，在Cooper，T.G.，Biochemische Arbeitsmethoden，Verlag Walter deGruyter，Berlin，New York或在Scopes，R.，蛋白质纯化，SpringerVerlag，New York，Heidelberg，Berlin中描述了合适的方法。
使用载体系统或通过特定核苷酸序列延伸DNA的寡核苷酸从而编码更方便纯化的经修饰多肽或融合蛋白质来分离重组蛋白质有特别的优势。例如，此类型合适的修饰为可作为锚的所谓标签，如已知的六个组氨酸锚或作为抗原通过抗体识别的表位的修饰(例如，在Harlow，E.和Lane，D.，1988，抗体实验室手册.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中有描述)。此类锚能用于将蛋白质吸附于诸如聚合物基质的固相支持物上，例如，固体支持物能够填充到层析柱内，或者用于微孔板或另一种支持物上。
此类锚能同时用于识别蛋白质。也有可能用于识别蛋白质常规标记物，例如荧光染料、与底物反应之后形成可检测反应产物的酶标志、或者放射性标记物，单独或与锚联合用于衍生蛋白质。
下面的非限制性实施例描述了本发明的特定实施方案。
实施例常规实验细节a)常规克隆方法为了本发明的目的实施的克隆步骤，如限制性酶切，琼脂糖凝胶电泳，DNA片段纯化，核酸向硝酸纤维素膜和尼龙膜转移，DNA片段连接，大肠杆菌细胞的转化，细菌培养，噬菌体复制和重组DNA序列分析，按照如Sambrook等人(1989)中的描述实施。
b)聚合酶链反应(PCR)依照标准方法使用以下标准混合物实施PCR8μl dNTP混合物(200μM)，10μl无MgCl2的Taq聚合酶缓冲液(10x)，8μl MgCl2(25mM)，每一引物1μl(0.1μM)，1μl待扩增的DNA，2.5 UTaq聚合酶(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)，加软化水至100μl。
c)大肠杆菌的培养重组大肠杆菌DH5α在37℃于LB-Amp培养基(胰蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，酵母提取物5.0g，氨苄青霉素100g/ml，加水至1000ml)中培养。为了实现此目的，使用接种环将一个克隆从琼脂平板转移入5ml LB-Amp培养基。培养约18小时后，将4ml培养物接种至2升三角瓶内的400ml培养基中，以220转/分钟的频率振荡培养。OD578达到0.8-1.0之间的值后，在42℃通过热休克诱导3-4个小时，大肠杆菌内诱导表达P450。
d)细胞破裂将湿菌量重达15g的DH5α大肠杆菌的细胞沉淀放置冰上化冻，并悬浮于25ml磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.5，1mM EDTA)或Tris/HCl缓冲液(50mM，pH 7.5，1mM EDTA)中。冰冷的大肠杆菌细菌悬浮液通过超声(BransonSonifier W250，(Dietzenbach，Germany)，输出功率80W，运行间隔20％)进行破菌处理3分钟。蛋白质纯化前，细胞悬浮液以32,500g离心20分钟，经0.22mm Sterivex GP过滤器(微孔过滤器(Millipore))过滤，获得粗提取物。
实施例1嗜热栖热菌HB27来源的P450及其组氨酸标签衍生物的克隆和表达1.嗜热栖热菌HB27来源的P450的克隆含有编码P450序列(下文中也称为CYP175A1基因)的克隆(TTHB66)从嗜热菌基因文库中得到。将编码P450的序列(钝末端)克隆入质粒pTZ19R(MBI Fermentas)的Hinc II酶切位点。质粒TTHB66通过PCR扩增以此方法获得编码P450的序列。所用引物如下a)含有作为P450 ATG起始密码子一部分的Nde I酶切位点(斜体部分)的30聚体有义寡核苷酸5′-CGAAGCTCATATGAAGCGCCTTTCCCTGAG(SEQ ID NO7)。
b)含有作为P450 TGA终止密码子一部分的EcoRI酶切位点(斜体部分)的30聚体反义寡核苷酸5′-GCGAATTCACGCCCGCACCTCCTCCCTAGG(SEQ ID NO8)。
将获得的片段克隆入载体pCYTEXP1(具有噬菌体8的温度诱导型PRPL启动子系统的质粒(Belev T.N.等人，质粒(1991)26147))的Nde I酶切位点，并转化入大肠杆菌DH5α(Clontech，Heidelberg)。
含有目的质粒的大肠杆菌DH5α接种至存在氨苄青霉素的LB培养基中，培养物在37℃培育过夜。部分样本接种至新鲜的LB培养基(含有氨苄青霉素)，由此得到的培养物于37℃培养至OD值达到0.9。通过增加温度至42℃诱导24小时。表达过程中P450含量的变化在测量CO差异光谱的基础上测定。
2.嗜热栖热菌HB27来源的带有N末端组氨酸标签的P450的克隆编码P450的序列通过从质粒TTHB66进行PCR来扩增，所用引物如下(a)含有作为P450 ATG起始密码子和标签编码密码子(下划线部分)部分的Nde I酶切位点(斜体部分)的50聚体有义寡核苷酸5′-CGAAGCTCATATGCATCACCATCATCATCACAAGCGCCTTTC(SEQ ID NO9)；(b)含有作为TGA终止密码子部分的EcoRI酶切位点(斜体部分)的30聚体反义寡核苷酸5′-GCGAATTCACGCCCGCACCTCCTCCCTAGG(SEQ ID NO8)。
获得的片段克隆入载体pCYTEXP1的Nde I和EcoRI酶切位点，并在大肠杆菌DH5α中表达。
包含目的质粒的大肠杆菌DH5α接种到存在氨苄青霉素的LB培养基，该培养物于37℃培养过夜。部分样本接种至新鲜的LB培养基(含有氨苄青霉素)，将得到的培养物于37℃培养至OD值达到0.9。通过增加温度至42℃诱导24小时。表达过程中P450含量的变化在测量CO差异光谱的基础上测定。
3.嗜热栖热菌HB27来源的带有C端组氨酸标签的P450序列的克隆编码P450的序列通过从质粒TTHB66进行PCR来扩增，所用引物如下(a)含有作为P450 ATG起始密码子部分的Nde I酶切位点(斜体部分)的30聚体有义寡核苷酸5′-CGAAGCTCATATGAAGCGCCTTTCCCTGAG(SEQ ID NO7)。
(b)含有作为P450 TGA终止密码子和标签编码密码子部分(下划线)部分的EcoRI酶切位点(斜体部分)的47聚体反义寡核苷酸5′-CGGAATTCAGTGATGATGATGGTGATGCGCCCGCACCTCCTC(SEQ ID NO10)。
得到的片段克隆入载体p-CYTEXP1的Nde I和EcoRI酶切位点，并在大肠杆菌DH5α中表达。
含有目的质粒的大肠杆菌DH5α接种至存在氨苄青霉素的LB培养基中，培养物在37℃培育过夜。部分样本接种至新鲜的LB培养基(含有氨苄青霉素)，由此得到的培养物于37℃培养至OD值达到0.9。通过增加温度至42℃诱导24小时。表达过程中P450含量的变化在测量CO差异光谱的基础上测定。
实施例2嗜热栖热菌HB27来源的P450与P450 BM3的热稳定性的比较测定两种酶分别在pH 7.5，25mM的Tris/HCl缓冲液中，于不同温度下孵育30分钟。然后将混合物冷却后通过光谱测定法测定P450浓度。结果总结如下表，并在图2中以图显示。
实验结果明显证明，在所有温度下孵育30分钟后，本发明的酶具有显著提高的热稳定性。
实施例3表达嗜热栖热菌HB27来源的细胞色素P450单加氧酶的表达载体的产生含有细胞色素P450单加氧酶编码序列(CYP175A1基因)的质粒DNA(克隆TTHB66)是起始位点。使用聚合酶链反应(PCR)将EcoR I和PstI限制性酶切位点导入CYP175A1基因。用下面的引物扩增基因5′-CCGGAATTCATGAAGCGCCTTTCCCTGAGG；(SEQ ID NO11)5′-CCAATGCATTGGTTCTGCAGTCAGGCCCGCACCTCCTCCCTAGG(SEQ ID NO12)新的限制性酶切位点用下划线显示。PCR反应混合物由模板DNA(100ng)，2.5U的pfu DNA聚合酶(Stratagene)，5μl反应缓冲液，5μl DMSO，0.4μmol每种寡核苷酸，400μmol dNTPs，加水至50μl组成。下面的PCR循环反应参数设置为95℃，1分钟；(95℃，1分钟；53℃，1分钟30秒；68℃，1分钟30秒)30个循环；68℃，4分钟。CYP17SA1基因序列通过DNA测序验证。
PCR产物经限制性酶消化后，将CYP17SA1基因克隆入质粒pKK 223-3(Amersham Pharmacia)的EcoR I和Pst I限制性酶切位点。pKK 223-3含有用于调节蛋白表达的多克隆位点上游的强tac启动子及其下游的强rrnB核糖体终止子。由此得到的质粒称为pKK_CYP。
实施例4
β-胡萝卜素在重组大肠杆菌株中的生物转化产生可通过异源互补作用产生β-胡萝卜素的重组大肠杆菌株，用于β-胡萝卜素的生物转化。
大肠杆菌JM109菌株用来作为与质粒pACYC_Y和pKK_CYP(如在实例3中制备)互补试验的宿主细胞。质粒pACYC_Y含有从噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)中分离的胡萝卜素形成基因crtE，crtB，crtIC14和crtY。为使表达成为可能，所述的基因在每一情况下都克隆有它们自己的lac启动子。此类质粒的产生在I.Kauffmann，Erhohung mikrobiellerDiversitat van Carotinaiden，2002年6月，Institute of TechnicalBiology的论文中有所描述。含有胡萝卜素形成基因crtE、crtB、crtIC14前体构建体在Schmidt-Dannert(2000)，Curr Opin.Biotechnol.11，255-261中有描述。
异源互补作用的更多细节，例如，在Ruther，A.Appl.Mikrobiol.Biotechnol.(1997)48162-167；Sandmann，G.，Trends in Plant Science(2001)61，14-17和Sandmann，G.等人，TIBTECH(1999)，17233-237中也有描述。
在上述出版物的公开此处引用作为参考。
使用质粒pACYC_Y和pKK_CYP以本身已知的方法转化大肠杆菌JM109，并在LB培养基于30℃和37℃培养两天。按常规方法加入氨苄青霉素(1μg/ml)，氯霉素(50μg/ml)，异丙基β-硫代半乳糖苷(1mmol)。作为参比样品，大肠杆菌JM109菌株仅用质粒pACYC_Y转化，并以相同的方式培养。
通过先用丙酮再用己烷进行细胞提取从重组大肠杆菌株中分离类胡萝卜素。合并的提取物用水分层。有机相经过分离，浓缩干燥，并用水/乙腈(5∶95)通过HPLC的DXSIL C8柱分级。本方法的条件设置如下分离柱DXSIL C8，3μm，120A，2.1×100mm流速0.35mL/分钟洗脱液等梯度水/乙腈5/95
检测UV_VIS_第一波长＝453nmUV_VIS_第一带宽＝4nm三维场最大波长＝600nm三维场最小波长＝190nm三维场参考波长＝399nm三维场参考带宽＝40nm使用二极管阵列检测器直接从洗脱峰对光谱进行检测。对分离物质通过它们的吸收光谱和它们保留时间与标准样品比较进行确定。
β-胡萝卜素、玉米黄质和隐黄素标准品的色谱图见附图4A到4C。图5A显示从使用质粒pACYC_Y转化的大肠杆菌株中得到的样品的色谱分析。明显可见，后者由于异源互补作用能产生β-胡萝卜素。图5B显示通过本发明的异源互补作用产生的而且额外用质粒pKK_CYP转化的大肠杆菌株的色谱图。在此情况下，可以极其明显看到，除了β-胡萝卜素外，相应的羟基化物玉米黄质和隐黄素的产量显著增加。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>类胡萝卜素的生物转化方法<130>M43191 β-胡萝卜素的生物转化<140>
<141>
<160>12<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>1170<212>DNA<213>嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1170)<400>1atg aag cgc ctt tcc ctg agg gag gcc tgg ccc tac ctg aaa gac ctc 48Met Lys Arg Leu Ser Leu Arg Glu Ala Trp Pro Tyr Leu Lys Asp Leu1 5 10 15cag caa gat ccc ctc gcc gtc ctg ctg gcg tgg ggc cgg gcc cac ccc 96Gln Gln Asp Pro Leu Ala Val Leu Leu Ala Trp Gly Arg Ala His Pro20 25 30cgg ctc ttc ctt ccc ctg ccc cgc ttc ccc ctg gcc ctg atc ttt gac 144Arg Leu Phe Leu Pro Leu Pro Arg Phe Pro Leu Ala Leu Ile Phe Asp35 40 45ccc gag ggg gtg gag ggg gcg ctc ctc gcc gag ggg acc gcc aag gcc 192Pro Glu Gly Val Glu Gly Ala Leu Leu Ala Glu Gly Thr Thr Lys Ala50 55 60acc ttc cag tac cgg gcc ctc tcc cgc ctc acg ggg agg ggc ctc ctc 240Thr Phe Gln Tyr Arg Ala Leu Ser Arg Leu Thr Gly Arg Gly Leu Leu
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<400>2Met Lys Arg Leu Ser Leu Arg Glu Ala Trp Pro Tyr Leu Lys Asp Leu1 5 10 15Gln Gln Asp Pro Leu Ala Val Leu Leu Ala Trp Gly Arg Ala His Pro20 25 30Arg Leu Phe Leu Pro Leu Pro Arg Phe Pro Leu Ala Leu Ile Phe Asp35 40 45Pro Glu Gly Val Glu Gly Ala Leu Leu Ala Glu Gly Thr Thr Lys Ala50 55 60Thr Phe Gln Tyr Arg Ala Leu Ser Arg Leu Thr Gly Arg Gly Leu Leu65 70 75 80Thr Asp Trp Gly Glu Ser Trp Lys Glu Ala Arg Lys Ala Leu Lys Asp85 90 95Pro Phe Leu Pro Lys Asn Val Arg Gly Tyr Arg Glu Ala Met Glu Glu100 105 110Glu Ala Arg Ala Phe Phe Gly Glu Trp Arg Gly Glu Glu Arg Asp Leu115 120 125Asp His Glu Met Leu Ala Leu Ser Leu Arg Leu Leu Gly Arg Ala Leu130 135 140Phe Gly Lys Pro Leu Ser Pro Ser Leu Ala Glu His Ala Leu Lys Ala145 150 155 160Leu Asp Arg Ile Met Ala Gln Thr Arg Ser Pro Leu Ala Leu Leu Asp165 170 175Leu Ala Ala Glu Ala Arg Phe Arg Lys Asp Arg Gly Ala Leu Tyr Arg180 185 190Glu Ala Glu Ala Leu Ile Val His Pro Pro Leu Ser His Leu Pro Argl95 200 205Glu Arg Ala Leu Ser Glu Ala Val Thr Leu Leu Val Ala Gly His Glu210 215 220Thr Val Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Phe Leu Leu Leu Ser His Arg
225 230 235 240Pro Asp Trp Gln Lys Arg Val Ala Glu Ser Glu Glu Ala Ala Leu Ala245 250 255Ala Phe Gln Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Trp Ile Leu Thr260 265 270Arg Arg Leu Glu Arg Pro Leu Leu Leu Gly Glu Asp Arg Leu Pro Pro275 280 285Gly Thr Thr Leu Val Leu Ser Pro Tyr Val Thr Gln Arg Leu His Phe290 295 300Pro Asp Gly Glu Ala Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Glu Glu Arg Gly305 310 315 320Thr Pro Ser Gly Arg Tyr Phe Pro Phe Gly Leu Gly Gln Arg Leu Cys325 330 335Leu Gly Arg Asp Phe Ala Leu Leu Glu Gly Pro Ile Val Leu Arg Ala340 345 350Phe Phe Arg Arg Phe Arg Leu Asp Pro Leu Pro Phe Pro Arg Val Leu355 360 365Ala Gln Val Thr Leu Arg Pro Glu Gly Gly Leu Pro Ala Arg Pro Arg370 375 380Glu Glu Val Arg Ala385<210>3<211>1188<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(21)<223>His标签
<220>
<223>人工序列的描述N-末端具有His标签<220>
<221>CDS<222>(1)..(1188)<400>3atg cat cac cat cat cat cac aag cgc ctt tcc ctg agg gag gcc tgg 48Met His His His His His His Lys Arg Leu Ser Leu Arg Glu Ala Trp1 5 10 15ccc tac ctg aaa gac ctc cag caa gat ccc ctc gcc gtc ctg ctg gcg 96Pro Tyr Leu Lys Asp Leu Gln Gln Asp Pro Leu Ala Val Leu Leu Ala20 25 30tgg ggc cgg gcc cac ccc cgg ctc ttc ctt ccc ctg ccc cgc ttc ccc 144Trp Gly Arg Ala His Pro Arg Leu Phe Leu Pro Leu Pro Arg Phe Pro35 40 45ctg gcc ctg atc ttt gac ccc gag ggg gtg gag ggg gcg ctc ctc gcc 192Leu Ala Leu Ile Phe Asp Pro Glu Gly Val Glu Gly Ala Leu Leu Ala50 55 60gag ggg acc acc aag gcc acc ttc cag tac cgg gcc ctc tcc cgc ctc 240Glu Gly Thr Thr Lys Ala Thr Phe Gln Tyr Arg Ala Leu Ser Arg Leu65 70 75 80acg ggg agg ggc ctc ctc acc gac tgg ggg gaa agc tgg aag gag gcg 288Thr Gly Arg Gly Leu Leu Thr Asp Trp Gly Glu Ser Trp Lys Glu Ala85 90 95cgc aag gcc ctc aaa gac ccc ttc ctg ccg aag aac gtc cgc ggc tac 336Arg Lys Ala Leu Lys Asp Pro Phe Leu Pro Lys Asn Val Arg Gly Tyr100 105 110cgg gag gcc atg gag gag gag gcc cgg gcc ttc ttc ggg gag tgg cgg 384Arg Glu Ala Met Glu Glu Glu Ala Arg Ala Phe Phe Gly Glu Trp Arg115 120 125ggg gag gag cgg gac ctg gac cac gag atg ctc gcc ctc tcc ctg cgc 432Gly Glu Glu Arg Asp Leu Asp His Glu Met Leu Ala Leu Ser Leu Arg130 135 140
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85 90 95Arg Lys Ala Leu Lys Asp Pro Phe Leu Pro Lys Asn Val Arg Gly Tyr100 105 110Arg Glu Ala Met Glu Glu Glu Ala Arg Ala Phe Phe Gly Glu Trp Arg115 120 125Gly Glu Glu Arg Asp Leu Asp His Glu Met Leu Ala Leu Ser Leu Arg130 135 140Leu Leu Gly Arg Ala Leu Phe Gly Lys Pro Leu Ser Pro Ser Leu Ala145 150 155 160Glu His Ala Leu Lys Ala Leu Asp Arg Ile Met Ala Gln Thr Arg Ser165 170 175Pro Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ala Ala Glu Ala Arg Phe Arg Lys Asp180 185 190Arg Gly Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Glu Ala Leu Ile Val His Pro Pro195 200 205Leu Ser His Leu Pro Arg Glu Arg Ala Leu Ser Glu Ala Val Thr Leu210 215 220Leu Val Ala Gly His Glu Thr Val Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Phe225 230 235 240Leu Leu Leu Ser His Arg Pro Asp Trp Gln Lys Arg Val Ala Glu Ser245 250 255Glu Glu Ala Ala Leu Ala Ala Phe Gln Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Pro260 265 270Pro Ala Trp Ile Leu Thr Arg Arg Leu Glu Arg Pro Leu Leu Leu Gly275 280 285Glu Asp Arg Leu Pro Pro Gly Thr Thr Leu Val Leu Ser Pro Tyr Val290 295 300Thr Gln Arg Leu His Phe Pro Asp Gly Glu Ala Phe Arg Pro Glu Arg305 310 315 320
Phe Leu Glu Glu Arg Gly Thr Pro Ser Gly Arg Tyr Phe Pro Phe Gly325 330 335Leu Gly Gln Arg Leu Cys Leu Gly Arg Asp Phe Ala Leu Leu Glu Gly340 345 350Pro Ile Val Leu Arg Ala Phe Phe Arg Arg Phe Arg Leu Asp Pro Leu355 360 365Pro Phe Pro Arg Val Leu Ala Gln Val Thr Leu Arg Pro Glu Gly Gly370 375 380Leu Pro Ala Arg Pro Arg Glu Glu Val Arg Ala385 390 395<210>5<211>1188<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1168)..(1185)<223>His标签<220>
<223>人工序列的描述C-末端具有His标签<220>
<221>CDS<222>(1)..(1188)<400>5atg aag cgc ctt tcc ctg agg gag gcc tgg ccc tac ctg aaa gac ctc 48Met Lys Arg Leu Ser Leu Arg Glu Ala Trp Pro Tyr Leu Lys Asp Leu1 5 10 15cag caa gat ccc ctc gcc gtc ctg ctg gcg tgg ggc cgg gcc cac ccc 96Gln Gln Asp Pro Leu Ala Val Leu Leu Ala Trp Gly Arg Ala His Pro20 25 30cgg ctc ttc ctt ccc ctg ccc cgc ttc ccc ctg gcc ctg atc ttt gac 144
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Glu Arg Ala Leu Ser Glu Ala Val Thr Leu Leu Val Ala Gly His Glu210 215 220acg gtg gcg agc gcc ctc acc tgg tcc ttt ctc ctc ctc tcc cac cgc 720Thr Val Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Phe Leu Leu Leu Ser His Arg225 230 235 240ccg gac tgg cag aag cgg gtg gcc gag agc gag gag gcg gcc ctc gcc 768Pro Asp Trp Gln Lys Arg Val Ala Glu Ser Glu Glu Ala Ala Leu Ala245 250 255gcc ttc cag gag gcc ctg agg ctc tac ccc ccc gcc tgg atc ctc acc 816Ala Phe Gln Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Trp Ile Leu Thr260 265 270cgg agg ctg gaa agg ccc ctc ctc ctg gga gag gac cgg ctc ccc ccg 864Arg Arg Leu Glu Arg Pro Leu Leu Leu Gly Glu Asp Arg Leu Pro Pro275 280 285ggc acc acc ctg gtc ctc tcc ccc tac gtg acc cag agg ctc cac ttc 912Gly Thr Thr Leu Val Leu Ser Pro Tyr Val Thr Gln Arg Leu His Phe290 295 300ccc gat ggg gag gcc ttc cgg ccc gag cgc ttc ctg gag gaa agg ggg 960Pro Asp Gly Glu Ala Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Glu Glu Arg Gly305 310 315 320acc cct tcg ggg cgc tac ttc ccc ttt ggc ctg ggg cag agg ctc tgc 1008Thr Pro Ser Gly Arg Tyr Phe Pro Phe Gly Leu Gly Gln Arg Leu Cys325 330 335ctg ggg cgg gac ttc gcc ctc ctc gag ggc ccc atc gtc ctc agg gcc 1056Leu Gly Arg Asp Phe Ala Leu Leu Glu Gly Pro Ile Val Leu Arg Ala340 345 350ttc ttc cgc cgc ttc cgc cta gac ccc ctc ccc ttc ccc cgg gtc ctc 1104Phe Phe Arg Arg Phe Arg Leu Asp Pro Leu Pro Phe Pro Arg Val Leu355 360 365gcc cag gtc acc ctg agg ccc gaa ggc ggg ctt ccc gcg cgg cct agg 1152Ala Gln Val Thr Leu Arg Pro Glu Gly Gly Leu Pro Ala Arg Pro Arg370 375 380gag gag gtg cgg gcg cat cac cat cat cat cac tga 1188
Glu Glu Val Arg Ala His His His His His His385 390 395<210>6<21l>395<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述C-末端具有His标签<400>6Met Lys Arg Leu Ser Leu Arg Glu Ala Trp Pro Tyr Leu Lys Asp Leu1 5 10 15Gln Gln Asp Pro Leu Ala Val Leu Leu Ala Trp Gly Arg Ala His Pro20 25 30Arg Leu Phe Leu Pro Leu Pro Arg Phe Pro Leu Ala Leu Ile Phe Asp35 40 45Pro Glu Gly Val Glu Gly Ala Leu Leu Ala Glu Gly Thr Thr Lys Ala50 55 60Thr Phe Gln Tyr Arg Ala Leu Ser Arg Leu Thr Gly Arg Gly Leu Leu65 70 75 80Thr Asp Trp Gly Glu Ser Trp Lys Glu Ala Arg Lys Ala Leu Lys Asp85 90 95Pro Phe Leu Pro Lys Asn Val Arg Gly Tyr Arg Glu Ala Met Glu Glu100 105 110Glu Ala Arg Ala Phe Phe Gly Glu Trp Arg Gly Glu Glu Arg Asp Leu115 120 125Asp His Glu Met Leu Ala Leu Ser Leu Arg Leu Leu Gly Arg Ala Leu130 135 140Phe Gly Lys Pro Leu Ser Pro Ser Leu Ala Glu His Ala Leu Lys Ala145 150 155 160Leu Asp Arg Ile Met Ala Gln Thr Arg Ser Pro Leu Ala Leu Leu Asp165 170 175
Leu Ala Ala Glu Ala Arg Phe Arg Lys Asp Arg Gly Ala Leu Tyr Arg180 185 190Glu Ala Glu Ala Leu Ile Val His Pro Pro Leu Ser His Leu Pro Arg195 200 205Glu Arg Ala Leu Ser Glu Ala Val Thr Leu Leu Val Ala Gly His Glu210 215 220Thr Val Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Phe Leu Leu Leu Ser His Arg225 230 235 240Pro Asp Trp Gln Lys Arg Val Ala Glu Ser Glu Glu Ala Ala Leu Ala245 250 255Ala Phe Gln Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Trp Ile Leu Thr260 265 270Arg Arg Leu Glu Arg Pro Leu Leu Leu Gly Glu Asp Arg Leu Pro Pro275 280 285Gly Thr Thr Leu Val Leu Ser Pro Tyr Val Thr Gln Arg Leu His Phe290 295 300Pro Asp Gly Glu Ala Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Glu Glu Arg Gly305 310 315 320Thr Pro Ser Gly Arg Tyr Phe Pro Phe Gly Leu Gly Gln Arg Leu Cys325 330 335Leu Gly Arg Asp Phe Ala Leu Leu Glu Gly Pro Ile Val Leu Arg Ala340 345 350Phe Phe Arg Arg Phe Arg Leu Asp Pro Leu Pro Phe Pro Arg Val Leu355 360 365Ala Gln Val Thr Leu Arg Pro Glu Gly Gly Leu Pro Ala Arg Pro Arg370 375 380Glu Glu Val Arg Ala His His His His His His385 390 395
<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR-引物<400>7cgaagctcat atgaagcgcc tttccctgag 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR-引物<400>8gcgaattcac gcccgcacct cctccctagg 30<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR-引物<400>9cgaagctcat atgcatcacc atcatcatca caagcgcctt tc42<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR-引物
<400>10cggaattcag tgatgatgat ggtgatgcgc ccgcacctcc tc42<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR-引物<400>11ccggaattca tgaagcgcct ttccctgagg 30<210>12<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR-引物<400>12ccaatgcatt ggttctgcag tcaggcccgc acctcctccc tagg 4权利要求
1.氧化类胡萝卜素的方法，该方法包括在具有细胞色素P450单加氧酶活性的酶存在下反应类胡萝卜素，还包括分离氧化产物。
2.如权利要求1所述的方法，其中a1)可产生具有细胞色素P450单加氧酶活性的酶的重组微生物在有外源性类胡萝卜素或作为中间体形成的类胡萝卜素存在的培养基中培养；或a2)将含有类胡萝卜素的反应培养基与具细胞色素P450单加氧酶活性的酶孵育；以及b)从培养基中分离所形成的氧化产物或其次要产物。
3.如权利要求2所述的方法，其中氧化产物包含玉米黄质、隐黄素、金盏花玉红质、虾青素、叶黄素或其混合物。
4.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中氧化作用在氧存在下、培养温度至少约20℃且pH约6-9的条件下通过培养微生物而进行。
5.如权利要求4所述的方法，其中微生物能通过异源互补作用产生类胡萝卜素并且可额外表达具有细胞色素P450单加氧酶活性的酶。
6.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中将类胡萝卜素作为外源底物加入到培养基中，且氧化作用是在有氧、培养温度至少约20℃、pH约6-9时于含有底物的培养基中通过酶促反应进行，含底物的培养基中可额外包含基于底物的大约10-100倍摩尔的过量还原等同物。
7.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中细胞色素P450单加氧酶所具有的氨基酸序列包含如SEQ ID NO2所示的从氨基酸残基Pro328到Glu345的部分序列。
8.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述单加氧酶具有的氨基酸序列额外包含如SEQ ID NO2所示的从氨基酸残基Val216到Ala227的部分序列。
9.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述单加氧酶具有的氨基酸序列包含至少一种其它的部分序列，其中所述其它的部分序列选自如SEQ ID NO2所示的从氨基酸残基Met1到Phe327和从Gly346到Ala389的指定序列区域的至少10个连续氨基酸的部分序列。
10.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述单加氧酶具有的氨基酸序列基本对应于SEQ ID NO2的氨基酸序列。
11.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中使用了细菌栖热菌属来源的细胞色素P450单加氧酶。
12.如权利要求11所述的方法，其中使用了细菌嗜热栖热菌来源的细胞色素P450单加氧酶。
13.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中培养含有这样的表达构建体的重组微生物，所述表达构建体包含在调节性核苷酸序列调控下的如权利要求7-12中任意一项所述的细胞色素P450单加氧酶的编码序列。
14.如权利要求7-12中任意一项所述的细胞色素P450单加氧酶的用途或者编码其的核苷酸序列的用途，用于微生物氧化类胡萝卜素。
15.重组微生物，其能通过异源互补作用产生β-胡萝卜素并且可额外表达具有细胞色素P450单加氧酶活性的酶。
16.如权利要求15所述的方法，其中异源互补作用是用胡萝卜素形成基因进行互补。
17.如权利要求15或16中所述的微生物，其来源于埃希氏菌属的细菌。
18.如权利要求17所述的微生物，其来源于大肠杆菌，尤其是大肠杆菌JM 109。
19.如权利要求15-18中任意一项所述的微生物，其已使用这样的表达载体转化，所述表达载体包含在调节性核苷酸序列基因调控下的如权利要求7至12中任意一项所述的细胞色素P450单加氧酶的编码序列。
20.包含如权利要求7-12中任意一项所述的细胞色素P450单加氧酶编码序列的表达载体，其中所述编码序列可操作地连接有上游的强tac启动子和下游的强rrnB核糖体终止子。
全文摘要
本发明涉及使用具有细胞色素P450单加氧酶活性的酶生物转化类胡萝卜素的方法，其中所述的单加氧酶特别是来源于尤其栖热菌属的嗜热菌。
文档编号C12P23/00GK1671857SQ03817963
公开日2005年9月21日 申请日期2003年7月25日 优先权日2002年7月26日
发明者M·马图舍克, B·豪尔, R·施密德, I·M·考夫曼, F·布拉斯克, C·施密特-丹纳特 申请人:巴斯福股份公司