用于生产转质体基因组被子植物的载体的制作方法

专利名称：用于生产转质体基因组被子植物的载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更特别地涉及植物遗传工程。具体说，提供了一种用于在被子植物质体(plastids)中有效导入和表达外源基因的DNA构建体。公开了这些遗传构建体用于高效地得到转质体基因组(transplastomic)植物的用途，其中转质体基因组植物表达异源蛋白，特别是疫苗抗原和有药学用途的蛋白。
背景技术：
植物遗传工程已经表明是一项对基础研究和新的生物技术产品的商业化生产十分有生产价值的技术(Hammond J.Curr.Top.Microbiol.Immunol 1999，2401-19；Simoens C.和Van Montagu M.ReproductionUpdate 1995，1523-542)。
直到数年前，通过直接转化方法或农杆菌介导的转化方法生产转基因植物的焦点是嵌合基因如何稳定地插入植物细胞的细胞核(见Hansen G.和Chilton M.D.Curr.Top.Microbiol.Immunol.1999，24021-57；Newell C.A.Mol.Biotechnol 2000，1653-65)。然而，目前核转化的一些缺陷只能通过选择新基因转入植物细胞器的方法来克服(见Bogorad L.Trends in Biotechnology 2000，18257-263；Heifetz P.B.Biochimie 2000，82655-666)。特别地，外源基因在质体中表达同核表达相比，具有下面的优点1)由于质体基因组在每个细胞中的高拷贝数，转入基因在质体中的表达水平比细胞核中的高10到50倍；2)新基因通过同源重组的插入是位点专一的，避免了位置效应，基因沉默和其它的影响转入植物细胞核中基因表达的不良现象；3)多顺反子基因表达是可能的，这对于试图制造新陈代谢途径或改变多基因特征的工程是非常需要的；4)质体的遗传信息主要来自母本，减少了嵌合基因由于通过花粉扩散到环境中而对自然界可能造成损坏的危险性。此外，质体中基因的表达提供了在新的能够提供更加稳定和/或更加简易纯化方法的微环境中积累异源蛋白的可能性。
已经报道了将基因转入藻类和高等植物的质体中的不同方法。具体说，常见的是用DNA包裹的加速微粒子进行轰击(Boynton J.E；GilhamE.H；Hosler J.P等Science 1988，2401534-1538；Daniell H；Vivekananda J；Nielsen B等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，8788-92；Svab Z；Hajdukiewicz P；Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，878526-8530)，少数则使用PEG对植物的原生质体进行转化(O′Neill C；Horvath G.V；Horvath E等Plant J 1993，3729-738；Golds T；Maliga P；Koop H-U.Biotechnology 1993，1195-97)，还有使用微注射的方法(Knoblauch M；Hibberd J.M；Gray J.C；van BelA.J.E.Nature Biotechnol 1999，17906-909)。
通过使用这些细胞器中天然存在的同源重组的有效机制，已经将转化的DNA序列稳定地插入质体基因组中(Blowers A.D；Bogorad L；Shark K.B.；Sanford J.C.Plant Cell 1989，1123-132；Staub J.M.和Maliga P.Plant Cell 1992，439-45；Kavanagh T.A；Thanh N.D；Lao N.T等Genetics 1999，1521111-1122)。需要着重强调的是DNA同源区域越大，重组的频率就会越高，当同源区域小于137bp时就可忽略不计了(Zoubenko O.V；Allison L.A；Svab Z；Maliga P.NucleicAcid Res 1994，223819-3824)。
许多区域被认为是用于在植物质体中插入嵌合序列的合适重组位点rbcL-accD，psbE-petA，trnV-16SrRNA操纵子，psbA-trnH，trnA-trnI，23SrRNA区等(Svab Z.和Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917；Zoubenko O.V；Allison L.A；Svab Z；Maliga P.Nucleic Acid Res 1994，223819-3824；Daniell H；DattaR；Varma S等Nature Biotechnol 1998，16345-348；US专利号5,877,402；WO9910513)。尽管这些区域中的一些被认为用于在不同植物品种的质体基因组中整合外源DNA序列是“通用的”，然而，由于以下一种或多种原因，它们普遍存在限制1)它们的序列和/或结构在不同的植物品种的质体基因组中不是高度保守的；2)它们的高同源区非常短，后面跟随或者间隔了内含子，或其它较低保守的区域(这降低了同源重组的频率以及因此的转基因质体(转质体基因组(transplastomics))植物的获得量)；3)它们有时位于质体的操纵子中，可是已知这些结构体内部的改变会影响每个操纵子基因的野生转录水平或多顺反子的正确的加工(Ohme M；Kamogashira T；Shinozaki K；Sugiura M.Nucleic Acid Res 1985，131045-1056)，这会给质体代谢造成不良后果。事实上，使用含有上述提到的区域作为重组位点的载体，在同期发表的刊物中，只报道了生产来自烟草(Svab Z.和Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917)，马铃薯(Sidorov V.A；Kasten D；Pang S.Z等Plant J 1999，19209-216)和西红柿(Ruf S；Hermann M；Berger I.J等Nature Biotechnol 2001，19870-875)的转质体基因组植物不是偶然现象，上述茄科种(Solanaceus species)植物在进化和DNA一级结构水平上非常接近。此外，使用这些重组区域的载体显示出同质的转质体基因组植物(所有的质体基因组都被均匀转化的植物)的产率低，可能是因为这些载体包括使用了大于174bp的质体来源的终止子区域和启动子(Iamtham S.和Day A.Nature Biotechnol2000，181172-1176)，这样由于载体元件和质体基因组同源区域间的重组产生了非活力质体，导致许多转化失败(Svab Z.和Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917；Kanevski I；Maliga P；Rhoades D.F；Gutteridge S.Plant Physiol 1999，119133-141)。
被子植物之间，结构和核苷酸序列上更加普遍保守的质体基因组区域是由分开转录的rbcL和atpB操纵子组成。事实上，这些含有大于1500bp的DNA片段的基因，在属于不同纲(双子叶和单子叶)的植物的质体中有高于85％的同源性，而且在分析的同纲植物中核苷酸的同源性大于91％(见表1)。相反，这些操纵子间的基因间区域在双子叶和单子叶植物的质体基因组中则表现了很低的核苷酸同源性(低于50％)。
表1来源于不同种和纲的植物的rbcL和atpB基因的核苷酸序列同源性
核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)的大亚基由质体基因rbcL编码。试验表明rbcL亚基的羧基末端区域形成了这个蛋白的8号α-螺旋，而且此区域涉及与由核基因rbcS编码酶的小亚基的相互作用(Knight S；Andersson I；Branden C-I.J.Mol.Biol.1990，215113-160；Curmi P.M.G；Cascio D；Sweet R.M等J.Biol.Chem.1992，26716980-16989)。从这些和其它数据(Kanevski I；Maliga P；Rhoades D.F；Gutteridge S.Plant Physiol.1999，119133-141)开始，鉴于不同植物品种的质体rbcL蛋白质的C末端区域间的低度保守性，人们提出假设rbcL的α-螺旋8规定了Rubisco酶亚基间相互作用的种特异性。已经表明可能由于一个位于rbcL启动子(从转录起始点+1位至+26位)转录起始处附近的环状结构，使产生的信使RNA变得稳定，这种方式弥补了启动子在黑暗期转录活性的下降(Shiina T；Allison L；Maliga P.The Plant Cell 1998，101713-1722)。同样地，位于启动子结构区域附近或里面的各种序列片段与叶绿体DNA结合因子(CDF)的序列相似，可能在rbcL启动子的转录调节中起到重要作用。
已经报道了atpB-atpE操纵子(编码叶绿体ATP-合成酶的β亚基和ε亚基)转录/翻译的一些标志性特征(Shinozaki K；Deno H；Kato A；Sugiura M.Gene 1983，24147-155；Gatenby A.A；Rothstein S.；Nomura M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，864066-4070；KapoorS；Wakasugi T；Deno H；Sugiura M.Curr.Genet.1994，26263-268)。这两个基因是重叠的，而且特别引人注意的是atpE的翻译特征，因为它们基于开放阅读框架移码，和atpB编码序列内的保守区域含有一个atpE的可能启动子(核苷酸序列+1027位至+1064位，编码水稻，烟草等的atpB蛋白)。这个启动子在体内的功能还没有得到证实，但不可忽略的是它可能在atpE表达的转录调节中扮演一定角色。
atpB-rbcL基因间区域作为质体中外源基因插入靶点的用途仅在欧洲专利No.0251654由Cannon M.C.和Cannon F.C.描述过。然而，这个专利提出使用细菌转座子作为把外源基因引入两个分散的转录操纵子之间的基因间区域的载体分子。Cannon M.C.和Cannon F.C.没有成功得到转质体基因组植物不是偶然的，因为转座子插入基因间区域不仅防碍了atpB和rbcL启动子之间已报道的相互作用(Hanley-Bowdoin L.和Chua N-H.Mol.Gen.Genet.1989，215217-224)，而且(例如，对玉米和水稻来说)中断了从位于rbcL基因5’非翻译区的NEP启动子(核聚合酶依赖启动子)开始的atpB基因的转录(Welhe A.和BrnerT.Trends in Plant Science 1999，4169-170)。显然，精确的转录和由这些操纵子编码的产物的表达调节对质体的正确功能和活力来说，是绝对需要的。此外，Cannon M.C.和Cannon F.C.所述的表达载体不含有转录终止子，它是质体中基因正确表达必不可缺的元件(Stern D.B.和Kindle K.L.Mol.Cell Biol.1993，132277-2285；Chen H.C.和Stern D.B.Mol Cell Biol.199l，114380-4388)。
除了可能细菌来源的转录终止区域之外(Chen L.J.和Orozco E.M.Jr.Nucleic Acid Res.1988，168411-8431)，还必须将转入质体的基因置于该细胞器中的功能启动子的控制之下。在最常用的用于转基因质体中基因表达的启动子中，最强的启动子是16S rRNA的Prrn(SvabZ.y Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917)和PsbA(Daniell H.Methods in Molecular Biology 1997，62463-489)。Prrn启动子是组成型的，然而PsbA启动子产生的RNA转录和翻译是受光诱导的，并且依赖5’非翻译区。删除了psbA基因的5’非翻译区使得它的mRNA表达变成光非依赖型，尽管这会影响翻译(Staub J.M.y Maliga P.Plant J.1994，6547-553；Eibi C；Zou Z；Beck A等Plant J.1999，19333-345)。这些启动子有与细菌启动子同源的-35和-10的一致序列，并且它们的转录依赖质体基因组(PEP)编码的聚合酶(Hess W.和Brner T.Int.Rev.Cytol.1999，1901-59)。
其它的质体和细菌的转录/翻译的相似性也得到证实，多顺反子mRNA可以在烟草质体中表达和有效翻译(Staub J.M.和Maliga P.PlantJ.1995，7845-848)；含有SD类似序列的核糖体结合位点(RBS)在叶绿体中是有功能的(Stern D.B；Higgs D.C；Yang J.Trends Plant Sci.1997，2308-315)。
为了方便筛选转质体基因组植物，在其它替代方案中，已经提出使用阳性筛选标记，比如卡那霉素(Daniell H.Methods in MolecularBiology 1997，62463-489)，或最常用的壮观霉素(Svab Z；Hajdukiewicz P；Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，878526-8530；Svab Z.和Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917)；为了此目的，带来对筛选试剂有抗性的基因被克隆到转化载体中合适的控制信号下，以便在质体中正确表达。
为了保护自然界，人们设计了“清除”技术允许在释放到环境中时，从植物中除去编码筛选标记的基因。以下两项技术成功地应用到转质体基因组的生产中两个载体共转化，随后分离，并且除去携带筛选标记的个体(Fisher N；Stampacchia O；Redding K；Rochaix J.D.Mol.Gen.Genet.1996，251373-380)，和将标记基因插入表达盒中的两个同向重复序列间，在随后的使用非选择性培养基的培养周期中，允许通过同源重组除去这些基因(Fisher N；Stampacchia O；Redding K；RochaixJ.D.Mol.Gen.Genet.1996，251373-380；Iamtham S.和Day A.Nature Biotechnol.2000，181172-1176)。
发明详述本发明提供的用于在被子植物质体中稳定转化和表达异源基因的载体含有一些独有的特点1)不使用转座子向质体基因组中插入DNA片段；2)atpB和rbcL边界区域属于不同纲的被子植物，形成了人工基因间区域；3)人工基因间区域内中转录非活性的多克隆位点允许插入一个或多个异源基因，而不会影响atpB和rbcL基因正确的转录，mRNA加工和表达；4)载体的设计允许当核糖体结合位点位于编码蛋白的序列之前时，转入基因的表达不一定需要携带启动子区域和终止子区域(这有助于减少不良重组事件，而且节省质体新陈代谢的资源，允许导入的外源DNA片段有更大的稳定性和增加同质体植物的产率)；5)本发明提出的边界序列的结构和序列保证了载体的通用性。此外，这里提供的载体构成了一个用于向农作物转入基因时的“清除”工具，这是因为设计了一旦获得同质的转质体基因组植物后，通过同向重复序列间的同源重组允许除去筛选标记。
带有人工基因间区域的atpB-rbcL区域的设计和扩展构成了本发明目的的基础，因为它允许我们以有效和稳定的方式向任何种的被子植物的质体基因组中插入基因和操纵子，而不会引起功能的改变。
对于设计人工基因间区域来说，必须要解决的问题是在该区域导入外源基因将不会影响rbcL和atpB启动子的相互作用和它们的野生转录水平。
另一方面，还必须考虑由atpB和rbcL基因产物作亚基组成的酶要执行质体和植物存活的重要功能。这种情况限制了选择作为重组边界的片段的长度，因为这些蛋白的某些区域会参与蛋白-蛋白的相互作用并且可能决定这些酶的不同亚基间的识别特异性以及它们的正确折叠和功能是合理的。
为了在不同种植物质体中使用atpB-rbcL区域作为外源基因插入的重组位点，考虑生产杂种蛋白是重要的，因此上面所述内容值得引起特别注意。以这种方式，为了避免干扰杂种Rubisco的正确折叠和功能，一定要在发生重组时保持编码α螺旋8的rbcL基因区域不变。因此，在设计本发明的目的载体时，一定要使含有部分可翻译的rbcL基因序列(更多的称作rbcL-边界)的，通过同源重组用于质体转化的DNA片段只应延伸到α螺旋8的N-末端区域，特别是只到被子植物rbcL蛋白该部分中高度保守的色氨酸(Trp-411)位点。
关于atpB基因编码区域，在比较来源不同种植物质体的蛋白质序列时，没有发现任何有显著变异的区域。然而，在选择含有部分可翻译的atpB基因序列(更多的称作atpB-边界)，作为通过同源重组使外源基因整合进质体的DNA片段时，要考虑atpB-atpE操纵子的转录/翻译特征。
为了设计允许新基因插入质体而不会影响atpB和rbcL的转录速率的人工基因间区域，我们利用了在比较来源不同种植物质体的序列时，操纵子间在核苷酸水平表现低同源性的区域。
在本发明目的遗传构建体中，rbcL-边界应包括一个带有基因的部分和整个5’调控区的DNA片段。这个片段含有1)结合有CDF序列的rbcL基因的PEP启动子(依赖质体编码的聚合酶)；2)rbcL基因的5’非翻译区，和3)截至N末端α螺旋8对应区域的编码rbcL蛋白的序列。因而，本发明目的载体中rbcL-边界包括一个DNA片段，从烟草中编码此蛋白的核苷酸序列的-291位延伸至始于该基因翻译起始密码子的+1233位(Trp-411所在的氨基酸序列位置)。需要指出的是当试图克隆rbcL-边界时，我们发现rbcL基因从自身启动子开始的表达对大肠杆菌是有毒的。因此，需要用“理想”lac操纵子来置换该基因5’非翻译区的少量保守片段(Simons A；Tils D；von Wilcken-Bergmann B；Muller-Hill B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984，811624-1628)，并且将这个嵌和边界克隆到一个低拷贝数的质粒载体(pBR322)中，在1acIq大肠杆菌例如XL-1blue，JM 101等中繁殖。
在本发明目的遗传构建体中，作为atpB-边界的DNA片段一定要包括1)相邻的rbcL启动子和转录起始位点附近的稳定该启动子产生的mRNA的茎-环状序列；2)包括其NEP启动子的atpB基因的启动子；3)atpB基因的5’非翻译区和4)截至基因终止密码子前300bp的atpB编码序列。以这种方式，设计本发明的目的载体时，atpB边界从水稻中编码蛋白的核苷酸序列的-654位延伸至始于该基因翻译起始密码子的+1211位。
在atpB-边界中，rbcL启动子与atpB基因相邻可使目的基因以与atpB-atpE操纵子转录相反的方向稳定地转录和表达。便于用户的是，可能克隆含有一个或多个受质体中功能启动子控制的外源基因的遗传表达盒到rbcL启动子下，这样这些基因的表达将会由于两个串联的启动子的转录而得到增强。
前面所述的边界区域引入质粒载体内在大肠杆菌中维持和增殖，被含有用于插入将进一步转入质体基因组的异源DNA的多克隆位点(MCS1，见图1-A)的DNA片段隔开。按照这个结构，atpB基因和rbcL基因将分开转录，由于rbcL启动子区域的复制，获得的两个同向重复DNA片段以含有多克隆位点的区域为边界。然而，由于来自不同种被子植物质体基因组之间，基因间区域在核苷酸水平的低同源性，预见不到我们的构建体中重组事件，因为只有90bp的小片段有高度的同源性。
前面所述构建体是本发明目的载体的基础，其中编码允许筛选阳性转化细胞的筛选标记的基因将引入MCS1(与rbcL-边界同向，始于atpB-边界的rbcL启动子)，以一旦得到同质的转质体基因组植物后，能够通过同源重组除去标记基因的同向重复DNA序列为边界。标记基因或引入MCS1的其它基因的转录将被位于与rbcL-边界的5’末端相邻的细菌终止子终止(优选大肠杆菌的rrnB操纵子的rrnBT1T2双向终止子(Brosius J；Dull T.J；Sleeter D.D；Noller H.F.J.Mol.Biol.1981，148107-127)，因此避免了插入基因的转录干扰rbcL-边界启动子的正常功能。
以这种方式，图1-B显示了本发明目的载体的基本结构，其中目的基因插入atpB-边界的rbcL启动子下，形成单顺反子或多顺反子的转录单元(图1-C)，或者其它质体功能启动子下，允许获得例如，在两个串联的启动子后的多顺反子单元(图1-D)，或者在启动子区域的不同组合之后的两个独立的转录单元(图1-E和图1-F)。
为了便于筛选转质体基因组植物，我们决定使用潮霉素作为选择标记，尽管这种抗生素对象烟草这样的双子叶植物是极端有毒的，因此应该小心使用，然而它作为获得带有遗传修饰质体的单子叶植物的筛选试剂会更加有效。用此种方式，含有适当SD序列，在克雷白氏杆菌(Klebsiella)(Critz L.and Dvies J.Gene 1983，25179-188)中编码抗潮霉素B的hgh基因被克隆到MCS1中，置于atpB-边界的rbcL启动子下(图1-B)。
为了达到提供生态学工具的目的，本发明目的载体中的标记基因被转入两个同向重复DNA序列的边界处，当同质的(homoplasmic)转质体基因组植物已经得到后，一旦从培养基中除去筛选试剂，这两个同向重复DNA序列通过同源重组将其除去(图1-B)。用在构建体中的重复序列来自编码噬菌体T7的s10蛋白的DNA区域(Dunn J.J.和StudierF.W.J.Mol.Biol.1983，166477-535)。这些载体有只除去标记基因的特性，这样剩下的操纵子调控序列将维持不变(图1-C，1-D，1-E和1-F)；因此，与标记基因转录融合的任何基因将不会改变它们的表达，以这种方式节约了载体的资源。本发明目的载体的结构是它区别于其它所述系统中质体遗传转化载体的另一个优点。
显然，带来对抗生素如壮观霉素(Chinault A.C；Blaskeley V.A；Roessler E；Willis D.G等Plasmid 1986，15119-131)或磺胺(Guerineau F.和Mullineaux P.Nucleic Acid Res 1989，174370)有抗性的其它基因，也能用于筛选转质体基因组植物。同样地，带来对杀虫剂如草甘膦(glyfosate)(Shah D.M；Horsch R.B；Klee H.J；Kishore G.M等.Science 1986，233478-481；Comai L；Facciotti D；Hiatt W.R；Thompson G等Nature 317741-744)，草铵膦(gluphosinate)(DeBlock M；Botterman J；Vandewiele M；Dockx J等EMBO Journal 1987，62513-2518)，磺草灵(asulam)(GuerineauF；Brooks L；Meadows J；Lucy A等Plant Mol Biol 1990，15127-136)，溴苯腈(bromoxinil)(Stalker D.M.等McBride K.E.J.Bacteriol 1987，169955-960)，磺酰脲和咪唑啉酮(LaRossa R.A和Smulky D.R.J.Bacteriol 1984，160391-394)等等，有抗性的基因也可被克隆到人工基因间区域并作为筛选标记，其优点是杀虫剂耐性是农业需要的特征。
本领域技术人员和熟知遗传工程的人，根据这里所述内容，显然可以使用具有所述全部或部分特征的atpB和rbcL区域的任何组合，作为向质体基因组整合基因的边界区域，只要这些区域来自不同纲(单子叶或多子叶)的被子植物的质体。同样地，多个基因，筛选标记以及顺反子和操纵子的组合都可克隆到本发明目的载体的人工基因区域的MCS1(图1-A)中，为了在任何被子植物质体中稳定地插入和表达它们。
微生物的保藏质粒载体pVTPA-HB-aadA，pVTPA-f-GUS和pVIEP根据布达佩斯条约保藏在比利时微生物协调保藏中心BCCM，LMBP中心，编号分别为LMBP4635，LMBP4636和LMBP4637，保藏日为2002年9月24日。


图1.A，本发明目的载体构建的基本结构，图中表明含有多克隆位点(MCS1)的区域受到来源于不同纲(单子叶或双子叶)的被子植物的 atpB边界和 rbcL边界的限制。
B，本发明目的载体的一般结构，(rbcL基因的rbcLpr-启动子，atpB基因的atpBpr-启动子，非质体来源的转录终止子，筛选标记基因，通过同源重组允许除去标记基因的R1，R2-同向重复序列)。
C，D，E，F，本发明目的载体的变体，图中显示了表达一个或多个作为单顺反子单元(E，F)，二顺反子(C，E，F)或三顺反子(D)的目的基因(基因，基因1，基因2)的可能性，它们处于一个(C，E，F)或多个(D，F)质体功能启动子(Pr，Pr1，Pr2)的控制下。
图2用于被子植物质体转化的载体pVTPA-f的图谱。
图3用于被子植物质体转化的载体pVTPA的图谱。
图4质体中基因表达的中间载体pVIEP(S/D-Shine-Dalgarno序列)的图。
图510μg蔗糖梯度纯化的叶绿体DNA用PstI消化与32P标记的rbcL基因5′片段作为探针的Southern印迹。道1非转化植物；道2-6转化植物(可以看出所有植物都是同质的)；道7和道8体外组培最后一个周期中，在缺乏筛选试剂的条件下生长的转化植物(道7中注明标记基因还没有完全除去)。
图6Western印迹显示了使用本发明目的转化载体，用于在叶绿体中表达乙肝表面抗原每道总共使用10μg的叶子蛋白。道1非转化植物；道2-5表达HbsAg的转质体基因组植物(可以看见乙肝病毒抗体在预期的25kDa分子量处检测到信号)。
图7Western印迹显示了使用本发明目的转化载体，用于在质体中表达单克隆抗体的重链和轻链每道总共使用10μg叶子蛋白。道1非转化植物；道2-5表达重组抗体CB-Hep.1的转质体基因组植物(可以检测到免疫球蛋白重链(50kDa)和轻链(25kDa)对应的信号)。
实施例实施例1.用于在被子植物质体中稳定地转化和表达异源基因的载体的构建。
a)rbcL-边界的获得通过使用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所述的寡核苷酸，利用聚合酶链反应(PCR)扩增1524bp的与编码烟草的rbcL蛋白的基因相对应的DNA片段，得到rbcL-边界片段。用来自N.tabacum var.SR1.叶子的纯化的叶绿体DNA作PCR。扩增的DNA片段克隆到用SpeI(Klenow)/EcoRV限制性内切酶预先消化的pBScript SK载体(Stratagene，美国)，以生产pBSrbcL克隆。一些阳性克隆被完全测序，结果表明尽管在进行PCR时使用了高保真的DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶，Promega，USA)，所有的克隆都出现了突变。这个事实和本发明不相关的其它证据，表明烟草的rbcL蛋白当从自身启动子开始表达时，对大肠杆菌是有毒的。因此，我们决定用含有一个“理想”lac操纵子的允许在lacI+大肠杆菌中克隆边界片段的DNA的片段来置换rbcL基因的5’非翻译区的低保守DNA片段。为了完成突变，用NcoI和EcoRI限制性内切酶分别在-162位和-29位消化pBSrbcL13克隆子(在克隆的rbcL基因的SacII/BamHI片段中含有一个突变)，然后用带有在rbcL基因(SEQ ID NO3)的-124位至-97位区域插入了“理想”lac操纵子的合成DNA片段来置换该片段。
一旦1ac操纵子插入pBSrbcL13克隆(现在称为pBSrbcL131acOp)，用XbaI(Klenow)/SalI限制性内切酶切除rbcL片段，并克隆到预先用SalI和EcoRV限制性内切酶(修复的XbaI位点)消化的低拷贝载体pBR322(New England Biolabs，美国)中，获得质粒pBR322rbcL131acOp，其中rbcL基因按照SalI/XbaI方向转录。
然后，用来自另一个测序的pBSrbcL克隆的非突变的SacII/BamHI片段置换pBR322rbcL131acOp的SacII/BamHI片段，我们除去了rbcL13克隆子中存在的突变。用这种方式得到了含有rbcL-边界(SEQ ID NO4)的质粒pBR322rbcLOK。
b)atpB-边界的获得通过使用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所述的寡核苷酸，利用PCR扩增1754bp的与编码水稻的atpB蛋白的基因相对应的DNA片段，获得atpB-边界片段。用来自Oriza sativa var.IAC-18叶绿体纯化的DNA作PCR。扩增的DNA片段克隆到预先用HincII限制性内切酶(HincII(SalI)限制酶切位点在克隆片段的5’区域得到修复)消化的pBScript SK载体(Stratagene，美国)，用来生产pBSatpB克隆。一些阳性克隆被测序，然后选择完全正确的克隆。
正确的pBSatpB克隆在片段(原始序列得到修复，SalI位点在克隆后丢失)的5’端用HindIII和SalI限制性内切酶消化，用于克隆带有附加限制酶切位点和含有NEP启动子(SEQ ID NO7)的水稻atpB基因的5’非翻译区的一部分的合成DNA片段，得到质粒pBSatpBcmoplete。在该质粒中，atpB基因按照从HindIII到XhoI的方向转录。构建的atpB-边界的核苷酸序列如SEQ ID NO8所示。
c)带有重复边界的筛选盒的获得由质粒pBSBar开始得到1kb的含有编码潮霉素抗性(hgh)的基因的DNA片段，是通过使用SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所述的寡核苷酸进行PCR扩增，在基因翻译起始处前引入7bp的SD序列和便于该片段操作的限制酶切位点。用KpnI限制性内切酶消化扩增的DNA片段，然后克隆到KpnI/SmaI-消化的pUC19载体(克隆后SmaI位点保留)，产生质粒pUC19Hyg。随后，获得的质粒用HindIII和SmaI限制性内切酶消化，它被引入含有用于进一步基因操作(SEQ ID NO11)的限制酶切位点的合成DNA片段。得到的质粒载体称为pUC19-接头-Hyg。
一旦获得同质的转质体基因组植物，用于通过同源重组除去标记基因的重复DNA片段是由编码存在于pET3xb表达载体(Novagen，美国)中的噬菌体T7的s10蛋白的DNA片段得到的。pET3xb载体首先用BamHI和NdeI消化，得到的780bpDNA片段再用TaqI(Klenow)和KpnI消化，得到的约310bp的DNA片段克隆到SmaI/KpnI-消化的pUC19载体中，用于获得质粒pUC-间隔区。
来自pUC19-间隔区310bp的s10基因片段以XbaI(Klenow)/KpnI片段，克隆到先用EcoRI(Klenow)/KpnI消化的质粒pUC19-接头-Hyg中hgh基因的下游，产生了pUC19-接头-Hyg-间隔区。
第二个310bp的重复片段以EcoRI(Klenow)/BamHI片段，克隆到先用SmaI和BglII限制性内切酶消化的质粒pUC19-接头-Hyg-间隔区中hgh基因的上游，用来生产质粒pUC-接头-间隔区-Hyg-间隔区。
用BspHI消化，绿豆核酸酶处理和HindIII消化pTrcHisB表达载体(Invitrogen，美国)得到来自大肠杆菌的双向终止子rrnBT1T2，用于将470bp的终止子片段克隆到先用HindIII和SmaI限制性内切酶消化的pBScript SK载体中，得到质粒pBS-rrnBT1T2。
最后，包含rrnBT1T2终止子的DNA片段作为HindIII(Klenow)/XbaI片段，克隆到先用BamHI(Klenow)/XbaI消化的质粒pUC19-接头-间隔区-Hyg-间隔区中与hgh基因相连的间隔区片段的下游，产生了质粒pUC-接头-间隔区-Hyg-间隔区-rrnBT1T2。从前面构建体中切下含有从接头到rrnBT1T2的表达盒以HindIII/XbaI片段，克隆到HindIII/XbaI-消化的pBScript SK载体以获得带有重复边界的筛选表达盒的质粒pUC-接头-间隔区-Hyg-间隔区-rrnBT1T2(SEQ ID NO12)。
d)用于在被子植物的质体中稳定地转化和表达异源基因的载体，pVTPA-f的构建本发明提出的用于在被子植物的质体中稳定地转化和表达异源基因的载体的装配如下含有接头-间隔区-Hyg-间隔区-rrnBT1T2的筛选盒以NotI(Klenow)/SalI片段克隆到先用EcoRI(Klenow)/SalI消化的载体pBR322中用于生产质粒pBR322-sp-Hyg-sp-T。随后，来自质粒pBR332rbcLOK的rbcL-边界以HindIII(Klenow)/XbaI片段克隆到用BamHI(Klenow)/XbaI消化的质粒pBR322-sp-Hyg-sp-T以得到构建体pBR-sp-Hyg-sp-T-rbcL。最后，来自pBSatpBcomplete质粒的atpB-边界以HindIII/XhoI片段克隆到用HindIII和SalI消化的质粒pBR-sp-Hyg-sp-T-rbcL中。以这种方法获得了具有图1-B所述结构的载体，称为pVTPA-f(见图2的结构图)。SEQ ID NO13显示了位于pBR322运送载体的+651位(SalI位点)和+1位(EcoRI位点)之间的来自pVTPA-f的DNA片段的核苷酸序列。
pVTPA-f载体的特征允许在被子植物质体稳定地转化，并且获得表达克隆到该载体的基因编码的重组蛋白的转质体基因组植物，只要这些基因在离它们的翻译起始密码子的合适距离处含有核糖体结合位点。
e)载体pVTPA允许几个基因作为独立转录单元在质体中插入和表达的载体pVTPA-f的变体通过在pVTPA-f载体的克隆位点中插入能够增强质体中转录以及转录终止的DNA序列获得了允许几个基因作为独立转录单元在质体中插入和表达的pVTPA-f的变体(见图1-E)。为了此目的，例如包含质体核糖体RNA(Prrn)(SEQ ID NO14)的16S亚基的启动子和便于基因操作的克隆位点的合成DNA片段，被插入载体pBluescript SK的EcoRI和SmaI限制酶切位点之间，用于获得质粒pBSPrnn。随后，包含Prrn启动子的DNA片段以HindIII/MluI片段克隆到质粒pVTPA-f中，产生了构建体pVTPA(见图3和SEQ ID NO15)。
实施例2异源单顺反子单元在烟草转质体基因组植物中的表达(pVTPA-f-GUS)。
为了使用载体pVTPA-f在转质体基因组中表达异源基因，该基因必须携带一个位于翻译起始密码子上游约5至15bp处的核糖体结合位点(RBS)。为此原因，和达到便于在我们的载体中克隆外源基因的目的，设计了允许在此插入目的基因的中间载体(pVIEP)，然后用限制性酶消化切下它们，克隆到载体pVTPA-f或pVTPA中。向pVIEP载体中克隆基因引入一个RBS，同时允许增加转录终止子或附加的启动子用于在本发明目的载体中正确的表达。
为了构建载体pVIEP，包含带有为了避免光对该基因的翻译控制而删除了部分5’非翻译区(始于翻译起始子的-68位和-25位之间)的烟草psbA基因的启动子的DNA片段(PpsbA*，SEQ ID NO16)，以EcoRI/SmaI片段克隆到载体pBluescript SK中，以获得质粒pBSPpsbA*。随后，含有微顺反子(mini-cistron)(用于稳定mRNA和帮助翻译)的合成DNA片段，一个核糖体结合位点(RBS)和多克隆位点(SEQ ID NO17)，以NdeI/SacI片段克隆到质粒pBSPpsbA*中PpsbA*启动子的下游，产生了质粒pBSPpsbA*-接头。
最后，通过在BamHI/StuI-消化的质粒pBSPpsbA*-接头中，插入由BamHI/EcoRV消化质粒pET3c(Novagen，美国)得到的噬菌体T7(Tφ)转录终止子，得到了pVIEP载体。序列SEQ ID NO18对应于pVIEP载体(见图4)中KpnI和第二个SalI位点之间的一级结构。通过用EcoRI(绿豆核酸酶)/SnaBI消化pVIEP得到了缺少PpsbA*启动子和微顺反子的中间载体pVIEP的改型体(version)，然后再连接用于生产构建体pVIEP-2。
为了在转质体基因组植物中表达异源单顺反子单元，由NcoI/SmaI消化质粒pDMC200(CAMBIA)得到uidA基因(gus)，并连接到NcoI/SmaI-消化的pVIEP-2载体以获得质粒pVIEP-GUS。包含由质粒pVIEP-GUS获得的RBS融合的uidA基因的DNA片段，以HindIII/SmaI片段克隆到MluI(Klenow)/HindIII-消化的质体转化载体pVTPA-f中水稻rbcL启动子的下游，得到构建体pVTPA-f-GUS(SEQ ID NO19)。在转化阶段筛选维持期时，pVTPA-f-GUS载体转化的转质体基因组植物将表达处于rbcL启动子的转录控制下，作为双-顺反子单元的基因hgh和uidA；然而，一旦在非选择条件下培养转质体基因组植物时，将通过同源重组除去标记基因，而uidA基因的表达将由单顺反子表达单元继续维持。通过按照如下方法获得的烟草转质体基因组植物说明该构建体的功能体外生长的4-6周龄植物的烟草(var.SR1)叶子远轴朝上地放置在补加了0.4M甘露醇(manitol)的诱芽培养基上(SIMS盐和维生素(Murashige T.，Skoog F.Physiol.Plant.1962，15493-497)，BAP1mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖25g/L，植物凝胶(phytagel)4g/L，pH5.7)，用于2-4小时的渗透性预处理。被DNA包裹的0.6μm的金粒子(BioRad)用于如发表所述的轰击(Russell D.R.，Wallace K.M.，Bathe J.H.等Plant Cell Rep.1993，12165-169)。使用1100帕斯卡(psi)压力的PDS-1000/He biolistic基因枪(Biorad)执行转化，射程是6cm，每个叶子样品一枪。被轰击的叶子在等渗培养基中维持14-16小时，然后在SI培养基中放置2天。随后，将叶子切成小段(3mm×3mm)，远轴朝下地转移到含有5mg/L潮霉素B(Duchefa，荷兰)的SI培养基上。5-8周培养后，出现了抗性绿芽和愈伤组织；绿色的愈伤组织和芽被转移到使用加大浓度的潮霉素B(10mg/L和15mg/L)的相同筛选培养基上用于第2次和第3次筛选周期。最后，抗性芽在添加了15mg/L潮霉素B的MS培养基(MS盐和维生素，蔗糖30g/L，植物凝胶4g/L，pH5.8)上生根以获得植株。所有培养阶段使用16小时光照和8小时黑暗的制度。
根据Jefferson(Jefferson R.A.Plant Mol.Biol.Rep.1987，5387-405)的使用X-gluc的组织化学分析方法，检测了一些抗潮霉素B的克隆的GUS活性。表2显示了3次转化试验和它们对照物的结果。
表2.使用构建体pVTPA-f-GUS得到转质体基因组植物

此外，用PstI限制性内切酶消化蔗糖梯度纯化的叶绿体DNA，并使用标记的rbcL基因片段作为探针的Sowthern印迹(Sambrook J.，Fritsch E.F.，Maniatis T.1989.分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社)表明，在一些随机选择的克隆中嵌和DNA片段整合到叶绿体基因组中(图5)。所有检测的阳性克隆产生了约6.8kb的预期带，而阴性对照(非转化植物)产生了21.5kb的预期带。当一些转质体基因组克隆在非筛选培养基上繁殖时，在Southern印迹中观察到这些克隆产生了5.5kb的杂交带，这证实了通过位于基因边界的同向重复序列之间的同源重组消除了标记基因(hgh)。
一些生根的转质体基因组克隆被转移到温室中通过自花传粉获得种子。收获的种子在MS培养基和补加了15mg/L潮霉素B的MS培养基中发芽，结果表明在这些克隆子中除去了标记基因，然而GUS活性仍然维持不变，以此种方式证实了转质体基因组植物的同质(homoplasmic)状态。
在我们的试验中也注意到，不像使用壮观霉素作为质粒转化试验的筛选试剂时得到的结果，使用潮霉素B作为筛选试剂时，我们不会得到自发的突变体。然而，要再生转质体基因组植物必须建立合适的筛选浓度。
这些试验数据证实了本发明目的载体的功能和用于获得表达任何来源的目的基因的转质体基因组植物的用途。
实施例3处于两个质体功能启动子(pVTPA-aadA)控制下的异源单顺反子单元在烟草转质体基因组植物中的表达。
通过使用pVTPA载体，在质体中处于Prrn和水稻rbcL启动子控制下表达基因是可能的；为了此目的，使用序列SEQ ID NO20和SEQ IDNO21所述的寡核苷酸利用PCR从载体pDE1001(遗传学系，吉特大学，比利时)中扩增编码酶氨基糖苷3’-腺苷酰转移酶(aadA，带来链霉素抗性和壮观霉素抗性)的基因。扩增的DNA片段克隆到XhoI(Klenow)-消化的载体pVTPA中，处于上面提到的两个启动子的转录控制下，产生了构建体pVTPA-aadA(SEQ ID NO22)。根据实施例2所述方法获得烟草转质体基因组植物，具有在第一次筛选周期中用壮观霉素(500mg/L)和在第二次筛选周期中用链霉素(500mg/L)筛选得到的转质体基因组克隆的特性。为了比较使用不同特征的载体获得转质体基因组植物的频率，我们使用载体pVSR326MOD(ICGIB，New Delhi，印度)作了一些转化试验。该载体在烟草rbcL和accD基因之间插入了两个表达盒，其中含有gus基因，处于psbA基因启动子和终止子调节下；aadA基因，处于Prrn基因启动子和rbcL基因终止子的控制下。经过两次再生/筛选周期和三次非选择性室外培养周期后，所述转化试验的结果如表3所示。
表3.载体pVTPA-aadA和pVSr326MOD转化频率的比较

得到的实验结果证实了我们的假设，没有携带质体来源的终止子序列的本发明目的载体提供了高产率的转质体基因组植物。此外，结果表明该载体提供了在两个串联的启动子PrbcL和Prrn的转录控制下，表达外源基因(在本例中是aadA基因)的可能性。
实施例4异源双-顺反子单元在西红柿转质体基因组植物中的表达(pVTPA-f-GUS-aadA)。
本发明目的载体提供了以多顺反子单元形式表达几个基因的可能性。为了阐明这种可能性，在载体pVTPA-f-GUS(见实施例2)中，gus基因的下游插入aadA基因以形成三-顺反子单元(认为hgh标记基因也将作为rbcL启动子生产的mRNA的一部分表达)，通过同源重组除去hgh筛选标记后，该三-顺反子单元仅表达编码β-葡萄糖醛酸酶和氨基糖苷3’-腺苷酰转移酶的基因。
如实施例3所述使用PCR扩增aadA基因，然后克隆到质粒pVTPA-f-GUS的ApaI位点(Klenow补平)中，产生了载体pVTPA-f-GUS-aadA(SEQ ID NO23)。这个新载体用于获得西红柿转质体基因组植物，按照下面所述的方法灭菌的西红柿种子(var.Campbell-28)在半稀释的MSO培养基(MS盐，Gamborg B5维生素，蔗糖30g/L，植物琼脂(phytoagar)8g/L，pH5.8)上发芽12天，在液体MSO培养基上收获子叶叶子，然后远轴朝下地在每个含有添加了1mg/L玉米素和0.4M甘露醇的固体MSO培养基的培养皿中培养4小时，用于渗透性预处理。使用实施例2所述用于烟草的biolistic方法进行转化。轰击的子叶叶子在相同培养基上维持14-16小时，然后远轴朝上地在添加了1mg/L玉米素的MSO培养基上放置2天。随后，轰击的子叶叶子远轴朝上地转移至添加了1mg/L玉米素和5mg/L潮霉素-B(Duchefa，荷兰)的MSO培养基上。3-6周培养内出现的抗性绿芽和愈伤组织转移至含有10mg/L浓度的潮霉素B的相同选择培养基上，用于第二次筛选周期。3-4星期后，抗性绿芽和愈伤组织被转移至含有0.1mg/L玉米素和15mg/L潮霉素-B的MSO培养基上，3周后在添加了15mg/L潮霉素-B的MSO培养基上生根。所有培养阶段执行16小时光照和8小时黑暗的制度。评估得到克隆对500mg/L链霉素(Spcr)的抗性以及GUS基因的表达情况(通过组织化学分析)。三次转化试验结果如下表所示表4.使用构建体pVTPA-f-GUS-aadA得到西红柿转质体基因组植物

当植物在温室条件下培养时，无可鉴别的转质体基因组西红柿和非转化的西红柿之间的表型差异，这样验证了杂种atpB和rbcL蛋白的功能以及遗传操作蛋白提高质体新陈代谢活性的可行性。
这个例子不仅说明了本发明目的载体作为相同mRNA的一部分用于表达各种基因的能力，而且证实了这些载体作为获得与用于异源DNA整合进质体基因组的边界序列的供体植物不同的转质体基因组被子植物的载体的通用性。
例5在烟草转质体基因组植物中表达两个独立的转录单元(pVTPA-HB-aadA)。表达多聚体疫苗抗原的转质体基因组植物的获得。
用EcoRI(Klenow补平)/NcoI消化质粒pSA0503(CIGB，古巴)得到编码乙肝表面抗原(HBsAg)(Valenzuela P；Gray P；Quiroga M；Zaldivar J；Goodman H.M；Rutter W.J.Nature 1979，280815-819)的基因，然后插入NcoI/SmaI-消化的pVIEP-2载体(见实施例2)，用于融合位于HBsAg翻译起始密码子上游的核糖体结合位点，通过这种方式得到了质粒pVIEP-2-HB。用XhoI消化质粒pVIEP-2-HB得到含有编码乙肝表面抗原的820bp的DNA片段，然后克隆到SalI-消化的pVTPA-aadA载体中aadA基因的上游(见实施例3)，得到载体pVTPA-HB-aadA(SEQ ID NO24)，其中携带正确方向的HbsAg基因处于水稻rbcL启动子的转录控制之下，而且也表达处于Prrn启动子下游的标记基因aadA和hgh。
载体pVTPA-HB-aadA按照实施例2所述转化程序，用于获得表达乙肝表面抗原的烟草转质体基因组植物。最初用10mg/L潮霉素-B筛选转质体基因组植物，最后检测对500mg/L壮观霉素的抗性以及用ELISA特异分析(CIGB，古巴)和蛋白质印记(图6)检测HbsAg的表达情况。得到的结果如表5所示
表5.使用构建体pVTPA-HB-aadA得到烟草转质体基因组植物

这些结果证实了本发明目的载体用于在转质体基因组植物的基因组中作为独立的转录单元，表达两个或多个基因的用途。此外，证实了该载体在质体中表达编码形成多聚体复合物的有用蛋白的基因的用途。特别地，我们获得了乙肝病毒表面多聚体抗原的表达。显然，这里所述内容可用于其它疫苗抗原，同样地，一旦在植物细胞中表达，可用于配制提供给人或动物时能够诱导针对这些传染源的免疫性的制剂。该载体表达的其它多聚体蛋白可以是免疫球蛋白。
实施例6处于两个启动子和微顺反子(pVTPA-GUS1-aadA和pVTPA-GUS3-aadA)控制下的异源基因在质体中的表达。
用于在本发明目的载体中克隆和表达基因的中间载体(见实施例2)，允许克隆的基因处于设计的用于增加稳定性和促进产生的mRNA翻译的PpsbA*启动子和微顺反子的控制下。如实施例2所述用于克隆基因uidA得到质粒pVIEP-GUS1。
为了检测微顺反子的功能，构建了一个遗传构建体，它是用SnaBI和NdeI消化质粒pVIEP除去微顺反子，用S1核酸酶作填平处理，然后再连接得到pVIEP-3载体，其中如前所述克隆uidA基因产生了质粒pVIEP-3。含有gus基因的表达盒都是通过HindIII消化中间载体并克隆到pVTPA-aadA载体中得到的。最终获得的构建体含有处于水稻rbcL和PpsbA*启动子控制下的gus基因，它们分别被命名为pVTPA-GUS1-aadA和pVTPA-GUS3-aadA。烟草植物的质体如实施例2所述用这些质粒进行转化。
利用这些构建体得到了转质体基因组植物，然后我们根据Jefferson(Jefferson R.A.Plant Mol.Biol.Rep.1987，5387-405)所述步骤，使用4-MUG荧光测定法，比较了来自每个构建体的5个克隆的GUS表达水平。结果如表6所示。
表6.处于两个启动子和微顺反子控制下的uidA基因在烟草质体中的表达。

如前表所示，处于串联的水稻rbcL和PpsbA*启动子控制下，表达uidA基因的构建体都表现了高水平的GUS活性。此外，表中显示在携带含有微顺反子的遗传构建体的转化植物中，GUS活性的平均值要高很多，这样证明了这个遗传元件在质体中的功能以其作为在植物细胞器中增强基因表达的工具的用途。
例7使用构建体pVTPA-f-GUS-aadA得到水稻转质体基因组植物。
使用如下的步骤得到水稻转质体基因组植物灭菌的成熟水稻种子在N6-2培养基上(N6-2培养基的盐和维生素(Chu C.C等Scientia Sinic1975，18659)；肌醇0.1g/L；酪蛋白水解液1g/L；2，4D 2mg/L；蔗糖30g/L；植物凝胶3g/L，pH5.7)培养21天产生水稻胚体愈伤组织。这些愈伤组织在新鲜的N6-2培养基上再培养5天，然后在添加了3mg/L细胞分裂素的N6-2培养基上避光放置48-72小时。轰击前，胚体愈伤组织在添加了0.4M甘露醇的相同培养基上作再培养用于渗透性预处理。每个培养皿中放置约30个愈伤组织，被质粒pVTPA-f-GUS-aadA包裹的金粒子(0.6μm)用于如实施例2所述的轰击。轰击后的愈伤组织在相同的渗透性培养基上避光维持16小时，随后在相同条件下的N6-2培养基上再培养2天。后来，愈伤组织被转移至添加了20mg/L的潮霉素B的N6-2培养基上。10天后，抗生素抗性的愈伤组织被转移至相同的新鲜培养基上用于10天的第二次筛选周期。最后，抗性愈伤组织被转移至添加了30mg/L的潮霉素B的改良KIBAN再生培养基(MS培养基的盐和维生素；细胞分裂素3mg/L；BAP 0.5mg/L；NAA 1mg/L；麦芽糖30g/L；植物凝胶3g/L，pH5.8)上，在16小时光照和8小时黑暗的光照周期培养3-4周后，得到的约2cm的绿芽转移至添加了20mg/L的潮霉素B的改良液体MS培养基(MS培养基的盐和维生素；蔗糖30g/L；BAP 5mg/L；pH5.7)中进行微繁殖周期。芽放置在装有这种液体培养基的50ml锥形瓶中，28℃，150rpm的振荡速度，16小时光照和8小时黑暗的光照周期的条件下培育。孵育7天后，每个培养皿得到了约7个新芽，它们在含有30g/L蔗糖和30mg/L的潮霉素B的固体MS培养基上生根。评估得到的转质体基因组克隆的壮观霉素抗性(500mg/L)以及用组织化学分析gus基因的表达情况。此外，结果证明在轰击之前用细胞分裂素预处理细胞显著地增加了转质体基因组植物的产率。这些转化试验的结果如表7所示。
表7.用构建体pVTPA-f-GUS-aadA在有和没有细胞分裂素(细胞分裂素3mg/L)预处理的情况下，得到水稻转质体基因组植物(var.IAC-28)

本实施例通过转化单子叶植物证实了本发明目的载体的通用性和功能。
实施例8使用构建体pVTPA-f-GUS-aadA得到甘蔗转质体基因组植物。
使用如下方法得到甘蔗转质体基因组植物6个月大的野生甘蔗(var.Ja60-5)的茎底部的幼叶切成0.5×1cm的片段，灭菌后在添加了3mg/L细胞分裂素的P+5固体培养基(MS盐和维生素；肌醇100mg/L；酪蛋白水解液500mg/L；蔗糖20g/L；2，4D5mg/L；植物凝胶4g/L；pH5.7)上光照培养48小时。随后，这些外植体在添加了0.4M甘露醇的相同培养基上光照放置6-8小时，用于轰击前的渗透性预处理。被质粒pVTPA-f-GUS-aadA包裹的金粒子(0.6μm)按照实施例2所述，使用PDS-1000/He系统(Bio-Rad)进行轰击。轰击后的外植体在同样的培养基上避光维持24小时，随后在P+5培养基上放置2天，然后在添加了15mg/L潮霉素B的P+5培养基上避光培养。经过4周的培养后，出现了潮霉素抗性愈伤组织，它们被转移至光照的含有潮霉素B的P-固体培养基(不含有2，4D的P+5培养基)上用于再生。分离抗性的再生芽，使其在含有20mg/L的潮霉素B的P-培养基上生根。
评估得到的甘蔗克隆中的壮观霉素(500mg/L)抗性以及gus基因的表达情况(通过组织化学分析)。两次转化试验的结果如表8所示。
表8使用构建体pVTPA-f-GUS-aadA得到甘蔗转质体基因组植物

本实施例再次证实了本发明目的载体作为获得与用于异源DNA整合进质体基因组的重组边界序列的供体植物不同的转质体基因组被子植物的载体的通用性。
例9具有目的农学特征的转质体基因组植物的获得。
在针对害虫，疾病，杂草，增产，降低成本和提高农作物品质的斗争中，没有传播新基因到环境中的危险而得到含有新引入的农业特征的转质体基因组植物，是一个重要的目标。
用XbaI(S1核酸酶补平)和BamHI消化质粒pBS-Bar(C.I.G.B)得到编码吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)(Thompson C.J；Movva N.R；Tizard R；Crameri R；Davies J.E等EMBO Journal 1987，62519-2523)的膦丝菌素(BASTATM除草剂的活性成分)乙酰转移酶的基因pat(bar)，克隆到用NcoI处理(S1核酸酶补平)和BamHI-消化的pVIEP-2载体(见实施例2)产生了质粒pVIEP2-Bar。包含用XhoI消化pVIEP2-Bar得到的带有一个RBS的pat基因的670bp的DNA片段，克隆到pVTPA载体中产生了构建体pVTPA-Bar(SEQ ID NO25)。根据实施例2所述步骤得到了烟草转质体基因组植物，鉴定转化子对培养基中5mg/L的膦丝菌素(Duchefa，荷兰)的抗性。得到的结果如表9所示。
表9.使用构建体pVTPA-Bar得到抗除草剂的烟草转质体基因组植物

显然，在本发明目的载体中克隆和表达带来对除草剂例如，草甘膦，磺草灵(asulam)，磺酰脲类(sulphonilurea)，咪唑啉酮和溴苯腈抗性的其它基因，会产生抗这些化学药品的转质体基因组植物。同样地，显然，使用本发明目的载体在转质体基因组植物中克隆和表达带来对害虫和疾病有抗性的基因是可行的，例如编码苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的蛋白晶体的基因；或编码有抗真菌活性如几丁质酶和葡聚糖酶的蛋白质的基因；或有抗非生物压力特性如胆碱氧化酶的蛋白质的基因。修饰或引入增强光合作用效率或农作物品质的基因是使植物的一些功能能够通过使用本发明提出的用于被子植物质体转化的通用载体得到提高。
实施例10非农业用途的蛋白质在质体中的表达。
在实施例5中我们证实了本发明目的载体用于在被子植物质体中稳定地导入和表达编码多聚体蛋白的基因的用途。利用我们的转化/表达载体系统在转质体基因组植物中生产其它有医学，兽医或工业用途的蛋白是同样可行的。
为了在叶绿体中表达对治疗血栓和心脏病非常有用的血纤维蛋白溶解剂链激酶，用EcoRI(S1核酸酶补平)和BamHI消化pEKG-3载体(Estrada M.P；Hernández L；Pérez A；Rodr íguez P；Serrano R；Rubiera R；Pedraza A等Bio/Technology 1992，101138-1142)，切下编码链球菌成熟蛋白SKC-2的1254bp DNA片段，插入NcoI(S1核酸酶补平)/BamHI-消化的载体pVIEP(见实施例2)中得到质粒pVIEP-Strep。用SalI/XhoI消化质粒pVIEP-Strep得到用于在质体中处于PpsbA*启动子和微顺反子控制下的链激酶基因的表达盒，然后克隆到SalI/XhoI-消化的pVTPA载体(见实施例1)以构建质粒pVTPA-Strep(SEQ ID NO26)。
用实施例2所述载体pVTPA-Strep转化烟草植物的质体。获得的结果如表10所示(一些克隆中产生的链激酶血纤维蛋白溶解活性通过酪蛋白/血纤维蛋白溶解酶原平皿技术测定(Estrada M.P；Hernández L；Pérez A；Rodr íguez P；Serrano R；Rubiera R；Pedraza A；y otros.Bio/Technology 1992，101138-1142)。
表10.烟草质体中链激酶的表达

这些结果证实了本发明目的载体用于在质体中表达编码有用蛋白的基因的用途，特别是如溶栓剂，干扰素，细胞因子，生长因子，激素，抗原，细胞受体等这样有药学或兽医用途的特殊蛋白。显然，通过使用本申请所述转化/表达载体，这里举例的内容也可应用到其它有工业用途的如脂肪酶，蛋白水解酶等酶和蛋白质在质体中的表达。
例11免疫球蛋白在质体中的表达。
用NcoI/XbaI分别消化质粒pHESΩHbsAgCL和pHESΩHBsAgCH(Nadia Ram írez，“转基因烟草(Nicotiana tabacum L.)一种用于生产抗乙肝表面抗原的抗体及其片段的体系”，博士论文，C.I.G.B.，2002)，得到编码特异于HBsAg的单克隆抗体CB-Hep.1的重链和轻链的DNA片段，然后插入NcoI/XbaI-消化的pVIEP载体用于制备质粒pVIEP-Hc和pVIEP-Lc。随后，用SnaBI/BamHI消化pVIEP-Lc载体，切下编码轻链的DNA片段，插入SmaI/BamHI-消化的载体pVIEP-Hc中产生了双顺反子构建体pVIEP-HcLc。进一步，每个融合了RBS，包含重链和轻链的表达盒以HindIII片段克隆到pVTPA-f载体中；这样，得到了质粒pVTPA-f-HcLc。该质粒按照实施例2所述用于烟草质体的转化。
用western印迹分析得到的转质体基因组植物，用于检测CB-Hep.1单克隆抗体双链的存在情况(图7)；而且此外，通过用来自转质体基因组植物的蛋白质抽提物和缀合了碱性磷酸酶的兔抗鼠多克隆抗体作ELISA检测HbsAg的存在证实了生产的重组免疫球蛋白的功能。
本试验证明了使用我们的转化/表达载体在转质体基因组植物中生产全功能抗体的可能性，而且同时我们再次证实了在质体中表达和正确装配多聚体蛋白的可能性。
序列表<110>遗传工程及生物工程学中心.
<120>用于制备被子植物质体基因组转化(transplastomic)植物的载体.
<130>用于质体转化的载体<140>0000<141>2002-08-05<160>26<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相应于烟草rbcL基因的-291至-270区(从翻译起点)的寡核苷酸。
<400>1gggaagttct tattatttag g 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相应于烟草rbcL基因的+1213至+1233区(从翻译起点)的寡核苷酸。
<400>2ccaaggatgt cctaaagttc 20<210>3<211>133<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述相应于烟草rbcL基因的非翻译lider的-162至-29区的合成DNA片段，带有引入“理想的”lacO的修饰。
<400>3ccatggtcta ataatcaaac attctgatta gttgataatt caaattgtga gcgctcacaa 60tttgaaagat tcctgtgaaa agtttcatta acacggaatt cgtgtcgagt agaccttgtt 120gttgtgagaa ttc133<210>4<211>1523<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述rbcL-边界的核苷酸序列。
<400>4gggaagttct tattatttag gttagtcagg tatttccatt tcaaaaaaaa aaaaagtaaa 60aaagaaaaat tgggttgcgc tatatatatg aaagagtata caataatgat gtatttggca 120aatcaaatac catggtctaa taatcaaaca ttctgattag ttgataattc aaattgtgag 180cgctcacaat ttgaaagatt cctgtgaaaa gtttcattaa cacggaattc gtgtcgagta 240gaccttgttg ttgtgagaat tcttaattca tgagttgtag ggagggattt atgtcaccac 300aaacagagac taaagcaagt gttggattca aagctggtgt taaagagtac aaattgactt 360attatactcc tgagtaccaa accaaggata ctgatatatt ggcagcattc cgagtaactc 420ctcaacctgg agttccacct gaagaagcag gggccgcggt agctgccgaa tcttctactg 480gtacatggac aactgtatgg accgatggac ttaccagcct tgatcgttac aaagggcgat 540gctaccgcat cgagcgtgtt gttggagaaa aagatcaata tattgcttat gtagcttacc 600ctttagacct ttttgaagaa ggttctgtta ccaacatgtt tacttccatt gtaggtaacg 660tatttgggtt caaagccctg cgcgctctac gtctggaaga tctgcgaatc cctcctgctt 720atgttaaaac tttccaaggt ccgcctcatg ggatccaagt tgaaagagat aaattgaaca 780agtatggtcg tcccctgttg ggatgtacta ttaaacctaa attggggtta tctgctaaaa 840actacggtag agccgtttat gaatgtcttc gcggtggact tgattttact aaagatgatg 900agaacgtgaa ctcacaacca tttatgcgtt ggagagatcg tttcttattt tgtgccgaag 960cactttataa agcacaggct gaaacaggtg aaatcaaagg gcattacttg aatgctactg 1020caggtacatg cgaagaaatg atcaaaagag ctgtatttgc tagagaattg ggcgttccga 1080tcgtaatgca tgactactta acggggggat tcaccgcaaa tactagcttg gctcattatt 1140gccgagataa tggtctactt cttcacatcc accgtgcaat gcatgcggtt attgatagac 1200agaagaatca tggtatccac ttccgggtat tagcaaaagc gttacgtatg tctggtggag 1260atcatattca ctctggtacc gtagtaggta aacttgaagg tgaaagagac ataactttgg 1320gctttgttga tttactgcgt gatgattttg ttgaacaaga tcgaagtcgc ggtatttatt 1380tcactcaaga ttgggtctct ttaccaggtg ttctacccgt ggcttcagga ggtattcacg 1440tttggcatat gcctgctctg accgagatct ttggggatga ttccgtacta cagttcggtg 1500
gaggaacttt aggacatcct tgg 1523<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相应于稻atpB基因的-543至-519(从翻译起点)区的寡核苷酸。
<400>5gacttgagtt gttgttattg taag24<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相应于稻atpB基因的+1188至+1211(从翻译起点)区的寡核苷酸。
<400>6atgtcctgaa gttctttgta acg 23<210>7<211>132<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相应于稻atpB基因的非翻译lider的-654至-543区的合成DNA片段<400>7aagcttggcc aaaaaggccg tcgacaaaat ggggggcatg cttaagttaa tgaatatgtt 60tcattcatat aatatgtttc attcatatat aatgggtaca ccctgtgtac attctatgct 120ataggaattc at 132<210>8<211>1887
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述atpB-边界的核苷酸序列。
<400>8aagcttggcc aaaaaggccg tcgacaaaat ggggggcatg cttaagttaa tgaatatgtt 60tcattcatat aatatgtttc attcatatat aatgggtaca ccctgtgtac attctatgct 120ataggaattc attcgacttg agttgttgtt attgtaagtt aacatgcttc gattattaaa 180ccatggattt gattcaccaa atccatcttt attgtatact ctttaataga tatagcgcaa 240ccccaaatca acttctaatc cttattaagt tcttaataga cccccttttc ttattttgag 300tggaaatacc taaatactac gaaaattctc tgttgacagc aatctatgct tcacagtagt 360atatattttg tatatcgaag tcctagataa gaaagtagag taggcacaaa tcgtttacaa 420aaggcaaaat gtatatgaaa aaaagattga ttgaactttc cgacggactc attccatgag 480taaacgattg aatgggattc gtttgggcaa cgaaatcaag tgctggtccc cttttctctc 540ttattgaatt aactaattca tttccttttg acttttggat ttttggatat ttttttggtg 600ttgatttggc attattcaac aagaaaaaaa tcaaaatttc gataaattcc ttttttttga 660aaattatgtg ataattatga gaaccaatcc tactacttct cgtcccgggg tttctacaat 720tgaagaaaaa agtacagggc gtatcgatca aattattgga cccgtgctgg atgtcacttt 780tcccccgggc aagttacctt atatttataa tgctttggta gtcaagagtc gagacactga 840cggtaagcaa attaatgtaa cttgtgaggt acaacaatta ttaggaaata atcgagttag 900agctgtagct atgagtgcta cagatgggtt gatgagagga atggaagtga ttgacacggg 960agctcctctc agtgttcctg tcggtggagc tactcttgga cgaattttca acgttcttgg 1020ggagcctgtt gacaatttgg gtcctgtaga tactagtgca acattcccta ttcatagatc 1080cgcgcccgcc tttatcgagt tagatacgaa attatccatc tttgaaactg gtattaaggt 1140ggtcgatctt ttagctcctt atcggcgtgg aggaaaaatc ggactatttg ggggagctgg 1200agtaggtaaa acagtactca tcatggaatt aatcaacaat attgctaaag ctcacggggg 1260cgtatccgta tttggcggag taggggaacg gactcgtgaa ggaaatgatc tttatatgga 1320aatgaaggaa tctggagtaa ttaatgaaaa aaatcttgag gaatcaaagg tagctctagt 1380ctatggccaa atgaatgaac cgccaggagc tcgtatgaga gttggtttga ctgccctaac 1440tatggcagaa tatttccgag atgttaataa gcaagacgtg cttctattca tcgataatat 1500ctttcgtttt gttcaagcag gatcggaggt atctgcctta ttagggagaa tgccctctgc 1560agtgggttat caacctactc ttagtacaga aatgggttct ttgcaagaaa gaattacttc 1620tactaaaaag ggatctataa cttcgatcca agcggtttat gtacctgcgg acgatttgac 1680cgaccctgct cctgctacaa catttgcaca tttggatgct actaccgtac tttccagagg 1740attagcttcc aaagggattt atcctgcagt agatccttta gattcaacct caactatgtt 1800acaacctcgg atcgttggca acgaacatta tgaaactgca caaagagtta agcaaacttt 1860acaacgttac aaagaacttc aggacat 1887<210>9<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于PCR扩增hgh基因的寡核苷酸引物，具有RBS<400>9gggaggaatg agatatgaaa aagc 24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于PCR扩增hgh基因的寡核苷酸引物，具有添加的KpnI位点<400>10gtcggtacct actctatttc tttg 24<210>11<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述带有用于构建具有hgh基因的筛选盒的有用的限制位点的合成DNA片段<400>11aagcttgatt cgagtgaacg cgtatagggc ccgggagatc t41<210>12<211>2223<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述包含带有克隆在pBluescript中的重复边界的筛选盒的DNA片段的核苷酸序列<400>12
aagcttgatt cgagtgaacg cgtatagggc ccaattcgag ctcggtacca gcaccaccag 60cggtgaggtg cggaacttct acaacctcaa agcccataac gttgcggata gaacccttct 120cagggtcaat cagagcagcg tagtttgctg cgttcggcat cagtgctgcc agaatcgcag 180agtagctatc tgggtcacag tagaacacac ggtcagcagc cggaacatag ttcttggtca 240gagccgcacg agccttagtc agagccgcaa taatctcctt acccagcgca acttggtcgg 300tcaagtgcgg ccttgttctg agtggtctca attacggtag cagtacctaa gccctcgggg 360gatctgggga ggaatgagat atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt 420ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat 480ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg 540ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga 600ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc 660gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac 720cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg 780gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga 840ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg 900tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc 960tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg 1020tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct 1080tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc 1140cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac 1200tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg 1260acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg 1320cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca 1380gcactcgtcc gagggcaaag aaatagagta ggtaccagca ccaccagcgg tgaggtgcgg 1440aacttctaca acctcaaagc ccataacgtt gcggatagaa cccttctcag ggtcaatcag 1500agcagcgtag tttgctgcgt tcggcatcag tgctgccaga atcgcagagt agctatctgg 1560gtcacagtag aacacacggt cagcagccgg aacatagttc ttggtcagag ccgcacgagc 1620cttagtcaga gccgcaataa tctccttacc cagcgcaact tggtcggtaa gtgcggcctt 1680gttctgagtg gtctcaatta cggtagcagt acctaagccc tcgggggatc agcttggctg 1740ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg 1800tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc 1860gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt 1920agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt 1980ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt 2040tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca 2100ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc 2160tttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctgggggatc cactagttct 2220aga 2223<210>13<211>5669<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述来自载体pVTPA-f稻atpB和烟草rbcL边界之间的DNA片段的核苷酸序列<400>13gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620ttaagaactt aataaggatt agaagttgat ttggggttgc gctatatcta ttaaagagta 1680tacaataaag atggatttgg tgaatcaaat ccatggttta ataatcgaag catgttaact 1740tacaataaca acaactcaag tcgaatgaat tcctatagca tagaatgtac acagggtgta 1800cccattatat atgaatgaaa catattatat gaatgaaaca tattcattaa cttaagcatg 1860ccccccattt tgtcgacggc ctttttggcc aagcttgatt cgagtgaacg cgtatagggc 1920ccaattcgag ctcggtacca gcaccaccag cggtgaggtg cggaacttct acaacctcaa 1980agcccataac gttgcggata gaacccttct cagggtcaat cagagcagcg tagtttgctg 2040cgttcggcat cagtgctgcc agaatcgcag agtagctatc tgggtcacag tagaacacac 2100ggtcagcagc cggaacatag ttcttggtca gagccgcacg agccttagtc agagccgcaa 2160taatctcctt acccagcgca acttggtcgg tcaagtgcgg ccttgttctg agtggtctca 2220attacggtag cagtacctaa gccctcgggg gatctgggga ggaatgagat atgaaaaagc 2280
ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg 2340acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc 2400gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt 2460atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta 2520gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctgc 2580ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg 2640cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat 2700acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa 2760ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt 2820gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg 2880tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg 2940attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc 3000agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg 3060cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg 3120atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg 3180tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag 3240tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag aaatagagta 3300ggtaccagca ccaccagcgg tgaggtgcgg aacttctaca acctcaaagc ccataacgtt 3360gcggatagaa cccttctcag ggtcaatcag agcagcgtag tttgctgcgt tcggcatcag 3420tgctgccaga atcgcagagt agctatctgg gtcacagtag aacacacggt cagcagccgg 3480aacatagttc ttggtcagag ccgcacgagc cttagtcaga gccgcaataa tctccttacc 3540cagcgcaact tggtcggtaa gtgcggcctt gttctgagtg gtctcaatta cggtagcagt 3600acctaagccc tcgggggatc agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct 3660gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag 3720tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga 3780tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa 3840aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc 3900tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt 3960ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga 4020cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc tttttgttta tttttctaaa tacattcaaa 4080tatgtatccg ctgggggatc agcttgatgg ccgccagtgt gatggatggg aagttcttat 4140tatttaggtt agtcaggtat ttccatttca aaaaaaaaaa aagtaaaaaa gaaaaattgg 4200gttgcgctat atatatgaaa gagtatacaa taatgatgta tttggcaaat caaataccat 4260ggtctaataa tcaaacattc tgattagttg ataattcaaa ttgtgagcgc tcacaatttg 4320aaagattcct gtgaaaagtt tcattaacac ggaattcgtg tcgagtagac cttgttgttg 4380tgagaattct taattcatga gttgtaggga gggatttatg tcaccacaaa cagagactaa 4440agcaagtgtt ggattcaaag ctggtgttaa agagtacaaa ttgacttatt atactcctga 4500gtaccaaacc aaggatactg atatattggc agcattccga gtaactcctc aacctggagt 4560tccacctgaa gaagcagggg ccgcggtagc tgccgaatct tctactggta catggacaac 4620tgtatggacc gatggactta ccagccttga tcgttacaaa gggcgatgct accgcatcga 4680gcgtgttgtt ggagaaaaag atcaatatat tgcttatgta gcttaccctt tagacctttt 4740tgaagaaggt tctgttacca acatgtttac ttccattgta ggtaacgtat ttgggttcaa 4800agccctgcgc gctctacgtc tggaagatct gcgaatccct cctgcttatg ttaaaacttt 4860ccaaggtccg cctcatggga tccaagttga aagagataaa ttgaacaagt atggtcgtcc 4920
cctgttggga tgtactatta aacctaaatt ggggttatct gctaaaaact acggtagagc 4980cgtttatgaa tgtcttcgcg gtggacttga ttttactaaa gatgatgaga acgtgaactc 5040acaaccattt atgcgttgga gagatcgttt cttattttgt gccgaagcac tttataaagc 5100acaggctgaa acaggtgaaa tcaaagggca ttacttgaat gctactgcag gtacatgcga 5160agaaatgatc aaaagagctg tatttgctag agaattgggc gttccgatcg taatgcatga 5220ctacttaacg gggggattca ccgcaaatac tagcttggct cattattgcc gagataatgg 5280tctacttctt cacatccacc gtgcaatgca tgcggttatt gatagacaga agaatcatgg 5340tatccacttc cgggtattag caaaagcgtt acgtatgtct ggtggagatc atattcactc 5400tggtaccgta gtaggtaaac ttgaaggtga aagagacata actttgggct ttgttgattt 5460actgcgtgat gattttgttg aacaagatcg aagtcgcggt atttatttca ctcaagattg 5520ggtctcttta ccaggtgttc tacccgtggc ttcaggaggt attcacgttt ggcatatgcc 5580tgctctgacc gagatctttg gggatgattc cgtactacag ttcggtggag gaactttagg 5640acatccttgg atctgcagct agttctaga 5669<210>14<211>176<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述编码质体16S核糖体RNA(Prrn)的启动子区的合成DNA片段，带有添加的限制位点<400>14gaattccccc gggctgctcc cccgccgtcg ttcaatgaga atggataaga ggctcgtggg 60attgacgtga gggggcaggg atggctatat ttctgggagc gaactccggg cgaatacgaa 120gcgcttggat acagttgtag ggagggattt catcgtttaa actcgagtga acgcgt 176<210>15<211>5834<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述来自载体pVTPA稻atpB和烟草rbcL边界之间的DNA片段的核苷酸序列<400>15gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300
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taaacttgaa ggtgaaagag acataacttt gggctttgtt gatttactgc gtgatgattt 5640tgttgaacaa gatcgaagtc gcggtattta tttcactcaa gattgggtct ctttaccagg 5700tgttctaccc gtggcttcag gaggtattca cgtttggcat atgcctgctc tgaccgagat 5760ctttggggat gattccgtac tacagttcgg tggaggaact ttaggacatc cttggatctg 5820cagctagttc taga 5834<210>16<211>96<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述带有添加的限制位点和RBS的嵌合PpsbA*启动子的核苷酸序列<400>16gaattcacct tggttgacac gagtatataa gtcatgttat actgttgaat aaaaagcctt 60ccattttgat taaataaagg aggattttca tatgat 96<210>17<211>106<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述编码小顺反子，RBS和限制位点的合成DNA片段<400>17catatgtatc gattacgtaa ggaggaataa accatggacg agctctagac tgcagcatgc 60ccgggatcct aggcctgata tcaagcttct cgagctgtcg acagct106<210>18<211>365<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述来自显示表达盒和周围限制位点的载体的片段的核苷酸序列<400>18ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcaccttg 60gttgacacga gtatataagt catgttatac tgttgaataa aaagccttcc attttgatta 120
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<223>人工序列描述来自载体pVTPA-f-GUS稻atpB和烟草rbcL边界之间的DNA片段的核苷酸序列<400>19gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620
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<223>人工序列描述来自载体pVTPA-f-GUS-aadA稻atpB和烟草rbcL边界之间的DNA片段的核苷酸序列<400>23gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300
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<223>人工序列描述来自载体pVTPA-HB-aadA稻atpB和烟草rbcL边界之间的DNA片段的核苷酸序列<400>24gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620ttaagaactt aataaggatt agaagttgat ttggggttgc gctatatcta ttaaagagta 1680tacaataaag atggatttgg tgaatcaaat ccatggttta ataatcgaag catgttaact 1740tacaataaca acaactcaag tcgaatgaat tcctatagca tagaatgtac acagggtgta 1800
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述来自载体pVTPA-Estrep稻atpB和烟草rbcL边界之间的DNA片段的核苷酸序列<400>26gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620ttaagaactt aataaggatt agaagttgat ttggggttgc gctatatcta ttaaagagta 1680tacaataaag atggatttgg tgaatcaaat ccatggttta ataatcgaag catgttaact 1740tacaataaca acaactcaag tcgaatgaat tcctatagca tagaatgtac acagggtgta 1800cccattatat atgaatgaaa catattatat gaatgaaaca tattcattaa cttaagcatg 1860ccccccattt tgtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcaccttg gttgacacga 1920gtatataagt catgttatac tgttgaataa aaagccttcc attttgatta aataaaggag 1980gattttcata tgtatcgatt acgtaaggag gaataaacca tgattgctgg acctgagtgg 2040ctgctagacc gtccatctgt caacaacagc caattagttg ttagcgttgc tggtactgtt 2100gaggggacga atcaagacat tagtcttaaa ttttttgaaa ttgacctaac atcacgacct 2160
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1.一种用于在质体中稳定地转化和表达基因的DNA载体，其中所述的欲被表达的基因插入由两个自然转录方向相反且属于不同纲或门的植物的质体基因的5′非翻译区组合而成的人工基因间区域中。
2.如权利要求1所述的DNA载体，用于在被子植物的质体中高频率稳定地转化和表达基因，其特征在于a)含有人工基因间区域，其中可能插入编码多肽、处于质体中适于其转录和翻译的信号下、使用非质体来源的转录终止序列的DNA序列，b)人工基因间区域侧翼与质体基因组中两个自然转录方向相反的基因相邻，其中这两个基因的核苷酸序列与来源于不同纲(双子叶和单子叶)的被子植物的质体的atpB和rbcL基因的编码序列一致，c)人工基因间区域包括用于atpB和rbcL基因转录和翻译的5′调节序列；用于插入目的基因的限制性酶切位点，后面有非质体来源的转录终止子；用于属于不同与前面rbcL基因所属纲的被子植物的质体中rbcL基因转录和翻译的第二个5′调节区。
3.如权利要求2所述的DNA载体，包含与来自烟草或水稻质体rbcL基因的序列同源的边界DNA序列。
4.如权利要求3所述的DNA载体，其中所述的与rbcL基因同源的DNA序列至少包含烟草rbcL基因的，始于翻译起始密码子的第-291位至第+1233位的核苷酸序列片段。
5.如权利要求4所述的DNA载体，其中所述的与rbcL基因同源的边界DNA序列包含序列SEQ ID NO4。
6.如权利要求2所述的DNA载体，包含与来源于水稻或烟草质体atpB基因的序列同源的边界DNA序列。
7.如权利要求6所述的DNA载体，其中所述的与atpB基因同源的DNA序列至少包含水稻atpB基因的，始于翻译起始密码子的第-654位至第+1211位的核苷酸序列片段。
8.如权利要求7所述的DNA载体，其中所述与atpB基因同源的边界序列包含序列SEQ ID NO8。
9.如权利要求2所述的DNA载体，其中所述的人工基因间区域中非质体来源的转录终止子是来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的双向终止子rrnBT1T2或其同源物。
10.如权利要求2所述的DNA载体，在人工基因间区域插入允许筛选转质体基因组植物的基因。
11.如权利要求10所述的DNA载体，其中所述的筛选基因能够通过基因边界处的同向重复DNA序列之间的同源重组被消除。
12.如权利要求11所述的DNA载体，其中所述的筛选基因编码允许植物细胞在抗微生物化合物存在时存活的蛋白。
13.如权利要求12所述的DNA载体，其中所述的抗微生物化合物属于氨基糖苷抗生素类。
14.如权利要求13所述的DNA载体，其中所述的抗生素化合物是潮霉素B。
15.如权利要求13所述的DNA载体，其中所述的抗生素化合物是壮观霉素。
16.如权利要求12所述的DNA载体，其中所述的抗微生物化合物属于磺胺类化合物。
17.如权利要求16所述的DNA载体，其中所述的抗微生物化合物是磺胺嘧啶。
18.如权利要求10所述的DNA载体，其中所述的筛选基因编码允许植物细胞在除草剂化合物存在时存活的蛋白。
19.如权利要求18所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物属于谷氨酰胺合成酶抑制剂类。
20.如权利要求19所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物是草铵膦(膦丝菌素)。
21.如权利要求19所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物是双丙氨膦。
22.如权利要求18所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物属于5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)抑制剂类。
23.如权利要求22所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物是草甘膦(N-磷酸甲基氨基乙酸)。
24.如权利要求18所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物属于叶酸合成抑制剂类。
25.如权利要求24所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物是磺草灵((4-氨基苯磺酰)-氨基甲酸甲酯)。
26.如权利要求18所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物属于乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类。
27.如权利要求26所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物是磺酰脲(sulphonylurea)。
28.如权利要求26所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物是咪唑啉酮。
29.如权利要求18所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物属于光合系统II抑制剂类。
30.如权利要求29所述的DNA载体，其中所述的除草剂化合物是溴苯腈(3，5-二溴-4-羟基苄腈)。
31.如权利要求10所述的DNA载体，其中所述的筛选基因编码允许植物细胞在毒性化合物存在时存活的蛋白。
32.如权利要求31所述的DNA载体，其中所述的毒性化合物是甜菜醛。
33.如权利要求1-8所述的DNA载体，具有图1A所示的一般结构或其变体。
34.如权利要求1-11所述的DNA载体，具有图1B所示的一般结构或其变体。
35.如权利要求1-11所述的DNA载体，具有图1C所示的一般结构或其变体。
36.如权利要求1-11所述的DNA载体，有图1D所示的一般结构或其变体。
37.如权利要求1-11所述的DNA载体，具有图1E所示的一般结构或其变体。
38.如权利要求1-11所述的DNA载体，有图1F所示的一般结构或其变体。
39.如权利要求2所述的DNA载体，在rbcL基因的第二个5′非翻译区有与大肠杆菌lacI阻抑蛋白结合位点功能上同源的序列。
40.一种DNA载体，在rbcL基因的翻译起始密码子上游有一个DNA序列，允许在非诱导条件下抑制该基因的转录，这样所述的载体在任何宿主中都能维持在和复制。
41.如权利要求40所述的DNA载体，在rbcL基因的5′非翻译区有一个与大肠杆菌lacI阻抑蛋白结合位点功能上同源的序列。
42.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述的lacI结合位点的核苷酸序列，至少部分对应于SEQ ID NO3所示序列。
43.如权利要求1-11所述的DNA载体，在人工基因间区域，插入一个或多个处于一个或多个质体功能启动子下的单顺反子或多顺反子转录单元。
44.如权利要求12-17所述的DNA载体，在人工基因间区域，插入一个或多个处于一个或多个质体功能启动子下的单顺反子或多顺反子转录单元。
45.如权利要求18-38所述的DNA载体，在人工基因间区域，插入一个或多个处于一个或多个质体功能启动子下的单顺反子或多顺反子转录单元。
46.如权利要求43，44或45所述的DNA载体，其中至少一个所述的质体功能启动子是人工基因间区域的rbcL启动子。
47.如权利要求46所述的DNA载体，其中所述的质体功能启动子是包含于序列SEQ ID NO8的水稻rbcL启动子。
48.如权利要求43，44或45所述的DNA载体，其中至少一个所述的质体功能启动子是包含于序列SEQ ID NO16的psbA*启动子或其变体。
49.如权利要求48所述的DNA载体，具有一个与所述的psbA*启动子相功能上连接的微顺反子。
50.如权利要求49所述的DNA载体，其中所述的微顺反子具有与SEQ ID NO17所示序列或其变异体同源的核苷酸序列。
51.一种用于在质体中稳定导入和表达基因的DNA载体，它使用微顺反子来增强导入转质体基因组植物中的基因的表达。
52.如权利要求43，44或45所述的DNA载体，其中至少一个农业、兽医、药学、食品或工业的目的基因是所述的转录单元的组件。
53.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的农业目的基因编码有杀虫剂活性的蛋白。
54.如权利要求53所述的DNA载体，其中所述的杀虫剂蛋白属于来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的Cry蛋白家族。
55.如权利要求53所述的DNA载体，其中所述的杀虫剂蛋白是蛋白酶抑制剂。
56.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的农业目的基因编码有抗微生物活性的多肽。
57.如权利要求56所述的DNA载体，其中所述的多肽属于与致病力相关的植物蛋白(PR蛋白)类的一种。
58.如权利要求57所述的DNA载体，其中所述的PR蛋白是葡聚糖酶。
59.如权利要求57所述的DNA载体，其中所述的PR蛋白是几丁质酶
60.如权利要求57所述的DNA载体，其中所述的PR蛋白是奇异果甜蛋白样蛋白。
61.如权利要求56所述的DNA载体，其中所述的多肽是核糖体失活蛋白(RIP)。
62.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的农业目的基因编码带来对非生物压力产生抗性的蛋白。
63.如权利要求62所述的DNA载体，其中所述的蛋白有胆碱氧化酶活性。
64.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的农业目的基因编码有助于增加植物产率的蛋白。
65.如权利要求64所述的DNA载体，其中所述的蛋白参与提高植物的光合作用。
66.如权利要求65所述的DNA载体，其中所述的蛋白有果糖-1，6-二磷酸磷酸酶(FBPase)活性。
67.如权利要求65所述的DNA载体，其中所述的蛋白有原卟啉原氧化酶(PROTOX)活性。
68.如权利要求65所述的DNA载体，其中所述的蛋白有核酮糖-1-5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RUBISCO)活性。
69.如权利要求65所述的DNA载体，其中所述的蛋白直接或非直接地参加了植物的碳固定过程。
70.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的农业目的基因编码有助于增加植物产品收获后保存期的蛋白。
71.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的食品目的基因编码有助于增加植物产品的营养品质的蛋白。
72.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的兽医或药学目的基因编码细胞因子。
73.如权利要求72所述的DNA载体，其中所述的细胞因子属于干扰素家族。
74.如权利要求72所述的DNA载体，其中所述的细胞因子属于白细胞介素家族。
75.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的兽医或药学目的基因编码在免疫反应中有调节活性的多肽。
76.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的兽医或药学目的基因编码有激素活性的多肽。
77.如权利要求76所述的DNA载体，其中所述的有激素活性的多肽是胰岛素。
78.如权利要求76所述的DNA载体，其中所述的有激素活性的多肽是生长激素。
79.如权利要求76所述的DNA载体，其中所述的有激素活性的多肽是促生长素。
80.如权利要求76所述的DNA载体，其中所述的有激素活性的多肽是促性腺激素。
81.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的兽医或药学目的基因编码细胞增殖因子。
82.如权利要求81所述的DNA载体，其中所述的细胞增殖因子是表皮生长因子(EGF)。
83.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的兽医或药学目的基因编码有造血活性的多肽。
84.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的兽医或药学目的基因编码细胞受体。
85.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的兽医或药学目的基因编码蛋白酶抑制剂。
86.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的兽医或药学目的基因编码有溶栓活性的多肽。
87.如权利要求86所述的DNA载体，其中所述的多肽是链激酶。
88.如权利要求86所述的DNA载体，其中所述的多肽是组织溶酶原激活剂(t-PA)。
89.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的兽医或药学目的基因编码疫苗抗原。
90.如权利要求89所述的DNA载体，其中所述的疫苗抗原属于病毒。
91.如权利要求90所述的DNA载体，其中所述的疫苗抗原属于肝炎病毒。
92.如权利要求91所述的DNA载体，其中所述的疫苗抗原是乙肝表面抗原。
93.如权利要求91所述的DNA载体，其中所述的疫苗抗原属于甲肝病毒。
94.如权利要求90所述的DNA载体，其中所述的疫苗抗原属于丙肝病毒。
95.如权利要求90所述的DNA载体，其中所述的疫苗抗原属于口蹄疫病毒(FMDV)。
96.如权利要求90所述的DNA载体，其中所述的疫苗抗原属于人类免疫缺陷病毒(HIV)。
97.如权利要求89所述的DNA载体，其中所述的疫苗抗原属于细菌。
98.如权利要求89所述的DNA载体，其中所述的疫苗抗原属于原生动物。
99.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的基因编码免疫球蛋白可变区的片段。
100.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的基因编码多聚蛋白。
101.如权利要求100所述的DNA载体，其中所述的多聚体蛋白是免疫球蛋白。
102.如权利要求100所述的DNA载体，其中所述的多聚体蛋白是激素。
103.如权利要求100所述的DNA载体，其中所述的多聚体蛋白是疫苗抗原。
104.如权利要求100所述的DNA载体，其中所述的多聚体蛋白是酶。
105.如权利要求100所述的DNA载体，其中所述的多聚体蛋白是细胞受体。
106.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的工业目的基因编码生物聚合体的蛋白质组分。
107.如权利要求52所述的DNA载体，其中所述的工业目的基因编码酶。
108.如权利要求107所述的DNA载体，其中所述的酶是蛋白酶。
109.如权利要求107所述的DNA载体，其中所述的酶是脂肪酶。
110.如权利要求107所述的DNA载体，其中所述的酶是异构酶。
111.如权利要求107所述的DNA载体，其中所述的酶有glycosil-水解酶活性。
112.如权利要求111所述的DNA载体，其中所述的有glycosil-水解酶活性的酶是果聚糖蔗糖酶。
113.如权利要求111所述的DNA载体，其中所述的有glycosil-水解酶活性的酶是蔗糖酶。
114.如权利要求111所述的DNA载体，其中所述的有glycosil-水解酶活性的酶是果聚糖酶。
115.如权利要求111所述的DNA载体，其中所述的有glycosil-水解酶活性的酶是葡聚糖酶。
116.将如权利要求1-115任一所述的DNA载体转入植物细胞之前，加入细胞分裂素的植物细胞培养物，用于增加转质体基因组植物的产率。
117.如权利要求116所述的细胞分裂素的用途。
118.如权利要求1-115任一所述的DNA载体稳定转化的转质体基因组被子植物。
119.权利要求118的转质体基因组植物的子代。
120.权利要求118和119的转质体基因组植物，其稳定地表达至少一种存在于用于转化的DNA载体中的基因。
121.权利要求118和119的转质体基因组植物，含有杂合的atpB和/或rbcL蛋白。
122.权利要求120的转质体基因组植物的培养物。
123.权利要求120的转质体基因组植物细胞的培养物。
124.由于表达所述基因，生产权利要求120的转质体基因组植物的细胞的蛋白的纯化和应用。
125.权利要求118-121的转质体基因组植物，其是被子植物。
126.权利要求125的转质体基因组植物，其是双子叶植物。
127.权利要求126的转质体基因组植物，其为茄科。
128.权利要求127的转质体基因组植物，其属于以下一种烟草，西红柿或马铃薯。
129.权利要求125的转质体基因组植物，其是单子叶植物。
130.权利要求129的转质体基因组植物，其是禾本科植物。
131.权利要求130的转质体基因组植物，其属于以下一种水稻，甘蔗，玉米，小麦或大麦。
全文摘要
本发明涉及制备转质体基因组被子植物的载体。更具体而言，本发明涉及一种能在任何被子植物细胞的质体基因组中稳定地插入和表达异源基因的DNA载体。在该载体中，外源基因可插到位于由属于不同纲(双子叶和单子叶)的植物的atpB和rbcL操纵子的组合得到的人工基因间区域的多克隆位点中。表达盒通过载体的atpB和rbcL边界序列与质体基因组相应同源区域之间的同源重组插入基因组中；以这种方式能够在与编码atpB基因的边界区域相邻的rbcL启动子的控制下表达一个以上的目的基因。
文档编号C12N15/82GK1685047SQ03822991
公开日2005年10月19日 申请日期2003年9月15日 优先权日2002年9月27日
发明者G·塞尔曼－侯塞因索萨, E·阿吉亚尔卡韦萨, A·D·C·冈萨雷斯奎恩特罗, O·拉莫斯冈萨雷斯 申请人:遗传工程与生物技术中心