专利名称：来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及获得胶束酪蛋白(micellar casein)的酸溶性蛋白质的方法，涉及该蛋白质的级分，涉及该蛋白质作为药物的用途，还涉及该蛋白质在生产药物或消费品中的用途。
背景糖尿病是世界上最普遍的疾病之一。糖尿病主要有两种类型I型和II型。I型糖尿病患者的特征在于分泌胰岛素的胰腺β细胞的自身免疫破坏。II型糖尿病患者占所有糖尿病患者的90-95％，他们的特征在于在外周组织(主要是肝脏和肌肉)中形成胰岛素抗性，以及不恰当的胰岛素分泌能力。
患II型糖尿病的人具有严重的长期并发症的高度危险。这些并发症基本上是心血管病，以及视网膜病，肾病和神经病。
当前对II型糖尿病的治疗包括几类药物，它们能单独或结合胰岛素使用，这依赖于仍然产生的胰岛素的量(如磺酰脲，噻唑烷二酮类化合物)。最终，当不再产生胰岛素时，药物治疗将由单独注射胰岛素取代。
胰岛素生物合成和胰岛素原基因表达受胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的刺激，几乎仅在内分泌肠细胞中表达。该促分泌激素的重要作用很好地概括在“″Glucagone-like peptide-1a major regulator of pancreatic b-cellfunction，R.Perfetti和P.Merkel，European Journal of Endocrinology(2000)，143，717-725”，此处引用该文献作为参考。
已表明，例如，当静脉内GLP-1施用后，II型糖尿病的胰岛素分泌反应将恢复到正常患者状态。
而且，GLP-1抑制胃能动性、胃酸分泌、胃排空和延缓酶分解及营养的吸收。这些影响几乎在I型和II型糖尿病患者中都保存。
此外，证明GLP-1影响饱满感并可能与降低食物的摄取有关。
因而认为GLP-1是治疗糖尿病的理想选择。
此外，无论何时释放一分子的GLP-1，也将释放一分子的胰高血糖素样肽-2(GLP-2)。哺乳动物胰高血糖素原的转录物来源于一个mRNA。因而GLP-1和GLP-2在消化道中是共分泌的。
GLP-2抑制胃分泌和胃能动性。用GLP-2的长期治疗对肠具有有益的营养效果，例如提高组织质量和粘膜厚度，降低肠细胞程序性细胞死亡速率等等。关于GLP-1合成、分泌和生物活性的综述可以见Glucagon-LikePeptide 2，D.J.Drucker，The Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism，2001，86，1759-64。
在WO 01/37850(Societe des Produits Nestle)中第一次描述用体外细胞模型测量胰高血糖素原基因表达和GLP-1分泌。该细胞系称为NCI-H716并例如以ATCC号CCL-250保存。因此，某些牛奶蛋白质水解产物促进GLP-1分泌。
WO 98/31239描述了在至少一种另外的蛋白质级分存在下选择性水解酪蛋白的方法。该方法提到如此获得的制品对糖尿病有益。
本发明的目的是刺激来自胰高血糖素原的激素的分泌的一种或几种分子。
另一的目的是发现生物活性分子，例如，因为它们是在特定的食物原料中自然产生的，所以认为它们是营养安全的。
本发明的其他目的是预防或治疗II型糖尿病，调节血清中葡萄糖浓度，治疗或预防以伤害肠黏膜上皮和/或肠黏膜上皮功能异常为特征的肠紊乱，增加肠粘膜的厚度和表面积，和/或降低食欲和食物摄取。
本发明的另一目的是改善人和哺乳动物中GLP-1和GLP-2的递送。
发明概述令人惊奇地，通常与胶束酪蛋白结合或与之紧密地交互作用的奶的蛋白质级分能刺激GLP-1的分泌。可以通过将完整或酶处理的酪蛋白暴露于酸性条件释放该蛋白质级分。迄今为止还没有表征包含在该级分中的一些蛋白质。
因此，第一方面，本发明提供了获取胶束酪蛋白酸溶性蛋白质级分的方法，其包括以下步骤-分离胶束或酶处理的酪蛋白和乳清蛋白质，-酸化胶束酪蛋白或酶处理的酪蛋白到pH低于6，-从酪蛋白中分离酸溶性蛋白质，和-分离酸溶性蛋白质的不同级分。
第二方面，本发明提供了来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的亚级分，其特征在于它可以通过疏水作用层析获得，并且通过包含26.4-36体积％乙腈的流动相从疏水固定相洗脱该级分。
第三方面，本发明提供了来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的亚级分，其特征在于该级分可以通过疏水作用层析获得，并且通过包含43.2-46.4体积％乙腈的流动相从疏水固定相洗脱该级分。
第四方面，本发明提供了来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用作药物或预防性或治疗性治疗人体或动物体。
第五方面，本发明提供了来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于增强胰岛素分泌和/或胰岛素原基因的表达的消费品或药物。
第六方面，本发明提供了来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于预防或治疗I型和/或II型糖尿病的消费品或药物。
第七方面，本发明提供了来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于增加GLP-1和/或GLP-2的分泌和/或调节血液中葡萄糖浓度的消费品或药物。
另一方面，本发明提供了来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于降低胃排空和酸分泌的消费品或药物。
在另一方面，本发明提供了来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于调节食欲，降低食物摄取和/或增加饱满感的消费品或药物。
另一方面，本发明提供了包含根据本发明的任一蛋白质级分或亚级分的消费品。
另一方面，本发明提供了来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备消费品或药物，所述消费品或药物用于治疗以受伤或功能异常为特征的肠疾病和/或增加肠粘膜的厚度和/或表面积。
本发明的一个优点是它提供了能刺激GLP-1分泌的自然产生的有效成分。
本发明的另一个优点是所讨论的蛋白质级分能容易地分离并以足够量提供给任何食品。
本发明的另一优点是它提供了营养安全成分，其可以用于治疗或预防I型和/或II型糖尿病、节段性回肠炎(Crohn’s disease)、短肠综合征、调节血液中葡萄糖水平，和/或增加饱腹感及降低食物摄取。
在附图中，
图1比较牛奶的不同蛋白质级分体外刺激的GLP-1释放。以0.5mG/ml(灰色条线)和5mg/ml(黑色条线)施用蛋白质，只是根据本发明的胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质除外，所述酸溶性蛋白质即使在低浓度下也显示出对GLP-1释放的最高影响(灰色条线)。用包含0.2％BSA，pH7.4的Krebs-Ringer平衡缓冲液(KRBB)制备奶提取物。对照仅由缓冲液(KRBB)和BSA(0.2％)组成。
图2比较胶束酪蛋白酸溶性蛋白质的不同亚级分体外刺激的GLP-1释放。不同的亚级分以相同浓度(30μg/ml)施用，发现特别地，亚级分5、7、8、10和11对GLP-1分泌显示出明显影响。将包含所有14种级分的最初混合物的全部以更高的浓度(5μg/ml)施用。
图3显示来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的14个级分的HI-HPLC(疏水相互作用高效液相层析)层析图。水平轴阐明来自胶束酪蛋白的不同酸溶性蛋白质疏水性的增加，所述蛋白质分为所述14种不同亚级分。垂直轴指出从柱子上洗脱的蛋白质的量，其通过UV在214nm下检测。
附图的进一步详细说明可以从实施例获得。
发明详述在该说明书上下文中，词语“包含”是指“其中，包括”。不意在将其理解成“仅由...组成”。
在本发明的上下文中，术语消费品意在包括任何营养完全的或补充性可消费的产品。因此，该组合物可由人、宠物，如猫和狗，和/或其他动物消费。它可以是营养巴(bar)、小吃、营养配方，例如液态或粉末状和可重构的配方、婴儿或幼儿配方、冰淇淋、奶制品、糖制品、或它可以辅助物或药物，其可以任选加入到另一食品中，如加入到上述食品中。它也可以是液态产品。
例如，如果食品是营养配方，它可以是确限配方或补充配方。确限配方通常由成人每天消耗1.8到2.2L的量，婴儿每天0.6到1.4L。
如果配方作为补充使用，则每天的量为例如确限配方的约1/8到约1/2。
但是，根据本发明的消费品不限于任何产品。它可以是食品本身或是任意食品的成分或组分。
关于胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的方法，天然的或从乳清蛋白质来源的胶束酪蛋白，或从乳清蛋白质得到的酶处理的酪蛋白的分离可以用多种方法处理，如超速离心，或微量过滤。乳清蛋白质也可通过根据它们的疏水性选择性除去特定乳清蛋白质而将其与酪蛋白分离。
调节pH到低于6，优选低于5，更优选低于4.8，例如，4.6，进行胶束或酶处理的酪蛋白的酸化。任何酸都是适宜的，只要它是食品级，如HCl、乙酸等。
从胶束酪蛋白中分离酸溶性酪蛋白可再次通过任何合适的方法获得，所述方法为例如超速离心、过滤、倾析以及其它方法。
分离酸溶性蛋白质不同的亚级分可根据疏水性质进行，如用疏水作用层析(HIC)、疏水相互作用液相层析(HI-HPLC)，以及基于相似原理的方法。其它方法也是适宜的，如可利用不同级分的大小或电荷性质分离。
根据本发明的酸溶性蛋白质的亚级分可根据表1给出的洗脱特征来定义。表1显示在乙腈浓度为26.4-36体积％-范围内洗脱的级分相应于表1下面定义的在缓冲液A和B组成的混合物中缓冲液B的33-45体积％范围。
上面的缓冲液B和缓冲液A的浓度范围足够表征所洗脱的蛋白质级分(表1)。对于上面的洗脱范围，聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒优选用作固定相。来自Amersham的产品目录号为No.15 RPC TN 17-0727-02的产品优选用作固定相。
具体地，根据上面特征的洗脱pH通常为1.8-2.2范围，优选约2。该pH主要由三氟乙酸(TFA)的量决定。
除了可能未知的物质以外，亚级分6、7和8可能包含PP8(蛋白胨)，级分8和9包含PP8和PP5(蛋白胨)，级分10包含乳铁蛋白(lactoferrin)，级分11包含β-乳球蛋白。
从而，在根据本发明的优选方案中，根据本发明的亚级分是亚级分5、6、7、8、10和11，它们在表1中通过在特定缓冲液或乙腈浓度范围洗脱来表征。特别可以重新测试亚级分5，因为怀疑具有某种细胞毒性性质。
进行本发明的一中可能的方法首先分离此处报导的特定奶蛋白质级分。这可用任何足够方法完成并至少有一些步骤是合适的。
例如，来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质可通过超速离心从奶或脱脂乳(或衍生物)中分离酪蛋白而获得。因此，如脱脂乳在30,000到90,000或最高110,000g超速离心45-90分钟。可以回收组成胶束酪蛋白的沉淀物(或不溶蛋白质)。
可以通过将胶束酪蛋白分散在CaCl22mM/NaCl 0.9％，并如上超离心洗涤该胶束酪蛋白。
来自酪蛋白的酸溶性蛋白质可通过酸化洗涤过的胶束酪蛋白获得，如上述。例如，胶束酪蛋白(不溶性蛋白质)可分散在20mM pH4.6的乙酸钠缓冲液中。由于酪蛋白的缓冲行为，通过乙酸(或其它合适的酸)加入可实现约4.6的pH。
该溶液于是离心(如9,000到15,000g，20-50分钟)，收集上清液，其含有来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质。
另一种从胶束酪蛋白中获得酸溶性蛋白质的方法可以来自Proteincomposition of micellar casein obtrained by cross-flow micro-filtration ofskimmed milk，R.Jost，R.Brandsma，S.Rizvi，International Dairy Journal9(1999)389-90。
因此，天然酪蛋白是通过微量过滤而不是超离心获得。因此，通过纯物理方法可以用孔径范围为0.1-0.2μm的微量过滤膜将奶的胶束相与它的血清相分离。
例如，加热到50℃的脱脂乳经1P19-40 Tetra-laval 1.4μmMembralox设备过滤可减少它的细菌负荷。然后将它加热到55℃并在配备有CarbosepM14(0.14μm孔径)膜的Tech-Sep 1S 151微量过滤装置上分离。该奶从而以浓缩模式工作分级分离成存留物和透过液(permeatestream)。当达到浓缩因数3(cf3)后，添加脱矿质水开始渗滤。6初始体积水(cf3/cf6)渗滤后获得的存留物组成胶束酪蛋白。
可用盐酸(或其它酸，如乙酸)酸化再稀释的存留物到pH4.6，并通过离心分离凝乳得到胶束酪蛋白的酸溶性部分。结果，3-5％的总N可从凝乳中分离为胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质。
在这种情况下，可以获得蛋白质级分，其包含乳铁蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白H-和L-链、具有与β-乳球蛋白相似的电泳迁移率的蛋白质。而且，该级分可能包含蛋白胨组分5(β-酪蛋白1-105/1-107)和蛋白胨组分8fast。
胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的其它组分由本发明定义。
当然，上述方法仅作为从胶束酪蛋白中分离或纯化酸溶性蛋白质的例子。技术人员可以很容易地设想出其它方法来获得它们。
例如，胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质经酶处理后(如，粗制凝乳酶)可能保留至少部分附着到酪蛋白。在该情况下，用酶处理奶，随之回收由凝结的酪蛋白形成的凝乳，可以获得胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质。通过如上述酸化可以将胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质至少部分地从凝乳中分离。
该方法可代替用离心或超过滤分离胶束酪蛋白，只要胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质主要保持与切割的酪蛋白质级分结合。
酸化奶或脱脂乳也可能回收胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质。根据本发明的蛋白质必须从酸性乳清中分离，后者还包含在酸性乳清中包含的其它可溶性奶组分(主要是α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白)。这可以通过适合选择性除去上述乳清级分的任何合适的分离技术，如HICl或离子交换层析进行。
本发明基于令人惊奇地认识到胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质包含适合促进GLP-1和(与之结合的)GLP-2释放的生物活性成分。
然而，来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的进一步分级分离及筛选显示胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的某些亚级分是优选的。
进一步分离更有效的亚级分可通过如疏水作用层析(HIC)，或通过疏水相互作用高效液相层析(HI-HPLC)，反相高效液相层析等实现，所有这些方法都基于相同的分离原理。
HIC的原理为技术人员已知的。通常地，样品装入包含能滞留该样品的疏水材料的平衡柱(固定相)。疏水材料可以是，如，大孔交联的聚苯乙烯，例如商品化的Amberlite Xad 16(XAD 16来自Rohm和Hass)。Amersham的15 RPC TN 17-0727-02(聚苯乙烯-二乙烯基苯)或等同物也可使用。
在根据本发明的蛋白质级分装载到柱子上之前，应该用缓冲液平衡柱子。装载级分后，缓冲液或缓冲液混合物(移动相)可以流过柱子，其中缓冲液混合物改变并且可以具有根据疏水性从柱子洗脱的蛋白质亚级分，这些亚级分具有不同的性质。
根据该方法分离乳清蛋白质描述于″Simultaneous separation andquantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptoneand caseinomacropeptide by reversed-phase high performance liquidchromatography on polystyrene-divinylbenzene″，D.F.Elgar等人，Journal of Chromatography A 878(2000)183-196。
从柱子上洗脱的蛋白质亚级分可用实现它们从固定相上洗脱的缓冲液混合物的组成或乙腈含量来精确描述。
例如，来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质可以加到装填聚苯乙烯-二乙烯基苯珠(15 RPC TN 17-0727-02，Amersham)的柱子上，缓冲液A可定义为水中的0.1体积％三氟乙酸(TFA)，缓冲液B可定义为水中的80体积％乙腈和0.85体积％TFA。
然后，缓冲液A和B的混合和传输可由特定系统，如FPLC(快速蛋白质液相层析)UNICORN工作站(Pharmacia，Amersham)控制，并流过柱子。
洗脱的蛋白质亚级分可由上述缓冲液A和B的混合比例的洗脱范围来限定。利用特定的缓冲液组成，蛋白质亚级分的洗脱时间或间隔可简单地由本发明的蛋白质级分在洗脱时的存在的乙腈的相对量来描述。然而，值得注意的是，洗脱顺序是依赖pH值的。
下表1通过缓冲液B的体积百分比范围或乙腈的范围定义了根据发明的胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的14种酸溶性蛋白质亚级分，在所述乙腈范围内洗脱根据本发明的优选实施方案的亚级分。
表1通过疏水作用层析定义的来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的亚级分
缓冲液A水TFA 0.1％缓冲液B乙腈/水/TFA(80％/19.15％/0.85％；v/v)柱子Source 15 RPC Amersham(基质聚苯乙烯/二乙烯基苯)，柱体积(CV＝100ml)梯度从20％B缓冲液开始，1柱体积(CV)后注射样品，然后以15CV将梯度增加到高达75％B，然后用2CV达到100％B缓冲液。
如果希望，亚级分可通过蒸发、超滤或透析以除去有机溶剂进行浓缩，然后干燥，例如通过真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、流化床干燥、烘烤干燥或任何其它适合的干燥方法干燥。
亚级分5、6、7、8、9、10和11在促进GLP-1体外释放中特别有效并构成了本发明的优选实施方案。亚级分5、7、8和11构成了更优选的实施方案。
已经表明亚级分5对体外模型的细胞有毒性作用，因此可证明该级分在人或动物上的适用性较小。
胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质包含提高体外模型中GLP-1分泌的生物活性成分。
因此，级分或所选亚级分可用于调节依赖或由GLP-1、GLP-2或胰岛素控制的过程。实例是预防或治疗I或II型糖尿病，调节血糖浓度，抑制胃能动性和分泌，减少液体和固体的胃排空速率，减小小肠转运，抑制平滑肌活动，降低膳食引起的葡萄糖偏离，延缓肠中营养物的酶分解和吸收，降低食欲，减少食物摄取，等等。
例如，该级分可用于降低人或动物的总体消化和吸收活性。
蛋白质级分可添加到消费品或药物中。消费品的实例为营养配方、婴儿配方或临床配方。其它的实例是饮料，如耐储存的、冷冻的或即时可饮的饮料。该级分可添加到其它食品，如巧克力、营养巴、谷类、奶制品、冰淇淋、冷冻食品、宠物食品、咖啡、胶囊剂、片剂等。
下面的实施例仅用于阐明并且决不能解释为限制本发明的主题。除非另外指出，百分比和部分是按重量计算的。
实施例1从胶束酪蛋白中分离酸溶性蛋白质牛奶从当地市场获得(瑞士，toni lait，2000-02-01)。
通过1000-4500g的离心从全脂奶提取乳酪。通过用固定角转子SorvallGS3将加速度增加到13,600g(30分钟内9000转/分钟)提高该步的选择性。从2200ml全脂奶开始，在顶层回收90g乳酪。
然后，将250μl CaCl2200mM添加到250ml脱脂乳中达到2mM终浓度。将奶在固定角转子45TI(Beckman L8-60M超速离心机；32,000转/分钟，对应于管中间100,000g)中超速离心(6管含42.1g脱脂乳)1小时从不溶的胶束酪蛋白分离乳清。
胶束酪蛋白(24g)分散于220ml CaCl22mM/NaCl 0.9％中并如上超速离心。将22g洗涤的经回收胶束酪蛋白分散在CaCl22mM/NaCl 0.9％中并将体积调节到250ml。将其等分试样，标上不溶蛋白质(胶束酪蛋白)并冷冻。
从190g全脂奶开始，将所洗涤的不溶性蛋白质沉淀物(17g)分散在40ml乙酸钠缓冲液20mM pH4.6中。
由于酪蛋白的缓冲行为，添加乙酸将pH(6.5)调节到4.6，通过添加醋酸盐缓冲液将体积调整到最初奶体积的一半(90ml)。溶液经离心(12,000g，30分钟)并将上清液(77g)标上来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质。
对于下面的实施例3，将样品浸于液氮中冷冻，并在-20℃保存。
实施例2不同的牛奶级分促进的GLP-1释放材料和方法MH(肉水解产物)和EAH(蛋白蛋白水解产物)购于Sigma，基质胶(matrigel)购于BD bioscience。CGMP根据WO 9853702中描述获得。
获得脱脂乳、甜乳清、酸性乳清、酸性酪蛋白、可溶性蛋白质、不溶性蛋白质的分级分离步骤从常规奶方法(见Alais C.1984 science du lait，Principe des Techniques Laiti ères，4 è me é dition，SEPAIC，Paris，29-35，159-178)改编。在更高的加速率下离心并洗涤不溶级分以增加选择性和分离效率。
酸性酪蛋白是酸处理脱脂乳后从沉淀物收集的酪蛋白。可溶性蛋白质是以100,000g超速离心脱脂乳1h(见实施例1)后在水溶液中回收的蛋白质，不溶性蛋白质(胶束酪蛋白)是之后在沉淀中回收的部分。
来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质从实施例1获得，基本上是通过酸化和离心上面段落的所得酸性酪蛋白获得。
将NCI-H716人肠细胞系(ATCC号CCL-251)在37℃培养在含5％CO2的湿润培养箱中。为了增殖，细胞悬浮生长在添加了10％FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(Life Technologies Inc)中。对于分泌研究，将细胞接种在基质胶涂布的平板上，并在添加了10％FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM(低葡萄糖)(Life Technologies Inc)中孵育2天。
在实验前两天，细胞以一百万个细胞/每孔接种在12孔板中。在实验当天，细胞用HBSS(Hank′s Balanced Salt Solution；Life Technologies Inc)洗涤一次，并在不同蛋白质溶液存在下37℃孵育2小时。将受试蛋白质溶于含0.2％BSA(级分V；Sigma)的pH 7.4的1ml KRBB中(Krebs-Ringer平衡缓冲液)中。在培养期结束时，用10μl PMSF 200mM回收上清液并在-80℃立即冷冻。
以两种浓度每ml培养基中0.5mg蛋白质和5mg蛋白质加入蛋白质溶液。
结果图1显示不同浓度(0.5和5mg/ml)的不同奶蛋白质级分对体外GLP-1释放的影响。根据实施例1获得的来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质即使在低浓度(0.5mg/ml)下也对GLP-1释放具有最高影响。
总之，通过根据实施例1的方法获得的来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质包含生物活性成分。这些因子可用于人或动物体的疾病预防或治疗。GLP-1的释放提示这些成分在预防和治疗如糖尿病和肥胖症中的有用性和工业应用性。
实施例3来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的亚分级分离如下进行疏水相互作用液相层析用。用100ml Source 15 RPC TN17-0727-02(聚苯乙烯-二乙烯基苯)填充的HR16×50柱连接由UNICORN工作站(Amersham Pharmacia Biotech)控制的FPLC系统。将15ml HCl酸溶性级分(见实施例1)在37℃水浴中解冻20分钟，通过涡旋混合并在5415Eppendorf离心机中以13000转/分钟离心1分钟。在0.45μm Millipore滤器(306/GSWP04700.GS)上过滤后，注射10ml该制备物。
层析条件为A缓冲液水中的0.1％TFA(在0.45μm Millipore系统上过滤的2000ml miliQ水，加入2ml TFA(Sigma 91699，100ml)；B缓冲液乙腈80％，TFA 0.85％(在0.45μm Millipore系统上过滤的400ml miliQ水，加入1600ml乙腈，并在超声浴中脱气15分钟，最后加入1.7ml TFA)。
柱子用20％B缓冲液平衡。一个柱体积(CV)后，将样品注入，B缓冲液在15个CV内增加到75％并在2.5CV内增加到100％。最后，梯度在0.4个CV内降低到20％。流速固定在3ml/分钟。
用塑料管收集96个18ml级分。级分保存在-20℃。经HPLC分析后，通过HPLC图的相似性将96个收集管合并成14个级分并蒸发浓缩后冻干用于随后检测。
记录215nm处的紫外吸收，对应的HIC图在图3中给出。
用本说明书的表1中描述的它们从柱子上洗脱的时刻和对应的乙腈浓度(疏水性)表征来自胶束酪蛋白的14个酸溶性蛋白质亚级分。
实施例4实施例3的亚级分促进的GLP-1释放根据实施例2中给出的实验设计筛选实施例3中获得的亚级分的GLP-1释放促进能力。所有亚级分在30μg/ml的培养基中检测，只有包括所有亚级分的“总级分”在500μg/ml的培养基中检测。
在本实验中提到，所检测的疏水层析库的浓度为比实施例2中来自胶束酪蛋白的最初酸溶性蛋白质的1/16-1/17(30μg/ml相比500μg/ml)。
结果在图2中显示。在体外几乎所有级分都引起GLP-1释放增加。用亚级分5、7、8、以及9、10、和11在非常低的蛋白质浓度(30μg蛋白质/ml培养基)发现非常强的增加。
然而，发现亚级分5对细胞系有毒性作用。
总之，亚级分7、8、9、10和11包含生物活性分子或成分。这些可作为药物，其特别用于治疗II型糖尿病，也可能治疗I型糖尿病或肥胖症。在人体或动物体内GLP-1的多种其它效果解释了如权利要求中给出的亚级分的其他应用。
实施例5包含来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的营养配方根据推荐值(315KJ/dl)，用根据实施例1的胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质完成了按干物质重量百分比计包含14％蛋白质、62％糖、18％脂肪和3.2％矿物质和维生素的营养配方。
以生理有效量加入酸溶性蛋白质。在完整的、确限营养配方中(预计消费为每天2升)将最终浓度调节为0.1-0.5mg/ml配方。在作为其它营养物补充的配方中(预计消费为每天2升)中，调节浓度到1-5mg/ml配方。根据情况和个人需要使用更高的剂量。
实施例6包含来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质亚级分的营养配方实施例5的配方富含在实施例3中获得的亚级分7和8的蛋白质，而不是实施例1所得到的蛋白质。
对于完整配方(见实施例5)，将营养配方中亚级分干物质的量调节到5-25μg/ml液态配方，对于2dl的日剂量调节到50-250μg/ml(补充品)。
还制备了包含亚级分的高剂量配方(对于上述2dl补充物浓缩10倍)。根据本发明的蛋白质浓度在2dl中为0.5-2.5mg/ml。
权利要求
1.得到胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质级分的方法，其包括步骤分离胶束酪蛋白或酶处理的酪蛋白和乳清蛋白质，酸化胶束酪蛋白或酶处理的酪蛋白到低于6的pH，从酪蛋白分离酸溶性蛋白质，和分离酸溶性蛋白质的不同亚级分。
2.来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的亚级分，其特征在于它可以通过疏水作用层析获得并且通过包含26.4到36体积％乙腈的流动相从疏水固定相洗脱该级分。
3.来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的亚级分，其特征在于该级分可以通过疏水作用层析获得并且通过包含43.2到46.4体积％乙腈的流动相从疏水固定相洗脱该级分。
4.来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用作药物或预防性或治疗性治疗人体或动物体。
5.根据权利要求2-4的酸溶性蛋白质，其中该酸溶性蛋白质包含选自根据权利要求2、权利要求3的蛋白质、 蛋白胨5、 蛋白胨8、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和其混合物的蛋白质。
6.来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于增强胰岛素分泌和/或胰岛素原基因表达的消费品或药物。
7.来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于预防或治疗I型和/或II型糖尿病的消费品或药物。
8.来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于增加GLP-1和/或GLP-2分泌和/或调节血液中葡萄糖浓度的消费品或药物。
9.来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于降低胃排空和酸分泌的消费品或药物。
10.来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备用于调节食欲，降低食物摄取和/或增加饱满感的消费品或药物。
11.来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质的用途，用于制备消费品或药物，所述消费品或药物用于治疗以受伤或功能异常为特征的肠疾病和/或用于增加肠粘膜的厚度和/或表面积。
12.消费品，其包含根据权利要求2-5任一项的任一种蛋白质级分或亚级分。
全文摘要
本发明涉及通过酸化胶束酪蛋白并将沉淀的酪蛋白即酸溶性蛋白质从胶束酪蛋白中分离可以获得的奶级分。发现奶级分，特别是其某些亚级分具生物活性并且在体外促进GLP－1释放。基于这些结果，来自胶束酪蛋白的酸溶性蛋白质可用于治疗和预防II型糖尿病、肥胖症并可进一步添加到针对处理胃肠道的其它目的的配方中。
文档编号A23J3/32GK1860131SQ03827177
公开日2006年11月8日 申请日期2003年8月30日 优先权日2003年8月30日
发明者S·格莱姆里希, L·博韦托, C·梅斯 申请人:雀巢技术公司