专利名称：苏云金芽孢杆菌固体造粒培养方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物农药的制造方法，尤其是一种用于制备微生物杀虫剂——苏云金芽孢杆菌培养方法。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)简称B.T，是目前全世界产量最大的微生物杀虫剂。它广泛用于防治农业害虫、森林和果树害虫、贮藏害虫以及医学昆虫，并取得了显著的经济效益、社会效益和生态效益。特别是在急需发展无公害农产品的情况下，使用苏云金芽孢杆菌可以大大减少化学农药的残留，杜绝因施用化学农药而造成的人畜中毒现象。
现有技术中，一类是采用深层液体发酵技术培养苏云金芽孢杆菌(如申请号为91105123.6的中国发明专利申请所公开的《一种植物用杀虫菌的生产方法》等)，该类方法需要发酵罐、空气过滤系统、板框压滤机、浓缩罐等大型设备，工艺复杂、投资大、成本高、耗能大；另一类采用固体发酵技术，包括浅盘式、箱式和槽式发酵器培养苏云金芽孢杆菌。此类传统的固体发酵技术工艺简单、投资少、但产量低。由于苏云金芽孢杆菌属好氧微生物，透气性差将会抑制苏云金芽孢杆菌的正常生长和代谢。因此，常常往培养基料(如麦麸、米糠、玉米粉、豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等)中加入疏松剂(如谷壳、锯末、玉米芯、高粱秆等富含粗纤维的物质)来改善其透气性，但对苏云金芽孢杆菌的发酵和后处理(制成不同的剂型的过程)造成以下不良后果①苏云金芽孢杆菌生长增殖所需要的水分、空气和营养物质来自于培养基料固体颗粒表面，疏松剂的加入，大大减少了单位体积内能被苏云金芽孢杆菌所利用的有效表面积，使发酵效率降低；②苏云金芽孢杆菌几乎不分泌纤维素酶，添加的疏松剂不能被利用，既浪费了原料，又使苏云金芽孢杆菌生长增殖变慢、生产周期延长、产品的毒力效价不高；③疏松剂在发酵物中很难分离和粉碎，造成终产品的性能(如细度、稳定性、悬浮率等)达不到相关质量标准，在苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂的生产中显得更为突出。因此，上述现有培养苏云金芽孢杆菌的方法有待于改进。
发明内容
本发明的目的是对上述采用固体发酵技术培养苏云金芽孢杆菌的方法进行改进，提供一种可缩短发酵周期，降低生产能耗，增加设备生产能力和提高产品毒力效价的苏云金芽孢杆菌固体造粒培养方法。
本发明的苏云金芽孢杆菌固体造粒培养方法是按以下步骤进行①、对用于苏云金芽孢杆菌固体培养的固体培养基原料进行机械粉碎，粉碎细度在200～400目；②、在粉碎后的固体培养基原料中加水使之湿化并搅拌均匀，加水量为固体培养基原料总重量的60～80％；③、将湿化的固体培养基原料成型为颗粒，所成型颗粒的最大横截面部位的直径为2～10mm；④、将成型的颗粒在压力0.1～0.15MPa、温度121～135℃下灭菌30～45分钟；⑤、使灭菌处理后的成型颗粒自然冷却，当其温度降至28～30℃时，把苏云金芽孢杆菌的菌种液接入该成型颗粒中进行发酵培养，发酵培养温度为27～37℃、湿度为90～95％；当成型颗粒中芽孢、伴孢晶体出现40～60％游离时即终止培养。
在上述步骤①中，所采用的固体培养基原料可以是现有固体发酵培养方法中的常规原料，如麦麸、米糠、玉米粉、豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等。同时，固体培养基原料中的各个组份均按原有工艺要求的比例进行配制。也就是说，如何确定固体培养基的原料及其各组份的比例，均不是本发明方法所要解决的问题。在本发明方法的步骤①中，只需直接对按现有的固体培养方法(即按现有的原料配方)准备的常规原料实施粉碎，使之达到一定的细度即可。对固体培养基原料的机械粉碎可以采用普通的超微粉碎机械进行。在步骤②中，固体培养基原料中所加水量以能够使固体培养基料湿化，使之具有挤压成型的塑性，且成型后得到的颗粒不变形、不粘连、表面光滑为准。在必要时，还可以将其它微量成分，如酵母粉、硫酸镁、磷酸氢钠、硫酸亚铁、硫酸锌、碳酸钙等溶解于水中，再加入已搅拌均匀的固体培养基原料中。在步骤③中，可以采用现有的挤压成型设备实现造粒，所制得的成型颗粒可以是圆柱状、圆球状、椭球状或类似椭球形状的颗粒。当成型颗粒为圆柱状时，其最大横截面为圆柱的圆形横断面，而非圆柱的长度；当成型颗粒为圆球状时，其最大横截面的直径即为圆球的球径；当成型颗粒为椭球状或类似椭球的形状时，其最大横截面直径为椭球的短轴长度，而非椭球的长轴长度。所制颗粒的表面应光滑圆润、无毛刺、不开裂。就步骤④来说，采用的是现有固体发酵技术培养苏云金芽孢杆菌的常规灭菌方法。在步骤⑤中，当检测到成型颗粒中芽孢、伴孢晶体出现40～60％游离时即终止培养，而不考虑发酵培养的全程时间。这是因为，当采用不同的固体培养基原料或菌种时，其发酵培养的全程时间有可能发生较大的差异。另外，接入该成型颗粒中的菌种液可以是由苏云金芽孢杆菌斜面制得的菌种液，也可以是由三级种子罐制得的菌种液，所应用的苏云金芽孢杆菌的培养条件实际上与现有技术中的固体发酵培养条件相同。在培养结束后，可以按现有工艺要求对培养所得产物进行后处理，进而制成水悬浮剂、可湿性粉剂等成品。
本发明的有益效果是①、采用固体造粒培养技术，在培养条件下颗粒与颗粒之间形成孔隙，可以保留充足的氧气及顺畅的通风，保证了苏云金芽孢杆菌在固体培养过程中对营养和透气性的需求。有效地避免疏松剂给发酵和后处理带来不良后果。尤其适宜于苏云金芽孢杆菌固体发酵的大规模工业化生产。②、传统的固体发酵在接种后要立即进行拌料，极易染菌。采用固体造粒培养技术之后，由于颗粒的光滑表面以及孔隙作用，可以省去接种后拌料这一操作，即只在由成型颗粒堆积成的培养基料料表面喷洒菌种液，菌种液便能自然地沉降在各个成型颗粒上，并能均匀分布，减小了苏云金芽孢杆菌生产过程中杂菌感染的机率和劳动强度。③、采用固体造粒培养技术之后，使苏云金芽孢杆菌只在颗粒表面生长成厚厚的菌苔，而颗粒内部则不形成。在后处理工序中，表面的菌苔易与颗粒分离，不仅使有效成分的收得率提高，而且也容易制得极高毒力效价的苏云金芽孢杆菌产品。④、固体造粒培养技术可以同现有的任何一种苏云金芽孢杆菌固体发酵装置相结合，在提高产品毒力效价的同时，还可以缩短发酵周期，降低能耗，增加设备的生产能力。
在本发明中，为了让成型颗粒具有较为光滑的表面，并在成型颗粒之间形成足够的孔隙，可以让步骤③所制得的成型颗粒为表面具有弧形表面的颗粒。
本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。
具体实施例方式
本实施例中的苏云金芽孢杆菌固体造粒培养方法按以下步骤进行(以下所涉及的各重量份的单位为公斤)①、对用于苏云金芽孢杆菌固体培养的固体培养基原料进行机械粉碎，粉碎细度为300目。在本实施例中，采用了现有的固体培养基原料配方，被粉碎的固体培养基原料为麦麸、豆饼粉和玉米粉，三者的重量份比例为82.2比2比2。粉碎后按上述比例进行混合。
②、在粉碎后的固体培养基原料中加水使之湿化并搅拌均匀，加水量为固体培养基原料总重量的70％。在本实施例中，在向固体培养基原料中加水时，将重量份分别为1.5、0.03、0.3的微量成分酵母粉、硫酸镁和碳酸钙加水搅拌，将生石灰(重量份1.25)单独加水成石灰水溶液后与酵母粉等制成的溶液混合，再加入上述被粉碎的固体培养基原料中。另外，将重量份为4.5的鱼粉加水煮沸35分钟，与重量份为2的葡萄糖混合后，制成营养液单独灭菌待用。
③、将湿化的固体培养基原料成型为颗粒。在本实施例中，利用挤出成型设备，把混合均匀的固体培养基料挤压成圆柱状颗粒，其颗粒的最大横截面部位的直径(即圆柱的横截面直径)为4mm，颗粒长度在3cm。上述成型颗粒为表面具有弧形表面的颗粒。
④、将成型的颗粒(即颗粒状培养基料)移入高温灭菌锅进行灭菌。灭菌压力为0.1MPa，温度在121℃，灭菌40分钟，待培养基料的温度降至58℃，压力为0时移入培养室内。
⑤、使灭菌处理后的成型颗粒自然冷却，当其温度降至29℃时，把苏云金芽孢杆菌的菌种液接入该成型颗粒中进行发酵培养，发酵培养温度为27～37℃、湿度为90～95％；当成型颗粒中芽孢、伴孢晶体出现40～60％游离时即终止培养。具体过程是当由成型颗粒堆积而成的培养基料的温度降至29℃时，把苏云金芽孢杆菌的菌种液(菌株编号HBNK-1)与一半量的营养液混合，喷入培养基料的表面(无需搅拌培养基料，菌种液便能在颗粒间的孔隙中自然沉降，并能均匀分布在颗粒上)。培养的前1～12小时，苏云金芽孢杆菌的营养体处于对数期。培养至11～12小时，营养体处于对数峰期。此时将余下的另一半量的营养液喷入培养基料表面，补充营养源。这一时期的温度控制在28～30℃。培养时间在13～25小时，此时苏云金芽孢杆菌的营养体处在稳定期，这一时期的温度控制在30～32℃。26小时以后，苏云金芽孢杆菌的营养体处在芽孢及伴孢晶体游离阶段，此时的温度控制在34～36℃，以促进其老熟。培养时间至32～34小时，有50％的芽孢及伴孢晶体游离，故终止培养。整个发酵过程控制湿度在90～95％。此时在颗粒表面形成厚厚的一层苏云金芽孢杆菌的菌苔(如果将培养基料直接干燥、粉碎后，测定其毒力效价在14000～16000IU/mg)。
在本实施例中，上述培养结束后，按现有工艺要求对培养所得产物进行了后处理，其处理方法是A、将培养结束的固体培养基料倒入搅拌罐中加入1.8倍的无菌水，机械搅拌30分钟，生长在培养基料表面的苏云金芽孢杆菌菌苔，通过表面光滑的颗粒之间的相互磨擦，被洗入水中成为苏云金芽孢杆菌的菌液，而培养基料在短时间内不会溶散开，极易实现苏云金芽孢杆菌与固体培养基料的分离。
B、将搅拌后的混合液通过2mm的振动筛进行自然沉降，颗粒状的培养基料被滤出，滤出液粗滤后通过离心机进行细滤，滤液再通过200目滤布后，装入盛放第一次菌液的贮罐。将滤渣再加入无菌水，再重复洗涤一次。得到的菌液装入第二次菌液的贮罐。经过3次复洗，有效成份的收得率在93％。
C、将上一批次生产的第一次菌液作为水洗液，加入到下一批次的培养基料中，重复上述操作进行洗涤。即可获得高毒力效价的苏云金芽孢杆菌的菌液。
D、将分级获得的菌液直接制备2000IU/μl(合格品)、4000IU/μl(一级品)、8000IU/μl(优级品)的水悬浮剂产品。
E、将获得的高毒力效价的菌液经过浓缩、干燥，可以制备出40000IU/mg(合格品)、50000IU/mg(一级品)的苏云金芽孢杆菌原粉。也可以将发酵结束后的固体培养基料直接干燥、粉碎后制备8000IU/mg(合格品)、16000IU/mg(一级品)的可湿性粉剂产品。
为了进一步说明本发明方法的技术效果，以下特给出采用现有固体发酵方法培养苏云金芽孢杆菌的例子，即对照例对照例的原料配方同本发明以上实施例的配方。
其生产过程为第一步将原料(鱼粉、葡萄糖除外)按比例进行混合，加入总水量的70～80％混合均匀。鱼粉加水煮沸30-40分钟，与葡萄糖混合后制成营养液单独灭菌待用。
第二步把配制好的固体培养基料移入高温灭菌锅进行灭菌。灭菌压力为0.1MPa，温度在121℃，灭菌40分钟，待培养基料的温度降至58℃，压力为0时移入培养室内。
第三步当培养基料的温度降至29℃时，把苏云金芽孢杆菌的种子液(菌株编号HBNK-1)与营养液混合，接入已灭菌的固体培养基料中，拌和均匀，并且每隔6小时翻料一次。1～17小时，苏云金芽孢杆菌的营养体处于对数期，这一时期的温度控制在28～30℃。培养时间在18～32小时，苏云金芽孢杆菌的营养体处在稳定期，这一时期的温度控制在30～32℃。33～50小时，此时期的温度控制在32～34℃。整个发酵过程控制湿度在90～95％。当有50％的芽孢及伴孢晶体游离，便终止培养，此时发酵周期在50小时左右。而且培养基料的表面肉眼看不出厚厚的菌苔。将培养基料直接干燥、粉碎后，测定其毒力效价在8000～10000IU/mg。
现将本发明实施例(固体造粒培养)和对照例(常规固体培养)发酵的基本情况进行比较，列表如下固体造粒培养与常规固体培养基本情况对照表
从以上对照表可以看出，与现有同类方法相比较，采用本发明的苏云金芽孢杆菌固体造粒培养方法的发酵周期大为缩短，产品的毒力效价和有效成份的收得率显著提高，可生产的品种增多，劳动强度减小，生产成本降低，生产能耗也较小，从而具有极高的应用价值。
权利要求
1.一种苏云金芽孢杆菌固体造粒培养方法，其特征是按以下步骤进行①、对用于苏云金芽孢杆菌固体培养的固体培养基原料进行机械粉碎，粉碎细度在200～400目；②、在粉碎后的固体培养基原料中加水使之湿化并搅拌均匀，加水量为固体培养基原料总重量的60～80％；③、将湿化的固体培养基原料成型为颗粒，所成型颗粒的最大横截面部位的直径为2～10mm；④、将成型的颗粒在压力0.1～0.15MPa、温度121～135℃下灭菌30～45分钟；⑤、使灭菌处理后的成型颗粒自然冷却，当其温度降至28～30℃时，把苏云金芽孢杆菌的菌种液接入该成型颗粒中进行发酵培养，发酵培养温度为27～37℃、湿度为90～95％；当成型颗粒中芽孢、伴孢晶体出现40～60％游离时即终止培养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是在步骤③中，所制得的成型颗粒为表面具有弧形表面的颗粒。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是在步骤⑤中，通过向由成型颗粒堆积成的培养基料表面喷洒菌种液，完成将苏云金芽孢杆菌的菌种液接入成型颗粒中的操作。
全文摘要
一种苏云金芽孢杆菌固体造粒培养方法，其特征是按以下步骤进行①对固体培养基原料进行机械粉碎，粉碎细度在200～400目；②在粉碎后的固体培养基原料中加水使之湿化并搅拌均匀，加水量为固体培养基原料总重量的60～80％；③将湿化的固体培养基原料成型为颗粒，所成型颗粒的最大横截面部位的直径为2～10mm；④将成型的颗粒灭菌；⑤把菌种液接入成型颗粒中进行发酵培养。采用本发明的苏云金芽孢杆菌固体造粒培养方法的发酵周期大为缩短，产品的有效成分的收得率显著提高，可生产的品种增多，劳动强度减小，生产成本降低，生产能耗也较小，发酵产物的毒力效价达到14000～16000 IU/mg。
文档编号C12N1/20GK1554743SQ200310104078
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月22日 优先权日2003年12月22日
发明者胡佩, 阎玉鹏, 胡 佩 申请人:胡佩, 阎玉鹏, 胡 佩