专利名称：用于基因芯片的免pcr扩增的信号放大试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片技术领域。更具体地，涉及用于基因芯片的免PCR扩增的信号放大试剂。
背景技术：
基因芯片技术是随着“人类基因组计划”(human genome project，HGP)的进展而发展起来的，它是上世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，被广泛应用于基因序列分析、基因突变检测及单核苷酸多态性分析以及疾病的基因诊断等领域，其特点是一次试验能得到大量的生物学信息。
由于基因芯片与原始DNA模板的杂交是固相与液相之间的反应，反应效率低，且受目前检测方法灵敏度所限，所以杂交前必须对原始DNA模板的目标区段进行大量的复制，同时标记荧光素或生物素以便于信号的检出。
PCR扩增及电泳检查很费时，通常约需2～3小时，约占整个试验过程一半的时间。另外防止PCR扩增污染也是令众多研究人员头痛的问题。
因此，本领域特别需要开发快速、准确的基因芯片技术，尤其是能够免除PCR扩增的基因芯片技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能免除PCR扩增，从而大幅度缩短基因芯片实验过程的技术及其相关的试剂。
本发明的另一目的就是提供相关的试剂。
在本发明的第一方面，提供了一种下式所示的锁核酸复合物，F-B-LNA式中，F表示荧光素、生物素、荧光纳米微球或链亲和素纳米微球；
LNA表示4-6聚体的锁核酸；B表示化学键或选自下组的连接基团-HNCO-、-HNPO3-、-HCN-、-链亲和素-生物素-和二硫键；若F是荧光素或生物素，则F与LNA的摩尔比是1∶1，若F是荧光纳米微球或链亲和素纳米微球，则F与LNA的摩尔比为1∶10～104(更佳地为1∶102～103)。
在另一优选例中，所述纳米微球的直径为10-100nm，微球包裹了荧光素且表面被-NH2、-COOH、-PO4、-SH活性基团修饰，或微球包裹了链亲和素。
在另一优选例中，所述纳米微球的成分选自聚苯乙烯、三聚氰胺脂或硅。
在另一优选例中，所述LNA纳米微球上的LNA带有8-15个PolyA或PolyT尾巴，且尾巴末端被-NH2或-COOH或-SH或-PO4或-生物素活性基团修饰，以便使LNA纳米微球与目标DNA杂交进行信号放大时有较高地自由度。
在本发明的第二方面，提供了一种用于基因芯片的免PCR扩增的LNA组合物，它含有缓冲液和本发明上述的LNA复合物，而且当LNA是4聚体时，该组合物含有44种LNA纳米微球或标记了荧光素或生物素的LNA，每种LNA纳米微球表面连有一种碱基序列的4聚体；当LNA是5聚体时，该组合物含有45种LNA纳米微球或标记了荧光素或生物素的LNA，每种LNA纳米微球表面连有一种碱基序列的5聚体；当LNA是6聚体时，该组合物含有46种LNA纳米微球或标记了荧光素或生物素的LNA，每种LNA纳米微球表面连有一种碱基序列的6聚体。
在另一优选例中，所述的LNA是4聚体。
在另一优选例中，所述的LNA是5聚体。
在另一优选例中，所述的LNA是6聚体。
在本发明的第三方面，提供了了一种免PCR扩增用于基因芯片杂交信号检测的方法，包括以下步骤(a)将含原始DNA分子的待测样品与基因芯片杂交，该芯片上固定有捕获待测DNA分子的单链核酸探针；(b)洗涤去除未杂交的DNA分子；(c)用与基因芯片上的各探针互补的核酸封闭基因芯片上未发生杂交反应的探针，其中包括阴性探针和过量的阳性探针；(d)洗涤去除用于封闭的过量的互补核苷酸；
(e)将基因芯片与本发明上述的LNA组合物在20～30℃下混合15-60分钟，使LNA组合物结合于被基因芯片上的探针捕获的DNA分子；(f)洗去基因芯片上过量的LNA组合物；(g)检测LNA组合物的荧光或链亲和素或生物素。
较佳地，在步骤(e)中是在常规杂交液盐离子强度(如5～6×SSC)下混合。
在另一优选例中，在步骤(g)中，若为荧光检测，基因芯片可直接用荧光扫描仪检测，若为酶联显色，基因芯片还需与生物素-HRP或链亲和素-HRP在室温(20～25℃)5×SSC离子强度下反应15分钟洗涤后用TMB显色。
在本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，它含有容器和装于容器中本发明上述的锁核酸复合物或LNA组合物。
图1显示了本发明一个实例中的信号检测示意图。其中1为DNA芯片基片，2为固定在DNA芯片上的探针，3为与探针2发生杂交的一条DNA单链，4为本发明的纳米微球，所述的微球为荧光纳米微球或链亲和素纳米微球5，6为LNA。
图2显示了本发明另一实例中的信号检测示意图。其中1为DNA芯片基片，2为固定在DNA芯片上的探针，3为与探针2发生杂交的一条DNA单链，4为本发明的LNA，5为标在LNA上的荧光素或生物素。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，有机而巧妙地将短片段寡核苷酸的高杂交概率、“锁核酸”(Locked Nucleic Acid，简称为“LNA”)对互补核酸的高亲和性和稳定性，以及信号放大技术结合在一起，从而首次实现了在不进行PCR扩增的情况下对基因芯片杂交信号的快速检测。
如本文所用，术语“LNA纳米微球”指由LNA和纳米级(直径小于100nm)荧光纳米微球或链亲和素纳米微球通过化学键(如-CO-NH-或-链亲和素-生物素-)连接在一起所形成的纳米微球。
术语“荧光纳米微球”和“链亲和素纳米微球”指纳米级(直径小于100nm)纳米微球与荧光基团或链亲和素通过化学键(如-CO-NH-)连接在一起所形成的纳米微球。
荧光纳米微球、链亲和素纳米微球和标记了荧光素或生物素的LNA是本领域中已知的，可通过商业途径购得。
将荧光纳米微球或链亲和素纳米微球与LNA偶联也是本领域的常规技术。以下为几种制备LNA纳米微球的方法。
1.-NH2修饰的一种碱基序列的LNA 5mmol·L-1加入N-ethyl-N′(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC)、0.33mmol·L-1N-hydroxysulfosuccini-mide(NHSS)和0.1mol·L-12-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)的缓冲溶配制成50nmol·L-1的稀溶液；分别取上述50nmol·L-1-NH2修饰的LNA和COOH-修饰的FITC荧光素包裹的硅纳米微球溶液(2.5％)各1μL混入100μL上述由EDC、NHSS和MES组成的缓冲液中，20℃反应2-4小时；混合液8000r/min离心1min，弃去上清液，经反复5次0.02％SDS和水洗及离心后，沉淀物分散于100μL磷酸盐缓冲液(pH6.5)中，即得一种碱基序列的LNA荧光纳米微球溶液，同法可得其他4聚体LNA荧光纳米微球溶液。
2.-NH2修饰的FITC荧光素包裹的硅纳米微球溶液(2.5％)1μL加入100μL 1％戊二醛磷酸盐缓冲液(pH6.5)中，室温(25℃)反应1小时。混合液8000r/min离心1min，弃去上清液，经反复3次水洗和离心后，沉淀物分散于100μL磷酸盐缓冲液(pH6.5)中，即得醛基修饰的FITC荧光素包裹的硅纳米微球溶液。
-NH2修饰的一种碱基序列的LNA 5mmol·L-11μL和醛基修饰的FITC荧光素包裹的硅纳米微球溶液1μL加入100μL磷酸盐缓冲液(pH6.5)中，室温(25℃)反应1小时。混合液8000r/min离心1min，弃去上清液，经反复5次0.02％SDS和水洗及离心后，沉淀物分散于100μL磷酸盐缓冲液(pH6.5)中，即得一种碱基序列的LNA荧光纳米微球溶液，同法可得其他4聚体LNA荧光纳米微球溶液。
3.生物素修饰的一种碱基序列的LNA用去离子水稀释至1nmol·L-1，并取1μL与包裹链亲和素的纳米硅微球溶液1μL混入100μL合适的缓冲液(如2×SSC)室温反应30min。在此条件下链亲和素的量是生物素量的上千倍，因此还有大量的链亲和素可结合生物素-HRP用于最终的信号检测。
混合液8000r/min离心1min，弃去上清液，经反复5次0.02％SDS和水洗及离心后，沉淀物分散于100μL磷酸盐缓冲液(pH6.5)中，即得一种碱基序列的LNA链亲和素纳米微球溶液，同法可得其他4聚体LNA链亲和素纳米微球溶液。
本发明的信号放大的基本技术原理如下，然而应理解，本发明的范围并不受该原理的限制。
1.核酸探针长度与特异性的关系核酸探针长度与特异性的关系可用数学公式归纳为f＝L/4N式中，f为特异性系数，L为某生物基因组DNA的碱基数，N为探针的碱基个数。
可以看出，在L一定的情况下，N越大，f越小，即探针的特异性越高，反之则低。例如1个16bp的寡核苷酸探针理论上在约3×109个碱基(416＝4×109)的人类基因组上只能找到1段16bp的与之完全互补的碱基序列，而4bp的寡核苷酸探针，理论上每44，即每256个碱基就有1个相同bp数且与之完全互补的碱基序列。对于人类基因组，16bp和4bp两种探针的f分别为0.71和1.1×107(L取约3×109个碱基)。
2.LNALNA是锁核酸(Locked Nucleic Acid)的缩写。LNA的结构和制备方法是本领域技术人员已知的，可参见各种文献和专利，例如Locked nucleic acid(LNA)fine-tuning the recognition of DNA and RNA Dwaine A.Braasch，David R.Corey Chemistry & Biology 8(2001)1-7。
LNA的特点是它与互补的DNA或RNA有高度的亲和性，形成的杂交体非常稳定，4聚体、5聚体、6聚体和7聚体的100％LNA的Tm值分别约为32、40、56、65℃。
3.信号放大参见附图1和附图2。
当原始DNA样品与基因芯片杂交并洗涤后，与探针2发生杂交的原始DNA模板的一条DNA单链3被保留下来。除形成杂交体的区域之外，单链3的其他绝大部分任为单链或局部二级结构。
对于一种碱基序列的4聚体LNA(如GGCA)，理论上在原始DNA模板的1条链中每256个(44个)碱基就能形成1个杂交体。对于上述LNA复合物的LNA纳米微球，1个荧光纳米微球或链亲和素纳米微球5上固定了一种序列的LNA(图1中6所示)，因此每个杂交体具有1个荧光纳米微球或链亲和素纳米微球(图1中5所示)；而对于上述LNA复合物的标记了荧光素或生物素LNA，每个杂交体有1个荧光素或生物素(图2中5所示)。目前市售核酸提取试剂盒提取的人基因组DNA片段长度一般不小于50kb，则50kb的单链理论上能结合约195个荧光纳米微球或链亲和素纳米微球或荧光分子或生物素。由于使用的纳米微球中除了含序列为GGCA的LNA的纳米微球之外，还含有其他序列的LNA(如TTCA、TACA、GGGG等)纳米微球，因此，每种序列的4聚体LNA都存在约195个结合位点。理论上50kb的DNA片段最多能结合12500个不同序列的4聚体的LNA，即12500个荧光纳米微球或链亲和素纳米微球或荧光分子或生物素。而一个荧光纳米微球或链亲和素纳米微球上可包被或结合有104～105个荧光分子或生物素标记的辣根过氧化酶(生物素-HRP)，则理论上LNA复合物的LNA纳米微球对1个原始DNA模板的信号放大倍数可达到108～109，而LNA复合物的标记了荧光素或生物素的LNA对1个原始DNA模板的信号放大倍数为12500。实时荧光定量PCR在18个循环时就能检测到较稳定的荧光信号，理论上此时对1个原始DNA模板的信号放大倍数为2.5×105。因此LNA复合物的LNA纳米微球既适合用于痕量病源微生物DNA的检测，又适合用于高丰度DNA样本的检测，如人和其他动植物的DNA；而LNA复合物的标记了荧光素或生物素的LNA适合用于高丰度DNA样本的检测，如人和其他动植物的DNA。
由于LNA有与各探针结合的可能，所以必须在LNA复合物与原始DNA分子结合之前先用与芯片上固定的探针互补的核苷酸封闭对标本显阴性的探针和过量的对标本显阳性的探针，以保证每个探针信号的特异性。
可用于本发明的信号放大技术没有特别限制，优选的信号放大系统包括(但并不限于)链亲和素-生物素检测系统、荧光检测系统等。
本发明还提供了一种免PCR扩增用于基因芯片杂交信号检测的方法，它包括步骤(a)将含原始DNA分子的待测样品与基因芯片杂交，该步骤可用本领域技术人员熟知的常规方法和条件进行。
(b)洗涤去除未杂交的原始DNA分子，该步骤可用本领域技术人员熟知的常规方法和条件进行。
(c)用与单链探针互补的核苷酸封闭未反应(即未与DNA分子结合)的探针。该步骤可用本领域技术人员熟知的常规方法和条件进行。
(d)洗涤去除过量的与单链探针互补的核苷酸，该步骤可用本领域技术人员熟知的常规方法和条件进行。
(e)将基因芯片与本发明的LNA组合物在室温(20～25℃)常规杂交液盐离子强度(如5～6×SSC)条件下混合30分钟，使LNA复合物结合于被基因芯片上的探针捕获的原始DNA分子。
(f)利用LNA复合物的信号分子(荧光分子或链亲和素或生物素)检测。具体的检测方法取决于所选用的信号放大系统。例如，采用荧光纳米微球或荧光标记的LNA，则用激光扫描仪检测信号；若是链亲和素纳米微球或生物素标记的LNA，可用生物素-HRP或链亲和素-HRP进行酶联显色法检测信号。
本发明的主要优点是(1)检测快速；(2)操作简便，免除了PCR扩增；(3)检测结果准确。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例14聚体LNA荧光纳米微球的制备-NH2修饰的一种碱基序列的LNA 5mmol·L-1加入N-ethyl-N′(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC)、0.33mmol·L-1N-hydroxysulfosuccini-mide(NHSS)和0.1mol·L-12-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)的缓冲溶配制成50nmol.L-1的稀溶液；分别取上述50nmol·L-1-NH2修饰的LNA和COOH-修饰的FITC荧光素包裹的硅纳米微球溶液(2.5％)各1μL混入100μL上述由EDC、NHSS和MES组成的缓冲液中，20℃反应2-4小时；混合液8000r/min离心1min，弃去上清液，经反复3次水洗和离心后，沉淀物分散于100μL磷酸盐缓冲液(pH6.5)中，即得一种碱基序列的LNA荧光纳米微球溶液，同法可得其他4聚体LNA纳米荧光纳米微球溶液。
4聚体LNA链亲和素纳米微球的制备生物素修饰的一种碱基序列的LNA用去离子水稀释至1pmol·L-1，并取1μL与包裹链亲和素的纳米硅微球溶液(2.5％)1μL混入100μL合适的缓冲液(如2×SSC)室温反应30min。在此条件下链亲和素的量是生物素量的上千倍，因此还有大量的链亲和素可结合生物素-HRP用于最终的信号检测。
混合液8000r/min离心1min，弃去上清液，经反复3次水洗和离心后，沉淀物分散于100μL磷酸盐缓冲液(pH6.5)中，即得一种碱基序列的LNA纳米链亲和素纳米微球溶液，同法可得其他4聚体LNA纳米链亲和素纳米微球溶液。
实施例2用于HBV DNA芯片1.HBV DNA样本的制备取全血1ml，分离血清于沸水中煮沸5分钟并浓缩至50μL后，迅速置于冰浴，用杂交缓冲液稀释10倍。
2.溶液的配制合成与DNA芯片上所有探针完全配对的各互补探针，用水溶解，并用杂交缓冲液稀释至与对应的最终用于点样的探针溶液浓度一致，如10nmol·L-1为混合溶液。
将实施例1制备的64种LNA荧光纳米微球或链亲和素纳米微球均匀分散于杂交缓冲液中，使每种LNA的浓度约为2.5×10-4nmol·L-1，即为LNA复合物信号放大试剂。
3.杂交与洗涤用原始HBV DNA样本稀释液与固定了HBV DNA探针的玻片在常规条件(如3mol·L-1TMAC，50℃)下进行1小时的杂交反应，然后洗涤玻片，以去除未杂交的DNA分子。
4.封闭探针将洗涤后的玻片与上述步骤2中制备的混合溶液进行第二次杂交，先在50℃保温0.5小时，使各互补探针与相应的未与DNA模板杂交的探针发生退火，封闭可能与LNA结合的所有探针的结合位点，2×SSC缓冲液室温下洗涤玻片或膜片。
5.结合LNA纳米微球将洗涤后的玻片与步骤2中制备的含LNA复合物信号放大试剂在室温(约20-30℃)下，在3mol·L-1TMAC条件下进行第三次杂交反应0.5小时(注意环境温度不要超过30℃)，最后用5×SSC缓冲液室温下洗涤玻片。
6.信号检测若是FITC荧光纳米微球，则用激光扫描仪检测信号。若是链亲和素纳米微球，可用生物素-HRP进行酶联显色法检测信号。
7.结果(a)本发明检测方法快速。在本实施例中，从样品处理、与基因芯片杂交到获得检测结果，通常为2～2.5小时，平均为2.3小时(荧光检测)，或者通常为2.5～3.0小时，平均为2.8小时，(链亲和素)。而常规的基因芯片试验过程样品提取需0.5～1小时，PCR扩增及电泳检查(2.5～3.0小时)和杂交洗涤(1～2小时)。
(b)本发明检测方法快速、准确，检测结果与用常规的基因芯片检测的结果完全一致。
(c)F与LNA的摩尔比为1∶102～103之间变动时，结果都非常令人满意。
实施例3人类白细胞抗原A(Human Leukocyte Antigen，HLA-A)位点的分型1.DNA样本的提取取全血1ml，DNA样本的提取可采用《分子克隆实验指南》中的常规方法，或用市售DNA提取纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司提供)，浓缩至50μL，用杂交缓冲液稀释10倍。
2.溶液的配制合成与A位点所有探针完全配对的各互补探针，用水溶解，并用杂交缓冲液稀释至与对应的最终用于点样的探针溶液浓度一致，如10nmol·L-1为混合溶液。
通过商业途径购得的荧光或生物素标记的64种随机碱基序列的4聚体LNA溶解后用杂交缓冲液3mol·L-1的TMAC中，使每种LNA的浓度约为2.5×10-4μmol·L-1，即为LNA复合物信号放大试剂。
3.杂交与洗涤用原始DNA样本稀释液与固定了HLA-A位点探针的玻片在常规条件(如3mol·L-1TMAC，50℃)下进行1小时的杂交反应，然后洗涤玻片，以去除未杂交的DNA分子。
4.封闭探针将洗涤后的玻片与上述步骤2中制备的混合溶液进行第二次杂交，先在50℃保温0.5小时，使各互补探针与相应的未与DNA模板杂交的探针发生退火，封闭可能与LNA结合的所有探针的结合位点，2×SSC缓冲液室温下洗涤玻片或膜片。
5.结合LNA纳米微球将洗涤后的玻片与步骤2中制备的LNA复合物信号放大试剂在室温(约20-30℃)下，在3mol·L-1TMAC条件下进行第三次杂交反应0.5小时(注意环境温度不要超过30℃)，最后用5×SSC缓冲液室温下洗涤玻片。
6.信号检测若是FITC荧光标记，则用激光扫描仪检测信号。若是生物素标记，可用Streptavdin-HRP进行酶联显色法检测信号。
结果(a)本发明检测方法快速。在本实施例中，从样品与基因芯片开始杂交到获得检测结果，通常为2～2.5小时，平均为2.3小时(荧光检测)，或者通常为2.5～3.0小时，平均为2.8小时，(链亲和素)。而常规的基因芯片试验过程除样品提取外包括PCR扩增及电泳检查(2.5～3.0小时)和杂交洗涤(1～2小时)。
(b)本发明检测方法准确，检测结果与用常规的基因芯片检测的结果完全一致。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种下式所示的锁核酸复合物，其特征在于，F-B-LNA式中，F表示荧光素、生物素、荧光纳米微球或链亲和素纳米微球；LNA表示4-6聚体的锁核酸；B表示化学键或选自下组的连接基团-HNCO-、-HNPO3-、-HCN-、-链亲和素-生物素-和二硫键；若F是荧光素或生物素，则F与LNA的摩尔比是1∶1，若F是荧光纳米微球或链亲和素纳米微球，则F与LNA的摩尔比为1∶102～103。
2.如权利要求1所述的LNA复合物，其特征在于，所述纳米微球的直径为10-100nm，微球包裹了荧光素且表面被-NH2、-COOH、-PO4、-SH活性基团修饰，或微球包裹了链亲和素。
3.如权利要求1所述的LNA复合物，其特征在于，所述纳米微球的成分选自聚苯乙烯、三聚氰胺脂或硅。
4.如权利要求1所述的LNA复合物，其特征在于，所述LNA纳米微球上的LNA带有8-15个PolyA或PolyT尾巴，且尾巴末端被-NH2或-COOH或-SH或-PO4或-生物素活性基团修饰。(使LNA纳米微球与目标DNA杂交进行信号放大时有较高地自由度。)
5.一种用于基因芯片的免PCR扩增的LNA组合物，其特征在于，它含有缓冲液和权利要求1所述的LNA复合物，而且当LNA是4聚体时，该组合物含有44种LNA纳米微球或标记了荧光素或生物素的LNA，每种LNA纳米微球表面连有一种碱基序列的4聚体；当LNA是5聚体时，该组合物含有45种LNA纳米微球或标记了荧光素或生物素的LNA，每种LNA纳米微球表面连有一种碱基序列的5聚体；当LNA是6聚体时，该组合物含有46种LNA纳米微球或标记了荧光素或生物素的LNA，每种LNA纳米微球表面连有一种碱基序列的6聚体。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的LNA是4聚体。
7.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的LNA是5聚体。
8.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的LNA是6聚体。
9.一种免PCR扩增用于基因芯片杂交信号检测的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将含原始DNA分子的待测样品与基因芯片杂交，该芯片上固定有捕获待测DNA分子的单链核酸探针；(b)洗涤去除未杂交的DNA分子；(c)用与基因芯片上的各探针互补的核酸封闭基因芯片上未发生杂交反应的探针，其中包括阴性探针和过量的阳性探针；(d)洗涤去除用于封闭的过量的互补核苷酸；(e)将基因芯片与权利要求5所述的LNA组合物在20～30℃下混合15-60分钟，使LNA组合物结合于被基因芯片上的探针捕获的DNA分子；(f)洗去基因芯片上过量的LNA组合物；(g)检测LNA组合物的荧光或链亲和素或生物素。
10.一种试剂盒，它含有容器和装于容器中的权利要求1所述的锁核酸复合物或权利要求5的组合物。
全文摘要
本发明公开了一种下式所示的锁核酸复合物，F－B－LNA。式中，F表示荧光素、生物素(Biotin)、荧光纳米微球或链亲和素(Streptavidin)纳米微球，LNA(Locked Nucleic Acid)表示4－6聚体的锁核酸，B表示连接基团或化学键。还提供了含有该LNA复合物的试剂盒和利用该LNA复合物对基因芯片杂交进行信号放大的方法。本发明方法可以免除PCR扩增，从而大幅度缩短基因芯片实验过程。本发明具有快速、简便、准确的特点。
文档编号C12Q1/68GK1611611SQ200310108299
公开日2005年5月4日 申请日期2003年10月31日 优先权日2003年10月31日
发明者庞磊 申请人:庞磊