专利名称：重组大肠杆菌的发酵方法
技术领域：
本发明涉及重组大肠杆菌的发酵方法，属基因工程药物制备领域。
背景技术：
大肠杆菌的分子遗传学背景已相当明了，不断完善的基因操作技术可将大肠杆菌构建为异源蛋白生产的分子工厂，而且，这种工程菌在价格低廉的培养基中生长迅速，易于控制，大规模发酵经济。因此，重组大肠杆菌在蛋白药物的大规模生产中具有重要的经济意义。
大肠杆菌表达异源蛋白的方式依启动子不同，分为组成型和诱导型。组成型表达无任何诱导剂，从简化发酵过程操作的观点看，组成型表达系统最为简便和经济，但过早的表达产物往往会对细胞有毒害作用，使宿主菌特有的比生长速率下降，甚至会使细胞死亡，造成对宿主生长及表达的抑制，至使菌密度及总表达水平都不高。因而，工程菌发酵大多采用诱导型。诱导型表达克服了组成型表达的不足。诱导表达依阻遏子的阻遏作用不同可分为环境条件(温度、pH、溶氧等)诱导、化学物质(IPTG、IAA等)诱导、营养物质(碳、氮、磷等)饥饿诱导。在大批量的蛋白质制备中，温度和IPTG诱导是两种广泛的使用方式，但对于人类临床药用蛋白质的大批量制备，IPTG则不是理想的诱导物，因为它有毒性，而且价格也很昂贵。所以，在医药生产中广泛采用以温度诱导的方式。而现有的温度诱导方式均采用一步升温诱导，其存在菌密度及目标蛋白表达量不高之缺陷。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种重组大肠杆菌的发酵方法，以此克服现有技术中存在的不足。
技术方案本发明所说的重组大肠杆菌的发酵方法，其依次包括菌种在基础培养基中的分批培养、补料培养和外源基因升温诱导表达阶段，其特征在于，所说的基础培养基包括如下组分及含量(含量以g/L计)
葡萄糖(glucose) 2～6g/L柠檬酸三胺((NH4)3-citric)0.6～1g/L氯化氨(NH4Cl) 0.3～0.7g/L硫酸氨((NH4)2SO4) 1～5g/L磷酸二氢钾(KH2PO4) 3～5g/L磷酸氢二钠(Na2HPO4) 6～10g/L氯化钠(NaCl)0.3～0.7g/L微量元素 适量其中所说的微量元素包括铁、钴、锌、锰和/或铜；所说的补料培养基包括如下组分及含量(含量以g/L计)葡萄糖(glucose) 480～520g/L柠檬酸三胺((NH4)3-citric) 0.6～1g/L硫酸镁(MgSO4) 0.2～0.3g/L；诱导表达阶段中至少包括一个降温及再升温过程。
优选如下技术方案菌种在基础培养基中的分批培养和补料培养阶段的温度为26～31℃，培养15～23小时后升温诱导表达，诱导表达阶段温度为40～45℃，待菌体的光密度(OD600)增加到升温诱导表达前的1.6倍时，降温至35～38℃培养，待菌体的OD600为降温前的1.6倍时，第二次升温到40～45℃，进行第二次诱导表达，持续诱导表达5～8小时，在整个发酵过程中，发酵液中溶氧不低于30％；分批培养和补料培养阶段的pH＝6.5～7.0为宜，诱导表达阶段优选pH＝7.2～7.6；补料控制以菌种在基础培养基中的分批培养4～6小时后加入补料培养基，补料量根据发酵液中的残余葡萄糖浓度(小于0.1g/L)反馈补料为宜。
本发明所说的重组大肠杆菌的发酵方法具有如下特点(1)在发酵过程中采用全合成培养基，与现有技术(采用复合培养基)相比，降低了发酵成本；(2)独特的外源基因诱导表达方法，使得发酵既可实现高密度、又可实现高表达，菌体收率高达200～250g湿重菌体/每升发酵液，目标蛋白含量可达20～40％，从而克服现有技术中存在的不足。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的是为更好理解本发明的内容，因此，所举之例并不限制本发明的保护范围实施例11按2.5L发酵液，发酵培养基包括如下组分及含量(含量以g/L计)葡萄糖(glucose)3g/L柠檬酸三胺((NH4)3-citric)0.8g/L氯化氨(NH4Cl) 0.5g/L硫酸氨((NH4)2SO4) 3g/L磷酸二氢钾(KH2PO4) 4g/L磷酸氢二钠(Na2HPO4) 8g/L氯化钠(NaCl) 0.5g/L微量元素(包括铁、钴、锌、锰和/或铜)适量补料培养基的配方葡萄糖(glucose)480g/L柠檬酸三胺((NH4)3-citric)0.6g/L硫酸镁(MgSO4) 0.2g/L2发酵工艺(1)接种量菌种的接种量为培养基溶液的8％，接种后发酵液OD600为0.42；(2)发酵菌种在基础培养基中的分批培养和补料培养阶段(菌种在基础培养基中的分批培养4～6小时后加入补料培养基)的温度为30℃，pH＝7.0，培养23小时后升温诱导表达，诱导表达阶段温度为42℃，pH＝7.4，待菌体的光密度(OD600)增加到升温诱导表达前的1.6倍时，降温至37℃培养，待菌体的OD600为降温前的1.6倍时，第二次升温到42℃，进行第二次诱导表达，持续诱导表达5小时，在整个发酵过程中，通过通气和搅拌调整溶氧，使发酵液中溶氧不低于30％；发酵完毕后菌体经分离菌体得率为248g湿菌体/发酵液(L)，目的蛋白含量达24.1％。
实施例21按2.5L发酵液，发酵培养基包括如下组分及含量(含量以g/L计)葡萄糖(glucose) 2.8g/L柠檬酸三胺((NH4)3-citric) 0.7g/L氯化氨(NH4Cl) 0.55g/L硫酸氨((NH4)2SO4) 2.8g/L磷酸二氢钾(KH2PO4) 3.7g/L磷酸氢二钠(Na2HPO4) 8.2g/L氯化钠(NaCl)0.54g/L微量元素(包括铁、钴、锌、锰和/或铜) 适量补料培养基的配方葡萄糖(glucose) 520g/L柠檬酸三胺((NH4)3-citric) 1g/L硫酸镁(MgSO4) 0.3g/L2发酵工艺(1)接种量菌种的接种量为培养基溶液的10％，接种后发酵液OD600为0.45；(2)发酵菌种在基础培养基中的分批培养和补料培养阶段(菌种在基础培养基中的分批培养4～6小时后加入补料培养基)的温度为28℃，pH＝7.0，培养23小时后升温诱导表达，诱导表达阶段温度为42℃，pH＝7.4，待菌体的光密度(OD600)增加到升温诱导表达前的1.6倍时，降温至36℃培养，待菌体的OD600为降温前的1.6倍时，第二次升温到41℃，进行第二次诱导表达，持续诱导表达6小时，在整个发酵过程中，通过通气和搅拌调整溶氧，使发酵液中溶氧不低于30％；发酵完毕后菌体经分离菌体得率为237g湿菌体/发酵液(L)，目的蛋白含量达23.2％。
实施例31、按2.5L发酵液，发酵培养基包括如下组分及含量(含量以g/L计)葡萄糖(glucose)3.1g/L柠檬酸三胺((NH4)3-citric)0.82g/L氯化氨(NH4Cl) 0.6g/L硫酸氨((NH4)2SO4) 2.87g/L磷酸二氢钾(KH2PO4) 4.1g/L磷酸氢二钠(Na2HPO4) 7.86g/L氯化钠(NaCl) 0.45g/L微量元素(包括铁、钴、锌、锰和/或铜)适量补料培养基的配方葡萄糖(glucose)500g/L柠檬酸三胺((NH4)3-citric)0.8g/L硫酸镁(MgSO4) 0.25g/L2、发酵工艺(1)接种量菌种的接种量为培养基溶液的8％，接种后发酵液OD600为0.36；(2)发酵菌种在基础培养基中的分批培养和补料培养阶段(菌种在基础培养基中的分批培养4～6小时后加入补料培养基)的温度为31℃，pH＝6.8，培养20小时后升温诱导表达，诱导表达阶段温度为42℃，pH＝7.5，待菌体的光密度(OD600)增加到升温诱导表达前的1.6倍时，降温至37℃培养，待菌体的OD600为降温前的1.6倍时，第二次升温到43℃，进行第二次诱导表达，持续诱导表达7小时，在整个发酵过程中，通过通气和搅拌调整溶氧，使发酵液中溶氧不低于30％；发酵完毕后菌体经分离菌体得率为246g湿菌体/发酵液(L)，目的蛋白含量达23.4％。
权利要求
1.一种重组大肠杆菌的发酵方法，其依次包括菌种在基础培养基中的分批培养、补料培养和外源基因升温诱导表达阶段，其特征在于，所说的基础培养基包括如下组分及含量葡萄糖 2～6g/L柠檬酸三胺 0.6～1g/L氯化氨 0.3～0.7g/L硫酸氨 1～5g/L磷酸二氢钾 3～5g/L磷酸氢二钠 6～10g/L氯化钠 0.3～0.7g/L微量元素 适量其中所说的微量元素包括铁、钴、锌、锰和/或铜；所说的补料培养基包括如下组分及含量葡萄糖 480～520g/L柠檬酸三胺 0.6～1g/L硫酸镁 0.2～0.3g/L；诱导表达阶段中至少包括一个降温及再升温过程。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，菌种在基础培养基中的分批培养和补料培养阶段的温度为26～31℃，培养15～23小时后升温诱导表达，诱导表达阶段温度为40～45℃，待菌体的光密度(OD600)增加到升温诱导表达前的1.6倍时，降温至35～38℃培养，待菌体的OD600为降温前的1.6倍时，第二次升温到40～45℃，进行第二次诱导表达，持续诱导表达5～8小时，在整个发酵过程中，发酵液中溶氧不低于30％；
3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，其中分批培养和补料培养阶段的pH＝6.5～7.0，诱导表达阶段pH＝7.2～7.6。
4.如权利要求2或3所述的发酵方法，其特征在于，菌种在基础培养基中的分批培养4～6小时后加入补料培养基。
全文摘要
本发明公开了一种重组大肠杆菌的发酵方法，其一在发酵过程中用全合成培养基替代现有技术中的复合培养基；其二采用了独特的外源基因诱导表达方法，使重组大肠杆菌的发酵既可实现高密度、又可实现高表达。因此，本发明具有工艺新颖、菌体收率高、目的蛋白表达量高及发酵成本低等特点。
文档编号C12N15/87GK1542131SQ200310108479
公开日2004年11月3日 申请日期2003年11月6日 优先权日2003年11月6日
发明者庄英萍, 马文峰, 丁满生, 郭美锦, 储炬, 张嗣良 申请人:华东理工大学