专利名称：使用双方向多聚合酶Ⅲ启动子来表达小核糖核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及RNA多聚合酶III启动子，更进一步讲它涉及双方向的RNA多聚合酶III启动子，该启动子指导短的RNA序列表达，如用于沉默基因的RNA序列表达。
背景技术：
RNA多聚合酶(以下称作多聚合酶III)启动子用来表达不同的基因已经使用多年。由于U6和H1多聚合酶III启动子的特性很多人选择它们用来表达短的RNA序列，这些序列可以减少或“沉默”真核细胞的基因表达。这种用来沉默基因短的RNA序列通常有发夹结构。这种结构导致了一个双链区，具有这种短的RNA序列被称作短发夹RNA干扰序列(shRNAi)。本文将使用名词“短RNA序列”，它的意思不仅包括了shRNAi序列，还包括了长度大致在300个核苷酸的RNA序列。如反义的序列和核酶等。使用U6和H1启动子存在如下几个主要问题，(1)这些启动子只能表达一个短的RNA序列；(2)这些启动子在不同的细胞内表达效率不同；(3)如果需要使用一个以上的按顺序排列的多个启动子来表达多个短的RNA序列时，这些重复的序列就会引起载体的不稳定，最终导致表达终止。
发明内容
本发明是高效、快速、节省成本的产生短的RNA序列的方法。由于已知的多聚合酶III启动子存在的上述缺陷，本发明提供了一个新的双方向的多聚合酶III启动子来指导短的RNA序列在真核细胞内的表达。每一个双方向的多聚合酶III启动子可以指导两个短的RNA序列表达。当需要表达一个以上的短的RNA序列时，双方向的多聚合酶III启动子就会提高表达的效率和效力。双方向的多聚合酶III启动子与以前任何传统的单个多聚合酶III启动子或单方向多个串连的多聚合酶III启动子相比具有更多优点。
为此本发明所提供的多聚合酶III启动子具有两个控制成分。其中一个控制成分指导一个方向的短的RNA序列的转录，另一个控制成分被加到相反的方向来指导另一个方向的短的RNA序列的转录。本文对本发明的双方向的多聚合酶III启动子的构成进行了描述。
双方向的多聚合酶III启动子由以下部分构成(1)一个完整的多聚合酶III启动子，其中包括了3种控制成分TATA序列、一个近端序列成分(PSE)和一个远端序列成分(DSE)。(2)一个被加到第一个完整启动子DSE相反方向5末端的基本启动子，此基本启动子仅包括了一个TATA序列和一个近端序列成分。这样就使两个传统的无方向的多聚合酶III启动子(U6和H1启动子)被变成双方向的启动子。
本文也描述了一种质粒的组成成分，其中包括了一个或多个双方向多聚合酶III启动子，这些成分利于质粒在细菌和真核细胞内的繁殖。
本发明包括了一种腺性病毒的组成成分，其中包括了一个或多个双方向多聚合酶III启动子，这些成分利于病毒在真核细胞内的繁殖。
本发明还提供了指导两个或更多不同的短的RNA序列构成的载体的表达方法，此载体包括了一个或多个指导短的RNA序列转录的双方向的多聚合酶III启动子。
本发明公开了沉默两个或多个基因表达的方法，此方法包括了在一个或多个双方向RNA多聚合酶III启动子指导下的两个或者多个短的RNA序列的表达。
本发明描述了提高表达短的RNA序列数目的方法，这种表达是用含有一个或者多个双方向多聚合酶III启动子的单个载体来完成的。
本发明也公开了使用一种含有双方向RNA多聚合酶III启动子的载体来研发治疗人类和其他动物疾病药物的一种方法。
本发明包括了使控制成分体积最小化的方法，这些由一个或者多个双方向多聚合酶III启动子组成的控制成分可以指导短的RNA序列的转录。
本文公开了一种便利构建载体的试剂盒，这种含有一个或者多个双方向多聚合酶III启动子的载体可以有效表达一个或者多个短的RNA序列。
以上内容描述了本发明的重要特征，其他特征将在后续部分逐一介绍。
本发明的目的包括如下内容(1)提供双方向多聚合酶III启动子克服了以前传统的多聚合酶III启动子的缺点。
(2)提供双方向U6多聚合酶III启动子指导两个不同的短的RNA序列表达。
(3)提供了一种含有一个或者多个双方向多聚合酶III启动子的单个载体来表达多个短的RNA序列的方法，这种表达是在调控成分指导下进行的。
(4)提供了一个双方向多聚合酶III启动子，该启动子比传统的多聚合酶III启动子在沉默基因表达方面更为有效，因为它可以同时表达多个短的RNA序列来攻击一个基因中的不同区域。
(5)降低了使用单个短的RNA序列来沉默基因表达效果所遇到的不确定性，因为本发明的载体可以同时表达多个短的RNA序列。
(6)使用协调的方式可以沉默两个或多个基因的表达，因为一个含有双方向多聚合酶III启动子的单一载体可以同时表达多个短的RNA序列。
(7)由于最小化了双方向多聚合酶III启动子的体积，因此它可以被插入到任何载体中，特别是那些有体积限制的载体，如腺性相关病毒和慢病毒等。
(8)提供一个杂交的很少或没有重复序列的双方向多聚合酶III启动子以使转录活性达到最大化。
具体实施例方式
RNA多聚合酶III启动子(比如U6和H1)可能适合用来表达单个的短RNA序列，但它们并不适合用于表达两个以上的短RNA序列。表达多个短RNA序列可以用本发明的双方向多聚合酶III启动子来完成。本发明所描述的双方向多聚合酶III启动子与传统的概念和设计有显著的差别。新构建的启动子使得双方向多聚合酶III启动子的每一个方向都可用于表达短RNA序列。
据估计在最适合的条件下，U6和H1启动子可以表达多达40000个RNA转录子在一个细胞中。这样的基因表达水平足以有效地抑制特异基因的表达(Tuschl，T，2002，Nat.Biotechnol.，48446-448)。但是目前选择有效的shRNA序列是一个令人头痛的问题。有一些规则可以帮助人们选择有效的shRNA序列。但即使使用复杂的计算机程序也不能够保证选择的每一个shRNA序列有效地沉默基因的表达。很显然选择shRNA序列的效率是变化不定的，完全依赖人们的经验。目前有数个公司提供4个一套的合成RNAi序列，每个RNAi序列可攻击一个基因的不同区域用以提高有效沉默基因的可能性。此策略大大地降低了检测有效RNAi序列所需的时间和费用。
U6和H1启动子一直用于表达反义RNA，最近它们又被用于表达沉默基因shRNA。基因沉默技术比如合成的RNAi和载体表达的shRNA已经成为研究基因功能的重要工具，这些技术已广泛用于功能基因组和药物靶标的鉴定等。进一步地这些技术对于治疗重要人类疾病如爱滋病、肝炎、癌症、发炎疾病和代谢失调等有巨大地应用前景。
本发明地启动子由如下成分组成(1)一个完整的多聚合酶III启动子，其中包括了3种控制成分TATA序列、一个近端序列成分(PSE)和一个末(远)端序列成分(DSE)。(2)一个仅包括PSE和TATA序列的基本多聚合酶III启动子。这样的基本启动子可以被连接到完整多聚合酶反方向的5末端。TATA序列是多聚合酶III特性的主要决定体，它常常定位于转录起始点上游第20-30核苷酸地位置上，PSE则常常位于转录起始点上游第45-66核苷酸处。DSE可提高基本多聚合酶III启动子的活性。U6启动子的DSE通常定位于转录起始点上游190-260个核苷酸处。H1启动子的PSE紧连着DSE序列。本发明提供两个双方向的启动子作为例子，它们被称为双方向U6和双方向H1。
图1描述的是现在发明的双方向多聚合酶III启动子。
图2是人类双方向U6启动子的核苷酸序列。
图3是人类双方向H1启动子的核苷酸序列。
图4描述了一种用于检测双方向U6启动子的质粒特征。
图5对照比较了双方向U6启动子正方向和反方向表达的短RNA序列沉默一种报道基因的效果。
图6描述了一种用于检测双方向H1启动子的质粒特征。
图7对照比较了双方向H1正反两方表达的短RNA序列沉默一种报道基因的效果。
图8对照比较了双方向H1和U6启动子正反两方表达的短RNA序列沉默一种报道基因的效果。
图中描述的两个双方向多聚合酶III启动子可以单个使用，也可以结合起来一并使用表达多个短RNA序列。这些图仅代表了一类多聚合酶III启动子。U6和H1属于此类多聚合酶启动子。它们可以区别于其他的多聚合酶III启动子的特征在于它们的控制成分位置。它们的控制成分位于转录序列之外，U6和H1的双方向特征描述于图1。每一个双方向启动子由以下部分组成(1)一个完整的传统的无方向的多聚合酶III启动子，它含有3个外部控制成分一个DSE，一个PSE和一个TATA序列。(2)一个基本多聚合酶III启动子，它包括了一个PSE和一个TATA序列。基本多聚合酶启动子被连接到完整启动子的DSE反方向5末端上。TATA序列是基本的多聚合酶结合区域，也可以被TATA结合蛋白质所认识。SNAPs与PSE的相互关系保持了TATA结合蛋白质与TATA序列形成的结合体的稳定性，为了达到多聚合酶III启动子全部活性，PSE存在也是必要的(Murphy等.1992.Mol.Cell Biol.123247-3261，.Mittal等，1996 Mol.Cell Biol.161955-1965；Ford等，1997，JBC，27216048-16055；Frod等，1998，GenesDev.，123528-3540；Hovde等，2002，Genes Dev，162772-2777.)。转录成分Oct-1和DSE相互作用将提高转录活性100倍(Kunkeland Hixon，1998，Nuk.Acid Res.261536-1543)。由于正反方向定位的基本启动子可指导双链DNA模板相反链的转录，反方向定位的基本启动子的正链被连到DSE的负链5末端上。连续的4-5个胸腺嘧啶(T)序列可结束U6和H1启动子的转录活性。
图1表明U6和H1启动子有相似的基本结构，但是它们的PSE和DSE构成并不相同。H1启动子有非常紧凑的结构，它的DSE很靠近PSE和TATA序列Myslinski等，2001，Nucl.Acid Res.292502-2509)。而U6启动子的DSE则与PSE和TATA序列有150个核苷酸的距离，当我们构建反方向的基本启动子的时候，这样的空间距离被保留下来。图2描述详细的结构。图3描述了一个杂交的H1启动子，一个基本的U6启动子被连接到H1的DSE反方向的5末端。这样的结构有利于保持H1启动子的紧凑结构。为了便于构建双方向的H1启动子，一个小的片断序列被插入基本U6启动子和H1启动子之间。令人满意的转录结果指明多聚合酶III的DSE和PSE之间的距离并不是一个影响启动子转录的关键因素。
本发明进一步表明双方向的多聚合酶III启动子不仅可以单独使用，而且也可以和多个双方向或者传统无方向的多聚合酶启动子一起使用。
试验一为了演示正反两方向的转录活性，双方向的U6启动子被插入到一个质粒中。图4表明其结构除了双方向的启动子外，该质粒含有4个不同限制酶切点，以便于分别在正反两个方向插入两个寡核苷酸片断。我们进一步构建了两个指导shRNAi序列转录的寡核苷酸片断。这两个片断被设计用于沉默一种报道基因(β-半乳糖苷酶)的表达。一个片断末端含有限制酶Bgl II和Not I切点，以便于插入启动子的正方向，另外一个片断末端则含有限制酶BsaI和SpeI切点便于连接到启动子的反方向。两个构建的质粒被称为双方向U6F和双方向U6R。双方向U6F指导正方向的短RNA序列表达，而双方向U6R则指导反方向的短RNA序列的表达。在人类HEK239细胞测试中双方向的U6F和U6R大大减少报道基因(β-半乳糖苷酶)的表达水平(图5)。这一结果表明双方向U6启动子可以有效指导正反两个方向的短RNA序列的转录。
试验二相同策略也被用于检测双方向的H1启动子。在这个试验中，我们构建了两个质粒(称作双方向H1F和双方向H1R)详细的结构见图6。两个指导shRNAi序列转录的多聚核苷酸片断被合成，然后插入双方向H1启动子的正反两个方向，正方向的片断含有限制酶NcoI和ClaI切点。而反方向片断含有限制酶XhoI和BamHI切点。用人类HEK239细胞试验结果表明β-半乳糖苷酶的活性可以被表达的RNAi所抑制。图7表明了我们的试验结果。从图中可见双方向的H1F和H1R显著减少报道基因β-半乳糖苷酶的表达水平。这一结果也证明了双方向H1启动子可以有效指导正反两个方向的短RNA序列的转录。
试验三为了进一步检查双方向多聚合酶III启动子的效果，我们构建了四种含有同样短RNA序列的质粒。此短RNA序列被分别连接到双方向U6和H1的正反方向启动子上，建成了4个新的质粒，这些质粒称作U6F，U6R，H1F和H1R。这些质粒被转入小鼠Mlcar细胞中，结果表明所有4种质粒都能显著地沉默报道基因β-半乳糖苷酶的表达(图8)。这一结果进一步证明了双方向U6和H1可以有效指导正反两个方向的短RNA序列表达。
权利要求
1.一种双方向的RNA多聚合酶III启动子，包含在一个方向指导短RNA序列转录的控制成分和其他指导另一个方向短RNA序列转录的控制成分。
2.一种含有有一个或多个双方向RNA多聚合酶III启动子的质粒和其他有利于在细菌和真核细胞中繁殖的成分。
3.一种含有一个或多个双方向RNA多聚合酶III启动子的腺病毒及其他便于在真核细胞繁殖的成分。
4.一种指导两个或多个不同的短RNA序列表达方法其中包含有能指导短RNA序列表达的一个或多个双方向双方向RNA多聚合酶III启动子的载体。
5.权利要求4方法中的载体包括质粒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。
6.权利要求4方法中包含了无方向的启动子。
7.权利要求6方法中表达的短RNA序列数目是2、3和4个。
8.一种沉默两个或多个基因表达的方法，其中含有一个和多个双方向RNA多聚合酶III启动子指导下表达两个或多个短RNA序列。
9.权利要求8方法中的载体包括质粒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。
10.提高表达短RNA序列数量的方法，这种提高表达是用同一种单个含有一个或多个双方向RNA多聚合酶III启动子载体来完成的。
11.权利要求10方法中的载体包括质粒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。
12.使用含有双方向RNA多聚合酶III启动子的载体来研发治疗人类和其他动物疾病药物的方法。
13.权利要求12方法中的载体包括质粒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。
14.最小化控制成分长度的方法，这些控制成分子包括一个或多个双方向RNA多聚合酶III启动子和指导短RNA序列的转录的序列。
15.构建载体的试剂盒，这些载体含有一个或多个双方向RNA多聚合酶III启动子和指导两个或多个短RNA序列的表达。
16.权利要求15项试剂盒中的载体包括质粒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。
全文摘要
本发明是高效、快速、节省成本的生产短RNA序列的方法。本发明也提供了一个新的双方向的RNA多聚合酶启动子来指导短RNA序列在真核细胞内的表达。这些启动子具有两个控制成分，其中一个控制成分指导一个方向的短RNA序列转录，当需要表达一个以上的短RNA序列时，双方向的RNA多聚合酶III启动子就会大大提高表达的效率和效力。因此，它比任何传统单个多聚合酶III启动子或单方向多个串连的多聚合酶III启动子更具先进性和更多优点。
文档编号C12N15/63GK1624134SQ200310117110
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者罗科, 杜鸰, 彼特·弗里克 申请人:罗科, 杜鸰