专利名称：褐飞虱对吡虫啉靶标抗性的分子检测方法
技术领域：
本发明褐飞虱(Nilaparvata lugens Stl)对吡虫啉(Imidacloprid)靶标抗性的分子检测方法，属于生物技术领域，专用于褐飞虱对吡虫啉靶标抗性的高灵敏度快速检测。
背景技术：
中国水稻种植历史悠久，分布地域十分广泛，是最主要的粮食作物，水稻产量占到粮食总产量的40％以上。中国是世界上最大的水稻生产和消费国，水稻年种植面积约2860万公顷，年产稻米1.85亿吨，占全球水稻种植面积的1/5，占世界稻米总产量的1/3。因此，稻谷丰歉对国民经济及人民生活的影响很大。在水稻栽培生长过程中，常遭水、旱等多种自然灾害，然而为害水稻的重大害虫一褐飞虱，也是目前许多稻区影响稻谷丰歉的重要原因之一。自1980年以来，褐飞虱在中国每年发生面积1300～2000万公顷，约占全国水稻面积的50％。虽然自20世纪80年代以来，“以抗虫品种为基础，化学防治、生物防治协调为中心”的综合防治体系已经初步建立起来，并在不断完善中，但化学防治以其见效快、效果好、使用方便等优越性和特点，在褐飞虱的防治中仍然占着主要地位。从20世纪40年代到70年代末(80年代初)，褐飞虱的化学防治主要是有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂。20世纪80年代中期以来，几丁质合成抑制剂—扑虱灵在中国进行示范和推广。但由于该杀虫剂存在某些缺陷，如见效慢、对褐飞虱卵低效等缺点，20世纪90年代中期以来，新型高效内吸性杀虫剂—吡虫啉被广泛应用，并逐步成为防治稻飞虱的当家农药品种。
吡虫啉，Imidacloprid，属于新烟碱类杀虫剂。对这类杀虫剂的研究，起源于1979年Soloway等对杂环硝基亚甲基化合物具有杀虫活性的发现。1990年，国外首次合成了该化合物。拜耳公司于1991开始开发该类杀虫剂，1992年投放市场。1992年，国内(江苏省农药研究所)也首次合成了该化合物。吡虫啉是昆虫乙酰胆碱受体(Nicotinic Acetylcholine Receptor，nAChR)的效应物，为乙酰胆碱受体结合的不完全竞争性激动剂，作用机制独特，对哺乳动物毒性很低。吡虫啉具有极其优良的内吸活性，种子处理、土壤处理和叶面喷雾对防治很多农业害虫有高效，特别是刺吸式口器害虫，如飞虱、叶蝉、蓟马、蚜虫等。然而，正是吡虫啉特别高的防效，使得该药剂在生产上存在着单一使用、滥用等不良状况，而且目前已经监测到几种害虫对吡虫啉的抗性，预示着褐飞虱对该杀虫剂抗药性产生的可能性。虽然目前还没有监测到褐飞虱田间种群对吡虫啉的显著抗性产生，但已有监测表明田间种群中抗性频率有增加的趋势，说明在大范围内连续使用吡虫啉的情况下，褐飞虱田间种群产生显著抗性的可能性很大。[赵建周.害虫对吡虫啉抗性的研究进展.植物保护，1998，24(6)40～41.刘泽文，王荫长，韩召军，等.两种稻飞虱对杀虫剂的敏感性比较.南京农业大学学报，2003，26(2)29～32.]目前关于褐飞虱对吡虫啉抗性的监测都局限于生物测定，而生物测定本身的局限性使得这种常规的检测方法不能检测早期抗性或低频率抗性等位基因。目前用于监测褐飞虱对吡虫啉抗性的生物测定方法主要有点滴法、浸根法和浸茎法。生物测定技术普遍存在的缺点有(1)灵敏度低生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性等位基因，尤其是抗性等位基因是隐性或不完全隐性时；(2)周期长生物测定结果的检查一般需要24h以上，对于吡虫啉这类内吸性杀虫剂需要更长的时间，一般为48～96h；(3)对试虫数量要求很大测定一个标准曲线至少需要500头试虫，对昆虫饲养的要求也很高。在吡虫啉使用日益增长之际，一种快速抗性检测方法变得十分重要，而普通的生物测定方法根本不能满足这些要求。[庄永林，沈晋良.稻褐飞虱对噻嗪酮抗性的检测技术，南京农业大学学报，2000，23(3)114～117.]
发明内容技术问题 本发明的目的是针对现有技术中褐飞虱对吡虫啉抗性检测方法灵敏度低、周期长、材料要求高等问题，提供褐飞虱对吡虫啉靶标抗性的分子检测方法，达到准确性高、周期短、灵敏度高的目的。
技术方案 褐飞虱对吡虫啉靶标抗性的分子检测方法，包括1)特异性引物外引物P5′-ACA CGT CCC CAG TGA GCA-3′Q5′-GTC GGT GGA ATG ATC TCT GC-3′内引物A5′-ggggggggcc GTT TGG ATC CTG TAC ATC-3′B5′-ggggggggcg CAT GAT TGC CGT CGT-3′2)单头褐飞虱基因组DNA的提取(1)配制提取液A1％(g/mL)SDS，50mmol/L Tris·HCl，25mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，溶剂为超纯水；提取液B3mol/L KAC，PH7.2，溶剂为超纯水。
(2)将试虫置于1.0mL离心管中，液氮冰冻后用灭菌牙签捣碎，然后加入60μL提取液A，并用另外60μLA液清洗牙签；(3)65℃水浴45min，每隔15min混匀一次；(4)加入120μL提取液B，混匀后冰浴1～2h；(5)10000×g离心15min，将上清液转移到另一个灭菌离心管中；(6)10000×g离心10min，加入480μL预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置1～2h；(7)10000×g离心15min，倾尽上清液，收集沉淀，用70％(mL/mL)乙醇清洗1次；重复步骤(7)，37℃晾干或冷冻干燥沉淀，获得单头褐飞虱基因组DNA，加入50μL双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用；3)反应体系25μL2.5μL10×Buffer，1.25U Ex-Taq DNA polymerase，2.5μL单头褐飞虱基因组DNA，dNTPs各0.2mmol/L，MgCl21mmol/L，引物各1μmol/L，加双蒸水至反应总体积为25μL；4)PCR反应程序94℃3 min，20循环94℃ 30s，67-58℃ 30s，每2个循环降1℃，72℃ 1min；10循环94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，72℃ 5min；5)扩增产物的电泳检测取10μL PCR扩增产物，在1％(g/mL)的琼脂糖凝胶上进行电泳，稳流80mA，1.5h后在紫外光下检测如果存在长度分别约为900bp(PQ)和370bp(AQ)大小的两条带，说明个体为抗性纯合子；如果存在长度分别约为900bp(PQ)和540bp(PB)大小的两条带，说明个体为敏感纯合子；如果同时存在长度分别约为900bp(PQ)、540bp(PB)和370bp(AQ)大小的三条带，说明个体为杂合子。
有益效果本发明与现有的生物测定技术相比，其优点和积极效果表现在(1)灵敏度高低频率抗性纯合子或杂合子的存在和一定的筛选压力，是高水平抗性产生的关键因子。而生物测定监测技术是一种粗放的检测方式，不能检测早期抗性或低频率抗性纯合子或杂合子，所以，生物测定技术很难进行抗药性产生的风险预测。本发明根据褐飞虱抗吡虫啉品系抗性相关的点突变，设计适合于双向PCR扩增特异等位基因(Bi-PASA)的特异性引物，经过PCR扩增和凝胶检测，可以直接判断个体的基因型。通过一定数量个体的检测，可以初步确定某个种群中抗性纯合子、杂合子和敏感纯合子的频率，为抗药性预测、抗药性治理和害虫综合治理提供了最直接的证据。
(2)准确性高生物测定技术要求试虫标准化，虫体之间的差异对结果影响很大，造成了结果的不稳定性。操作者的操作误差也加大了这种不稳定性。而本发明基于PCR扩增的检测技术，由于PCR技术的日益成熟和推广以及操作的智能化发展，在一定程度上减少了这种不稳定性，使得检测结果可以作为褐飞虱防治策略制定的理想材料。
(3)周期短生测技术至少需要24h的观测时间，对于内吸性杀虫剂吡虫啉还会更长。而本发明中的双向PCR扩增特异等位基因(Bi-PASA)技术只需要不到10h的时间，就可以得出理想的结果。
(4)材料要求少生物测定技术中测定一个标准曲线至少需要500头标准试虫，这些试虫的饲养需要花费一定的人力、物力。而本发明对一个种群的检测只需要100头左右的试虫。如果抗性基因频率特别低，如1％左右，只需要300头左右的试虫，但这是生物测定技术无论用多少试虫都不能检测的。
(四)说明书附1不同品系个体双向PCR扩增特异等位基因结果1，2，3-抗性纯合子；4，5，6-敏感纯合子；7，8，9-杂合子；10-分子标记具体实施方式
双向PCR扩增特异等位基因(Bi-PASA)需要的特异性引物有外引物P5′-ACA CGT CCC CAG TGA GCA-3′Q5′-GTC GGT GGA ATG ATC TCT GC-3′内引物A5′-ggggggggcc GTT TGG ATC CTG GAC ATC-3′B5′-ggggggggcg CAT GAT TGC CGT CGT-3′单头褐飞虱基因组DNA的提取(1)取单头褐飞虱刚羽化的雌成虫100只，在双蒸水中漂洗3次，用细水纸吸干；(2)将试虫置于1.0mL离心管中，液氮冰冻后用灭菌牙签捣碎，然后加入60μL提取液A(1％SDS，50mmol/L Tris·HCl，25mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA)，并用另外60μLA液清洗牙签；(3)65℃水浴45min，每隔15min混匀一次；(4)加入120μL的提取液B(3mol/L KAC，PH7.2)，混匀后冰浴1h以上；(5)10000×g离心15min，将上清液转移到另一个灭菌离心管中；(6)10000×g离心10min，加入480μL预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置1h以上；(7)10000×g离心15min，小心倾尽上清液，收集沉淀，用70％(mL/mL)乙醇清洗1次；(8)重复步骤(7)，37℃晾干或冷冻干燥沉淀，加入50μL双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用。
反应体系(25μL)
2.5μL 10×Buffer，1.25U Ex-Taq DNA polymerase，2.5μL单头褐飞虱基因组DNA，dNTPs各0.2mmol/L，MgCl21mmol/L，引物各1μmol/L，加双蒸水至反应总体积为25μL。
PCR反应94℃3min，20循环(94℃30s，67-58℃30s(每2个循环降低1℃)，72℃1min)，10循环(94℃30s，58℃30s，72℃1min)，72℃5min。
PCR产物分析将PCR产物10μL上样于1％(g/mL)的琼脂糖凝胶(40mL凝胶中加溴化乙锭EB 2μL)，缓冲液为1×TBE，80mA稳流电泳1.5h。凝胶在紫外灯下观察或凝胶成像。10小时之内即可获得不同品系个体双向PCR扩增特异等位基因结果如
图11，2，3长度分别约为900bp(PQ)和370bp(AQ)大小的两条带，个体为抗性纯合子；4，5，6长度分别约为900bp(PQ)和540bp(PB)大小的两条带，个体为敏感纯合子；7，8，9长度分别约为900bp(PQ)、40bp(PB)和370bp(AQ)大小的三条带，个体为杂合子。本发明经过多年的筛选与纯化，获得了褐飞虱对吡虫啉的抗性和敏感品系，并发现了抗性相关突变位点。双向PCR扩增特异等位基因是一种快速、有效的基因单碱基突变检测技术，可以识别个体基因型的差异，进行低频率点突变抗性等位基因的检测，准确性高、周期短、灵敏度高，满足了早期抗性或低频率抗性等位基因检测的要求。
权利要求
1.褐飞虱对吡虫啉靶标抗性的分子检测方法，包括1)特异性引物外引物P5′-ACA CGT CCC CAG TGA GCA-3′Q5′-GTC GGT GGA ATG ATC TCT GC-3′内引物A5′-ggggggggcc GTT TGG ATC CTG TAC ATC-3′B5′-ggggggggcg CAT GAT TGC CGT CGT-3′2)单头褐飞虱基因组DNA的提取(1)配制提取液A1％(g/mL)SDS，50mmol/L Tris HCl，25mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，溶剂为超纯水；提取液B3mol/L KAC，PH7.2，溶剂为超纯水；(2)将试虫置于1.0mL离心管中，液氮冰冻后用灭菌牙签捣碎，然后加入60μL提取液A，并用另外60μL A液清洗牙签；(3)65℃水浴45min，每隔15min混匀一次；(4)加入120μL提取液B，混匀后冰浴1～2h；(5)10 000×g离心15min，将上清液转移到另一个灭菌离心管中；(6)10 000×g离心10min，加入480μL预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置1～2h；(7)10 000×g离心15min，倾尽上清液，收集沉淀，用70％(mL/mL)乙醇清洗1次；重复步骤(7)，37℃晾干或冷冻干燥沉淀，获得单头褐飞虱基因组DNA，加入50μL双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用；3)反应体系25μL2.5μL 10×Buffer，1.25 U Ex-Taq DNA polymerase，2.5μL单头褐飞虱基因组DNA，dNTPs各0.2mmol/L，MgCl21mmol/L，引物各1μmol/L，加双蒸水至反应总体积为25μL；4)PCR反应程序94℃3min，20循环94℃30s，67-58℃30s，每2个循环降1℃，72℃1min，10循环94℃30s，58℃30s，72℃1min，72℃5min；5)扩增产物的电泳检测取10μL PCR扩增产物，在1％(g/mL)的琼脂糖凝胶上进行电泳，稳流80mA，1.5h后在紫外光下检测如果存在长度分别约为900bp和370bp大小的两条带，说明个体为抗性纯合子；如果存在长度分别约为900bp和540bp大小的两条带，说明个体为敏感纯合子；如果同时存在长度分别约为900bp、540bp和370bp大小的三条带，说明个体为杂合子。
全文摘要
本发明褐飞虱对吡虫啉靶标抗性的分子生物学检测方法属于抗药性综合治理和褐飞虱综合防治范畴。所使用的特异性引物P5′－ACA CGT CCC CAG TGA GCA－3′，Q5′－GTC GGT GGA ATG ATC TCT GC－3′，A5′－ggggggggcc GTT TGG ATC CTG TAC ATC－3′，B5′－ggggggggcg CAT GAT TGC CGT CGT－3′。25μL反应体系2.5μL 10×Buffer，1.25 U Ex－Taq DNA polymerase，2.5μL单头褐飞虱基因组DNA，dNTPs各0.2mmol/L，MgCl
文档编号C12Q1/68GK1546689SQ20031011852
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月12日 优先权日2003年12月12日
发明者刘泽文, 韩召军 申请人:南京农业大学