专利名称：一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法
技术领域：
本发明涉及重组蛋白质药物的生产过程，特别提供了一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法。
背景技术：
随着基因工程技术的日益成熟，越来越多的重组蛋白质药物被开发利用。由于生产过程中涉及到革兰氏阴性大肠杆菌以及分离纯化过程复杂，因此会造成内毒素的污染。
亲和技术是分离纯化生物大分子的有效手段，主要利用配基与生物大分子之间的亲和作用原理。将配基通过共价键合多孔介质上就得到亲和介质，可以用来选择性地吸附内毒素，实现从重组蛋白质溶液中去除内毒素的目标。已有的亲和配基和亲和介质包括单克隆抗体，多克隆抗体，抗生素，多粘菌素B，聚乙烯亚胺，组氨酸，凝胶过滤柱，亲和膜，颗粒吸附剂等。如专利EP0800862，采用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用离子交换的原理，来去除重组蛋白质肿瘤坏死因子或白介素中的内毒素，主要吸附重组蛋白质。
专利EP0337243，使用串联的两只反相液相色谱柱，来纯化重组人IL-2。在纯化重组人白介素-2的同时，去除内毒素杂质，流速低，介质昂贵。
专利US4885168，采用低分子量壳聚糖，利用壳聚糖上带正电荷的氨基来与带负电荷的核酸与内毒素作用，达到除去核酸与内毒素的目的。但壳聚糖的利用率低。
专利00123290.6，魏桂林等的一种用于内毒素去除的疏水荷正电亲和膜，将胺类疏水荷正电亲和配基键合到纤维素膜上，得到相应的亲和膜。胺类疏水荷正电亲和配基包括2～12碳的烃基二胺、带有乙烯基的不饱和杂环化合物、带有环氧基团的季铵盐及带有多个疏水基团的季铵盐。
D.Petsch，T.C.Beeskow等(1997，Journal of Chromatography B.693，79-91.)采用去氧胆酸钠，或己二胺作为亲和配基，以微孔尼龙膜为介质，制成亲和膜。采用单张亲和膜，可以去除缓冲液或牛血清白蛋白中的内毒素。但流速低，阻力高，处理量少，不易放大。
由于重组蛋白质种类较多，其分离纯化(的方式和步骤)步骤各不相同，生产过程中对其中的内毒素含量要求也有差异，因此去除内毒素的方法和效果无法完全通用。
发明内容
本发明提供了一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，用该方法可以达到既 去除内毒素，又尽可能减少流感疫苗活性损失的目的。
本发明提供了一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，以亲和介质制成亲和柱或亲和膜分离器，以静态吸附、过滤的方式处理流感疫苗去除其中的内毒素，其特征在于所述亲和介质是以聚乙烯亚胺为亲和配基，亲和介质的含氮量为0.75-7.0％。
本发明从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法中，所述聚乙烯亚胺的分子量最好在600到60,000。
本发明从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法中，所述亲和配基可以通过共价交联的方式结合到N，N′-亚甲基-次(甲基丙烯酰胺)甲基丙烯酸缩水甘油酯-丙烯基缩水甘油醚和甲基丙烯酰胺的共聚物颗粒上制成亲和介质。
本发明从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法中，所述亲和配基又可以通过共价交联的方式结合到纤维素膜上制成亲和介质。
本发明从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法中，所述亲和配基还可以与纤维素、异硫氰酸酯混合、反应，得到膜状荷电微孔亲和介质，膜孔径为0.2-1微米。
本发明从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法中，流感疫苗与亲和介质的比例为20-200毫升/克。
本发明针对流感疫苗制剂生产过程中的内毒素，根据其分子量大小、等电点的范围、溶液中其它物质的含量和种类的需要，判断和选择聚乙烯亚胺作为亲和配基。
将聚乙烯亚胺共价结合到N，N′-亚甲基-次(甲基丙烯酰胺)甲基丙烯酸缩水甘油酯，丙烯基缩水甘油醚和甲基丙烯酰胺的共聚物颗粒上，得到亲和介质并装成2ml体积的填充柱，加入(处理)10ml流感疫苗溶液，经单次过滤处理，疫苗溶液的内毒素浓度从＞250EU/ml降低到＜50EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率为90％以上。
将聚乙烯亚胺共价结合到纤维素滤膜上，取0.03克亲和膜，加入3ml流感疫苗，静态吸附3小时后，疫苗溶液中的内毒素浓度从＞4400EU/ml降低到＜2200EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率为52％以上。
将聚乙烯亚胺与纤维素、异硫氰酸酯混合、反应，得到共混荷电微孔亲和膜，取0.04克亲和膜，加入2ml流感疫苗，静态振荡吸附2小时后，对疫苗溶液中内毒素的去除率为57％，流感疫苗中有效成分回收率为93％。
总之，本发明对内毒素的去除率高，特异性好，流感疫苗活性回收率高，适合生产的要求。
具体实施例方式实施例1.聚乙烯亚胺与颗粒的键合分别溶解0.3g不同分子量(600，60000)的聚乙烯亚胺于PH＝9、浓度为1mol/L的磷酸钾缓冲液12ml中，分别加入2gN，N′-亚甲基-次(甲基丙烯酰胺)甲基丙烯酸缩水甘油酯-丙烯基缩水甘油醚和甲基丙烯酰胺的共聚物颗粒；室温下放置72-96小时，抽滤去除液体；颗粒用50ml 0.1mol/LPH＝9的磷酸钾缓冲液分三次洗涤，备用。制成的亲和介质经凯氏定氮法测定其含氮量，分别为7.0％、6.8％。
实施例2.聚乙烯亚胺与纤维素膜的键合分别取50片直径为47毫米的纤维素膜，用大量水冲洗干净，置于一个200ml的烧杯中，加入40ml环氧氯丙烷、120ml浓度为1M的NaOH溶液和0.19gNaBH4，混合均匀，室温下静置过夜，进行活化。次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，沥干，然后分别加入125ml1％聚乙烯亚胺溶液(分子量分别为600，1800，10000)，于30℃恒温放置过夜(16小时以上)。次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，沥干，然后加入100ml0.25％硼氢化钠溶液(0.1M pH8.5磷酸缓冲液配制)，室温下还原反应4小时。取还原后的膜，用大量水洗至中性，沥干并烘干。装配成相应的亲和膜反应器。该亲和介质经凯氏定氮法测定其含氮量，分别为2.4％、1.5％、1.2％。
实施例3.荷电微孔亲和膜的制备纤维素以重量百分比7％的二醋酸纤维素，二甲基甲酰胺43.8％，丙酮22.7％，甘油26.5％，配制成制膜液，加入50％聚乙烯基亚胺(分子量为60000)水溶液、配制高分子溶液，将多异氰酸酯(二苯基甲基二异氰酸酯的多聚体)的7％溶液(DMF与丙酮各半为溶剂)，按多异氰酸酯与50％聚乙烯基亚胺重量比0.23∶1的量加入，交联后，再加入50％聚乙烯基亚胺和甘油配制制膜液，其最终重量百分比为二醋酸纤维素7％，二甲基甲酰胺43.8％，丙酮22.8％，50％聚乙烯基亚胺水溶液1.6％，多异氰酸酯用量0.25％，甘油24.5％，将膜液刮涂于玻璃板上，厚400μm，于50℃，相对湿度高于95％的空气中吸湿沉淀2min。待分相基本完成后浸入水中，使溶剂交换完全并除去不必要的组分，固化膜结构，制得平板微滤膜，膜孔径为0.2-1微米。所得经凯氏定氮法测定膜的含氮量为0.75％。
实施例4.聚乙烯亚胺亲和颗粒处理流感疫苗将实施例1的2ml亲和介质(聚乙烯亚胺分子量为600)填充成柱，干重0.5g，流感疫苗与亲和介质的比例为20毫升/克，以8ml/min流速，循环过滤处理10ml流感疫苗制剂，1小时后，过滤后溶液中的内毒素浓度从＞250EU/ml降低到＜80EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率为80％。
实施例5.聚乙烯亚胺亲和颗粒处理流感疫苗将实施例1的2ml亲和介质(聚乙烯亚胺分子量为60000)填充成柱，干重约0.5g，流感疫苗与亲和介质的比例为20毫升/克，以8ml/min流速，反复循环过滤10ml流感疫苗制剂，过滤后溶液中的内毒素浓度从＞2500EU/ml降低到＜750EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率为91％。
实施例6.聚乙烯亚胺亲和膜处理流感疫苗将实施例2的3张亲和膜(Φ13mm)浸泡于装有流感疫苗制剂2ml的西林瓶中，流感疫苗与亲和介质的比例为67毫升/克，以200r/min的振数振荡处理，经过3小时后，溶液中的内毒素浓度从＞4500EU/ml降低到＜100EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率为90％。
实施例7.荷电微孔亲和膜处理流感疫苗取实施例3的荷电微孔亲和膜0.012g，浸泡于装有流感疫苗制剂2ml的西林瓶中，流感疫苗与亲和介质的比例为167毫升/克，以200r/min的振数处理，经过二小时后，溶液中的内毒素浓度从＞4500EU/ml降低到＜450EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率为77％。
权利要求
1.一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，以亲和介质制成亲和柱或亲和膜分离器，以静态吸附、过滤的方式处理流感疫苗去除其中的内毒素，其特征在于所述亲和介质是以聚乙烯亚胺为亲和配基，亲和介质的含氮量为0.75-7.0％。
2.按照权利要求1所述从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，其特征在于所述聚乙烯亚胺的分子量在600到60,000。
3.按照权利要求1所述从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，其特征在于所述亲和配基通过共价交联的方式结合到N，N′-亚甲基-次(甲基丙烯酰胺)甲基丙烯酸缩水甘油酯-丙烯基缩水甘油醚和甲基丙烯酰胺的共聚物颗粒上制成亲和介质。
4.按照权利要求1所述从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，其特征在于所述亲和配基通过共价交联的方式结合到纤维素膜上制成亲和介质。
5.按照权利要求1所述从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，其特征在于所述亲和配基与纤维素、异硫氰酸酯混合、反应，得到膜状荷电微孔亲和介质，膜孔径为0.2-1微米。
6.按照权利要求1所述从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，其特征在于流感疫苗与亲和介质的比例为20-200毫升/克。
全文摘要
一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，以亲和介质制成亲和柱或亲和膜分离器，以静态吸附、过滤的方式处理流感疫苗去除其中的内毒素，其特征在于所述亲和介质是以聚乙烯亚胺为亲和配基，亲和介质的含氮量为0.75－7.0％。本发明对内毒素的去除率高，特异性好，流感疫苗活性回收率高，适合生产的要求。
文档编号C12N7/02GK1621088SQ200310119268
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月26日 优先权日2003年11月26日
发明者李京华, 邵英光, 陈兆安, 丛润滋, 王俊德 申请人:中国科学院大连化学物理研究所