具有抗肿瘤功能的双功能融合蛋白及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：具有抗肿瘤功能的双功能融合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤免疫学领域，具体涉及一种具有抗肿瘤功能的双功能融合蛋白及其编码核酸、制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤的免疫治疗是指主要通过肿瘤宿主防御机制或生物制剂的作用以调节机体自身的生物学反应，从而抑制或杀灭肿瘤细胞。它已经成为继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗模式，被誉为常规手段的“完善疗法”，为肿瘤的治疗提供了新的希望。在我国，肝癌，乳腺癌淋巴细胞瘤的发病率很高，是最常见的恶性肿瘤之一。肝癌患者就诊时约有2/3已丧失手术时机，即使能行手术切除者，因为无法切除肉眼看不见的肿瘤组织，术后复发率较高，更主要的是手术不能除去肿瘤发生的根本原因。放化疗对造血和免疫系统均有严重的抑制作用，甚至导致机体免疫力进一步下降，致使肿瘤广泛转移。因而，寻找有效的肿瘤免疫治疗新方法对于肝癌的彻底治愈具有极其重要的意义。
近年来的研究表明针对肿瘤凋亡或细胞增殖的细胞表面分子(如FAS，EGFR，HER2等)的单克隆抗体可直接诱导肿瘤细胞的凋亡(Shimizu M等，Biochem Biophys ResCommun.1996，228(2)375-9)。该发现抛弃了肿瘤治疗中抗原抗体反应的传统理念，而转向利用mAb靶向性调控细胞凋亡和增殖的信号传导通路，抗人HER2的单抗Herceptin成为第一个被FDA批准上市的治疗乳腺癌的单克隆抗体，其疗效已得到充分的肯定，为肿瘤的免疫治疗开辟了一个新的领域。目前研究的肿瘤靶向性治疗靶基因虽然较多，但主要集中于两条信号传导通路之中。其一是激活肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族，通过Caspase介导的细胞凋亡信号通路发挥作用；其二是阻断表皮生长因子受体(EGFR)家族介导的Ras途径。
TNF-R家族主要包括Fas、TNF受体和TRAIL受体。高表达于某些大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤组织细胞中。它们在单体状态下没有活性，但在相应配体(如FAS-配体、TNF或TRAIL)，或单克隆抗体(mAb)的作用下，可最终激活Caspase3。Caspase3可切割凋亡底物使其活化，造成细胞程序化死亡。FAS配体也可造成部份肝癌和黑色素瘤细胞的凋亡。但是，由于FAS也同时表达于胸腺，肝脏，心和肾。在体内实验中，抗FAS mAb或FAS配体可对上述正常组织细胞产生伤害(尤其是肝)，从而大大限制了它们在抗肿瘤治疗中的应用。
EGFR亚家族由4个密切相关的受体组成EGFR，HER2，HER3和HER4。均为具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，高表达于某些前列腺癌、大肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、非小细胞肺癌组织细胞中。它们在肿瘤的发生和发展过程中发挥着十分重要的作用。与FAS类似，在单体状态下没有活性，一旦在配体作用下发生结合形成二聚体，即可通过强有力的酪氨酸激酶活性激活下游的信号传导通路，诱导肿瘤的发生。EGFR或HER2特异的单克隆抗体(mAb)可靶向性地阻断它们与其配体的结合，从而阻断肿瘤细胞增殖的信号传导通路，抑制肿瘤生长并诱发细胞凋亡。
无论是FAS还是EGFR或是HER-2，虽在某些肿瘤细胞中高表达，但也表达于某些重要的正常组织中(如肝，肾，淋巴结等)。对这些正常组织信号传导通路的干扰有可能带来较大的副作用。P230是特异表达于人肝癌、乳腺癌和黑色素瘤组织细胞中的蛋白分子。由于它在Western bloting中可与单克隆抗体SM5-1(US专利申请号09/915,746)结合，并在230KD处显现特异条带故而得名。在体外无补体作用的培养液中，SM5-1可通过p230诱导肝癌细胞株(XJC)和黑色素瘤细胞株(U10)发生凋亡。裸鼠荷瘤实验也证实p230在SM5-1的诱导下可抑制肿瘤生长。流式细胞术表明SM5-1不能标记来源于C57BL/6小鼠的黑素瘤细胞B16和肝癌细胞hepal-6，将人抗原基因p230转染B16和hepal-6细胞，用流式细胞术等方法证实了p230抗原蛋白能够表达于小鼠肿瘤细胞的表面，应用SM5-1可诱导转染有p230基因的B16(B16p230)和hepal-6(hepap230)细胞发生凋亡。将B16p230和hepap230细胞分别接种C57BL/6小鼠，发现它们均能在小鼠体内成瘤，给予SM5-1能够造成肿瘤细胞大量坏死，抑制肿瘤的生长并造成肿瘤消退。
以上研究结果表明，p230是一个新发现的可用于肝癌治疗的靶基因，抗人p230单抗可通过与p230的作用介导人肝癌细胞凋亡，是一个新的肝癌靶向治疗单抗。
随着治疗性单抗技术的不断进步，有越来越多的单抗药物被用于肿瘤的临床治疗。但是，大量实验结果表明，单纯给予抗体治疗并不能解决目前恶性肿瘤存在高复发率的问题，这也是其它治疗性单抗包括已经上市的抗HER-2单克隆抗体Herceptin及抗CD20的单抗Rituximab等所遇到的共同难题。导致这一问题的主要障碍是，用这些抗体药物施治后，总有少量肿瘤细胞不能被杀死。这些残存的细胞一旦条件合适(如抗体治疗结束)，则会重新形成肿瘤。针对这个问题，如果能在发挥单抗良好的抗肿瘤疗效的同时，充分激发机体对肿瘤的特异性主动免疫应答，将机体对肿瘤的被动免疫与主动免疫反应有机地结合起来，就能更强地发挥抗肿瘤作用并且产生对同种肿瘤的“免疫力”，解决抗体治疗或其他治疗方法中存在的肿瘤复发的实际问题。
作为被动免疫治疗剂，过去十年单抗药物获得了巨大成功，已被用于临床治疗肿瘤等重大疾病。鼠源、人源的制备，鼠源抗体人源化改造、重组细胞株构建、重组抗体纯化等技术已经日益成熟，引物设计、定点突变、表达载体的构建、受体细胞的转染和重组细胞的筛选方法、细胞培养技术已经成为当今分子生物学的成熟技术。
肿瘤疫苗作为一种肿瘤特异性主动免疫治疗的方式，是指给机体输入具有肿瘤抗原性的疫苗，刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫效应，用于治疗肿瘤及免疫机体对肿瘤的复发进行预防。目前研究得较多的是以树突状细胞(Dendritic cells，DC)为基础的融合细胞性肿瘤疫苗。DC是机体免疫系统中功能最强的专职性抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells，APC)，其最大特点是能激活初始型T细胞(CD4+Th细胞和CD8+CTL细胞)，生成辅助性T细胞和杀伤性T细胞，DC能识别、加工、提呈抗原，表达高水平MHC类分子、共刺激分子、粘附分子，同时分泌高水平的IL-12，激活相应的免疫细胞，在抗肿瘤免疫中起重要作用。肿瘤患者体内的DC可能因数量或功能原因而缺乏对肿瘤特异性抗原的有效提呈，使肿瘤逃脱了机体的免疫监视。如果将机体的DC提取出来，经体外各种免疫调节剂的激活，用各种形式肿瘤抗原修饰DC，然后回输体内，通过DC对肿瘤抗原的高效提呈作用则可打破机体对肿瘤的免疫耐受，有效激发机体的特异性抗肿瘤免疫反应。目前，以DC为基础的肿瘤疫苗已经在抗肿瘤免疫治疗中展现了突出的疗效，临床应用已迅速展开。但是，DC疫苗运用于临床还有许多亟待解决的问题①由于MHC的严格限制作用，必须从患者外周血中分离、扩增制备大量的DC后再回输入血，此技术难度较高。②体外扩增后，DC的性质、抗原提呈能力是否发生变化以及由此对研究结果的影响还有待验证。③针对不同的肿瘤治疗方案，需要确定致敏DC所需的抗原/RNA剂量、DC的免疫途径、剂量、次数、间隔时间等。针对以上实际问题，考虑到如果能使DC细胞的扩增、活化及抗原修饰在肝癌患者机体内完成，将会大大简化DC疫苗的制备程序。但这个设想的实现基于两个问题的解决，一是如何在体内完成DC的扩增及活化，二是如何在体内为有功能的DC提供足够的肿瘤抗原进行修饰。对于以上的第二个问题，制备的肝癌靶向性单抗SM5-1有效地诱导肝癌细胞凋亡所产生的细胞裂解物及凋亡小体等可作为肿瘤抗原修饰DC。因此，如何在体内完成DC的扩增及活化并在肿瘤局部选择性集聚就成为了突出的问题。
因此，本领域迫切需要开发新的有效治疗肿瘤的药物。

发明内容
简述本发明的目的就是一种新的有效治疗肿瘤的物质，它是含有(a)具有诱导肿瘤细胞凋亡功能的分子作为第一部分和(b)Flt3配体作为第二部分的双功能融合蛋白。
在本发明的第一方面，提供了一种具有抗肿瘤功能的双功能融合蛋白，所述融合蛋白包括第一部分和第二部分，第一部分为具有诱导肿瘤细胞凋亡功能的分子，第二部分为Flt3配体。
在一优选例中，所述的诱导肿瘤细胞凋亡的分子选自单克隆抗体、单克隆抗体的可变区、或诱发肿瘤细胞凋亡的蛋白分子或其变异体。
在另一优选例中，所述的诱导肿瘤细胞凋亡的分子选自(a)SM5-1抗体、CD20抗体、Her2抗体、Her3抗体、Her4抗体、EGFR抗体或其可变区；(b)Fas、TNF受体、Trail受体、或其胞外区。
在另一优选例中，在第一部分和第二部分之间还含有长度为10-25个氨基酸的接头序列或异亮氨酸拉链序列。
在另一优选例中，所述融合蛋白含有SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ ID NO28，SEQ ID NO30，SEQID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO44，SEQ ID NO46，SEQ IDNO48，SEQ ID NO58，SEQ ID NO60，SEQ ID NO62，SEQ ID NO64，SEQ ID NO66或SEQ ID NO68所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明的双功能融合蛋白。较佳地，所述的核酸分子具有SEQ ID NO23，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQID NO29，SEQ ID NO31，SEQ ID NO33，SEQ ID NO43，SEQ ID NO45，SEQ ID NO47，SEQ ID NO57，SEQ ID NO59，SEQ ID NO61，SEQ ID NO63，SEQ ID NO65或SEQ IDNO67所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明上述的核酸分子，以及与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的载体。
在本发明的第五方面，提供了一种制备本发明的双功能融合蛋白的方法，该方法包括a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达双功能融合蛋白，b)分离或纯化所述的双功能融合蛋白。
在本发明的第六方面，提供了本发明双功能融合蛋白的用途，它被用于制备抗肿瘤药物。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明的双功能融合蛋白以及药学上可接受的载体。


图1显示了双特异四价抗体分子(A)和双功能蛋白Flex/Fc/Fv(B)融合蛋白基因结构。
图2显示了FLex的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQ ID NO2)序列。SP为信号肽序列。
图3显示了FLex-Ig的核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸(SEQ ID NO4)序列。SP为信号肽序列；FLex，人FL膜外区基因。
图4显示了接头(Gly4Ser)3的核苷酸(SEQ ID NO5)和氨基酸(SEQ ID NO6)序列。SP为信号肽序列。
图5显示了抗人p230单抗(SM5-1)可变区基因PCR产物的1％琼脂糖凝胶分析。其中泳道1SM5-1重链可变区；泳道2SM5-1轻链可变区；泳道3DL2000 DNA标准物。
图6显示了SM5-1单抗的重链可变区核苷酸(SEQ ID NO7)和氨基酸(SEQ ID NO8)序列。SP为信号肽序列。
图7显示了SM5-1单抗的轻链可变区核苷酸(SEQ ID NO9)和氨基酸(SEQ ID NO10)序列。SP为信号肽序列。
图8显示了SM5-1嵌合抗体(chSM)重链的核苷酸(SEQ ID NO11)和氨基酸(SEQ IDNO12)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图9显示了SM5-1嵌合抗体(chSM)轻链的核苷酸(SEQ ID NO13)和氨基酸(SEQ IDNO14)序列。SP为信号肽序列；Stop，翻译终止密码；图10显示了SM5-1嵌合重链表达载体示意图；其中HCMV pro表示人巨细胞病毒Major Immediate早期启动子；VH表示人源化SM5-1的重链可变区基因；CH表示人γ1链恒定区编码基因；BGH pA表示Bovine growth hormone多腺苷化信号；SV40 ori表示SV40病毒早期复制起点；DHFR表示二氢叶酸还原酶基因；pUC origin为质粒复制起点；Amp为氨苄青霉素抗性基因。
图11显示了SM5-1轻链表达载体示意图，其中VL表示人源化SM5-1的轻链可变区基因；CL表示人链恒区基因，其余元件同图10。
图12显示了SM5-1人源化抗体(huSM)重链可变区核苷酸(SEQ ID NO15)和氨基酸(SEQ ID NO16)序列。SP为信号肽序列。
图13显示了SM5-1人源化抗体(huSM)轻链可变区核苷酸(SEQ ID NO17)和氨基酸(SEQ ID NO18)序列。SP为信号肽序列。
图14显示了SM5-1人源化抗体(huSM)重链的核苷酸(SEQ ID NO19)和氨基酸(SEQID NO20)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图15显示了SM5-1人源化抗体(huSM)轻链的核苷酸(SEQ ID NO21)和氨基酸(SEQID NO22)序列。SP为信号肽序列；Stop，翻译终止密码；图16显示了HuSMVH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO23)和氨基酸(SEQ IDNO24)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图17显示了huSMVH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO25)和氨基酸(SEQID NO26)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图18显示了FL/Fc/huSMFv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO27)和氨基酸(SEQ IDNO28)序列。SP为信号肽序列，Stop，翻译终止密码；图19显示了SM5-1与Flex融合后的hFLex/Fc/Fv融合蛋白基因结构。
图20显示了chSMVH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO29)和氨基酸(SEQ IDNO30)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图21显示了chSMVH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO31)和氨基酸(SEQID NO32)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图22显示了FL/Fc/chSMFv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO33)和氨基酸(SEQ IDNO34)序列。SP为信号肽序列，Stop，翻译终止密码；图23显示了2B8单抗的重链可变区核苷酸(SEQ ID NO35)和氨基酸(SEQ ID NO36)序列。SP为信号肽序列。
图24显示了2B8单抗的轻链可变区核苷酸(SEQ ID NO37)和氨基酸(SEQ ID NO38)序列。SP为信号肽序列。
图25显示了CD20嵌合抗体重链的核苷酸(SEQ ID NO39)和氨基酸(SEQ ID NO40)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图26显示了CD20嵌合抗体轻链的核苷酸(SEQ ID NO41)和氨基酸(SEQ ID NO42)序列。SP为信号肽序列；Stop，翻译终止密码；图27显示了CD20VH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO43)和氨基酸(SEQ IDNO44)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图28显示了CD20VH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO45)和氨基酸(SEQID NO46)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；
图29显示了FL/Fc/CD20Fv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO47)和氨基酸(SEQ IDNO48)序列。SP为信号肽序列，Stop，翻译终止密码；图30显示了CD20与Flex融合后的hFLex/Fc/scFv融合蛋白基因结构图31显示了Her2人源化抗体重链可变区核苷酸(SEQ ID NO49)和氨基酸(SEQ IDNO50)序列。SP为信号肽序列。
图32显示了Her2人源化抗体轻链可变区核苷酸(SEQ ID NO51)和氨基酸(SEQ IDNO52)序列。SP为信号肽序列。
图33显示了Her2人源化抗体重链的核苷酸(SEQ ID NO53)和氨基酸(SEQ ID NO54)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图34显示了Her2人源化抗体轻链的核苷酸(SEQ ID NO55)和氨基酸(SEQ ID NO56)序列。SP为信号肽序列；Stop，翻译终止密码；图35显示了her2VH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO57)和氨基酸(SEQ IDNO58)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图36显示了her2VH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO59)和氨基酸(SEQID NO60)序列。SP为信号肽序列，阴影区表示内含子序列；Stop，翻译终止密码；图37显示了FL/Fc/her2Fv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO61)和氨基酸(SEQ IDNO62)序列。SP为信号肽序列，Stop，翻译终止密码；图38显示了Her2与FL融合后的hFLex/Fc/Fv融合蛋白基因结构图39显示了hFLex/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO63)和氨基酸(SEQ IDNO64)序列。SP为信号肽序列，Stop，翻译终止密码；图40显示了hFLex/TRAILex融合蛋白基因结构图41显示了hFLex/IZ/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO65)和氨基酸(SEQ IDNO66)序列。SP为信号肽序列，Stop，翻译终止密码；图42显示了hFLex/Fc/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO67)和氨基酸(SEQ IDNO68)序列。SP为信号肽序列，Stop，翻译终止密码；图43显示了hFLex/Fc/Trailex融合蛋白基因结构图44显示了SM/FL对人脐血CD34+细胞的体外扩增作用。
图45显示了SM/FL对NK和DC细胞的体内扩增作用。
图46显示了抗人SM5-1嵌合性单抗/FL融合蛋白(A)、抗SM5-1人源化单抗/FL融合蛋白(B)对各种细胞的体外抑制增殖曲线图47显示了FL融合蛋白对B16(A)、Hepal-6(B)、B16p230(C)和Hepal-6p230(D)等细胞的体外抑制增殖曲线图48显示了Her2/FL融合蛋白(A)和heceptin(B)对各种肿瘤细胞的体外抑制增殖曲线图49显示了Her2/FL融合蛋白(A)和heceptin(B)对各种肿瘤细胞的体外杀伤活性图50显示了CD20/FL融合蛋白对各种肿瘤细胞的体外杀伤活性图51显示了Trail/FL融合蛋白(A)和Trail(B)对各种肿瘤细胞的体外抑制增殖曲线图52显示了Trail/FL融合蛋白(A)和Trail(B)对各种肿瘤细胞的体外杀伤活性图53显示了抗HER-2/FL融合蛋白体内抗肿瘤活性。
图54显示了CD20/FL融合蛋白体内抗肿瘤活性。
图55显示了TRAIL/FL体内抗肿瘤活性。
图56显示了chSM/FL、huSM/FL融合蛋白的体内分布。
图57显示了抗人Her2单抗、抗人CD20单抗和TRAIL与FL组成的三种融合蛋白的体内分布实验。
发明详述发明的详细内容将分以下几部分介绍。
A、定义除非另有详细说明，本文所用的技术和科学术语同常规术语。
B、含有(a)具有诱导肿瘤细胞凋亡功能的分子作为第一部分和(b)Flt3配体作为第二部分的双功能融合蛋白。
一方面，本发明是一种双功能融合蛋白，该蛋白包括Flt3配体或其中的生物活性片段，和一种蛋白质或多肽分子，该分子能诱导肿瘤细胞调亡。更好的是，该融合蛋白是一个独立的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。
任何适合的Flt3配体均涉及本文提供的成分和方法。本文使用的术语“Flt3配体”是指一种多肽，能结合Flt3受体并诱导信号传导。Flt3配体或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，该序列并不影响其活性。适当替换氨基酸是本领域的共知技术，此项工作可以很容易进行并且保证不改变所得分子生物活性。这些技巧使人们认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。表1是这种替换的一些示例。
表1原氨基酸残基 保守性置换Ala(A) Gly；SerArg(R) LysAsn(N) Gln；HisCys(C) SerGln(Q) AsnGlu(E) AspGly(G) Ala；ProHis(H) Asn；GlnIle(I) Leu；ValLeu(L) Ile；Val
原氨基酸残基 保守性置换Lys(K) Arg；Gln；GluMet(M) Leu；Tyr；IlePhe(F) Met；Leu；TyrSer(S) ThrThr(T) SerTrp(W) TyrTyr(Y) Trp；PheVal(V) Ile；Leu可能还有其他的类似的可替换性，这种可替换性往往可以根据经验确定或者根据已知的保守序列进行确定。
Flt3配体是I型跨膜蛋白，以可溶性同源二聚体的形式释放到细胞外。见Lyman et al.，Flt3 ligand in THE CYTOKINE HANDBOOK(Thomson et al.ed.，4th ed(2003))。一种具体情况，Flt3配体或其生物活性片段是可溶的。在氨基酸水平人Flt3配体与鼠Flt3配体有72％的同源性，具有鼠源蛋白的很多特点，如糖基化位点，关键的半胱氨酸残基及剪切连接点。很多研究都提示了合适的Flt3配体的蛋白。如Cell751157-67(1993)，Hannum et al.，Nature，368364-67(1996)；U.S.Patent No.5,843,423；U.S.Patent Application Serial Nos200030113341and 20030148516；and Genebank AccessionNos.NM 001459，U2 9874，U03858，and U04806.等。
Flt3配体的受体，即Flt3，是三型受体酪氨酸激酶受体家族的成员。在正常的细胞，Flt3表达于未成熟的造血细胞，如CD34+细胞，胎盘，生殖腺及脑组织。见，e.g.，Rosnet，et al.，Blood 821110-19(1993)；Small et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91459-63(1994)；and Rosnet et al.，Leukemia 10238-48(1996).Flt3高表达在恶性血液组织，如急性骨髓型白血病，急性前B细胞性淋巴细胞性白血病，急性T细胞性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓性白血病。Flt3配体与其受体结合以后活化细胞内的信号转导途径，如STAT5，PI 3’-激酶，PLCγ，MAPK，SHC，SHP2，和SHIP。见e.g.，Gilliand et al.，Curr.Opin.Hematol.9274-81(2002).膜型FL和可溶性FL都可以结合并活化Flt3受体。
具体说来，Flt3配体(FL)或具有生物活性的片段都能刺激造血干细胞或祖细胞的增殖。特殊地，Flt3配体或具有生物活性的片段能选择性地刺激骨髓前体细胞或单核细胞，巨噬细胞，B细胞，树突状细胞和自然杀伤细胞增殖。FL最初表达在骨髓微环境的造血细胞和其他细胞，包括B细胞，T细胞和骨髓前体细胞。FL是CD34+祖细胞的生长刺激因子，促进树突状细胞和天然杀伤细胞的增殖和分化。比如我们的研究表明Flt3通过NK细胞的活性介导抗肿瘤信号。Péron et al.，J.Immunol.1616164-70(1998).
Flt3配体还促进树突状细胞的成熟，使之针对肿瘤细胞更有效地发挥抗原递呈细胞的作用。见，e.g.，Fong et al.，Gene Ther.9(17)1127-38(2002).更重要的是经Flt3配体诱导，成熟的树突状细胞从骨髓释放到外周血，使刺激免疫应答的树突状细胞数量增多。但是这种有效的诱导需要其他造血生长因子和细胞因子的存在。
任一FL的生物活性片段都可以应用到目前的研究方法中。在这里，FL片段的生物活性的含义是指作为Flt3的刺激因子，其仍然能保持功能。通常情况下，Flt3配体与Flt3在细胞表面结合，刺激一个或多个信号传导通路或途径并引起细胞反应，例如增殖。正常情况下，活性片段至少保持50％的刺激Flt3的活性。在更适宜的条件下，活性片段能够保持60％，70％，80％，90％，95％，99％和100％的刺激活性。Flt3的活性取决于采用一种合适的方法，包括但不仅仅限于信号分子的活性，这些信号分子包括STAT5，PLCγ，或者对Flt3依赖的细胞体外的体外增殖活性。例如，BAF/BO3细胞株缺乏Flt3受体，是IL-3依赖型细胞株。但是，用Flt3转染BAF/BO3细胞株，能够使其对Flt3配体诱导的增殖产生应答。见Hatakeyama，et al.，Cell59837-45(1989).
具体地说，Flt3配体或生物活性片段在融合蛋白中具有SEQ ID NO2氨基酸序列。Flt3配体能够特异性与和SEQ ID NO2氨基酸序列相结合的抗体相结合，并且，Flt3配体能够持续保持其生物学活性，任何合适的Flt3配体特异性抗体都能应用。另外，Flt3配体包含一段序列，该序列与SEQ ID NO2的28到128位具有80％的同源性。Flt3配体还包含一段氨基酸序列，该序列是从SEQ ID NO2的28到160位和28到182位的氨基酸残基中选择出来的。在特殊情况下，Flt3配体还包含一段SEQ ID NO2的28到128位的氨基酸残基。Flt3配体包含至少100个氨基酸残基，并且Flt3配体与SEQ ID NO2具有至少40％的同源性，这种同源性取决于SEQ ID NO2中的相同氨基酸序列的大小，并且，Flt3配体始终保持其生物学活性。
任何的生物活性片段都可应用到在这里提到的肿瘤有关方法当中。应用于此，“肿瘤药物”指的是能引起肿瘤细胞死亡的药物。这种药物通常是蛋白类的或多肽类的，这种细胞死亡可以是凋亡，坏死或类似情况。一般情况下，细胞死亡是由凋亡引起的，这种凋亡或者直接由能够诱导Fas配体的凋亡信号途径或间接地通过生长因子的失活而产生的。在这里，凋亡指的是肿瘤细胞的程序性死亡及最终导致染色质的凝集和DNA的裂解。任何一种合适的方法都可以用于细胞凋亡的评估，包括但不仅仅限于流式分析，例如TUNEL分析，琼脂糖凝胶分析和caspase 3活性分析。另外，融合蛋白的肿瘤药物在自然情况下发生抗肿瘤活性。这种药物包括能诱导肿瘤细胞生长停滞或死亡的受体的配体，包括自然情况下出现配体等分子，可以诱导包括TNF-α，Fas(CD95)配体，TRAIL，淋巴毒素(LT)，TWEAK，以及其他TNF配体超家族成员的凋亡。具体讲，以后的肿瘤药物是从FAS配体，TNF，TRAIL或者具有生物活性的细胞外基序中挑选出来的。另外，肿瘤药物的生物活性片段具有至少50％的凋亡活性，在合适的情况下，衍生片段具有60％，70％，80％，90％，95％，99％及100％的凋亡活性。
另外，肿瘤药物是一种能够抑制肿瘤增殖，在一些情况下，也能诱导凋亡的蛋白。这些抗体的靶向分子包括例如表皮细胞生长因子受体亚家族(包括EGFR，HER2，HER3和HER4)这些都是具有酪氨酸激酶活性的穿膜蛋白，这些蛋白在大多数恶性肿瘤(包括前列腺癌，结肠癌，乳腺癌，肾癌，卵巢癌，肺癌，胰腺癌)中表达，特异地抗EGFR或抗HER2抗体能够阻断这些蛋白与EGFR和HER2的结合从而阻断肿瘤细胞增殖的信号传导途径，直接或间接抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞的凋亡。见e.g.，Clin.CancerRes.81720-30(2002)；Brodowicz et al.Br.J.Cancer851764-70(2001)；Crombet-Ramos et al.，Int.J.Cancer101567-75(2002)；Herbst et al.，Expert Opin.Biol.Ther.1719-32(2001).
另外，肿瘤药物是一种能与肿瘤特异或相关抗原结合的诱导凋亡的蛋白。例如，p230是一种在人肝癌，乳腺癌，淋巴瘤细胞中特异表达的蛋白，其命名源于应用SM5-1单抗通过Western blotting检测方法得到的一条明显的特异的230KD的条带。See U.S.PatentApplication Serial No.09/915,746.P230由于其特异性提示它可以作为肿瘤免疫治疗的目标靶向基因，P230与配体或抗体的结合可以诱导细胞凋亡。一些抗SM5-1抗体可以在例3中得到描述。在一些特殊情况下，应用Serial No.(Attomey Docket No.54906-2000100)蛋白可以封闭SM5-1。
另外，肿瘤药物是一种抗体或具有生物学活性的片段，在这里，抗体是指完整的抗体，Fab片段，Fab′片段，F(ab′)2片段，Fv片段，二体，单链抗体，和抗体片段组成的多特异性抗体，其分子仍能够保持生物学活性。现在应用在各种方法中的抗体能够通过细胞培养，抗生素和动物中产生，这些动物包括但不仅仅局限于牛，兔，山羊，小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠，绵羊，狗，猫，猴，猩猩，人猿等。因此，目前应用的抗体都是哺乳动物来源的抗体。
噬菌体技术可以用来分离初始抗体或者生产不同的特异性或亲和力。这种技术已经成熟。具体地说，可以通过众所周知的重组技术来得到抗体。例如，可以通过含有编码抗体DNA序列的载体转染宿主细胞而得到重组抗体。一个或多个载体可以用来转染表达至少一个VL和一个VH区至宿主细胞。对于得到和生产抗体的重组技术规范性的描述包括Delves，ANTIBODY PRODUCTIONESSENTIAL TECHNIQUES(Wiley，1997)；Shephard，et al.，MONOCLONAL ANTIBODIES(Oxford University Press，2000)；以及Goding，MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press，1993)。
目前抗体的使用中可通过重组方法来修饰以提高抗体所需功能的有效性。同时可以预期抗体可以通过重组替换得以修饰。典型的这种替换为保守替换。例如，至少一个恒定区的氨基酸用其他残基来取代。详见U.S.Patent No.5,624,821，U.S.Patent No.6,194,551，Application No.WO 9958572；and Angal et al.，Mol.Immunol.30105-08(1993)。氨基酸的修饰包括缺失、添加和取代。在一些情况下，这种改变可以降低不需要的活性，如补体依赖细胞毒性。
抗体可以是人源化抗体。在这里所说的“人源化抗体”指抗体中非抗原结合区的氨基酸被改变，这样抗体更加类似于人的抗体，而仍然保留其原始的抗原特异性。典型的是可变区为一种物种如小鼠，而恒定区为人的。抗体也可以是嵌合抗体。在这里所说的“嵌合抗体”指抗体中氨基酸序列被改变，抗体含有的序列来自一种以上的哺乳动物，而仍然保留其原始的抗原特异性。在这里所说的“单链抗体(ScFv)”指基因工程抗体，含有免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区，通过柔性多肽连接。
更佳的，这里所述的方法及组合物中的抗体为单克隆抗体。这里所说的“单克隆抗体”指由一个B细胞得到的单一抗体。
抗体可以是人的抗体。在这里所说的“人的抗体”指基本上抗体的完整的轻链和重链区包括互补性决定区均来自人。例如，通过人杂交瘤技术、人B细胞技术可得到人单克隆抗体(详见Kozbor，et al.，Immunol.Today 4；72(1983)，EBV转化技术(详见Cole et al.MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96(1985))，或者使用噬菌体呈现技术(详见Marks et al.，J.Mol.Biol.222581(1991))。一个特殊的例子，通过转基因小鼠得到了人抗体。这种部分或完全的人抗体已有文献发表，任何这种技术都可以应用。依据一个特别指出的例子，在转基因小鼠中得到了表达人抗体轻链和重链基因的完整人抗体序列。对于制备生产人抗体的转基因小鼠的规范性描述见于Application No.WO 02/43478。来自生产所需抗体的转基因小鼠的B细胞可以再以杂交瘤细胞融合，这样可以连续生产抗体。详见U.S.Patent Nos.5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；and 5,545,806；and Jakobovits，Adv.Drug Del.Rev.3133-42(1998)；Green，et al.，J.Exp.Med.188483-495(1998)。
一个具体的例子，这里所用的抗体可以抑制目标肿瘤细胞的增殖。如果在某种抗体存在时细胞增殖是抑制的，而没有该抗体或为非结合抗体时细胞增殖，则认为该抗体对于细胞增殖是抑制的。增殖可以通过任何一种合适的方法定量测定。典型的方法是通过体外测定放射标记的核苷酸(如3H-胸腺嘧啶核苷)与DNA的结合来定量增殖。具体来说，可以通过ATP发光，如CellT iter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(Promega)测定增殖。这样，抗体可以特异的或针对任何调节细胞生存或生长的分子。
一个具体的例子，从一组含有抗p230、抗CD20、抗Her-2、抗Her-3、抗Her-4、抗EGFR抗体或其生物活性片段中筛选抗体。对于这些抗体包括例子规范性描述见于U.S.Patent Nos.5,677,171；6,399,061；6,458,356；6,455,043；and 5,705,157。
含有Flt3配体的融合蛋白或其生物活性片段以及杀癌细胞试剂的嵌合抗体可以用合适的连接子连接。例如，Flt3配体和杀癌细胞试剂可通过多肽连接子连接。一个特殊的例子，连接多肽是(Gly4Ser)3。
这里说的融合蛋白的成分和方法可以含有Flt3配体和杀癌细胞试剂以任何顺序连接。例如，Flt3配体位于融合蛋白的N端。再例如，Flt3配体也可位于融合蛋白的C端。
融合蛋白可进一步包括在其C端含有一个多肽片段的多肽标签。任何合适的标签都可以使用。例如，标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1(见表2)。这些标签可用于融合蛋白的纯化。
表2可使用的标签系统


1.Prickett，et al.，BioTechniques，7(6)580-584(1989)2.Xie，et al.，Endocrinology，139(11)4563-4567(1998)3.Nagelkerke，et al.，Electrophoresis，182694-2698(1997)4.Tolbert and Lameh，J.Neurochem.，70113-119(1998)5.Chen and Katz，BioTechniques，25(1)22-24(1998)6.Tseng and Verma，Gene，169287-288(1996)7.Rudiger，et al.，BioTechniques，23(1)96-97(1997)8.Olah，et al.，Biochem.，22194-102(1994)9.Wang，et al.，Gene，169(1)53-58(1996)10.Grose，U.S.Patent No.5,710,24811.Bastin，et al.，Mol.Biochem.Parasitology，77235-239(1996)Invitrogen，Sigma，Santa Cruz Biotech另一方面，本发明提供了编码一种融合蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链；这种融合蛋白包括Flt3配体、其有活性的片段或者能杀伤肿瘤的蛋白质和多肽。在一个实例中，分离的编码融合蛋白的核酸具有SEQ ID NO1、9、13、17、21或、25所示的核苷酸序列。本发明还提供了包含分离的编码融合蛋白的核酸分子的载体。载体还可能包含所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列。
任何编码Flt3配体或其有活性的片段的合适的DNA结构都适用于本发明。这样的结构包括但不限于Genbank编码U03858和ATCC编码ATCC 69382的核酸序列。可应用于本发明的还包括美国专利5,843,423和美国应用专利200030113341和20030148516中的DNA序列及其相应蛋白。
任何编码能杀伤肿瘤的蛋白质和多肽的DNA结构也适用于本方法。下文实例中提及的序列都适用于本方法。
任何合适的载体都可以使用。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达载体均已叙及，如Pouwels et al.，CLONING VECTORS实验室手册(Elsevier最新版)。
表达载体包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合蛋白DNA序列，如哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。调节序列包括转录启动子、操纵子、增强子、核糖体结合位点或控制转录和翻译起始和终止的合适序列。在融合蛋白序列需要调节序列功能的时候，则连接合适的调节序列。这样，启动子序列被连接在编码融合蛋白DNA序列前端。在宿主细胞内的复制的能力通常由复制起始点控制。用于转化株识别的筛选基因也可加入表达载体另外，非天然的Flt3配体或能杀伤肿瘤的蛋白质和多肽的信号肽的编码序列可以引入表达载体。例如信号肽(分泌引导物)序列可以和与融合蛋白编码序列融合，从而使翻译的融合蛋白有。信号肽可增强宿主细胞向胞外分泌嵌合多肽。信号肽在嵌合多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统也可用于重组融合蛋白的表达。Luckow andSummers综述了痘病毒系统用于在昆虫细胞中生产异种蛋白的情况(Bio/Technology647(1988).)哺乳动物来源的建系细胞也可应用。哺乳动物细胞系包括猴肾细胞COS-7(ATCC CRL 1651)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、Chinesehamster ovary(CHO)细胞、HeLa细胞、and BHK(ATCC CRL 10)细胞、来源于非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCC CCL 70)的CV-1/EBNA-1细胞系(EMBO J.102821，1991)及NSO细胞系Galfre et al.，Methods Enzymol.733-46(1981))用于哺乳动物细胞表达载体的转录和翻译调节序列可从病毒基因组中获得。常用的启动子和操纵子序列来源于多瘤病毒、腺病毒2、SV40和人巨细胞病毒。来源于SV40病毒基因组的序列，如SV40复制起始点、早期和晚期启动子、增强子、连接子、POLYA位点，可为在哺乳动物细胞中表达其他基因序列提供基因元件。病毒早期和晚期启动子尤其适用，因为二者容易从病毒基因组中获得，并包括一个病毒的复制起始点。参照，Fiers et al.，Nature273113(1978)。大SV40片段和小SV40片段也可应用，它可提供从Hind III位点到Bgl I位点的大约250bp的序列，包括了SV40的复制起始点。
可用的哺乳动物细胞表达载体可如Okayama and Berg(所述构建Mol.Cell.Biol.3280(1983)。一种在C127鼠乳腺上皮细胞中高表达的系统可如Cosman et al所述构建(Mol.Immunol.23935，1986)。一种高表达载体PMLSV N1/N4已保存于ATCC，编码39890，(Cosman et al.，Nature 312768，1984)。另外一种有用的哺乳动物表达在见EP-A-0367566和U.S.Pat.application Ser.No.07/701,415，在此也适用。逆转录病毒载体也适用。在天然信号肽序列的位置，可添加异源的信号肽序列，如U.S.Pat.No.4,965,195描述的IL-7的信号肽序列、Cosman等描述的IL-2受体的信号肽序列(Nature 312768(1984)、EP 367,566描述的IL-4的信号肽序列、U.S.Pat.No.4,968,607描述的I型IL-1受体的信号肽序列和EP 460,846描述的III型IL-1受体的信号肽序列。
生产融合蛋白的方法也已包括。该方法包括培养含有融合蛋白编码核酸的重组细胞。该融合蛋白包括Flt3配体、其有活性的片段或者能杀伤肿瘤的蛋白质和多肽。细胞表达编码的融合蛋白，表达的融合蛋白的复性。在一个实例中，方法还包括复性的融合蛋白的分离和/或纯化。该方法的产物也被保护。可将融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜，例如Millipore、Amicon、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。SP基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
可利用含有flt3配基的亲和层析柱对表达的融合性多肽进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。另一种替代的方法是利用含有结合Flt3-L的抗体亲和柱纯化该融合性多肽。
为简化纯化步骤，可利用转化的酵母细胞作为宿主细胞分泌性表达融合蛋白。从酵母细胞发酵上清中纯化重组多肽的方法可参考Urdal等(J.Chromatog.296171，1984)论著。
利用含有特定核酸序列的重组细胞表达融合蛋白也包括在内。实例之一，该细胞可为真核细胞。特指的实例之一中，该细胞可为CHO细胞、COS细胞，或NSO细胞。
重组蛋白以及编码该重组蛋白的核酸可利用适当的方法制备，例如，化学合成、重组表达，或其合并应用。参见John Wiley & Sons，Inc 2000年出版的《CurrentProtocols in Molecular Biology》，以及Cold Spring Harbor Laboratory Press1989年出版的《Molecular ConingA Laboratory Manual》。在一个实例中，编码融合蛋白的核酸序列是利用PCR技术制备的，方法参见Prodromou等(Protein Eng.5(8)827-29；1992)论著。
提请保护的药物成分含有一种融合蛋白，该融合蛋白即含有Flt3-L融合蛋白或其活性成分，又含有具有抗肿瘤活性的蛋白或多肽成分。该药物成分还可含有赋形剂成分。本专利所述的药用成分可利用常规的一种或多种方法制成药用配方，以利于药物活性成分发挥其药理作用。这种制药配方工艺可用常规的混悬、水针剂、颗粒、片剂、糖丸、胶囊、软膏、喷雾干燥、冻干等制剂工艺。如何选择适当的剂型取决于采用的给药途径。当采用液体制剂时，可选用水溶液、油(含动物、植物、矿物油)溶液、作为辅料。溶液中可含有生理性盐溶液、甘油、PEG等。当使用液体制剂时，其中本发明所提及的蛋白含量从0.5％至90％(w/w)，尤其是指从1-50％。
另一方面是一种组合物，该组合物由以下部分组成a)有效剂量的Flt3配体和有肿瘤杀伤作用的肽或蛋白组成的融合蛋白；b)有效的抗肿瘤制剂。我们所指的抗肿瘤制剂是能够抑制黑色素瘤、乳腺癌或肝癌的形成。它们通过诱导肿瘤细胞的生长抑制或凋亡发挥作用。还有一些抗肿瘤制剂包括细胞因子，配体，抗体，放射性核素和化疗成分。比如IL-2，TNF等；131I，90Y等；阿霉素，柔红霉素等；还有细菌、植物和其它毒素；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702；含抗肿瘤成分的脂质体；其他抗体或抗体的部分(Fab)。
提供操作方法的试剂盒。这样的试剂盒由一个或多个有效剂量的融合蛋白和使用这些融合蛋白的作用说明组成。融合蛋白是由Flt3配体和有肿瘤杀伤作用的肽或蛋白组成。具体来说这个试剂盒还要包含以上所说的有效的抗肿瘤制剂。最好的药用形式是溶在无菌生理盐水，葡萄糖，其它平衡液，或其它能发挥药效的无菌液体中。另外还可以冻干或干燥。在这种情况下这一试剂盒还应说明不影响药效的溶剂最好是无菌的生理盐水和葡萄糖液。还有一些试剂盒最好还有无菌包装针头和注射器。还可以含有指导医生或患者操作说明。
如本文所用，所谓的治疗有效剂量或有效组成是指单独使用融合蛋白或与其他治疗联合应用能有效的预防或缓解肿瘤生长、或肿瘤相关疾病。治疗的有效剂量是指复合体能有效缓解症状的剂量。比如治疗，治愈，预防，或缓解的相关医疗条件或提高治疗，治愈，预防，或缓解的医疗条件。当针对个体仅使用有活性的成分时，治疗的有效剂量仅指有效成分。当使用复合物时，治疗的有效剂量是指活性成分的组合量，无论是联合使用，续贯使用或同时应用。
C、含Flt3配体的融合蛋白及杀肿瘤制剂的用法本发明还包括给需要治疗或合乎要求的动物服用有效剂量的Flt3配体和蛋白或多肽类抗肿瘤物组成的融合蛋白。适用的细胞包括哺乳动物细胞。特殊情况下是哺乳类肿瘤细胞。具体说也可以是哺乳动物体内细胞。
Caspase活化途径在细胞的凋亡中起着重要的作用，(budihardjo等，ann。Reev。cell dev。Biol。15269-90)，caspase家族是具有很高的特异性的半胱氨酸蛋白酶家族，其裂解必须识别4个天门氡氨酸在靠近裂解的N-末端(Grutter，Curr.Op.Struct.Biol.10649-55(2000).)。caspase3又称作CPP32，YAMA和apopain，其特异性的裂解位点WEHD。它是个下游的或者是执行者caspase，可裂解多种底物如lamins，PARP，DFF等。caspase3以未激活的酶原存在于胞内，被上游的caspase9和Apaf-1裂解后活化，而caspase9和Apaf-1的活化则依赖于细胞外凋亡信号的刺激，如Fas-L，TNF和TRAIL。Caspase活化途径可被多种实验方法所证实，具体的一些方法见APOPTOSISAPRACTICAL APPROACH(Studzinski，ed.1999).
caspase3是半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，其在细胞凋亡或程序性细胞死亡中发挥重要的作用。(Grütter，Curr.Opin.Structural Biol.10649-55(2000))，它以酶原的形式存在于细胞内，其典型的激活方式是由启动者caspase如caspase8，9，10通过蛋白水解被激活。活化后的caspase3接着裂解其他的底物蛋白，包括参与DNA修复的蛋白，细胞骨架及核骨架蛋白，这些蛋白在天门氡氨酸后都含有其识别序列DEVD。caspase3活化状态的检测可参考下列文章美国专利6,342,611；6,391,575；6,335,429；和美国专利申请No.20030186214。因此，任何检测caspase 3活性的合适方法都可用于本发明。
这里我们提供了一种用嵌和蛋白治疗肿瘤的方法。即用含有FLt3-L，或其活性片段，和蛋白或多肽的肿瘤杀伤分子组成融合蛋白，用于治疗哺乳动物肿瘤，该方法还阐述了其必要性及有效剂量。见SUPRA的第二部分，其具体应用是肿瘤为黑色素瘤，乳腺癌及肝细胞癌时。
另一方面，该方法可产生肿瘤特异性的淋巴细胞。即通过给予有效剂量的上述融合蛋白(用含有FLt3-L，或其活性片段和蛋白或多肽的肿瘤杀伤分子组成融合蛋白)是哺乳动物产生肿瘤特异性的淋巴细胞。
通过给予有效剂量的上述融合蛋白和抗肿瘤分子来治疗需要该处理的哺乳动物。
任何哺乳动物都适用该治疗方法，尤其是人。只要该对象患有肿瘤，需要接受该种治疗。
该方法可用于患有腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤的对象。肿瘤组织的来源可以是肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道，心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞溜、少树突状胶质瘤、室管膜和脉络膜丛肿瘤、松果体肿瘤、神经元肿瘤、成神经管肿瘤、雪旺氏细胞瘤、脑脊膜瘤、脑脊膜肉瘤；此外眼部的肿瘤如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤，横纹肌肉瘤、成视网膜细胞瘤；还有内分泌腺肿瘤如垂体瘤、甲状腺榴、肾上腺皮质肿瘤，神经内分泌系统肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤；头和颈部肿瘤头颈肿瘤、口腔肿瘤、咽部肿瘤、喉部肿瘤、牙源性肿瘤；胸部肿瘤大细胞性肺癌，小细胞性肺癌、非小细胞性肺癌、胸腔肿瘤、恶性间皮瘤、胸腺榴、胸部原始胚胎细胞瘤；消化道部位的肿瘤食道瘤、胃部肿瘤、肝脏肿瘤、胆道肿瘤、胰腺肿瘤、结直肠腺癌、肛门肿瘤；泌尿生殖道肿瘤肾细胞癌、肾输尿管肿瘤、膀胱肿瘤、尿道肿瘤、前列腺肿瘤、阴茎肿瘤、睾丸肿瘤；女性生殖器肿瘤阴道肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫体腺瘤、卵巢癌、妇科肉瘤、乳腺肿瘤；皮肤肿瘤基地细胞癌、鳞状细胞癌、成纤维肉瘤、MERKEL细胞瘤、恶性黑色素瘤；骨及软组织肿瘤骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、chrondrosarcoma、ewing氏肉瘤、神经外胚层肿瘤、血管肉瘤；造血系统肿瘤脊髓发育不良综合症、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴系白血病、HTLV-1、T细胞白血病/淋巴瘤、慢淋巴系白血病、毛细胞白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、巨细胞白血病；儿童肿瘤急性淋巴浆细胞样白血病，急性髓细胞性白血病、成神经细胞瘤、骨肿瘤、横纹肌肉瘤、淋巴瘤、肾脏及肝脏肿瘤。
在这里，我们说的“抑制或治疗”作用包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟或/和这些症状严重程度的降低，它还进一步的包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻，并防止其他症状的出现，还可减少或防止转移。因此，抑制或治疗”作用指的对那些有恶性或具有发展为这些疾病或症状的哺乳动物有利的作用。
在实施这种治疗方法时，这种蛋白的有效剂量是根据个人情况决定的。如本发明提供的方法，这种融合蛋白可单独应用或联合使用其它方法例如用其它免疫分子(细胞因子)，化疗药和抗肿瘤药等。当于其它药物联用时，这种蛋白可以与其它药物同时注射或随后注射。如果随后注射，由实施医生决定它们先后的次序。这种治疗成分的有效性和毒性是由基本的药理动力学或实验动物来决定的，例如它们的半数致死量和半数有效量，这可以用LD50与ED50的比率来表示。融合蛋白表现好的疗效是所需要的。从细胞培养和动物研究所得到的数据可以用作人使用时的参考。剂量的改变根据注射的途径和使用形式来决定。医生根据患者的情况选择注射途径、药物形式和精确的剂量。根据个人的有效药物在血浆中水平决定药物的剂量和间隔时间，从而达到理想的疗效或最低的有效浓度。每种成分可以根据有效浓度而改变，也可以根据体外的数据而改变。
采用合适的注射途径。剂量形式包括片剂、药片、散剂、胶囊等，例如见雷明顿药理学。
根据每个患者的年龄、体重和反应，医生常规要决定这里给予的抗体剂量。
迅速形成蛋白和注射的方法技术可以参见REMINGTON’S PHAR-MACEUTICALScience。在这里提到的融合蛋白的形式和注射方法与抗体相似。合适的途径有口服、皮下、以及直接动脉注射、静脉注射或眼内注射等。观察这类蛋白的药理以及其实施这种方法可以按照传统方法来研究。
另外，人可以根据情况在局部注射这种蛋白而不是全身注射，比如将抗体直接注入肿瘤。而且，人可以用靶向药物输送系统注射蛋白，例如用脂质体包裹组织特异性抗体靶向输入肿瘤。
当通过静脉，皮内或皮下注射有效量的蛋白时，它是无热源的肠胃外可接受的水溶液。按照它的PH，稳定性等制备相应的蛋白。静脉，皮内和皮下注射的药物成分除了我们介绍的蛋白还有等渗液例如氯化钠等。对于肌肉内注射，渗透剂如何渗入是一障碍。
对于吸入法来说，融合蛋白常规是用合适的推进力以气雾剂形式吸入。就压缩的气雾剂来说，吸入的剂量是由提供送入量的阀门来决定。注射形式可以是单个剂量或多个剂量，也可以是溶液或栓剂。
不经肠的药物形式包括有活性的水溶液。另外，活性成分中的悬浮物可以以油剂悬浮物来制备。亲脂性溶液包括脂肪比如芝麻油，或合成的脂肪酸酯比如脂质体。水的注射悬浮成分包含能够增加可见度的物质。随意地，悬浮剂可以是能够增加高浓度的液体水溶性和稳定性的物质。可以替代的是活性成分可以是粉末形式，例如无菌无热源的水。
在药的成分中嵌合抗体的使用量依赖患者的条件和患者已经使用过的处理条件来决定的。最后，实施医生决定用不同的蛋白量治疗不同的患者。起初，医生用低剂量的蛋白来观察患者的反应情况，然后剂量逐渐增加直到达到用最合适的剂量取得最合适的治疗效果。然后剂量不再增加。不同的药物成分应该在0.01ug和1mg/kg之间使用。当使用时这些成分是无热源的，物理形式可以接受的。有疗效的物质除了融合蛋白还有其它成分，它们可以选择性的或另外的和蛋白同时或系统的注射。可仿效的代理药包含抗肿瘤药。
本文所述的融合蛋白可单独使用，也可与其它治疗方法联合使用。例如，在融合蛋白所结合的肿瘤局部进行放射治疗。放射治疗的剂量应足以杀灭增殖期的肿瘤细胞。理想的情况是，联合治疗的效果须高于放射治疗或融合蛋白的单一治疗效果。典型的放射治疗方法包括beta-射线、X-射线、alpha-粒子等。对肿瘤照射的放射源可以为外照射，也可为利用放射性核素产生内照射。实施内照射的方法可以是业内所熟悉的方法。肿瘤放射治疗的方法可参见V.T DaVita Jr.等所编《CancerPrinciples &Practice of Oncology 248》1993年第4版中S.Hellman所著“Principles of RadiationTherapy”章节。放射治疗的典型剂量为1至500cGy(例如，由1至500rads)。
可将含有Flt3-L或其有效成分，以及抗肿瘤蛋白/多肽的融合蛋白，与免疫增强剂作为疫苗使用。
另一方面，本文列出了利用含有Flt3-L或其有效成分，以及抗肿瘤蛋白/多肽的融合蛋白，与免疫增强剂作为疫苗使用，从而激活哺乳动物体内有效的抗肿瘤免疫的使用方法。
在此使用的“免疫增强剂”一词系指可增强或延长针对某靶抗原，如肿瘤抗原的免疫反应的物质。这种免疫增强作用可为叠加的或协同的。在此使用的“免疫反应”一词的涵义包括B细胞介导的免疫反应、T细胞介导的免疫反应、以及T、B细胞均参与的免疫反应。免疫反应增强剂的实例如细胞因子，如IL-12、IL-2、IFN-γ、免疫佐剂、免疫刺激多肽，等等。本发明所述的组合物和方法中，免疫增强剂与融合蛋白可同时使用或先后使用，可使用相同的给药途径或不同的给药途径。
可以用传统的方法来制备疫苗。例如，用合适的液体如盐水、完全或不完全佐剂来稀释免疫原。此外，免疫原分子也可以与或不与载体分子连接制备蛋白质抗原。这样的载体分子并不局限于小牛血清白蛋白、KLH、破伤风毒素等等。免疫原也可以与脂蛋白或脂质体、佐剂一起注射。免疫原可以以任何适合抗体产生的途径如静脉、皮下、皮内、肌肉注射等途径免疫动物。免疫原可以一次或规律间歇给药直到有显著的抗肿瘤T细胞反应或抗肿瘤细胞抗体产生。抗肿瘤细胞反应出现的评价可以通过在免疫前后检测抗肿瘤抗原细胞毒性T淋巴细胞的前体细胞的出现比率来实现。抗体的检测可以如文献报道用免疫检测的方法从血清测得。
当前传统注射疫苗是为了预防和治疗的目的。当以预防为目的时，融合蛋白在肿瘤任何症状或任何迹象出现前给予。给哺乳动物特别是人类预防性的注射融合蛋白是为了预防或减轻恶性症状。当以治疗为目的时，融合蛋白在疾病开始(或刚开始)、或任何症状出现前给药，其目的是为了减轻疾病。
局部给药至病变受累的部位可以用文献报道的方法，但并不局限于此，如，局部注射，植入多孔渗水装置，里面包括细胞表达的融合分子、融合蛋白或免疫增效剂。
疫苗的评价可以首先在动物模型中进行，从啮齿类动物开始，然后到非人类的灵掌类动物，最后到人。免疫程序的安全性是通过观察免疫动物的一般健康状况(体重、体温、胃肠功能的变化等等)和尸检的病理变化来决定的。动物实验之后，可以在肿瘤患者身上检测。传统的方法可以通过评价患者的免疫反应来决定疫苗的效能。例如，从体内分离到T淋巴细胞、外周血淋巴细胞、淋巴结、或肿瘤侵润淋巴细胞。这样的淋巴细胞能够从治疗的患者或志愿者身上用文献报道的方法分离到并做体外培养。其活性用台盼蓝染色检测。评价参数用来确定T淋巴细胞的效能、治疗后动物体内产生免疫细胞的情况和肿瘤的发展。可以用传统的方法来评估这些参数，包括细胞毒性实验、混合淋巴细胞反应、细胞因子的产生实验。
任何合适的肿瘤模型何以用来作为融合蛋白的测试模型。鼠类可以接受肿瘤而成为合适的品系。肿瘤可以是同种的或同种异型的或异体的。受者可以是一个或多个免疫相关功能具有活性或缺失，包括但并不限于nu/nu，scid，以及beige小鼠。例如受者是Balb/c或C57BL/6小鼠。任何合适的肿瘤都可用于动物模型实验，包括已建系的细胞，肿瘤活体组织中分得的细胞，短期多克隆肿瘤细胞。肿瘤细胞系包括Renca，B16黑色素瘤细胞，Hepal，BT-474，Raji，QYC，D2F2，4T1，A20。融合蛋白的剂量为1μg/小鼠～1mg/小鼠，至少给药一次。抗体可以通过任何合适的方法给予。一个具体的例子，给予抗体100μg/mouse/小鼠一周两次。一个特殊的例子，第0天时皮下种植肿瘤，在特定的时间里用游标卡尺测定肿瘤的体积。任何合适的对照蛋白均可使用。例如，对照蛋白是纯化了的IgG1同型对照抗体。
下述的实施举例是为了更好的说明这项发明的使用范围广泛，而并非限制这项发明的使用。
实施例1FL膜外区片段编码DNA的合成FL是一个I型跨膜蛋白，其N端为膜外区，这样的蛋白分子对其N端进行修饰有时会严重影响生物学活性，Morrison(Coloma MJ，Morrison S.Design and production of noveltetravalent bispecific antibodies.Nat Biotech，1997，15159-163)将一单链抗体分子置于另一完整抗体分子重链恒定区的C端，成功构建的双特异性四价抗体分子(如图1A所示)给提供了新的思路。为了保证获得高活性的双功能蛋白，考虑构建FL膜外区(Flex)在N端而抗体分子在C端的融合蛋白，将Flex基因的3′-端与人抗体恒定区(铰链区+CH2+CH3)基因的5′-相连，构建成Flex/Fc融合基因，然后再将SM5-1单链抗体接在Flex/Fc的C端，构建成双功能融合蛋白(Flex/Fc/Fv，请参见图1B)。
人FLT3配体基因cDNA序列是已知的(参见GenBank数据库http//www.ncbi.nkn.nih.gov/entrez/中登录号U03858的序列)，其中84-161为信号肽编码区，162-629为膜外区片段编码区，两者相加共546碱基。
按照Prodromou C，Pearl LH.(Recursive PCRa novel technique for total genesynthesis.Protein Eng.1992 Dec；5(8)827-829.)的方法进行全基因合成。委托上海生工生物工程公司进行基因全合成以及PAGE纯化。
对于回收的DNA，将其连接到pGEM-T载体(Promega公司产品)的多克隆位点，测序验证后确认获得了正确的克隆(图2，SEQ ID NOS1和2)。本例中的正确克隆记作pGEM-T/hFlex。
实施例2人抗体IgG1恒定区(Fc)编码序列的克隆与鉴定全长人IgG1 cDNA序列(5’→3’)的获得和克隆天然全长IgG1编码区含有1416bp，编码471个氨基酸以及终止密码子(参见Genbank登录号BC024289)。
通过反转录获得IgG1 cDNA序列，并克隆到载体pGEM-T上。具体操作过程为100毫升人外周血，用淋巴细胞分离液(Sigma产品)分离获得白细胞，用Qiagen的mRNA抽提纯化试剂盒抽提mRNA，在1.2％琼脂糖凝胶电泳上鉴定其完整性后用GIBCO公司的RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR扩增人IgG1 Fc片段，获得了所需的cDNA，电泳鉴定后克隆到pGEM-T载体上，记作pGEM-T/IgFc，测序验证无误后保存备用。
实施例3嵌合和人源化SM5-1抗体的构建1.SM5-1单抗的可变区基因与序列测定用Trizol试剂[Gibco公司产品]提取杂交瘤细胞SM5-1总RNA，然后按5’-RACE试剂盒[Gibco公司产品]说明书分别扩增抗体重链和轻链可变区基因。首轮PCR和巢式PCR反应均采用热启动，反应条件94 C 5分钟；94 C 45秒，60 C45秒，72 C 1分10秒，30个循环；72 C 7分钟。以上2次PCR产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳分析，首轮PCR扩增产物均无明显的特异性条带，巢式PCR扩增显示重链产物中有一条约590bp的特异带，轻链产物中有一条约530bp的特异带(参见图5)。将得到的PCR产物克隆到pGEM-T[Promega公司产品]载体，筛选阳性克隆进行测序，确定获得了正确的SM5-1重链可变区(图6 SEQ ID NO7)和轻链可变区基因(图7 SEQ ID NO9)。并根据上述的基因序列推断出其蛋白质序列(参见图6 SEQ ID NO8和图7 SEQ ID NO10)。为了克隆方便，采用PCR在抗体重链可变区基因的5’-端设计EcoRV和XbaI，3’-端加上NheI位点，在轻链可变区基因5’-端设计HindIII位点。将以上可变区基因分别克隆到pGEM-T载体，经测序验证无误。
2.SM5-1嵌合抗体表达载体的构建经测序鉴定后用EcoR V和Nhe I将SM5-1的重链可变区基因VH从pGEM-T-VH切下并克隆到经同样酶切的pAH4604[Coloma MJ，Hastings A，Wims LA，Morrison SL.Novelvectors for the expression of antibody molecules using variable regionsgenerated by polymerase chain reaction.J Immunol Methods，1992，15289]载体中，构成了嵌合抗体重链基因的完整表达框架pAH4604-VH，图8显示了SM5-1嵌合抗体(chSM)重链的核苷酸(SEQ ID NO11)和氨基酸(SEQ ID NO12)序列.用XbaI和BamHI酶解pAH4604-VH，分离纯化其中约3200bp的嵌合重链条带(VHCH)并克隆到pDR中，得到嵌合抗体重链表达载体pDR-VHCH(图10)。
由于轻链载体pAG4622[Coloma MJ，Hastings A，Wims LA，Morrison SL.Novelvectors for the expression of antibody molecules using variable regionsgenerated by polymerase chain reaction.J Immunol Methods，1992，15289]上的κ链基因中有大段内含子，不便于以后的载体构建，采用Overlapping PCR将SM5-1的人源化轻链可变区与人抗体轻链恒定区cDNA直接拼接起来，Overlapping PCR反应条件为94 C 5分钟；94 C 55秒，55 C 55秒，72 C 1分30秒，30个循环；72 C 7分钟，最后得到产物VLCL，其5’含有限制酶位点HindIII，3’端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，得pGEM-T-VLCL，筛选阳性克隆测序。图9显示了SM5-1嵌合抗体(chSM)轻链的核苷酸(SEQ ID NO13)和氨基酸(SEQ ID NO14)序列.最后用Hind III和EcoR I双酶消化，将VLCL从pGEM-T-VLCL载体上切下，克隆到同样酶解的pDR中，得pDR-VLCL(图11)，经酶切确定构建的表达载体。
3嵌合抗体的表达及纯化于3.5cm组织培养皿中接种3.5×105/孔的CHO-dhfr-细胞，细胞在含次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培养基中培养至90-95％融合时进行转染取质粒10μg(嵌合重链表达质粒4μg，嵌合轻链表达质粒6μg)和20μlLipofectamine2000 Reagent[Gibco公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加3ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24小时后将细胞按0.8×105/皿传到10cm培养皿中，换不含H、T、G的选择培养基，待克隆形成后用二氢叶酸还原酶抑制剂氨甲喋呤(MTX)进行加压筛选，浓度从2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加压，用有限稀释法进行亚克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离纯化嵌合抗体。
4人工合成SM5-1人源化抗体可变区基因首先根据上述鼠源SM5-1抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列和人源化设计的原则，以KOL和REI(参见Morea V et al.，Immunotechnology 1997 Mar；3(1)71-81)作人源化设计的模板，设计人源化SM5-1抗体的氨基酸序列。为了克隆方便，在人源化抗体重链可变区基因的5’-端设计EcoRV和XbaI，3’-端加上NheI位点，在轻链可变区基因5’-端设计HindIII位点。首先将SM5-1的重链和轻链CDR区分别直接移植到人源模板KOL和REI上，构成人源化的可变区重链和轻链基因，用与构建嵌合抗体表达载体同样的方法，获得了SM5-1人源化抗体的重链和轻链表达载体。由于抗体FR区不仅参与CDR区的空间构成，有的直接参与抗原抗体的相互结合，所以简单的CDR移植往往会破坏抗体与抗原的作用，使抗体的亲和力大大下降甚至消失，这时只有将人源FR区中某些重要残基回复突变成鼠源残基才能恢复抗体的活性。将得到的人源化重、轻链表达载体用Lipofectamine 2000[Gibco公司产品]共转染COS细胞，用流式细胞术测定抗体的抗原结合活性，结果发现直接的CDR移植抗体的活性几乎完全丧失。为了获得高亲和力的人源化抗体，我们对可能影响抗体结合活性的重要FR残基进行分析和回复突变用流式细胞术测定它们的抗原结合活性。经过筛选最终获得与鼠源SM5-1单抗活性相当的人源化抗体huSM5-1，其重链(huSM5VH)可变区序列见图12(SEQ ID NOS15 and 16)，轻链(huSM5VL)可变区序列见图13(SEQ ID NOS17 and 18)其人源化重链全长序列见图14(SEQ ID NOS19 and 20)。其人源化轻链全长基因序列与氨基酸序列见图15(SEQ IDNOS21 and 22)。
4.人源化抗体的表达及纯化于3.5cm组织培养皿中接种3.5×105/孔的CHO-dhfr-细胞，细胞在含次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培养基中培养至90-95％融合时进行转染取质粒10μg(重链表达质粒4μg，轻链表达质粒6μg)和20μl Lipofectamine2000Reagent[Gibco公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加3ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24小时后将细胞按0.8×105/皿传到10cm培养皿中，换不含H、T、G的选择培养基，待克隆形成后用二氢叶酸还原酶抑制剂氨甲喋呤(MTX)进行加压筛选，浓度从2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加压，用有限稀释法进行亚克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用ProteinA亲和柱分离纯化人源化抗体。
5.人源化和嵌合抗人SM5-1抗体的亲和力比较用Pharmacia公司的BIAcore，参照Karlsson等(Karlsson，R.，Michaelsson，A.，and Mattsson，L.(1991)Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigeninteractions with a new biosensor based analytical system.J.Immunol.Methods145，229-240)提供的方法测定两者的亲和力常数Kd(Kon/Koff)，发现人源化的抗体与嵌合抗体的亲和力接近，分别为9.31×10-9M和3.78×10-9M。
上述结果说明，本次对抗SM5-1的人源化设计改造是成功的，基本没有降低亲和力，达到了治疗用单抗的亲和力的要求。
实施例4FL/SM双功能融合蛋白基因(huSM/FL)的构建构建3种结构的融合蛋白基因用于以后的生物学功能研究。
A.构建双功能融合蛋白基因huSMFv/Fc/FL按照上述融合基因的构建方法，通过OverlapPCR将Flex基因直接与huSM5-1抗体重链基因(SMH)的3′-端融合，得到PCR产物huSMFv/Fc/FL，其5′-含有限制酶位点HindIII，3′端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。然后将测序正确的重链融合基因用HindIII和EcoRI双酶消化从pGEMT载体中切下，克隆到pDR载体中，构建成pDR(huSMFv/Fc/FL)表达载体。huSMFv/Fc/FL的氨基酸序列和基因序列分别列于SEQ ID NOS23和24(图16)。
于3.5cm组织培养皿中接种3.5×105/孔的CHO-dhfr-细胞，细胞在含次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培养基中培养至90-95％融合时进行转染取质粒10μg(融合基因表达质粒pDR(huSMFv/Fc/FL)4μg，人源化抗体轻链huSM5表达质粒6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Gibco公司产品]分别溶于500μ1无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加3ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24小时后将细胞按0.8×105/皿传到10cm培养皿中，换不含H、T、G的选择培养基，待克隆形成后用二氢叶酸还原酶抑制剂氨甲喋呤(MTX)进行加压筛选，浓度从2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加压，用有限稀释法进行亚克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgG1，κ)，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用5分钟，最后用H2SO4终止反应，测OD450值。。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离纯化融合蛋白。
B.构建带接头序列的双功能融合蛋白基因(huSMFv/Fc/Link/FL)按照前述融合基因的构建方法，用Overlap PCR将huSM5-1重链基因的3′-端通过(Gly4Ser1)3接头(Fig4，SEQ ID NO5和6)同FLex的5′-融合，得到PCR产物huSMFv/Fc/Link/FL，其5′-含有限制酶位点HindIII，3′端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。然后将测序正确的重链融合基因用HindIII和EcoRI双酶消化从pGEMT载体中切下，克隆到pDR载体中，构建成pDR(huSMFv/Fc/Link/FL)表达载体。huSMFv/Fc/Link/FL的氨基酸序列和基因序列分别列于SEQ ID NOS25和26(图17)此融合蛋白的表达及纯化方法同huSMFv/Fc/FL融合蛋白所用方法相同。
C.构建双功能融合蛋白基因(FL/Fc/huSMFv)分别以pGEM-T/hFLex载体及含人IgG1恒定区cDNA的载体pGEM-T/IgFc为模板用overlapping PCR得到hFLex基因和人Fc基因(含铰链区、CH2、CH3)，再通过重叠PCR，将hFLex基因的3′-端与人Fc基因的5′-端融合，获得了FL/Fc融合基因，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，记作pGEM-T(FL/Fc)，筛选阳性克隆测序，图3显示了FL/Fc的核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸(SEQ ID NO4)序列.。
采用前述融合蛋白基因构建方法，将huSM5-1的重链可变区的3′-端通过(Gly4Ser)3接头与其轻链可变区的5′-端融合，构成huSM5-1单链抗体基因(Fv)。
采用前述融合蛋白基因构建方法将hFLex/Fc的3′-端与SM5-1单链抗体Fv的5′-端融合，构建双功能融合蛋白基因FL/Fc/huSMFv(图18，SEQ ID NOS27和28.)，此融合基因的示意图见图19。
将融合基因克隆到pDR载体，构建成pDR(FL/Fc/huSMFv)表达载体。用脂质体法将表达载体转染CHO细胞，用MTX进行加压筛选，取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗FL进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用5分钟，最后用H2SO4终止反应，测OD450值。，将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离纯化融合蛋白。
采用-与huSM/FL同样的构建方法构建了SM5-1嵌合抗体与FL的上述三种融合蛋白。其中chSMVH/Fc/FL的序列见图20(SEQ ID NOS29 and 30)，chSMVH/Fc/Link/FL的序列见图21(SEQ ID NOS31 and 32)，FL/Fc/chSMFv的序列见图22(SEQ ID NOS33 and34)实施例5抗人CD20单抗和FL双功能融合蛋白基因的构建
1.抗人CD20嵌合抗体的构建与表达参照美国专利6,399,061提供的抗人CD20单抗资料及序列，用实施例1描述的方法合成抗人CD20的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)cDNA。图23显示了238单抗的重链可变区核苷酸(SEQ ID NO35)和氨基酸(SEQ ID NO36)序列.图24显示了2B8单抗的轻链可变区核苷酸(SEQ ID NO37)和氨基酸(SEQ ID NO38)序列.在抗体重链可变区基因的5’端设计EcoRV，3’端加上NheI位点，在轻链可变区基因5’端设计HindIII位点。经测序鉴定后用EcoR V和Nhe I将CD20单抗的重链可变区基因VH从pGEM-T-VH切下并克隆到经同样酶切的pAH4604载体中，构成了嵌合抗体重链基因的完整表达框架pAH4604-VH，用XbaI和BamHI酶解pAH4604-VH，分离纯化其中约3200bp的嵌合重链条带(VHCH)并克隆到pDR中，得到嵌合抗体重链表达载体pDR-VHCH。图25显示了CD20嵌合抗体重链的核苷酸(SEQ ID NO39)和氨基酸(SEQ ID NO40)序列。
采用Overlapping PCR将CD20单抗轻链可变区与人抗体轻链恒定区cDNA直接拼接起来，Overlapping PCR反应条件为94 C 5分钟；94 C 55秒，55 C 55秒，72 C 1分30秒，30个循环；72 C 7分钟，最后得到产物VLCL，其5’含有限制酶位点HindIII，3’端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，得pGEM-T-VLCL，筛选阳性克隆测序。最后用Hind III和EcoR I双酶消化，将VLCL从pGEM-T-VLCL载体上切下，克隆到同样酶解的pDR中，得pDR-VLCL，经酶切确定构建的表达载体。图26显示了CD20嵌合抗体轻链的核苷酸(SEQ ID NO41)和氨基酸(SEQ ID NO42)序列。
于3.5cm组织培养皿中接种3.5×105/孔的CHO-dhfr-细胞，细胞在含次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培养基中培养至90-95％融合时进行转染取质粒10μg(嵌合重链表达质粒4μg，嵌合轻链表达质粒6μg)和20μlLipofectamine2000 Reagent[Gibco公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加3ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24小时后将细胞按0.8×105/皿传到10cm培养皿中，换不含H、T、G的选择培养基，待克隆形成后用二氢叶酸还原酶抑制剂氨甲喋呤(MTX)进行加压筛选，浓度从2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加压，用有限稀释法进行亚克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离纯化嵌合抗体。
2.构建3种结构的融合蛋白基因用于以后的生物学功能研究。
A.构建双功能融合蛋白基因CD20Fv/Fc/FL按照上述融合基因的构建方法，通过Overlap PCR将Flex基因直接与CD20抗体重链基因的3′-端融合，得到PCR产物huSMFv/Fc/FL，其5′-含有限制酶位点HindIII，3′端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。然后将测序正确的重链融合基因用HindIII和EcoRI双酶消化从pGEMT载体中切下，克隆到pDR载体中，构建成pDR(huSMFv/Fc/FL)表达载体。图27显示了CD20VH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO43)和氨基酸(SEQ ID NO44)序列。
B.构建带接头序列的双功能融合蛋白基因(CD20Fv/Fc/Link/FL)按照前述融合基因的构建方法，用Overlap PCR将CD20重链基因的3′-端通过(Gly4Ser1)3接头同FLex的5′-融合，得到PCR产物CD20Fv/Fc/Link/FL，其5′-含有限制酶位点HindIII，3′端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。然后将测序正确的重链融合基因用HindIII和EcoRI双酶消化从pGEMT载体中切下，克隆到pDR载体中，构建成pDR(CD20Fv/Fc/Link/FL)表达载体。图28显示了CD20VH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO45)和氨基酸(SEQ ID NO46)序列。
C.构建双功能融合蛋白基因(FL/Fc/CD20Fv)采用前述融合蛋白基因构建方法，将CD20单抗的重链可变区的3′-端通过(Gly4Ser)3接头与其轻链可变区的5′-端融合，构成CD20单链抗体基因(Fv)。
采用前述融合蛋白基因构建方法将FL/Fc基因的3′-端与CD20单链抗体Fv的5′-端融合，构建双功能融合蛋白基因FL/Fc/CD20Fv，图29显示了FL/Fc/CD20Fv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO47)和氨基酸(SEQ ID NO48)序列.此融合基因的示意图见图30。
以上三种融合蛋白的表达和纯化方法与实施例4相同。
实施例6抗Her2人源化抗体与FL双功能融合蛋白基因的构建1.抗人Her2人源化抗体的构建与表达参照实施例1的方法全合成抗her2人源化抗体(hcrceptin)[参见Carter P，Presta L，Gorman CM，Ridgway JBB，Henner D，Wong WLT，Rwoland AM，Kotts C，Carver ME andShepard HM.Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy.ProcNatl Acad Sci USA，1992，894285]的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。图31显示了Her2人源化抗体重链可变区核苷酸(SEQ ID NO49)和氨基酸(SEQ ID NO50)序列。图32显示了Her2人源化抗体轻链可变区核苷酸(SEQ ID NO51)和氨基酸(SEQ ID NO52)序列。在人源化抗体重链可变区基因的5′-端设计EcoRV，XbaI位点，3′-端加上NheI位点，在轻链可变区基因5′-端设计HindHI位点。琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序。PCR采用Roche公司的高保真扩增系统，反应条件均为95℃ 5分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 55秒，30个循环；72℃ 7分钟。经测序鉴定后用EcoRV和NheI将人源化VH从pGEM-T/VH切下并克隆到经同样酶切的pAH4604载体中，构成了人源化抗体重链基因的完整表达框架pAH4604-VH。
用XbaI和BamHI酶解pAH4604-VH，分离纯化其中约3200bp的嵌合重链条带(VHCH)并克隆到pDR中，得到人源化抗体重链表达载体pDR-VHCH。图33显示了Her2人源化抗体重链的核苷酸(SEQ ID NO53)和氨基酸(SEQ ID NO54)序列。
采用Overlapping PCR将her2人源化抗体轻链可变区与人抗体轻链恒定区cDNA直接拼接起来，Overlapping PCR反应条件为94C 5分钟；94C 55秒，55C 55秒，72C 1分30秒，30个循环；72C 7分钟，最后得到产物VLCL，其5’含有限制酶位点HindIII，3’端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，得pGEM-T-VLCL，筛选阳性克隆测序。最后用Hind III和EcoR I双酶消化，将VLCL从pGEM-T-VLCL载体上切下，克隆到同样酶解的pDR中，得pDR-VLCL，经酶切确定构建的表达载体。图34显示了Her2人源化抗体轻链的核苷酸(SEQ ID NO55)和氨基酸(SEQ IDNO56)序列。
于3.5cm组织培养皿中接种3.5×105/孔的CHO-dhfr-细胞，细胞在含次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培养基中培养至90-95％融合时进行转染取质粒10μg(her2人源化抗体重链表达质粒4μg，her2人源化抗体轻链表达质粒6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Gibco公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加3ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24小时后将细胞按0.8×105/皿传到10cm培养皿中，换不含H、T、G的选择培养基，待克隆形成后用二氢叶酸还原酶抑制剂氨甲喋呤(MTX)进行加压筛选，浓度从2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加压，用有限稀释法进行亚克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离纯化人源化抗体。
2.构建3种结构的融合蛋白基因用于以后的生物学功能研究。
A.构建双功能融合蛋白基因her2Fv/Fc/FL按照上述融合基因的构建方法，通过OverlapPCR将Flex基因直接与her2抗体重链基因的3′-端融合，得到PCR产物her2/Fc/FL，其5′-含有限制酶位点HindIII，3′端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。然后将测序正确的重链融合基因用HindIII和EcoRI双酶消化从pGEMT载体中切下，克隆到pDR载体中，构建成pDR(her2/Fc/FL)表达载体。图35显示了her2VH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO57)和氨基酸(SEQ ID NO58)序列。
B.构建带接头序列的双功能融合蛋白基因(her2Fv/Fc/Link/FL)按照前述融合基因的构建方法，用Overlap PCR将her2重链基因的3′-端通过(Gly4Ser1)3接头同FLex的5′-融合，得到PCR产物CD20Fv/Fc/Link/FL，其5′-含有限制酶位点HindIII，3′端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。然后将测序正确的重链融合基因用HindIII和EcoRI双酶消化从pGEMT载体中切下，克隆到pDR载体中，构建成pDR(her2Fv/Fc/Link/FL)表达载体。图36显示了her2VH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO59)和氨基酸(SEQ ID NO60)序列。
C.构建双功能融合蛋白基因(FL/Fc/her2Fv)采用前述融合蛋白基因构建方法，将her2单抗的重链可变区的3′-端通过(Gly4Ser)3接头与其轻链可变区的5′-端融合，构成her2单链抗体基因(Fv)。
采用前述融合蛋白基因构建方法将FL/Fc基因的3′-端与her2单链抗体Fv的5′-端融合，构建双功能融合蛋白基因FL/Fc/her2Fv，图37显示了FL/Fc/her2Fv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO61)和氨基酸(SEQ ID NO62)序列.图38显示了Her2与FL融合后的hFLex/Fc/Fv融合蛋白基因结构以上三种融合蛋白的表达和纯化方法与实施例4相同。
实施例7TRAIL和Flt3L双功能融合蛋白基因的构建1.构建hFLex/TRAILex融合TRAIL基因的合成人TRAIL的cDNA序列参见GenBan登录号HSU37518，其中第88-933为TRAIL的编码区。该基因编码281个氨基酸的蛋白质，其中第95位氨基酸起至281位为细胞膜外区。
根据上述膜外区的编码DNA序列，按照实施例1所述的方法合成该基因，测序验证后的质粒(pGEM-T/hTRAIL)保存备用。
融合基因的合成按照实施例4构建融合蛋白基因的方法，以含有人TRAIL和Flt3L膜外区片段的pGEM-T载体(pGEM-T/hTRAIL和pGEM-T/hFLex)为模板，通过Overlap PCR将FLt3L膜外区(hFLex)的3’-端通过(Gly4Ser1)3接头同TRAIL膜外区基因(TRAILex)的5’-融合。融合片段经琼脂糖凝胶电泳分离后纯化目的片断，胶回收纯化回收后克隆到pGEM-T载体中，得pGEM-T(hFLex/TRAILex)，筛选阳性克隆测序，图39显示了hFLex/Trai lex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO63)和氨基酸(SEQ ID NO64)序列，图40显示了hFLex/TRAILex融合蛋白基因结构表达载体的构建用HindIII和EcoRI双酶消化，将hFLex/TRAILex从pGEM-T(hFLex/TRAILex)载体上切下，克隆到pDR载体中，得pDR(hFLex/TRAILex)，经酶切鉴定构建的表达载体。
于3.5cm组织培养皿中接种3.5×105/孔的CHO-dhfr-细胞，细胞在含次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培养基中培养至90-95％融合时进行转染取表达载体质粒10μg和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Gibco公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加3ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24小时后将细胞按0.8×105/皿传到10cm培养皿中，换不含H、T、G的选择培养基，待克隆形成后用二氢叶酸还原酶抑制剂氨甲喋呤(MTX)进行加压筛选，浓度从2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加压，用有限稀释法进行亚克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人Trail抗体包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2小时，加入待测的抗性克隆培养上清，37℃孵育2小时，加HRP-羊抗人FL进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用5分钟，最后用H2SO4终止反应，测OD450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用抗人Trail的亲和柱分离纯化融合蛋白。
2.构建hFLex/IZ/TRAILex融合蛋白基因TRAIL为三聚体时其活性最强，我们设计在hFLex和TRAILex之间加上一个异亮氨酸拉链(IZ，isoleucine zipper)[Harbury PB，Zhang T，Kim PS，et al.A sitch between two，three，and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants。Science，1993，2621401-1407]，可使此融合蛋白形成三聚体。基因构建与蛋白表达纯化参照1中所述的方法，只是将(Gly4Ser1)3替换成IZ的序列。图41显示了hFLex/IZ/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO65)和氨基酸(SEQ ID NO66)序列。
3.构建hFLex/Fc/TRAILex融合蛋白基因以含人Trail膜外区基因的质粒pGEM-T/hTRAIL为模板，PCR扩增获得Trailex基因片断，通过重叠PCR将Trailex基因的5′端与FL/Fc基因的3′端相融合，获得hFLex/Fc/TRAILex融合基因，其5′含有限制酶位点HindIII，3′端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收融合基因片断并克隆到pGEM-T vector(Promega)中，得pGEMT-(hFLex/Fc/TRAILex)，筛选阳性克隆测序。图42显示了hFLex/Fc/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO67)和氨基酸(SEQ ID NO68)序列。图43显示了hFLex/Fc/Trailex融合蛋白基因结构。
从以下的实施例8-16，chSM/FL，huSM/FL，CD20/FL，her2/FL，Trail/FL分别表示FL/Fc/chSMFv，FL/Fc/huSMFv，FL/Fc/CD20Fv，FL/Fc/HER2Fv和hFLex/IZ/Trailex等融合蛋白。
实施例8双功能分子SM/FL的生物学功能研究一.SM/FL对人脐血CD34+细胞的体外扩增作用为了测定SM/FL对骨髓CD34+祖细胞的体外促增殖活性，用细胞因子FL，SCF，G-CSF，GM-CSF，IL-3，CSF-1与FLT3配体(以下简写为FL)或chSM/FL，huSM/FL进行了试验。实验中使用的细胞培养基主成分为IMDM，含20％胎牛血清(GIBCO)，1％甲基纤维素，0.05mmolβ-巯基乙醇，300mg/ml谷氨酰胺，66mg/L青霉素，100mg/L链霉素以及待测细胞因子。
免疫磁珠(购自Pharmacia公司)法分离人脐血中的CD34+细胞，操作参照厂家说明书进行，流式细胞术分析其纯度，将上述分离的CD34+细胞接种至含血清、甲基纤维素及待测细胞因子的96孔细胞培养板中，每孔2×103细胞。；上述细胞板置于37℃，5％CO2孵箱培养，2周后计数集落形成数。
检测结果见图44，结果说明，SM/FL具有明显刺激骨髓CD34+祖细胞增殖的作用，SM/FL融合蛋白具有与FL相同的刺激作用。
二.SM/FL对NK、DC体内活性测定本试验所用C57BL/6小鼠购自上海市实验动物中心，FITC-anti CD3、PE-anti NK1.1及FITC-anti CD11c单克隆抗体购自美国R&D和SIGMA公司。试验过程如下
C57BL/6小鼠给予SM/FL，每只动物每天10ug。受试动物接受SM/FL一定时间(0天，3天，6天，8天，10天，12天，15天，18天)后，处死小鼠，取其骨髓、脾脏及肝脏组织，分离这些组织中的单个核细胞。FITC-anti CD3及PE-antiNK1.1单克隆抗体对上述单个核细胞双染，或者用FITC-antiCD11c单克隆抗体单染后用流式细胞仪进行分析检测，根据各器官的单个核细胞数及标记为阳性的细胞百分比计算各群细胞的数目，检测结果(×106/ml)见图45。
上述结果表明，SM/FL双功能分子和FL一样，具有在小鼠体内诱导脾脏、肝脏和骨髓NK细胞和DC细胞增殖的作用，在10-13天达到高峰。这种诱导作用有助于提高机体对肿瘤的抵抗能力。
三.SM/FL双功能融合蛋白体外对肿瘤生长抑制作用细胞系选用SMMU，Raji，Hepal-6/230，B16p230(由上海国际合作肿瘤研究所提供)。
主要试剂选用抗人SM5-1嵌合抗体/FL双功能融合蛋白(chSM5/FL)、抗人SM5-1人源化单抗/FL双功能融合蛋白(huSM/FL)、胎牛血清(GIBCO公司产品)、DMEM及RPMI-1640(GIBCO公司产品)、CellTiter96AQueous细胞增殖检测试剂盒(Promega公司产品)、0.05％胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸二钠(溶剂为1×PBS，过滤除菌)。
将对数生长期上述各种细胞用0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，计数，调整细胞密度为6×104/ml，重悬于10％FCS 1640/DMEM培养液中备用。
按如下方法稀释抗人SM5-1嵌合抗体/FL融合蛋白与抗人SM5-1人源化单抗/FL融合蛋白抗人SM5-1嵌合性单抗/FL融合蛋白的母液浓度为20mg/ml水溶液。用10％FCS1640/DMEM 10倍逐级稀释，直至浓度为16ug/ml，200ul/孔加入96孔板。然后用100ul10％FCS 1640/DMEM培养液作2倍比稀释，共十四个浓度。
抗人SM5-1人源化抗体/FL融合蛋白母液浓度为20mg/ml水溶液。稀释方法做2倍比稀释，共十四个浓度。10％FCS 1640/DMEM作为空白对照。
将上述各种细胞分别加入含两种抗体的96孔板中，100ul/孔。每种细胞一块96孔板。
为防止多孔板的边缘效应，不使用96孔细胞培养板边缘的孔，但须加入200ul/孔的PBS。在37℃，7％CO2细胞培养箱培养7天后显色读数。
将96孔板从细胞培养箱取出。加入PMS∶MTS＝1∶20的显色剂，20ul/孔。96孔板盖打开后放入细胞培养箱继续培养3小时。
酶标仪检测96孔板OD490nm，用Excel软件根据光吸收值数据作图，结果见图46。说明这两种融合蛋白对B16p230，hepal-6p230，SMMU等三种三种表达p230f蛋白的肿瘤细胞系的增值均能产生有效抑制作用。而这种抑制作用是特异性的，对无关细胞没有作用。
四.嵌合抗人SM5-1/FL及人源化SM5-1/FL体外抗肿瘤作用测活细胞株使用SKBR-3、QYC细胞系，以及Hepal-6、B16细胞系(购自ATCC)。上述细胞均传代培养于25cm2培养瓶中，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培养基。并将这两种细胞系分别转入P230基因。使其高表达人p230基因。
主要试剂选用抗人CD3嵌合性单抗/FL融合蛋白(chCD3/FL)、抗人CD3人源化单抗/FL融合蛋白(huCD3/FL)、抗人SM5-1嵌合性单抗/FL融合蛋白(chSM/FL)、抗人SM5-1人源化单抗/FL(huSM/FL)融合蛋白、胎牛血清(GIBCO公司产品)、DMEM及RPMI-1640(GIBCO公司产品)、CellTiter96AQueous细胞增殖检测试剂盒(Promega公司产品)、0.05％胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸二钠(溶剂为1×PBS，过滤除菌)。
将对数生长期的Hepal-6、B16及hepal-6p230，B16p230细胞系，用0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，计数，调整细胞密度为6×104/ml，重悬于10％FCS 1640/DMEM培养液中备用。
稀释抗人CD3嵌合性单抗/FL及抗人CD3全人源化单抗/FL融合蛋白及抗人SM5-1嵌合性单抗/FL及抗人SM5-1人源化单抗/FL融合蛋白。
抗人CD3嵌合性单抗/FL及抗人SM5-1嵌合性单抗/FL的母液浓度分别为20mg/ml水溶液。用10％FCS 1640/DMEM 10倍逐级稀释，直至浓度为16ug/ml，200ul/孔加入96孔板。然后用10％FCS 1640/DMEM培养液作2倍比稀释，共十四个浓度。
抗人CD3人源化抗体/FL及抗人SM5-1人源化单抗/FL母液浓度分别为20mg/ml水溶液。稀释方法同上。200ul/孔加入96孔板，然后用100ul 10％FCS 1640/DMEM培养液作2倍比稀释，共十四个浓度。
将上述各种细胞分别加入含两种抗体的96孔板中，100ul/孔。每种细胞二块96孔板。抗人CD3嵌合抗体/FL与抗人CD3人源化抗体/FL融合蛋白每种细胞一块96孔板。抗人SM5-1嵌合抗体/FL与抗人SM5-1人源化抗体/FL融合蛋白每种细胞一种96孔板。
为防止多孔板的边缘效应，不使用96孔细胞培养板边缘的孔，但须加入200ul/孔的PBS。37℃，7％CO2细胞培养箱培养7天后显色读数。
将96孔板从细胞培养箱取出。加入PMS∶MTS＝1∶20的显色剂，20ul/孔。96孔板盖打开后放入细胞培养箱继续培养3小时。
酶标仪检测96孔板OD490nm，用Excel将吸光度值数据作图，结果见图47。结果说明，在离体条件下，嵌合SM/FL融合蛋白和人源化hSM/FL融合蛋白有明显的抑制人P230转染的Hepal-6和B16细胞的作用，对不表达p230分子的Hepal-6和B16细胞没有抑制作用。无关抗体融合蛋白抗CD3/FL对以上4种细胞均无作用。
实施例9抗人HER-2单抗/FL，抗人CD20/FL及TRAIL/FL融合蛋白体外杀伤活性为了进一步研究FL与其他能够诱导肿瘤细胞凋亡的抗体或其他分子构成的融合蛋白也具有上述体外杀伤肿瘤细胞的作用，进行了如下实验。这些实验的结果证明，如同SM5-1单抗与FL构成的融合蛋白一样，具有诱导肿瘤发生细胞凋亡的抗人CD20单抗、抗人Her2单抗以及TRAIL与FL构成的融合蛋白分子也具有体外杀伤肿瘤细胞的活性。
抗Her2单抗/FL融合蛋白对靶细胞的生长抑制和杀伤活性的体外研究1.Her2/FL双功能分子体外抑制实验测活细胞株使用SK-BR-3，BT-474、D2F2、4T1细胞(上述细胞均来自ATCC)。其中BT-474，SK-BR-3在其细胞膜表面表达HER2抗原分子，D2F2、4T1、Jarket细胞不表达HER2抗原分子。
上述细胞均传代培养于25cm2培养瓶中，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培养基。采用QIAGEN公司的SuperFect Transfection Reagent(Qiagen CAT.301307)脂质体试剂将D2F2及4T1两种细胞系分别转染人her2基因，并使其在细胞表面获得高表达。转入her2基因的细胞系D2F2/e2和4T1/her2用于本实验。
主要试剂选用抗人Her2/FL双功能分子、Herceptin(购自Genetech公司)、胎牛血清(GIBCO公司产品)、DMEM及RPMI-1640(GIBCO公司产品)、CellTiter96AQueous细胞增殖检测试剂盒(Promega公司产品)、0.05％胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸二钠(溶剂为1XPBS，过滤除菌)。
将对数生长期上述各种细胞用0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，计数，调整细胞密度为6×104/ml，重悬于10％FCS 1640/DMEM培养液中备用。
抗人Her2/FL双功能分子和阳性对照Herceptin按如下方法稀释抗人Her2/FL双功能分子的母液浓度为20mg/ml水溶液。用10％FCS 1640/DMEM 10倍逐级稀释，直至浓度为16ug/ml，200ul/孔加入96孔板。然后用10％FCS 1640/DMEM培养液进行2倍比稀释，共十四个浓度。
Herceptin标准品母液浓度为20mg/ml水溶液。稀释方法同上，依次作2倍比稀释，共十四个浓度。
将上述各种细胞分别加入含融合蛋白和抗人Her2抗体(Herceptin)的96孔板中，100ul/孔。每种细胞一块96孔板。
实验步骤按照CellTiter96AQueous细胞增殖检测试剂盒厂家说明书进行。
实验结果如图48。
从上述结果可以看出，抗人HER2单抗/FL融合蛋白对表达有人Her2的各种受试靶细胞均有明显的生长抑制作用。该融合分子对无关细胞系没有抑制作用，说明这种抑制作用是特异性的。
2.抗人HER-2/FL融合蛋白体外杀伤活性测活细胞株使用SK-BR-3，BT-474、D2F2、4T1细胞(上述细胞均来自ATCC)，转入her2基因的细胞系D2F2/e2和4T1/her2。其中BT-474，SK-BR-3，D2F2/e2和4T1/her2在其细胞膜表面表达HER2抗原分子，D2F2、4T1、Jarket细胞不表达HER2抗原分子，试剂盒使用CytoTox 96非同位素细胞毒性实验试剂盒(Promega公司产品)检测细胞活力。步骤按照厂家说明进行。
取待检测样品抗Her2单抗/FL，用培养液逐步稀释至浓度为4μg/mL。而后以之为起始浓度，用培养液二倍比稀释至15.6ng/ml。
在96孔板中加入稀释好的待测样品，每孔体积100μl，每一浓度设2个复孔。培养液为阴性对照。
取对数生长期的细胞，调整细胞密度至6×104/ml，加入上述96孔培养板中，0.1ml/孔。
检测结果如图49所示。结果表明，Her-2抗体/FL融合蛋白对BT-474、SK-BR-3，D2F2/e2和4T1/her2细胞有特异性杀伤作用。
二.抗人CD20单抗/FL融合蛋白对靶细胞的体外杀伤活性原理人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞表面高表达CD20抗原分子，抗CD20单抗可与其结合。则能使结合了抗体的靶细胞溶解，在一定范围内抗体的浓度与细胞溶解的程度呈量-效关系。细胞溶解的程度可通过检测细胞溶解后释放的乳酸脱氢酶来检测。
主要试剂选用抗人CD20/FL双功能分子、抗CD20单抗rituximab.
细胞株Raji细胞(ATCC)，经检测无支原体污染。用含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/DMEM(1∶1)培养液传代培养于25-75cm2方瓶中。
培养液A为含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/DMEM(1∶1)培养液。B为不含血清的无酚红RPMI-1640培养液。C为含有5％正常人血清的培养液B。
检测试剂盒CytoTox 96非同位素细胞毒性实验试剂盒(Promega公司产品)取对数生长期的Raji细胞，加入培养液B调整细胞密度至2×105/ml，加入96孔培养板中，0.1ml/孔。
取待测样品用培养液C逐步稀释至4ug/mL，并以之为起始浓度二倍比稀释至7.8ng/ml。
以培养液C为阴性对照，在已接种过Raji细胞的培养板中，加入上步梯度稀释液0.1mL/孔和阴性对照的培养液。每个稀释度设2个复孔。置于37℃5％二氧化碳培养箱中培养3-4小时。
检测结果见图50，结果可以看出，在离体培养条件下，抗人CD20单抗/FL融合蛋白与抗CD20单抗类似，对受试靶细胞有明显的杀伤作用。
三.TRAIL/FL对靶细胞生长抑制和杀伤作用的体外研究TRAIL/FL体外测活实验测活细胞株选用L929、MDA-MB-231(购自ATCC)，Renca(购自韩国肿瘤研究所)。hepG2为阴性对照细胞。
上述细胞均传代培养于25cm2培养瓶中，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培养基。
试剂盒使用CellTiter 96 Aqueous非同位素细胞增殖实验试剂盒(Promega公司产品，Catalog#G5430)检测细胞活力。由MTS/PMS二种溶液组成，可反复冻融，保存于-70℃以下。使用前将二者按体积比20∶1混合。混合后的试剂可临时保存于-20℃。
取对数生长期的L929、MDA-MB-231，Renca，hepG2细胞，胰蛋白酶消化，计数，每次测活(1块96孔板)取约5×106个细胞，离心弃上清，加入培养液B调整细胞密度至5×105/ml，加入96孔培养板中，0.1ml/孔，培养过夜(18-24h)，每种细胞一块96孔板。
取待测定样品，用培养液稀释至10ug/ml，并以之为起始浓度二倍比稀释至19.5ng/ml。
以培养液为阴性对照，在已接种过细胞的培养板中，加入上步梯度稀释液0.1mL/孔和阴性对照的培养液。每个稀释度设2个复孔。
置于37℃5％二氧化碳孵箱中培养12h。
终点测定96孔板加入新鲜配制的20∶1混合的MTS/PMS溶液20μL/孔，在孵箱中继续孵育2-4小时(96孔板不盖盖子)，用酶标仪测量其A490-A630值。
从图51可以看出，TRAIL/FL融合蛋白对离体培养的各种靶细胞有明显的生长抑制作用，但是对无关细胞没有作用。
2.TRAIL/FL体外杀伤活性细胞株L929细胞，hepG2细胞用含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/D′MEM(1∶1)培养液传代培养于25-75cm2方瓶中；试剂盒使用CytoTox 96非同位素细胞毒性实验试剂盒(Promega公司产品)取对数生长期的L929细胞，胰蛋白酶消化，计数，每次测活(1块96孔板)取约2×106个细胞，离心弃上清，加入培养液B调整细胞密度至1.5×105/ml，加入96孔培养板中，0.1ml/孔，培养过夜(18-24h)。次日用培养液稀释放线菌素D至终浓度为20μg/mL，取0.5mL作为阴性对照。
取待测定样品，用含有放线菌素D的培养液稀释至1600ng/ml，并以之为起始浓度二倍比稀释至3.1ng/ml。
以培养液C为阴性对照，在已接种过L929细胞的培养板中，加入上步梯度稀释液0.1mL/孔和阴性对照的培养液。每个稀释度设2个复孔。置于37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养14-16小时。
实验步骤按照使用CytoTox 96非同位素细胞毒性实验试剂盒厂家说明书进行。
实验结果见图52，表明TRAIL/FL对L929细胞有与Trail相似的杀伤活性。
实施例10SM/FL、hSM/FL融合蛋白对B16/p230及Hepal-6/p230荷瘤小鼠的治疗作用主要试剂使用抗人SM5-1嵌合性单抗、抗人SM5-1全人源化单抗，抗人CD3嵌合性单抗/FL融合蛋白、抗人CD3全人源化单抗/FL融合蛋白，抗人SM5-1嵌合性单抗/FL及抗人SM5-1人源化单抗/FL融合蛋白。
将雄性C57BL/6小鼠分别于接种后待肿瘤直径平均达0.5cm，分组进行实验。随机分为7个大组。一组为PBS组，共8只小鼠。一组为无关抗体抗人CD3嵌合性单抗/FL融合蛋白。一组为抗人CD3人源化单抗/FL融合蛋白。一组为抗人SM5-1嵌合性单抗。一组为抗人SM5-1人源化单抗。一组为抗人SM5-1嵌合抗体/FL融合蛋白，一组为抗人SM5-1人源化单抗/FL融合蛋白，以4mg/kg尾静脉注射，每组十只小鼠。
将各种单克隆抗体均用PBS分别稀释至终浓度0.4mg/ml，四种不同浓度。尾静脉注射剂量按4mg/kg/周，对照组注射等体积PBS。根据小鼠体重，平均每只小鼠尾静脉注射体积为250ul左右。
连续观察6周，进行统计分析。结果见表3。
表3肿瘤治疗后肿瘤消退情况

从上述实验结果可以看出，在有p230抗原表达时，无论是嵌合的还是人源化的SM5-1单抗，也不论是否与FL融合，都具有明显的使肿瘤消退的能力。而无关抗体没有这种能力。但是，与FL融合能够很大程度提高在活体内的抗肿瘤能力。
实施例11SM/FL和hSM/FL融合蛋白诱导B16/P230及Hepal-6/P230荷瘤小鼠产生特异性免疫反应主要试剂选用抗人SM5-1嵌合性单抗、抗人SM5-1全人源化单抗，抗人CD3嵌合性单抗/FL融合蛋白、抗人CD3全人源化单抗/FL融合蛋白，抗人SM5-1嵌合性单抗/FL及抗人SM5-1人源化单抗/FL融合蛋白。
将雌性C57BL/6小鼠分别hepal-6/P230肿瘤细胞，于接种后待直径平均达0.5cm。随机分为7个大组。一组为PBS组，共8只小鼠。一组为无关抗体抗人SM5-1嵌合性单抗。一组为抗人SM5-1人源化单抗。一组为抗人SM5-1嵌合性单抗与FL合并使用。一组为抗人SM5-1人源化单抗与FL合并使用。一组为抗人SM5-1嵌合抗体/FL融合蛋白，一组为抗人SM5-1人源化单抗/FL融合蛋白，以2mg/kg尾静脉注射，每组10只小鼠。
将各种单克隆抗体均用PBS分别稀释至终浓度0.4mg/ml，四种不同浓度。尾静脉注射剂量按4mg/kg/周，对照组注射等体积PBS。根据小鼠体重，平均每只小鼠尾静脉注射体积为250ul左右。
连续观察至肿瘤消失，对肿瘤消退的小鼠进行亲代肿瘤细胞接种，观察小鼠成瘤情况，结果如表4。
表4融合蛋白的抗肿瘤作用

上述数据说明，SM或hSM与FL联合使用时，体内抗肿瘤能力有一定程度的提高。但是，融合蛋白SM/FL和hSM/FL提高的幅度更大，并可使小鼠肿瘤全部消失，再次接种后无瘤生存率高达100％。这说明，融合蛋白SM/FL和hSM/FL使小鼠获得了抵抗肿瘤的主动免疫能力。
抗人SM5-1嵌合抗体/FL与抗人SM5-1人源化抗体/FL融合蛋白所产生的免疫反应是特异性的。取抗人SM5-1嵌合抗体/FL与抗人SM5-1人源化抗体/FL融合蛋白治疗B16p230荷瘤小鼠和Hepal-6p230荷瘤小鼠，待肿瘤消失后，分别再次接种B16、Hepal-6、B16p230或Hepal-6p230肿瘤细胞，实验结果见表5。抗人SM5-1嵌合抗体/FL与抗人SM5-1人源化抗体/FL融合蛋白治疗的B16p230小鼠仅能抵抗B16肿瘤细胞的复发，而对Hepal-6无抵抗作用，反之亦然。
表5融合蛋白诱导B16/P230及Hepal-6/P230荷瘤小鼠产生特异性免疫反应

上述结果表明，用chSM和huSM与FL构成的融合蛋白治疗的B16p230小鼠获得了明显的抵抗再接种的B16肿瘤细胞形成肿瘤的能力，但对无关的Hepal-6肿瘤细胞显然没有这种作用。反之亦然。这进一步说明，两种融合蛋白诱发的免疫反应是特异性的。
实施例12抗人HER-2/FL，抗人CD20/FL及TRAIL/FL融合蛋白的体内抗肿瘤作用为了进一步研究FL与其他能够诱导肿瘤细胞凋亡的抗体或其他分子构成的融合蛋白也具有体内杀伤肿瘤细胞的作用，进行了如下实验。这些实验的结果证明，如同SM或hSM与FL构成的融合蛋白一样，具有诱导肿瘤发生细胞凋亡的抗人CD20单抗、抗人Her2单抗和TRAIL与FL构成的融合蛋白分子也具有体内杀伤肿瘤细胞的活性。
一.抗HER-2/FL融合蛋白体内杀伤活性材料人乳腺癌细胞系BT-474，雄性BALB/c裸鼠(购自上海市实验动物中心)。
BT-474细胞以2.5×107/ml悬于PBS中，200ul/只接种腋部皮下，即5×106/只；裸鼠于接种后七周肿瘤直径平均达0.5cm时，随机分为实验组及对照组，分别静脉注射10mg/kg/周的抗HER-2融合蛋白及等体积的PBS。连续观察6周，对调查所得数据进行统计分析。
检测结果见图53。对两组数据进行差异显著性检验，t＝2.64944，结果表明，在0.05水平p＝0.03806，差异达显著水平，说明抗人HER2单抗/FL融合蛋白具有明显的体内细胞的能力。
二.抗人CD20/FL融合蛋白体内杀伤活性细胞系为人淋巴溜细胞系Raji；雌性BALB/c裸鼠购自上海市实验动物中心。
Balb/c裸鼠准备BALB/c裸鼠60Co照射2GY每周一次，连续3周。Raji细胞调整密度为4×107/ml，接种0.5ml于裸鼠的腋下或背部皮下，即接种细胞总数为2×107。肿瘤生长至0.5cm大小时，无菌取瘤组织，切取8mm3组织块，复种60Co照射的裸鼠。裸鼠于接种后一周直径平均达0.5cm时，随机分为实验组及对照组，分别静脉注射10mg/kg/周的抗CD20/FL融合蛋白及PBS，连续给药4周。观察结果6周并进行统计分析。
检测结果见图54。对两组数据进行差异显著性测验，t＝2.82287，在0.05水平p＝0.03024，差异达显著水平。这说明，抗人CD20单抗/FL融合蛋白具有明显的活体内抑瘤作用。
三.TRAIL/FL体内杀伤活性实验材料选用人肝癌细胞系QYC；BALB/c裸鼠。
QYC细胞以5×107/ml悬于PBS中，200ul/只接种腋部皮下，即1×107/只；裸鼠于接种后10天直径平均达0.5cm。随机分为实验组及对照组，分别腹腔注射0.5mg/只/天的TRAIL及等体积的PBS。连续观察6周，进行统计分析。
结果如图55所示，显著性测验表明，两组数据的t＝2.63092，在0.05水平的p＝0.03901，差异达显著水平。这说明，在活体内，TRAIL/FL融合蛋白具有明显的抑瘤作用。
实施例13HER-2/FL，CD20/FL及TRAIL/FL融合蛋白诱导的特异性抗肿瘤免疫反应为了进一步研究抗人HER-2/FL，抗人CD20/FL及TRAIL/FL双功能融合蛋白是否象嵌合和人源化的SM单抗与FL的融合蛋白一样在体内具有对肿瘤的特异性杀伤作用，并具有诱导体内特异性抗肿瘤主动免疫反应，用上述三种融合蛋白对荷瘤小鼠进行了体内治疗实验。
一.抗人Her2单抗/FL融合蛋白的体内抗肿瘤实验实验材料雌性BALB/C小鼠；D2F2，D2F2/e2，4T1，4T1/her2肿瘤细胞株。
用2×106野生型D2F2，4T1和D2F2/e2，4T1/her2细胞分别接种BALB/C小鼠，皮下注射，每周测量肿瘤生长情况，当肿瘤生长至直径0.5厘米时进行治疗，剂量为4mg/kg，连续进行3周后，观察肿瘤的生长情况。取肿瘤消失的小鼠分别再次接种B16、Hepal-6、B16p230或Hepal-6p230肿瘤细胞，6周后对肿瘤生长、消失情况进行调查。实验结果见表6。
表6Her2/FL融合蛋白的抗肿瘤作用

从上述结果可以看出，Her2抗体一样，抗人Her2抗体/FL融合蛋白在体内抑制D2F2/e2和4T1/her2细胞生长，抵抗已形成的肿瘤，诱导产生抗肿瘤免疫。对第二次接种的肿瘤有强大的杀伤作用，使其不能形成肿瘤。而单纯给予Her2抗体，仅仅能够治疗已形成的肿瘤，但是不能有效抵抗再次的肿瘤接种。
二.抗人CD20单抗/FL融合蛋白的体内抗肿瘤实验试验材料采用A20细胞(ATCC)和BALB/C小鼠。A20细胞用Qiagen的转染试剂盒转入人CD20基因，并使人CD20抗原在细胞表面获得高表达，制备成A20/CD20细胞用于以后的实验。
用2×106A20/CD20细胞接种BALB/C小鼠，皮下注射，每周测量肿瘤生长情况，当肿瘤生长至直径0.5厘米时，用FL、抗人CD20单抗、FL+抗人CD20单抗(rituximab)联用、CD20/FL融合蛋白进行治疗，剂量为4mg/kg，连续进行3周后，观察肿瘤的生长情况。取肿瘤消失的小鼠分别再次接种A20/CD20肿瘤细胞，对肿瘤生长、消失情况进行调查。实验结果见表6。
6周后对肿瘤生长、消失情况进行调查。
实验结果见表7。
表7CD20/FL融合蛋白的抗肿瘤作用

从上述结果可以看出，和抗人CD20抗体一样，抗人CD20抗体/FL融合蛋白能够在体内治疗已形成的肿瘤，诱导产生抗肿瘤免疫。并对第二次接种的肿瘤有强大的杀伤作用，使其不能形成肿瘤。而单纯给予抗人CD20抗体，仅仅能够治疗已形成的肿瘤，不能有效抵抗再次的肿瘤接种。
三.人TRAIL/FL双功能分子对荷瘤小鼠的体内抗肿瘤实验测活细胞株选用Renca(购自韩国肿瘤研究院)上述细胞均传代培养于25cm2培养瓶中，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培养基。
主要试剂人TRAIL/FL双功能分子 TRAIL人FL对照组 无关抗体对照(抗人CD3/FL)取雌性BALB/c小鼠分别于Renca接种后5周两种肿瘤直径平均达0.5cm。随机分为五个大组。一组为PBS组，共8只小鼠。一组为无关抗体对照抗人CD3/FL，一组为人TRAIL/FL双功能分子，一组为TRAIL阳性对照组，一组为人FL对照组，分别以八只小鼠每组，治疗剂量为2mg/kg。
将各种样品均用PBS分别稀释至终浓度0.4mg/ml，四种不同浓度。尾静脉注射剂量按4mg/kg/周，对照组注射等体积PBS，连续进行3周后，观察肿瘤的生长情况。取肿瘤消失的小鼠分别再次接种Renca肿瘤细胞，对肿瘤生长、消失情况进行调查。实验结果见表7。实验结果见表8所示。
表8TRAIL/FL融合蛋白的抗肿瘤作用

上表结果说明，TRAIL和FL单独使用均有一定的抗肿瘤作用，但是单独使用时均未表现出明显的诱导主动免疫的作用。TRAIL/FL融合蛋白对接种形成的Renca肿瘤有明显的治疗作用，并可诱导产生主动免疫反应，使其可抵抗再次肿瘤接种。这种诱导主动免疫的作用有明显的特异性。
上述实验结果说明，供试的几种与FL组成的双功能融合蛋白不但具有明显的体内治疗作用，而且均具有诱导小鼠对特定肿瘤产生免疫反应的作用。表明融合蛋白有效诱导了体内DC和NK细胞扩增，不但提高了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，而且DC细胞使肿瘤细胞或其释放的某些组份的免疫原性大大提高，诱发机体对特定肿瘤产生了主动免疫反应。
实施例14肿瘤组织的免疫组化分析一.SM/FL以及hSM/FL融合蛋白对肿瘤组织给药后的免疫组化分析为了进一步阐明SM单抗/FL融合蛋白和hSM单抗/FL融合蛋白的作用机理，我们对治疗的小鼠进行了免疫组化分析。发现在给药动物肿瘤组织中有大量肿瘤细胞死亡，并伴有DC细胞、NK细胞和其他淋巴细胞的浸润。由此可见，SM单抗/FL融合蛋白和hSM单抗/FL融合蛋白具有引导DC、NK等细胞向肿瘤组织集中并发挥其对肿瘤细胞杀伤功能的作用。
1.接种复苏Hepal-6/P230小鼠肝癌细胞系及B16/P230小鼠黑色素瘤细胞系，用10％FCS16/DM培养。待细胞扩增至一定数目，用0.05％胰蛋白酶、0.02％EDTA消化，调整细胞密度为2.7×107/ml，分别以200ul/只皮下接种C57BL/6小鼠。待C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤直径达0.5cm时，用SM5/FL融合蛋白等药物尾静脉注射，4mg/kg。连续治疗3周进行肿瘤大小观察及免疫组化检测。
2.组化分析(HE染色法)试剂使用10％中性福尔马林。
用眼科剪、镊无菌条件下取出瘤组织。一半瘤组织用10％中性福尔马林固定24小时。固定后的瘤组织经过一系列常规脱水、透明、浸蜡，最后包埋成蜡块。将蜡块用切片机进行切片，每块蜡块分切10张10μM厚的切片，58℃烤片，18小时后，开始脱蜡。二甲苯I、II、III级各10分钟。无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各2分钟。自来水洗2-3分钟，进行HE染色。将切片在显微镜下观察，计数各种细胞的数量，统计分析。
实验结果见表9

其中，-为0细胞/mm2，+为0-5细胞/mm2，++为5-10细胞/mm2，+++为10-15细胞/mm2，++++为＞20细胞/mm2。
上述结果说明，FL单独使用时没有明显的诱导肿瘤细胞死亡的能力，但是嵌合的和人源化的SM单抗单独使用或者与FL联合使用时均可诱导明显的肿瘤细胞死亡。同时，观察发现，在肿瘤组织中和其周围有一定量的淋巴细胞浸润，浸润的细胞类型包括NK、DC和其他T细胞和B细胞。嵌合或人源化SM/FL融合蛋白则具有更加明显的诱导肿瘤细胞死亡的能力，其肿瘤组织和其周围有大量的淋巴细胞浸润。无关的融合蛋白抗CD3单抗/FL没有这种能力。
上述结果说明，两种抗体与FL组成的融合蛋白具有显著的引导DC、NK和其他淋巴细胞向肿瘤组织集中的能力。
二.抗人Her2、抗人CD20和TRAIL与FL组成的融合蛋白对肿瘤组织的免疫组化分析为了进一步阐明其他融合蛋白的作用机理，采用前述同样的方法对抗人Her2、抗人CD20和TRAIL与FL组成的融合蛋白进行了肿瘤组织的免疫组化分析。结果见表10
表10

其中，-为0细胞/mm2，+为0-5细胞/mm2，++为5-10细胞/mm2，+++为10-15细胞/mm2，++++为＞20细胞/mm2。
上述结果与前述SM、hSM的试验结果完全一致，说明SM、hSM、抗CD20单抗、抗Her2单抗和TRAIL及其与FL组成的融合蛋白都能通过激活免疫细胞的途径大量杀伤肿瘤细胞，在给药后，其能够发挥很大的活性，将NK和DC细胞带到肿瘤组织，从而达到治疗肿瘤的效果。
实施例15融合蛋白的体内分布实验为了研究嵌合的和人源化的SM5-1与FL构成的融合蛋白是否能够专一性地与肿瘤结合，我们研究了融合蛋白在体内的分布。
用放射性同位素标记的chSM、chSM/FL、huSM和huSM/FL融合蛋白分别尾静脉注射荷瘤小鼠，48小时后取其各种组织，测量其放射性强度。结果如图56。
图中显示的结果说明，SM/FL和hSM/FL融合蛋白与其相应嵌合单抗SM、人源化单抗的组织分布是一致的，它们都继承了其相应单抗的专一性，都高度集中分布在肿瘤组织。
上述单抗和融合蛋白的这种组织分布是由单抗的特异性决定的，这种组织分布的特异性在临床治疗上有重要意义。一方面，这种特异性组织分布使用药剂量明显降低，另外，较少的用药和药物特异性分布在靶组织，就减少了对非靶组织的损伤。
采用如同上述一样的方法，对抗人Her2单抗、抗人CD20单抗和TRAIL与FL组成的共三种融合蛋白的体内分布进行了研究。实验结果如图57所示。
如同前述看到的结果一样，抗人HER2、抗人CD20和TRAIL三种分子以及它们与FL形成的融合蛋白均大量集中在肿瘤组织，其他组织中的分布相对较低。这种特异性的分布情况与chSM/FL、huSM/FL形成的融合蛋白的情况相同。
实施例16淋巴细胞输注实验按实施例1中的实验方案将B16/P230及Hepal-6/P230荷瘤小鼠用chSM/FL或huSM/FL进行治疗，待荷瘤小鼠肿瘤消失后，杀死动物，取出脾脏，常规方法分离脾细胞。然后，调整细胞浓度达1×109/ml。制备好的脾脏细胞输给未接种过肿瘤的小鼠，每只小鼠输注5×107细胞，然后再接种Hepap230或B16p230细胞，6周后观察小鼠的存活情况。实验结果见表11。
表11淋巴细胞输注实验

上述结果说明，被动输注经chSM单抗/FL融合蛋白和huSM单抗/FL融合蛋白诱导产生主动免疫能力的小鼠的脾细胞可以使受试小鼠抵抗所接种肿瘤的攻击。无关抗体的融合蛋白抗CD3单抗/FL以及单独使用单抗和FL均不能使输注的淋巴细胞具有抗肿瘤作用。这说明，输注的淋巴细胞确实具有特异性的抗肿瘤作用。
上述结果还说明，SM单抗/FL融合蛋白和hSM单抗/FL融合蛋白抗肿瘤作用的机理在于它们诱导产生了专一性的抗肿瘤主动免疫反应。
采用上述相同的方法，按实施例1中的实验方案将荷有4T1/her2，A20/CD20；Renca的小鼠分别用her2/FL、CD20/FL或Trail/FL进行治疗，待荷瘤小鼠肿瘤消失后，杀死动物，取出脾脏，常规方法分离脾细胞。然后，调整细胞浓度达1×109/ml。制备好的脾脏细胞输给未接种过肿瘤的小鼠，每只小鼠输注5×107细胞，然后再分别接种4T1/her2，A20/CD20；Renca细胞，6周后观察小鼠的存活情况。实验结果见表12。
表12淋巴细胞输注实验

*实验所用关键细胞系为Her相关实验用4T1/her2；CD20相关实验用A20/CD20；TRAIL相关实验用Renca。
上述结果与前述的chSM/FL、huSM/FL的试验结果完全一致。说明SM、huSM、抗CD20单抗、抗Her2单抗和TRAIL与FL组成的融合蛋白都是通过激活淋巴细胞的途径达到杀伤肿瘤细胞效果的，而且这种杀伤作用具有特异性，对无关细胞系没有作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>马，菁<120>具有抗肿瘤功能的双功能融合蛋白及其制备方法和应用<130>037089<150>CN 03129290.9<151>2003-06-13<160>68<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>546<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>1atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg420ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca540gccccg 546<210>2<211>182<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>2Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro180<210>3<211>1242<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(45)<223>人工接头<220>5ggcggtggag gctctggtgg aggcggttca ggaggcggtg gatct 45
<210>6<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>人工接头编码序列<220>6Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>7<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(426)<223>抗SM5-1抗体核苷酸序列<220>7atcgccgcca ccatggaatg gagttggata tttctctttc tcctgtcagg aactgcaggt 60gtccactctg aggtccagct gcagcagtct ggacctgagc tggtaaagcc tggggcttca120gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggatac acattcacta gctatgttat gcactgggtg180aagcagaagc ctgggcaggg ccttgactgg attggatata ttgttcctta caatgatggc240actaagtaca atgagaagtt caaaggcaag gccacactga cttcaggcaa atcctccagc300acagcctaca tggagctcag cagactgacc tctgaggact ctgcggtcta ttattgtgtc360tacggtagta ggtacgactg gtatttagat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc420tcctca 426<210>8<211>138<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(138)<223>抗SM5-1抗体<220>8Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Asp Trp Ile Gly Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Val Tyr Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Val Trp115 120 125Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135<210>9<211>465<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(465)<223>抗SM5-1抗体核苷酸序列<220>9atcatcacca gaacagctta cgagcagacc gccagacagc tcacagggat caagcttgcc 60gccaccatgg aatcacagac tcaggtcttc ctctccctgc tgctctgggt atctggtacc120tgtgggaaca ttatgatgac acagtcgcca tcatctctgg ctgtgtctgc aggagaaaag180gtcactatga gctgtaagtc cagtcaaagt gttttataca gttcaaatca gaagaactac240ttggcctggt accagcagaa accagggcag tctcctaaac tgctgatcta ctgggcatcc300actagggaat ctggtgtccc tgatcgcttc acaggcagtg gatctgggac agattttact360cttaccatca gcagtgtaca agctgaagac ctggcagttt attactgtca tcaatatttc420tcctcataca cgttcggagg ggggaccaag ctggaaataa agcgg465
<210>10<211>133<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(133)<223>抗SM5-1抗体<220>10Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Thr Cys Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser35 40 45Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln50 55 60Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg65 70 75 80Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys His Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 120 125Leu Glu Ile Lys Arg130<210>11<211>2021<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2021)<223>抗SM5-1抗体核苷酸序列<220>11atcgccgcca ccatggaatg gagttggata tttctctttc tcctgtcagg aactgcaggt 60gtccactctg aggtccagct gcagcagtct ggacctgagc tggtaaagcc tggggcttca 120gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggatac acattcacta gctatgttat gcactgggtg 180aagcagaagc ctgggcaggg ccttgactgg attggatata ttgttcctta caatgatggc 240actaagtaca atgagaagtt caaaggcaag gccacactga cttcagacaa atcctccagc 300acagcctaca tggagctcag cagactgacc tctgaggact ctgcggtcta ttattgtgtc 360tacggtagta ggtacgactg gtatttagat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc 780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaatg a2021<210>12<211>468<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(468)<223>抗SM5-1抗体
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agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc720tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag780tgttag 786<210>14<211>239<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(239)<223>抗SM5-1抗体<220>14Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Thr Cys Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser35 40 45Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln50 55 60Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg65 70 75 80Glu Set Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys His Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 120 125Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp165 170 175Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp180 185 190Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>15<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(138)<223>抗SM5-1抗体<220>16Met Asp Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60
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<221>misc_feature<222>(1)..(2021)<223>抗SM5-1抗体核苷酸序列<220>19agagccgcca ccatggattg ggtgtggacc ttgctattcc tgttgtcagt aactgcaggt 60gtccactccc aggtgcagct ggtgcagtct ggcggtggag tggtccagcc cggccgcagc120ctgaggctgt cctgcaaggc atctggctac accttcacca gctacgtgat gacatgggtg180cgccaagccc ccggaaaggg cctcgaatgg attggctaca ttgtgcctta taatgacggt240actaagtaca atgaaaagtt caagggcaga tttacaatat caagtgacaa gagcaagtca300accgcattcc tccaaatgga cagcttgcgt ccagaggaca ccgccgtata ctattgtgtg360cgcggcagcc gttacgactg gtacttggac tactggggcc aaggcactcc agtcaccgtc420tcctctgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg540gtgtctggga actcaggcac cctgaccagc ggcatgcaca ccttcccggc tgtcctacag600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc780
tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagar1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaatg a2021<210>20<211>468<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(468)<223>抗SM5-1抗体<220>20Met Asp Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asn Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Lys Ser85 90 95Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp115 120 125Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro130 135 140Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr145 150 155 160Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr165 170 175Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro180 185 190Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr195 200 205Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn210 215 220His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser225 230 235 240Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu245 250 255Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser275 280 285His Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Gly Val Glu290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr305 310 315 320Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln355 360 365Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val370 375 380Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val385 390 395 400Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro405 410 415
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<221>misc_feature<222>(1)..(1986)<223>抗p230抗体融合蛋白编码序列<220>27atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac 120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg 180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag 240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc 300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt 360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg 420ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc 480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca 540gccccggagc ccaaatcttg tgacaaaact cacagatgcc caccgtgccc agcacctgaa 600ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 660tcccggaccc ctgaggtcac atgctgggtg gtggactgga gccacgaaga ccctgaggtc 720aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 780gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 840ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 900aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 960tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat1020cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc1080acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac1140aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac1200aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctcccggta aacaggtgca gctggtgcag1260tctggcggtg gagtggtcca gcccggccgc agcctgaggc tgtcctgcaa ggcatctggc1320tacaccttca ccagctacgt gatgacatgg gtgcgccaag cccccggaaa gggcctcgaa1380tggattggct acattgtgcc ttataatgac ggtactaagt acaatgaaaa gttcaagggc1440agatttacaa tatcaagtga caagagcaag tcaaccgcat tcctccaaat ggacagcttg1500cgtccagagg acaccgccgt atactattgt gtgcgcggca gccgttacga ctggtacttg1560gactactggg gccaaggcac tccagtcacc gtctcctctg gcggtggagg ctctggtgga1620ggcggttcag gaggcggtgg atctaacatc atgatgactc agagcccatc cagcttgagc1680gcatcagtag gcgaccgcgt aacgatcact tgcaaatcct ctcagtcagt attgtactcc1740agcaaccaga agaactacct ggccggatat cagcagactc ccggcaaagc cccaaagttg1800ctgatttatt gggcctccac gcgcgagtct ggcgtgccat cacgctttag cggcagcggg1860tccggtacag attacacgtt taccattagc agtctgcagc ctgaggacat agccacctac1920tactgtcacc agtactttag ttcctacact tttggccagg gaactaaact gcagattact1980cgatga 1986<210>28<211>661<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(661)<223>抗p230抗体融合蛋白
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<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(235)<223>抗CD20抗体<220>42Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu130 135 140Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145 150 155 160Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln165 170 175Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser180 185 190Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu195 200 205Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser210 215 220Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>43<211>2489<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2489)<223>抗CD20抗体融合蛋白编码序列<220>43gccaccatgg gattcagcag gatctttctc ttcctcctgt cagtaactac aggtgtccac 60tcccaggtac aactacagca gcctggggct gagctggtga agcctggggc ctcagtgaag120atgtcctgca aggcttctgg ctacacattt accaattaca atatgcactg ggtaaagcag180acacctggtc ggggcctgga atggattgga gctatttatc caggaaatgg tgatacttcc240tacaatcaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcc300tacatgcagc tcagcagcct gacatctgaa gactctgcgg tctattactg tgcaagatcg360acttactacg gcggtgactg gtacttcaat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc420tctgcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag 1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat 1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg 1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg 1200ccctagagta gcctgcatcc aaggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca 1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac aggcgtggtg gtggacgtga 1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccggatggtc tgcgtcctca 1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc 1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta 1680ccaacctctg tcctacgggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc 1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca 1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc 1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc 1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaaac ccaggactgc tccttccaac 2040acagccccat ctcctccgac ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc 2100aagattaccc agtcaccgtg gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct 2160
ggcggctggt cctggcacag cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga2220tgcaaggctt gctggagcgc gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc2280agcccccccc cagctgtctt cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga2340cctccgagca gctggtggcg ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc2400tggagctgca gtgtcagccc gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc2460tggaggccac agccccgaca gccccgtga 2489<210>44<211>626<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(626)<223>抗CD20抗体融合蛋白编码序列<220>44Met Gly Phe Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn115 120 125Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly145 150 155 160Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val195 200 205Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn210 215 220Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro225 230 235 240Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu245 250 255Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp260 265 270Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp275 280 285Val Ser His Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Gly290 295 300Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn305 310 315 320Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp325 330 335Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro340 345 350Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu355 360 365Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn370 375 380Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile385 390 395 400Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr405 410 415Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys420 425 430Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys435 440 445Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu450 455 450Ser Leu Ser Pro Gly Lys Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro465 470 475 480Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu485 490 495Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu500 505 510Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu515 520 525Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg
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<221>misc_feature<222>(1)..(2534)<223>抗CD20抗体融合蛋白<400>45gccaccatgg gattcagcag gatctttctc ttcctcctgt cagtaactac aggtgtccac 60tcccaggtac aactacagca gcctggggct gagctggtga agcctggggc ctcagtgaag 120atgtcctgca aggcttctgg ctacacattt accagttaca atatgcactg ggtaaagcag 180acacctggtc ggggcctgga atggattgga gctatttatc caggaaatgg tgatacttcc 240tacaatcaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcc 300tacathcagc tcagcagcct gacatctgaa gactctgcgg tctattactg tgcaagatcg 360acttactacg gcggtgactg gtacttcaat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420tctgcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc 780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatggtc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg caggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaagg cggtggaggc tctggtggag2040gcggttcagg aggcggtgga tctacccagg actgctcctt ccaacacagc cccatctcct2100ccgacttcgc tgtcaaaatc cgtgagctgt ctgactacct gcttcaagat tacccagtca2160ccgtggcctc caacctgcag gacgaggagc tctgcggggg cctctggcgg ctggtcctgg2220cacagcgctg gatggagcgg ctcaagactg tcgctgggtc caagatgcaa ggcttgctgg2280agcgcgtgaa cacggagata cactttgtca ccaaatgtgc ctttcagccc ccccccagct2340gtcttcgctt cgtccagacc aacatctccc gcctcctgca ggagacctcc gagcagctgg2400tggcgctgaa gccctggatc actcgccaga acttctcccg gtgcctggag ctgcagtgtc2460agcccgactc ctcaaccctg ccacccccat ggagtccccg gcccctggag gccacagccc2520cgacagcccc gtga 2534<210>46<211>641<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(641)<223>抗CD20抗体融合蛋白编码序列<400>46Met Gly Phe Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala GIu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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<221>misc_feature<222>(1)..(1976)
<223>抗CD20抗体融合蛋白编码序列<220>47atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac aaagccccat ctcctccgac 120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg 180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag 240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc 300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt 360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg 420ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc 480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca 540gccccggagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 600ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 660tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 720aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 780gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 840ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 900aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 960tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat1020cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc1080acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac1140aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatacatga ggctctgcac1200aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctcccggta aacaggtaca actacagcag1260cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc1320tacacattta ccagttacaa tatgcactgg gtaaagcaga cacctggtcg gggcctggaa1380tggattggag ctatttatcc aggaaatggt gatacttcct acaatcagaa gttcaagggc1440aaggccacac tgactgcaga caaatcctcc agcacagcct acatgcagct cagcagcctg1500acatctgaag actctgcggt ctattactgt gcaagatcga cttactacgg cggtgactgg1560tacttcaatg tctggggcgc agggaccacg gtcaccgtct ctgcaggcgg tggaggctct1620ggtggaggcg gttcaggagg cggtggatct caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc1680ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt1740tacatccact ggttccagca gaagccagga tcctccccca aaccctggat ttatgccaca1800tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac1860tctctcacaa tcagtagagt ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg1920actagtaacc cacccacgtt cggtggtggg accaagctgg agatcaaacg atga 1974<210>48<211>657<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(657)<223>抗CD20抗体融合蛋白<220>48Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln GIy85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 1757hr Ala Pro Thr Ala Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr180 185 190Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe195 200 205Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro210 215 220Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val225 230 235 240Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr245 250 255Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val260 265 270Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys275 280 285Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
290 295 300Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro305 310 315 320Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val325 330 335Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly340 345 350Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp355 360 365Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp370 375 380Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His385 390 395 400Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gln Val405 410 415Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val420 425 430Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met435 440 445His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala450 455 460Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly465 470 475 480Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln485 490 495Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg500 505 510Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly515 520 525Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly530 535 540Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile545 550 555 560Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser565 570 575Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser580 585 590Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro595 600 605Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile610 615 620Ser Arg Val Glu Ala Glu Ala Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp625 630 635 640Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys645 650 655Arg<210>49<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(426)<223>抗Her2抗体编码序列<220>49atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60agaggagagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc120cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatataca ctgggtgcgt180caggccccgg gtaagggcct ggaatgggtt gcaaggattt atcctacgaa tggttatact240agatatgccg atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca300gcctacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgttcraga360tggggagggg acggcttcta tgctatggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc420tcctcg 426<210>50<211>142<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(142)<223>抗Her2抗体编码序列<220>50Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45
Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr65 70 75 80Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr85 90 95Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 105 110Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala115 120 125Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135 140<210>51<211>390<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(390)<223>抗Her2抗体编码序列<220>51atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60agaggagaca tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg120gttaccatca cctgccgtgc cagtcaggat gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag180aaaccaggaa aagctccgaa actactgatt tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc240ccttctcgct tctctggctc cagatctggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg300cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaacatt atactactcc tcccacgttc360ggacagggta ccaaggtgga gatcaaacgt 390<210>52<211>130<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(130)<223>抗Her2抗体<220>52Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys50 55 60Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val65 70 75 80Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr85 90 95Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln100 105 110His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile115 120 125Lys Arg130<210>53<211>2021<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_featute<222>(1)..(2021)<223>抗Her2抗体编码序列<220>53atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60agaggagagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc120cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatataca ctgggtgcgt180caggccccgg gtaagggcct ggaatgggtt gcaaggattt atcctacgaa tggttatact240agatatgccg atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca300gcctacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgttctaga360tggggagggg acggcttcta tgctatggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc420tcctcggcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag crtgggcacc660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt720
ggtgagaggc cagcacaggg gaggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc 780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaatg a2021<210>54<211>472<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(472)<223>抗Her2抗体编码序列<220>54Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr65 70 75 80Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr85 90 95Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 105 110Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala115 120 125Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr145 150 155 160Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser195 200 205Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val225 230 235 240Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala245 250 255Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro260 265 270Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val275 280 285Val Asp Val Ser His Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp290 295 300Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln305 310 315 320Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln325 330 335Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala340 345 350Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro355 360 365Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr370 375 380Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser385 390 395 400Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
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<221>misc_feature<222>(1)..(711)<223>抗Her2抗体编码序列<220>55atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60agaggagaca tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg120gttaccatca cctgccgtgc cagtcaggat gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag180aaaccaggaa aagctccgaa actactgatt tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc240ccttctcgct tctctggctc cagatctggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg300cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaacatt atactactcc tcccacgttc360ggacagggta ccaaggtgga gatcaaacgt actgtggctg caccatctgt cttcatcttc420ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac480ttctatccca gagaggccaa attacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac540tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc600ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat660cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g 711<210>56<211>236<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(236)<223>抗Her2抗体<220>56Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys50 55 60Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val65 70 75 80Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr85 90 95Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln100 105 110His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile115 120 125Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp130 135 140Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn145 150 155 160Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu165 170 175Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp180 185 190Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr195 200 205Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser210 215 220Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>57<211>2489<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2489)<223>抗Her2抗体融合蛋白编码序列
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<221>misc_feature<222>(1)..(628)<223>抗Her2抗体融合蛋白<220>58Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr65 70 75 80Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr85 90 95Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 105 110Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala115 120 125Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr145 150 155 160Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser195 200 205Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
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ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaagg cggtggaggc tctggtggag2040gcggttcagg aggcggtgga tctacccagg actgctcctt ccaacacagc cccatctcct2100ccgacttcgc tgtcaaaatc cgtgagctgt ctgactacct gcttcaagat tacccagtca2160ccgtggcctc caacctgcag gacgaggagc tctgcggggg cctctggcgg ctggtcctgg2220cacagcgctg gatggagcgg ctcaagactg tcgctgggtc caagatgcaa ggcttgctgg2280agcgcgtgaa cacggagata cactttgtca ccaaatgtgc ctttcagccc ccccccagct2340gtcttcgctt cgtccagacc aacatctccc gcctcctgca ggagacctcc gagcagctgg2400tggcgctgaa gccctggatc actcgccaga acttctcccg gtgcctggag ctgcagtgtc2460agcccgactc ctcaaccctg ccacccccat ggagtccccg gcccctggag gccacagccc2520cgacagcccc gtga 2534<210>60<211>643<212>PRT<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(1098)<223>Trail融合蛋白编码序列<220>63atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg420ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca540gccccgggcg gtggaggctc tggtggaggc ggttcaggag gcggtggatc tgtgagagaa600agaggtcctc agagagtagc agctcacata actgggacca gaggaagaag caacacattg660tcttctccaa actccaagaa tgaaaaggct ctgggccgca aaataaactc ctgggaatca720tcaaggagtg ggcattcatt cctgagcaac ttgcacttga ggaatggtga actggtcatc780catgaaaaag ggttttacta catctattcc caaacatact ttcgatttca ggaggaaata840aaagaaaaca caaagaacga caaacaaatg gtccaatata tttacaaata cacaagttat900cctgacccta tattgttgat gaaaagtgct agaaatagtt gttggtctaa agatgcagaa960tatggactct attccatcta tcaaggggga atatttgagc ttaaggaaaa tgacagaatt 1020tttgtttctg taacaaatga gcacttgata gacatggacc atgaagccag tttttttggg 1080gcctttttag ttggctaa 1098<210>64<211>365<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(365)<223>Trail融合蛋白<220>64Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser180 185 190Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala195 200 205His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn210 215 220Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser225 230 235 240Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly245 250 255Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr260 265 270Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys275 280 285Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile290 295 300Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu305 310 315 320Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu
325 330 335Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met340 345 350Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly355 360 365<210>65<211>1203<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1203)<223>Trail融合蛋白编码序列<220>65atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg420ctgaagccct ggatcagtcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca540gccccgatga agcagatcga ggacaaaatt gaggaaatcc tgtccaagat ttaccacatc600gagaacgaga tcgcccggat taagaaactc attggcgaga cctctgagga aaccatttct660acagttcaag aaaagcaaca aaatatttct cccctagtga gagaaagagg tcctcagaga720gtagcagctc acataactgg gaccagagga agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc780aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaata aactcctgcg aatcatcaag gagtgggcat840tcattcctga gcaacttgca cttgaggaat ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt900tactacatct attcccaaac atactttcga tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaag960aacgacaaac aaatggtcca atatatttac aaatacacaa gttatcctga ccctatattg 1020ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttgg tctaaagatg cagaatatgg actctattcc 1080atctatcaag ggggaatatt tgagcttaag gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca 1140aatgagcact tgatagacat ggaccatgaa gccagttttt ttggggcctt tttagttggc 1200taa 1203<210>66<211>400<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(400)<223>Trail融合蛋白<220>66Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu180 185 190Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys195 200 205Lys Leu Ile Gly Glu Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu210 215 220Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg225 230 235 240Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser245 250 255Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser260 265 270Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu
275 280 285Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr290 295 300Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys305 310 315 320Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro325 330 335Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys340 345 350Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu355 360 365Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu370 375 380Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly385 390 395 400<210>67<211>1749<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(582)<223>Trail融合蛋白<220>68Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Tht Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr180 185 190Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe195 200 205Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro210 215 220Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val225 230 235 240Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr245 250 255Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val260 265 270Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys275 280 285Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser290 295 300Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro305 310 315 320Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val325 330 335Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly340 345 350Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp355 360 365Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp370 375 380Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His385 390 395 400Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val Arg405 410 415Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly420 425 430Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu435 440 445Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe450 455 460Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys465 470 475 480Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu485 490 495Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr500 505 510Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg515 520 525Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr530 535 540Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser545 550 555 560Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe565 570 575Gly Ala Phe Leu Val Gly580
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括第一部分和第二部分，第一部分为Flt3配体或其生物活性片段，第二部分为蛋白或多肽类抗肿瘤物。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，抗肿瘤物可以是引起细胞凋亡的分子。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，在其中的Flt3配体或其生物活性片段可以刺激造血干细胞或祖细胞增殖。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体或其生物活性片段可以刺激骨髓前体细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞以及树突状细胞和NK细胞增殖。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体或其生物活性片段可以来源于哺乳动物。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体或其生物活性片段可以来源于人。
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体或其生物活性片段是可溶性蛋白。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体包含至少100个氨基酸并且与SEQ IDNO2所示氨基酸序列有至少40％同源性。
9如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体可与1种抗体结合，此种抗体可特异性与SEQ ID NO2所示氨基酸序列构成的多肽结合，且Flt3配体充分保留了其生物学活性。
10.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体包含的氨基酸序列与SEQ ID NO2所示第28至128位氨基酸序列有至少80％同源性。
12.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体的氨基酸序列包含SEQ ID NO2所示第28至128位氨基酸。
13.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体包含的氨基酸序列可以选自SEQ IDNO2所示第28至160位氨基酸或SEQ ID NO2所示第28至182位氨基酸。
14.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，抗肿瘤物可以是抗体分子。
15.如权利要求14所述的融合蛋白，其中，抗体分子可以是完整抗体分子，Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，二体，单链抗体等片段或由各种抗体片段组成的多特异性抗体。
16.如权利要求14所述的融合蛋白，其中，抗体可以是抗p230抗体，抗CD20抗体，抗Her2抗体，抗Her3抗体，抗Her4抗体，抗EGFR抗体或他们的生物活性片段。
17.如权利要求14所述的融合蛋白，其中，抗体可以是人源或人源化抗体。
18.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，抗肿瘤物可以是Fas配体，TNF，TRAIL，或他们的生物活性膜外区片段。
19.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体可以位于融合蛋白的N端。
20.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体可以位于融合蛋白的C端。
21.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配体和抗肿瘤物可以被连接肽所分隔。
22.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，连接肽可以为(Gly4Ser)3。
23.如权利要求1所述的融合蛋白包含SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ ID NO28，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO44，SEQ ID NO46，SEQ IDNO48，SEQ ID NO58，SEQ ID NO60，SEQ ID NO62，SEQ ID NO64，SEQ ID NO66或SEQ ID NO68所示氨基酸序列。
24.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的双功能融合蛋白。
25.如权利要求24所述的核酸分子包含SEQ ID NO23，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQ ID NO29，SEQ ID NO31，SEQ ID NO33，SEQ ID NO43，SEQ ID NO45，SEQ IDNO47，SEQ ID NO57，SEQ ID NO59，SEQ ID NO61，SEQ ID NO63，SEQ ID NO65或SEQ ID NO67所示核苷酸序列。
26.一种分离的核酸分子，其特征在于，它包含与权利要求24所述核酸分子互补的核酸序列。
27.一种载体，其特征在于，它含有编码权利要求1所述融合蛋白的核酸分子。
28.如权利要求27所述的载体包含与编码FLt3配体和蛋白或多肽抗肿瘤物的核酸分子以及与其操作性相连的表达调控序列。
29.一种重组细胞，其特征在于，它含有权利要求24所述核酸分子。
30.如权利要求29所述的重组细胞，其特征在于，它是真核细胞。
31.如权利要求30所述的重组细胞，其特征在于，它是CHO，COS或NSO细胞。
32.一种产生融合蛋白的方法，其特征在于，它包括如何培养含有权利要求24所述核酸分子的重组细胞，以至此重组细胞表达编码的融合蛋白并回收此融合蛋白。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，它包括分离和纯化融合蛋白。
34.如权利要求32所述的方法的产物。
35.一种药物组合物，其特征在于，它包含有效剂量的Flt3配体和蛋白或多肽类抗肿瘤物组成的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
36.一种方案，其特征在于，它包含有效剂量的Flt3配体和蛋白或多肽类抗肿瘤物组成的融合蛋白以及如何服用所述融合蛋白的方法。
37.一种治疗哺乳动物肿瘤的方法，此方法包括给需要治疗或合乎要求的动物服用有效剂量的Flt3配体和蛋白或多肽类抗肿瘤物组成的融合蛋白。
38.如权利要求37所述的方法，其中，哺乳动物可以是人。
39.如权利要求37所述的方法，其中，肿瘤可以是黑色素瘤，乳腺癌或肝癌。
40.一种药物组合物，其特征在于，它包含a)有效剂量的Flt3配体和蛋白或多肽类抗肿瘤物组成的融合蛋白。b)有效剂量的抗肿瘤制剂。
41.如权利要求40所述的组合物，其中，抗肿瘤制剂是一种治疗黑色素瘤，乳腺癌或肝癌的制剂。
42.一种治疗哺乳动物肿瘤的方法，此方法包括给需要治疗或合乎要求的动物服用有效剂量的如权利要求40所述的组合物。
43.一种通过caspase-3诱导细胞凋亡的方法，其特征在于，它包括给需要诱导或合乎要求的细胞使用有效剂量的Flt3配体和蛋白或多肽类抗肿瘤物组成的融合蛋白。
44.如权利要求43所述的方法，其中，细胞可以是哺乳动物细胞。
45.如权利要求44所述的方法，其中，细胞可以是哺乳动物肿瘤细胞。
46.如权利要求43所述的方法，其中，细胞可以是在哺乳动物体内。
47.一种疫苗，其特征在于，它包含有效剂量的Flt3配体和蛋白或多肽类抗肿瘤物组成的融合蛋白，以及一种免疫增强剂。
48.一种在哺乳动物体内激发抗肿瘤免疫反应的方法，其特征在于，它包括给需要治疗或合乎要求的动物服用有效剂量的如权利要求47所述的疫苗。
49.一种产生肿瘤特异性淋巴细胞的方法，其特征在于，它包括给哺乳动物服用有效剂量的Flt3配体和蛋白或多肽类抗肿瘤物组成的融合蛋白以产生肿瘤特异性淋巴细胞并从所述的哺乳动物回收产生的肿瘤特异性淋巴细胞。
全文摘要
本发明公开了一类具有抗肿瘤功能的双功能融合蛋白，包括第一部分和第二部分，其中第一部分为具有诱导肿瘤细胞凋亡功能的分子，第二部分为Flt配体。本发明还公开了该双功能融合蛋白的编码核酸以及制备方法。本发明还公开了该双功能融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
文档编号C12N5/00GK1572801SQ200310119930
公开日2005年2月2日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年6月13日
发明者马菁 申请人:马菁