专利名称：一种抑制低乳糖奶褐变的方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种牛奶的处理方法以及用此方法得到的产品，具体的说，涉及一种抑制低乳糖奶褐变的方法，以及用此方法得到的无褐变牛奶。属于乳制品和乳品加工处理的领域。
背景技术：
乳是各种哺乳动物哺育其幼仔的最理想的天然食物，富含优质蛋白、乳脂、乳糖等营养成分和钙、磷、钾等矿物质及多种维生素。在发达国家中，乳与乳制品已经成为人们饮食的重要组成内容；我国新修订的《中国居民膳食指南》中明确强调了“一人一天一杯奶(250ml)”，而且WHO也把人均乳品消费量列为衡量一个国家人们生活水平的主要指标。由此可见，牛乳在人们饮食中具有的重要作用。
尽管牛乳具有优良的营养价值，但在我国，2000年乳制品的年人均消费量不足10Kg，远远低于世界年人均乳品消费量(100Kg)。除了我国乳业发展及加工水平相对滞后外，乳糖不耐症也在一定程度限制了乳制品在我国的推广。
牛乳中乳糖含量约为4.8％(顾瑞霞，2000)，占牛奶总糖的99％以上。正常生理条件下，乳糖经小肠内乳糖酶作用后，水解为葡萄糖和半乳糖才能被人体吸收。调查表明，全世界(特别是亚非国家)约有70％人体内缺少乳糖酶，这些人群中摄入牛乳后，出现腹泻、肠胃胀气等不良反应，即乳糖不耐症(Fox etal.，1992)。因此，在乳品加工的过程中，利用乳糖酶降解乳糖生产的低乳糖奶不但能给人们提供优质糖原，对患有乳糖不耐症的人群来说，也大大增加他们的牛奶摄入量。
中国专利CN1258452A公开了一种用固相化嗜热菌乳糖酶生产低乳糖牛奶的方法，其中，公开了用固相化嗜热菌乳糖酶生产低乳糖牛奶方法的温度参数和菌种使用方法，但是在灭菌的过程中，会由于分解得到的还原糖中的羰基与赖氨酸中ε-氨基结合，发生美拉德反应，导致低乳糖奶产生非酶褐变。无法得到合格的产品。
因为在低乳糖奶在加工过程中，乳糖被分解为葡萄糖和半乳糖，一方面增加了甜度，赋予低乳糖奶良好的口感和风味；另一方面，大量还原糖中的羰基与赖氨酸中ε-氨基结合，发生美拉德反应，导致低乳糖奶产生非酶褐变。
美拉德反应是在高温加热条件下，蛋白质与糖之间发生羰-氨反应，它是乳与乳制品产生褐变的重要因素。美拉德反应的第一步是氨基与羰基以开链形式反应，生成Schiff’s碱，其后是Amadori分子重排反应，生成N-取代-1氨基-1-脱氧-2-酮糖，该物质无色，不吸收紫外区附近的光线，随着反应的进行，该物质烯醇化为1，2-单烯氨基醇或2，3-烯三醇，前者最终形成5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural，5-HMF)(郭本恒，2001)。5-HMF的积累与褐变有很大的相关性(Ferrer et al.，2000)，因为5-HMF可断裂形成α-二羰基化合物，该羰基化合物与胺反应产生的类黑精(Morale et al.，1992)，是导致乳和乳制品褐变的重要因素。因此，可以通过控制5-HMF产生来降低产品褐变的程度。
本发明利用乳糖酶水解生产低乳糖奶，利用HPLC法(Morales et al.，1992)测定美拉德反应的主要中间产物5-HMF的含量，并以此为根据分析不同生产条件和不同抑制剂对低乳糖奶中5-HMF含量的影响。此外，本发明还针对不同灭菌条件和水解度条件下所得的低乳糖奶的色差进行了测定，分析色差与5-HMF含量之间的关系。
发明内容本发明的目的是提供一种提供一种方法来处理牛奶，使其具有低乳糖的特性，同时抑制分解糖分的时候所产生的褐变，而且风味洁净和新鲜；本发明的另一个目的是提供一种无褐变的低乳糖牛奶。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是取一定量的牛奶，在pH为6.6～6.8、温度8～9℃的条件下，向牛奶中加入乳糖酶，其中酶用量为0.5‰～0.75‰(重量份)，酶解时间14～8小时；，优选用0.5‰(重量份)酶用量酶解14小时，或0.75‰(重量份)酶用量酶解8小时。
还可以进行高温酶解，即在37～40℃时，酶用量为0.5‰～0.75‰(重量份)，时间3～2小时，优选在37℃下，用0.5‰(重量份)酶用量酶解3小时，或40℃下用0.75‰(重量份)酶量酶解2小时；可以达到满足水解率70％以上，水解速度快；灭菌过程中，操作参数选择如下在138-140℃下灭菌4.5-3.5s；在灭菌过程中加入抑制剂亚硫酸钠或半胱氨酸。
考虑到成本和水解率，在实际生产中生产低乳糖奶，不需要将乳糖全部分解，当低乳糖奶中乳糖的水解率达70％时，就可解决乳糖不耐症的问题。水解率在70％左右时，5-HMF含量较低。因此，可以在满足生产要求的情况下控制低乳糖奶的水解率来减少5-HMF的产生。
图1是利用乳糖酶降解牛乳中的乳糖来生产无褐变低乳糖奶的工艺流程图2是低温酶解(8～10℃)时水解率的变化情况；图3是高温酶解(37～40℃)时水解率的变化情况；图4是HPLC法检测5-HMF的图谱的出峰情况；图5是5-HMF含量(C5-HMF)和峰面积(Aera)的线性关系；图6是水解率对低乳糖奶中5-HMF含量的影响；图7是灭菌温度对5-HMF含量的影响；图8抑制剂对不同灭菌温度低乳糖奶中5-HMF含量的影响；图9抑制剂对不同水解率低乳糖奶中5-HMF含量影响；图10表示包含镜面反射时5-HMF含量与色差(ΔL*、Δa*和Δb*)的关系；图11表示排除镜面反射时5-HMF含量与色差(ΔL*、Δa*和Δb*)的关系。
具体实施方式以下实施例结合附图用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
图1所示的低乳糖奶生产工艺中，5-HMF主要产生于灭菌阶段，此阶段的高温条件是引起美拉德反应的主要因素；在图2中，低温条件下生产低乳糖奶，酶用量为0.1‰和0.25‰时，水解率在4～16小时较低；酶用量为0.5‰和0.75‰，水解率上升较快，分别在14小时和8小时达到70％以上；在图3中，高温条件下生产低乳糖奶，酶用量为0.1‰和0.25‰时，水解率在1～5小时较低；酶用量为0.5‰和0.75‰，水解率上升较快，分别在3小时和2小时后达到70％以上；从图4中可以看出，保留时间在3.1min左右时，a峰、b峰、c峰的峰面积随着进样浓度增加而依次增大，即a、b和c处为5-HMF经HPLC分析的出峰情况。
以样品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作5-HMF的标准曲线，得到浓度与峰面积的线性关系，结果如图5所示。5-HMF含量表示为C5-HMF，线性方程为Aera＝14363C5-HMF+2.1617，二者之间的相关性达99.89％。
经过预处理的待测样品经HPLC法检测后，获得峰面积，然后根据图5所示的标准曲线，计算即可得到样品中5-HMF的含量。
低乳糖奶生产过程中，随着水解率增加，还原糖含量升高。在139℃灭菌4s的情况下，水解率对于灭菌后低乳糖奶中5-HMF含量的影响如图6。
从图6中可以看出，随着水解率升高，低乳糖奶中5-HMF含量增加。发明人发现，当低乳糖奶中乳糖的水解率达70％时，就可解决乳糖不耐症的问题。由图6可知，水解率在70％左右时，5-HMF含量较低。因此，可以在满足生产要求的情况下控制低乳糖奶的水解率来减少5-HMF的产生。
生产低乳糖奶的过程中，酶解结束后要对酶解液高温处理，以达到灭酶、灭菌，从而延长保质期的目的。而最容易发生美拉德反应的也是灭菌阶段。在高温灭菌条件下，低乳糖奶中含有的还原糖与蛋白质的氨基酸残基反应，产生了美拉德反应的中间产物5-HMF。不同灭菌温度和保温时间对低乳糖奶中5-HMF含量的影响如图7。
如图7，灭菌温度和时间对5-HMF的含量都有影响。灭菌温度越高，低乳糖奶产生的5-HMF含量也多；灭菌时间越长，5-HMF含量越高。在生产长保质期灭菌奶时，实际生产中多采用139℃、4s或135℃、15s进行超高温灭菌，从图7可以看出，灭菌条件为139℃、4s时，产生的5-HMF含量更少。
从图8中可以看出，在所有灭菌温度下，即使灭菌时间较长(15s)，添加抑制剂后的低乳糖奶中5-HMF含量都低于未添加任何抑制剂的低乳糖奶中5-HMF含量。添加抑制剂亚硫酸钠或半胱氨酸后，5-HMF的含量受到灭菌温度的影响较小，但半胱氨酸抑制5-HMF产生的效果更好。
发明人分析了灭菌条件为139℃、4s时，添加抑制剂对不同水解率低乳糖奶中5-HMF含量影响，结果如图9。如图9，添加抑制剂后，不同水解率的低乳糖奶中5-HMF含量都低于没有添加任何抑制剂的低乳糖奶。随着水解率升高，添加抑制剂后的低乳糖奶中5-HMF的增加量低于未添加抑制剂的产品，且在所有水解率条件下，半胱氨酸抑制5-HMF产生的效果更好。
如图10所示，包含镜面反射的情况下，亮度值ΔL*随着5-HMF含量升高而降低，即低乳糖奶的颜色随5-HMF含量升高而逐步加深，而且这种颜色的变化可以肉眼观察。5-HMF含量和ΔL*之间存在二项式关系，同前，将5-HMF含量表示为C5-HMF，ΔL*和C5-HMF之间的数学关系为ΔL*＝-0.004(C5-HMF)2-0.3154C5-HMF+0.1381，相关性达99.44％。而红度值Δa*和黄度值Δb*随着5-HMF含量的升高而升高。Δa*和C5-HMF之间的数学关系表示为Δa*＝-0.0027(C5-HMF)2+0.2697C5-HMF-0.1581相关性达99.07％。Δb*和C5-HMF之间的数学关系表示为Δb*＝0.0036(C5-HMF)2+0.2369C5-HMF-0.5693，相关性为94.91％。
如图11，在排除镜面反射的情况下，5-HMF含量与色差(ΔL*、Δa*和Δb*)也存在与包含镜面反射时相同的趋势。亮度值ΔL*随5-HMF含量升高而降低，二者之间的数学关系为ΔL*＝-0.0058(C5-HMF)2-0.3129 C5-HMF+0.1389，相关性达99.58％。红度值Δa*和黄度值Δb*随着5-HMF含量的升高而升高。Δa*和C5-HMF之间的数学关系表示为Δa*＝-0.0024(C5-HMF)2+0.2854C5-HMF-0.1671，相关性为99.15％。Δb*和C5-HMF之间的数学关系表示为Δb*＝0.0063(C5-HMF)2+0.2371C5-HMF-0.6319，相关性为95.56％。
从上面的分析可知，低乳糖奶中5-HMF含量与其色差(ΔL*、Δa*和Δb*)存在二项式关系。无论检测过程中，比色杯的镜面反射存在与否，低乳糖奶的亮度值ΔL*随5-HMF含量升高而降低，红度值Δa*和黄度值Δb*均随5-HMF含量升高而升高。
为了明确低乳糖奶中5-HMF含量与色差的关系，本发明人检测了不同5-HMF含量的情况下，色差(ΔL*、Δa*和Δb*)的变化情况，同时分析了5-HMF含量和色差之间的数学关系。图10表示包含镜面反射时5-HMF含量与色差(ΔL*、Δa*和Δb*)的关系，图11表示排除镜面反射时5-HMF含量与色差(ΔL*、Δa*和Δb*)的关系。
实施例1HPLC法检测5-HMF本发明中，采用HPLC法测定乳中5-HMF含量。取三种不同浓度(1.1088μmol/ml、3.3264μmol/ml、6.6528μmol/ml)的5-HMF标准品，用HPLC进行分析，测定在280nm处的吸收，进样量为20μl。
实施例2低乳糖奶中5-HMF含量和色差的关系发明人分析了低乳糖奶中5-HMF含量与色差的关系，来验证使用测定5-HMF含量来监测低乳糖奶褐变的可行性。
利用乳糖酶水解牛乳，在水解度分别为52.1％、68.7％、69.6％和76.1％时取样，并对所得不同水解率的样品进行两种处理85℃灭菌15min，121℃灭菌10min，然后测定各样品的5-HMF含量和色差(ΔL*、Δa*和Δb*)。两种灭菌条件下色差的检测分别以对应灭菌条件的原料奶为标准样品。原料奶经85℃灭菌15min后，L*＝76.81，a*＝-2.11，b*＝4.36；原料奶经121℃灭菌10min后，L*＝73.02，a*＝1.0，b*＝10.10。经酶解后所得低乳糖样品中5-HMF含量和其色差结果如表1表1两种灭菌条件下不同水解度低乳糖奶中5-HMF和色差值
如表1，高温灭菌(121℃灭菌10min)条件下，低乳糖奶的5-HMF含量远远高于低温灭菌(85℃灭菌15min)，同时，亮度值ΔL*远远低于低温灭菌时的值。可见，水解率相同的情况下，高温灭菌时低乳糖奶产品的颜色更深。
采用同样的方法，分析了不同灭菌条件下，水解率为68.1％的低乳糖奶中5-HMF含量和色差，如表2。
表2不同灭菌条件下低乳糖奶中5-HMF含量和色差
从表2中可知，灭菌温度升高，低乳糖奶中5-HMF含量升高，低乳糖奶产品颜色加深。
从表1和表2可以看出，不同的处理条件下，低乳糖奶中5-HMF的含量有很大变化，同时，其色差值也随着5-HMF含量的变化而变化。
实施例3主要仪器岛津-高效液相色谱仪，SPD-10AVP/10AVVP紫外-可见检测器，DGU-12A自动脱气装置，美国Rite SP62分光光度仪试剂乳糖酶(EC 3.2.1.23)，5-羟甲基糠醛(5-HMF，Sigma)，甲醇(RomilChemicals，色谱纯)，结晶乙酸钠、乙酸、三氯乙酸、草酸、抑制剂亚硫酸钠和半胱氨酸均为分析纯，双蒸水。
乳糖水解率的测定乳糖水解率采用酶催法，利用试剂盒进行测定。
原理牛乳中一分子乳糖经乳糖酶水解后，产生一分子葡萄糖和一分子半乳糖，因此，可用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法专一地检测牛乳中葡萄糖的含量，从而可知乳糖的水解率。葡萄糖经葡萄糖氧化酶生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢进一步经过氧化物酶氧化后释放出新生态氧，该氧在苯酚存在的条件下，能使无色4-氨基安替吡啉(还原型)氧化成红色醌型化合物(氧化型)，该物质在505nm处有最大吸光值，且颜色的深浅与样品中葡萄糖含量成正比。反应条件为37℃、15min，反应过程可用下式表示
样品中葡萄糖含量和乳糖水解率按下式计算样品中葡萄糖含量(g/L)＝(测定管吸光度/标准管吸光度)×标准浓度乳糖水解率(％)＝(2×样品中葡萄糖含量)/乳糖含量×100％实施例4酶解条件的确定利用乳糖酶(EC 3.2.1.23)水解乳糖，生产低乳糖奶。模拟生产条件，采用低温酶解(8～10℃)和高温(37～40℃)酶解，pH6.6～6.8，酶用量均设4个浓度0.1‰、0.25‰、0.5‰、0.75‰。监测低温酶解过程4～16小时水解率的变化，以及高温酶解过程1～5小时水解率的变化情况，然后确定酶用量和酶解时间。
5-HMF含量的测定利用HPLC法测定5-HMF含量(Morales et al.，1992)。
色谱条件如下色谱柱Resolve C18色谱柱(150mm×4.0mm，大连依利特科学仪器有限公司)流动相0.1M pH3.8醋酸钠缓冲液∶甲醇＝92∶10检测波长紫外检测器检测，波长280nm进样量20μl标准溶液的配制先将0.056g 5-HMF标准品溶解，定容到200ml配制成原液，再分别取0.1ml、0.3ml、0.6ml原液，加入5ml 0.15M草酸、3ml 40％TCA和10ml4％TCA，然后定容到25ml。
样品预处理方法参照Ferrer(2000)，具体流程如下向15ml牛奶中添加5ml0.15M草酸溶液，混匀后在沸水中加热25min。待混合物冷却至室温，再加入3ml40％TCA，充分振荡，离心(2000×g，15min)，收集上清液。再向离心沉淀中加入10ml 4％TCA，混匀后离心(2000×g，15min)，收集上清液。合并两次离心的上清液，测定体积，然后通过微滤膜(0.45μm)，所得滤液用HPLC进行检测。
实施例5色差检测利用上述乳糖酶制备低乳糖奶，酶用量为0.5‰。
所得低乳糖奶样品的色差用美国Rite SP 62分光光度计测定。步骤将分光光度计置于差异显示模式，然后用白标准进行校准；将样品标准注入比色池，比色池置于专用比色架上，先测定标准样品的色差，然后再用相同的方法测定样品的色差。以CIE L*a*b*为样品色差的容差模式(Bertelli et al.，1996)，L*为亮度值，a*红度值，b*为黄度值，L*、a*和b*的变化按下式计算ΔL*＝L*-L*0(L*为样品亮度值，L*0为标准样品亮度值)Δa*＝a*-a*0(a*为样品红度值，a*0为标准样品红度值)Δb*＝b*-b*0(b*为样品黄度值，b*0为标准样品黄度值)所得结果中，若ΔL*为正，说明样品亮度值比标准样品高，颜色浅；若ΔL*为负，说明样品亮度值比标准样品低，颜色深。
实施例6取一定量的牛奶，在pH为6.6、温度9℃的条件下，向牛奶中加入乳糖酶，其中酶用量为0.5‰(重量份)，酶解时间14小时；灭菌过程中，操作参数选择如下在139℃下灭菌4s。
实施例7取一定量的牛奶，在pH为6.8、温度9℃的条件下，向牛奶中加入乳糖酶，其中酶用量为0.75‰(重量份)，酶解时间8小时；灭菌过程中，操作参数选择如下在138℃下灭菌4.5s。
实施例8一种抑制低乳糖奶褐变的方法，其特征在于取一定量的牛奶，在pH为6.8、温度8℃的条件下，向牛奶中加入乳糖酶，其中酶用量为0.75‰(重量份)，酶解时间8小时；灭菌过程中，操作参数选择如下在140℃下灭菌4.5s。
实施例9一种抑制低乳糖奶褐变的方法，其特征在于取一定量的牛奶，在pH为6.6、温度37℃的条件下，向牛奶中加入乳糖酶，其中酶用量为0.75‰(重量份)，酶解时间2小时；灭菌过程中，操作参数选择如下在139℃下灭菌4s。
实施例10一种抑制低乳糖奶褐变的方法，其特征在于取一定量的牛奶，在pH为6.6、温度40℃的条件下，向牛奶中加入乳糖酶，其中酶用量为0.5‰(重量份)，酶解时间14小时；灭菌过程中，操作参数选择如下在139℃下灭菌4s。
实施例11一种抑制低乳糖奶褐变的方法，其特征在于取一定量的牛奶，在pH为6.8、温度40℃的条件下，向牛奶中加入乳糖酶，其中酶用量为0.5‰(重量份)，酶解时间14小时；灭菌过程中，操作参数选择如下在139℃下灭菌4s。本发明的效果如下经过本发明经过参数的选择，酶解的时间和参数，灭菌温度和水解率，抑制剂的选择，在经过大量的实验后，本发明人得到了最优参数，使得制备低乳糖奶的过程中，很好地抑制褐变，而且能达到预期的效果。
权利要求
1.一种抑制低乳糖奶褐变的方法，其特征在于取一定量的牛奶，在pH为6.6～6.8、温度8～9℃的条件下，向牛奶中加入乳糖酶，其中酶用量为0.5‰～0.75‰(重量份)，酶解时间14～8小时；灭菌过程中，操作参数选择如下在138-140℃下灭菌4.5-3.5s。
2.如权利要求1所说的抑制低乳糖奶褐变的方法，其中，在灭菌过程中加入抑制剂亚硫酸钠或半胱氨酸。
3.如权利要求1或2所说的抑制低乳糖奶褐变的方法，其中所说的酶解条件为37～40℃时，乳糖酶的用量为0.5‰～0.75‰(重量份)，酶解时间3～2小时。
4.如权利要求3所说的抑制低乳糖奶褐变的方法，其中所说的酶解条件为40℃，乳糖酶的用量为0.75‰(重量份)，酶解时间2小时。
5.如权利要求3所说的抑制低乳糖奶褐变的方法，其中所说的酶解条件为37℃，乳糖酶的用量为0.5‰(重量份)，酶解时间3小时。
6.如权利要求1或3所说的抑制低乳糖奶褐变的方法，其中，在139℃下灭菌4s。
7.一种无褐变低乳糖奶，其特征在于用权利要求1-6中任何一项所述方法来生产。
全文摘要
本发明涉及一种牛奶的处理方法以及用此方法得到的产品，具体的说，涉及一种抑制低乳糖奶褐变的方法及其产品。属于乳制品和乳品加工处理的领域。在pH为6.6～6.8、温度8～9℃的条件下，向牛奶中加入乳糖酶，其中酶用量为0.5‰～0.75‰，酶解时间14～8小时；灭菌过程中，操作参数选择如下在138－140℃下灭菌4.5－3.5s。同时，在灭菌过程中加入抑制剂A或B。处理后的牛奶，具有低乳糖的特性，同时抑制分解糖分的时候所产生的褐变，而且风味洁净和新鲜。
文档编号A23C9/152GK1631184SQ200310121748
公开日2005年6月29日 申请日期2003年12月22日 优先权日2003年12月22日
发明者李文, 张雪梅, 卢阳, 佘国庆, 吕加平, 陈历俊 申请人:北京三元食品股份有限公司