专利名称：生产l-谷氨酰胺的方法和生产l-谷氨酰胺的细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及属于棒状杆菌的产L-谷氨酰胺细菌，用于产生L-谷氨酰胺。本发明还涉及生产L-谷氨酰胺的方法。L-谷氨酰胺是在工业上有很多用途的氨基酸，可作为调味品的成分、肝功能提升试剂、氨基酸浸剂、复合氨基酸药物等等。
除了上述提到的基因，氨基酸杂志(Amino Acids，773-77，1963)中暗示了棒状杆菌中存在涉及L-谷氨酰胺降解的酶。然而，铵离子和低PH可抑制此酶的活性，因此在谷氨酰胺发酵过程中存在胺离子，酶很少起作用。
谷氨酰胺酶(谷氨酰胺氨基水解酶)是已经报道了编码谷氨酰胺酶的基因有Pseudomonas细菌(FEMS Microbol.Lett.，178(2)，327-325，1999)、米曲霉(Appl.Microbiol.Biotechnol.，54，59 68，2000)、Rhizobium etli(Biochim.Biophys.Acta，1444(3)，451-6，1999)、大鼠(J.Biol.Chem，266(28)，18792-18796，1991)等。另外报道在大肠杆菌中也存在谷氨酰胺酶活性(J.Biol.Chem，243(5)，853-878，1968)。但是，还没有在棒状杆菌中分离出谷氨酰胺酶基因，关于此基因的任何有效突变对谷氨酰胺产量的影响也未可知。
通过修饰目的基因的起始序列来增强基因表达的方法是已知的(日本专利特开(Kokai)No.2000-818935)。现在已知棒状杆菌的编码谷氨酰胺合成酶“glnA”)的基因(FEMS Microbiology Letters，154，81-88，1997)。而且已经分离出包括起始位点的基因翻译起始区域(FEMS Microbiology Letters，205，361-367，2001)。然而以前没有修饰起始位点来增强谷氨酰胺合成酶基因的表达的描述。
在发酵生产L-氨基酸中经常使用提高微生物的方法。也就是说，既然野生微生物L-氨基酸的产量都非常的低，那么通过突变产生自养或者类似抗性、提高代谢调节或者两者相结合。尽管通过这些方法都可以产生L-谷氨酰胺，目前的现有技术需要提要发酵产量以便有效而且经济的生产L-谷氨酰胺发明概述本发明的发明人经过刻苦的研究获得了本发明。本发明涉及棒状杆菌中的一个新基因，以及利用重组技术提高L-谷氨酰胺产量的方法。首先，分离编码谷氨酰胺酶的基因，同时发现在谷氨酰胺酶活性降低的菌株中L-谷氨酰胺的产生能力优于那些谷氨酰胺酶活性与野生菌相似的菌株。进一步发现降低谷氨酰胺酶活性的同时增强谷氨酰胺合成酶的活性更加有利于L-谷氨酰胺的产生。
本发明的目的是通过降低L-谷氨酰胺的降解来提高棒状杆菌产L-谷氨酰胺的能力，因而提供利用这样特性的菌株来生产L-谷氨酰胺的方法。
本发明进一步的目的是提供具有L-谷氨酰胺产生能力并且经过修饰以使胞内谷氨酰胺酶活性降低的棒状杆菌。
本发明进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中是通过断裂染色体上的谷氨酰胺酶基因的方法降低胞内谷氨酰胺酶活性。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中谷氨酰胺酶活性约0.1U/mg细胞蛋白。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中当测定每单位质量细胞蛋白的酶活性时，谷氨酰胺酶活性与谷氨酰胺合成酶的活性相似或更低。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中进一步修饰增强谷氨酰胺合成酶活性。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中通过提高谷氨酰胺合成酶基因的表达来增强谷氨酰胺合成酶活性。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，通过增加编码谷氨酰胺合成酶基因的拷贝数或者修饰编码谷氨酰胺合成酶基因的翻译调控区来增强谷氨酰胺合成酶基因的表达，这样增强细菌基因的表达。
本发明更进一步的目的是提供一种生产L-谷氨酰胺的方法，包括在培养基中培养上面所述的细菌以产生L-谷氨酰胺，并且从培养物中收集L-谷氨酰胺。
本发明更进一步的目的是提供一种棒状杆菌的谷氨酰胺合成酶基因，其中基因的-35区(region)的序列替换成TrGCCA，-10区的序列替换成TATAAT。
根据本发明，棒状杆菌的产L-谷氨酰胺的能力增强，因而有效而低成本的获得高产量的L-谷氨酰胺。
图1含谷氨酰胺酶基因的质粒pHMKGLS5的构建图2在棒状杆菌中无自我复制位点的质粒pNEL的构建图3含断裂的gls的质粒pNELAgls的构建图4含增强表达的GS基因的质粒pNELglnA14的构建优选实施方案详述本发明的棒状杆菌在本发明中，棒状杆菌包括但不限于被划分为短杆菌属和棒状杆菌属的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255，(1981))，这两个菌属的关系非常接近。这样的棒状杆菌包括嗜乙酰乙酸棒状杆菌，醋谷棒状杆菌，Corynebacteriumalkanolyticum，美棒状杆菌，谷氨酸棒状杆菌，百合花棒状杆菌，Corynebacteriummelassecola，Corynebacterium thermoaminogenes，力士棒状杆菌，分支短杆菌，黄色短杆菌，Brevibacterium immariophilum，乳发酵短杆菌，玫瑰色短杆菌，解糖短杆菌，生硫短杆菌，产氨短杆菌，白色短杆菌，蜡状短杆菌，嗜氨微杆菌。
具体的说，包括了以下菌株嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870醋谷棒状杆菌ATCC15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511美棒状杆菌ATCC15991百合花棒状杆菌ATCC13020，13032，13060分支短杆菌ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965CorynebacteriumthermoaminogenesAJ12340(FERMBP-1539)力士棒状杆菌ATCC13868谷氨酸棒状杆菌ATCC14020黄色短杆菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳发酵短杆菌ATCC13869玫瑰色短杆菌ATCC13825解糖短杆菌ATCC14066生硫短杆菌ATCC19240产氨短杆菌ATCC6871，ATCC6872白色短杆菌ATCC15111蜡状短杆菌ATCC15112嗜氨微杆菌ATCC15354。
这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心获得。每个菌株有其指定的保藏号，根据这个保藏号可以请求提供所需的菌株。美国典型培养物保藏中心的目录中标明了每个菌株的保藏号。菌株AJ12340于1987年10月27日保藏于国家生命科学和人体技术研究院工业科学技术研究所(现在，独立的行政机构，国家高级工业科学和技术研究院，国际专利生物保藏中心(Tsukuba cebtral6，1-1，higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编305-5466))作为根据布达佩斯条约进行的国际保藏，保藏号为FERM BP-1539。菌株AJ12418于1989年1月5日保藏于国家生命科学和人体技术研究院工业科学技术研究所，作为根据布达佩斯条约进行的国际保藏，保藏号为FERM BP-2205。
在本发明中，“产L-谷氨酰胺的能力”是指当在培养基中培养本发明的棒状杆菌时该细菌在该培养基中积累L-谷氨酰胺的能力。这种产L-谷氨酰胺的能力是野生型棒状杆菌的特性，或者可以通过增殖被给予或增强。
为了通过增殖给予或增强产L-谷氨酰胺的能力，可以使用以下的方法获得6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性菌株的方法(日本专利特开No.3-232497)，获得嘌呤类似物和/或甲硫氨酸亚砜抗性菌株的方法(日本专利特开No.61-202694)，获得α-酮丙二酸抗性的方法(日本专利特开No.56-151495)，获得对含谷氨酸的肽的抗性的方法(日本专利特开No.2-186994)等等。具有产L-谷氨酰胺能力的棒状杆菌的具体实例包括但不限于黄色短杆菌AJ11573(FERMP-5492，参见日本专利特开No.56-151495)黄色短杆菌AJ12210(FERMP-8123，参见日本专利特开No.61-202694)黄色短杆菌AJ12212(FERMP-8123，参见日本专利特开No.61-202694)
黄色短杆菌AJ12418(FERM P-2205，参见日本专利特开No.2-186994)黄色短杆菌DH18(FERM P-11116，参见日本专利特开No.3-232497)Corynebacterium melassecola DH344(FERM P-11117，参见日本专利特开No.3-232497)谷氨酸棒杆菌AJ11574(FERMP-5493，参见日本专利特开No.56-151495)另外，本发明的谷氨酸棒杆菌经过修饰以致其细胞内谷氨酰胺酶活性降低。“谷氨酰胺酶活性”(即GLS活性)是指酶催化L-谷氨酰胺转化成L-谷氨酸的能力。GLS活性可通过下述方法或其他已知的方法测定。
将棒状杆菌的粗制酶溶液中加入含100mMTris-HCl(pH8.0)和75mM L-谷氨酰胺的溶液中，30℃反应30或60分钟，然后向反应混合物中加入SDS至终浓度为0.5％以终止反应，测定产生的L-谷氨酸的量。本发明中，在上述反应体系中每分钟产生1μmol谷氨酸的谷氨酰胺酶活力定义为1U。粗制酶溶液中的蛋白的量也可根据已知的方法例如“Bio-Rad”法测定，以牛血清蛋白作为标准品。在本文中，GLS活性/mg蛋白以“U/mg”表示。
上述的粗制酶溶液可用以下方法制备。首先，制备细胞。所用培养基含30g葡萄塘，1.5g KH2PO4，0.4g MgSO4·7H2O，0.01g FeSO4.7H2O，100μg VB1·HCl，，3μg生物素，200mg大豆蛋白水解物，1.5g尿素，0.02ml消泡剂GD-113，加纯水至1L(用NaOH调节pH6.8)。取20ml培养基加入500ml摇瓶中，高压蒸汽115℃灭菌10分钟，然后在31.5℃，115rpm振荡培养菌株细胞。培养基中糖类被完全利用之前结束培养，并立即冷却培养液。冷冻离心从培养液中分离细胞，用100mMTris-HCL(pH8.0)洗涤，超声波破碎细胞。15000g离心15分钟除去未裂解的细胞，就得到粗制酶溶液。该溶液使用前置于冰上保存。
根据上述方法，测定了已知的具有产L-谷氨酰胺能力的细菌的GLS活性，结果列于表8。
术语“修饰以致细胞内谷氨酰胺活性降低”是指棒状杆菌经过修饰使每个细胞的GLS活性低于野生型或非修饰的棒状杆菌。实例包括每个细胞中GLS(谷氨酰胺酶)分子的数量减少或每个GLS分子的活性降低等等。术语“降低”也包括活性的完全消失。作为对照的野生型或非修饰的棒状杆菌，例如黄色短杆菌ATCC14067，由于GLS活性降低，使培养基中L-谷氨酰胺的积累量增加，副产物L-谷氨酸的量减少。
与野生型或非修饰的棒状杆菌相比，本发明棒状杆菌的GLS活性显著降低。按照前文所述的测量方法测得GLS活力水平降至0.1U/mg或更低，优选0.02U/mg或更低，更优选降至0.01U/mg或更低。然而，本发明中GLS活性水平并不限于0.01U/mg或更低水平。
虽然以前没有确定棒状杆菌中编码GLS的基因，本发明提供了一种从黄色短杆菌中分离得到的基因。根据公开的谷氨酸棒杆菌的基因组序列，寻找其与Rhizobium bacterium中已知的GLS基因(Biochim.Biophys.Acta，1444(3)451-6，Mar.19，1999)同源的基因，该基因即为谷氨酸棒杆菌的GLS基因。根据谷氨酸棒杆菌的推定GLS基因序列，从黄色短杆菌中也分离到GLS基因，并且该基因与Rhizobium bacterium的GLS基因同源。gls基因可通过PCR方法获得(见White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185，(1989))，以例如SEQ ID NOS5和6所示序列为引物，棒状杆菌染色体DNA为模板。其他微生物中编码GLS的基因可以用类似的方法获得。按照这种方法获得的黄色短杆菌ATCC14067的gls基因的核酸序列如SEQ ID NO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
采用Saito和Miura的方法从作为DNA供体的细菌中制备染色体DNA(见H.Saito和K.Miura，Bioehem.Biophys.Acta，72，619(1963)，《生物工程实验手册》生物科学和生物工程协会主编，日本，97-98页，Baifukan，1992)。
降低棒状杆菌GLS活性的方法有紫外线照射或用诱变剂处理细菌，筛选突变菌株。能用于本发明的诱变剂有N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸。除了使用诱变剂，还可以用基因断裂的方法获得GLS活性降低的棒状杆菌。即，用含有缺失了部分序列的gls基因的DNA转化棒状杆菌，该gls基因的部分序列被删除了以致GLS的功能被破坏(缺失型gls基因)。随后发生的的缺失型gls基因与染色体gls基因的重组断裂了染色体gls基因。这种通过同源重组发生基因取代导致的基因断裂是已知的，利用线性DNA和含温度敏感复制起始点质粒来断裂基因的方法也是已知的。
将表达调控序列例如gls基因启动子替换为一个较弱的启动子也能降低GLS的活性(日本专利特开NO.2000-818935)。可联合使用诱变和断裂基因的方法。
采用如下方法将宿主染色体gls基因替换为缺失型gls基因。通过插入温度敏感复制起始点、缺失型gls基因和抗药标记基因如抗氯霉素基因制备重组DNA，然后用该重组DNA转化棒状杆菌。在含药物的培养基中培养转化体，而此时温度敏感复制起始点不起作用，结果获得了染色体DNA整合了重组DNA的转化体。
可采用任意一种已知的转化方法将上述重组DNA导入棒状杆菌中。例如用CaCL2处理受体细胞以增加细胞对DNA的通透性，这一方法已报道用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。用对数生长期细胞制备感受态细胞，将DNA导入其中，这一方法已报道用于枯草杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，GA.和Young，F.E.，基因，1，153，(1977))。或者制备易于接受重组DNA的原生质体型DNA受体细胞，再将重组DNA转化到该DNA受体细胞中。这种方法已应用于枯草杆菌，放线菌和酵母中(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，OA.，Nature，274，398，(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。还可采用电穿孔的方法制备棒状杆菌转化体(Sugimoto et al.，日本专利特开No.2-207791)。
棒状杆菌的温度敏感质粒包括但不限于p48K和pSFKT2(见日本专利特开No.2000-262288)，pHSC4(见法国专利
发明者中村纯, 秋山嘉代, 代 申请人:味之素株式会社