专利名称：用于迁移以及特定于键分离带电分子的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特别是在利用两个测量电极之间的氧化还原循环过程运行DNA传感器时，在水状溶剂中迁移以及特定于键分离带电分子的方法。此外，本发明还涉及一种有关的装置。
背景技术：
在众多的分子生物学方法中，带电粒子在电场中的迁移具有重要的作用。在此，带电粒子在流体介质中的扩散速度v与电场强度E和离子电荷Q成正比，而与粒子半径r和悬浮物的粘度η成反比。速度v由下式给出v＝QE/6πrη (1)例如，在电泳中就其大小和/或电荷来说不同的生物分子(如主要是蛋白质和DNA)相互分离。在电泳分离的特定形式下(例如等电子聚焦)要避免其它运动的带电粒子的存在，因为否则的话电荷迁移部分地或全部地由这些粒子进行，而不是由待分离的分子进行。因此，作为缓冲物质经常采用其等电点在期望pH值上的氨基酸。也就是说，在设定的pH值下缓冲分子本身不具有净电荷并因此不进行迁移。
在带电分子迁移时(例如为了提高或者降低确定位置的浓度)也施加电场。特别是在例如用于DNA分析的微传感器中，如果待检测的DNA片段(目标分子)集中在俘获分子(传感器表面)上的话，则可以提高灵敏度。按照质量作用定律，俘获/目标分子键的数目随之增加。但是无论如何，在这种反应中不仅建立了精确地相互匹配的俘获/目标分子对，而且还建立了其序列不与一些位置精确对应的俘获/目标分子对(失配)。
因为键能量的大小随着不对应的基底(Basen)数目而减小，可以通过使用对应的力有选择地再次分离具有一定失配数目的键(紧缩处理Stringenzbehandlung)。在此，与集中分子的第一过程相反而具有反向极性的电场可以起到力的作用。
带电粒子在电场中迁移的前提条件是，磁场梯度在电解液或者说迁移路段的内部严格单调地展开。也就是说，磁场梯度的符号不允许改变并且磁场强度也不能是零。为此，对于水状系统施加一个任意的电压不是必然足够的。在电极前不存在化学反应的条件下，电化学偶层上的电压降低并且电极间的场梯度变为零。不过，如果在电极上发生还原以及氧化反应，则该电极前的偶层被去极化，而电场在电解液的内部严格单调地展开。其结果是在水状电解液中的离子发生迁移。
一种经常使用的、在水状系统中产生这种电场的方法是，对水施加分解电压。在此，在阳极形成氧而在阴极形成氢。在试验性实施中必须注意，气体以及特别是其基本的前级(die radikalischeVorstufen)不能与待检查的分子接触，因为否则的话后者要起化学变化。在宏观的系统中，这通过将紧靠电极的电解空间与电极之间的电解空间进行分离来实现，例如通过隔膜。对于微传感器该方案有问题，因为隔膜不实用。
在微型系统中电泳的方法在于，在电极前引入由亲水聚合物制成的所谓的渗透层，为此可参看US 5605662A。在这些层中水电解液的反应物和待迁移的DNA的运动性被极大地延缓，使得几乎不发生混合。渗透层中的电荷迁移由更小的离子进行。
尽管该公知的方法是可行的，但是由于引入新的聚合物层而使得微传感器芯片的制造花费明显更多并因此更昂贵。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是，提供一种借助于电场迁移带电分子的适当方法，其中在电极上不形成氢和氧。特别是在利用电泳方法的条件下提供一种对应的装置，该装置只需具有标准的材料和芯片制造的层。
上述技术问题就方法而言是通过权利要求1或者权利要求12的特征解决的。在权利要求15中给出了所属的装置。该方法或者装置的扩展是各个从属权利要求的内容。
在按照本发明的装置中可以利用原理上相同的结构可选择地实施按照权利要求1的本发明发或者按照权利要求12的本发明的方法。在此，特别优选的也可以例如周期地相互结合两种方法。
本发明在应用电泳方法的条件下利用了为了在分析溶液中产生电场除了水的电解之外也可以施加其它反应。按照本发明，建议将一种金属/金属离子化合物(例如铜/铜组氨酸化合物)作为电极前的去极化物质。这样，在为了聚集带有负电的离子而对镀有铜的电极进行正极化时不形成氧，而是铜作为离子进入溶液。如果溶液中存在该金属的化合物成分、例如对于铜是组氨酸，则该金属离子稳定地存在于溶液中。因为例如铜组氨酸化合物非常稳定，自由铜离子的浓度非常低并接近于常数。由此，避免了铜离子对DNA混合的影响。
如果要负极化电极，以便提高对俘获/目标分子键(紧缩处理)的选择性，即，从俘获DNA中分离非专门附着的、非互补的试验DNA，则在存在充分的贵重金属(例如铜)的金属离子化合物的条件下，金属离子减少并在此过程中在电极上(在测量电极的情况下)离析。由此避免了形成氢。该金属离子的化合物成分也可以同时起到缓冲物的作用。例如，在pH＝7的条件下将组氨酸用作缓冲物。在测量电极上离析的铜可以在一个清洗步骤中通过重新施加负电平而被清除。这样来避免对目标分子的破坏，即，使用具有较高离子强度的清洗溶液，使得例如仅仅清除按照Cu2+离子形式的铜，而不移动目标DNA。
基于金属/金属离子化合物的电泳方法的优点在于，用于产生电场所必须的电压较低。其低于水的电解电压，使得可以不形成水电解的腐蚀性的产品。由此，电解空间和电泳空间的分离变得不需要了。尽管如此所产生的场也足以在分析物中迁移所希望的分子。
目前，铜已经被用于印刷板线路并且可以经常作为电极材料用于传感器以及诸如微电泳的微系统技术。因此，在制造这种微系统时可以利用半导体技术的廉价的标准方法。
本发明的其它细节和优点借助于附图由下面对优选实施方式的描述给出。图中图1表示用于实施本发明方法的原理结构，图2至4表示不同构成的装置的断面图，图5a和5b表示按照本发明的方法在按照图3的装置中目标分子从较低的浓度到达较高的浓度，图6a和6b表示按照本发明的方法的图5b的一种情形，但是其中也出现了经历所谓紧缩处理的非专门的、即非互补的试验DNA，图7表示在按照本发明使用牺牲电极(Opferelektrode)以及化合物成分的条件下的电极过程，图8至10表示不同测量电极配置的俯视图，图11按照断面图示出了具有相邻设置的测量位置的测量装置，和图12表示由对应于图8的单个位置构成的阵列的俯视图。
具体实施例方式
图1示出了用于实施生物化学测量的一般装置的原理结构。1表示例如由硅制成的板状基底，在其上设置了例如由氧化硅(SiO2)制成的薄绝缘层2。在该装置上有两个测量电极20和30，它们优选地由贵重金属(特别是金)制成。整个测量装置与水状溶剂15接触。
在水状溶剂15中存在带有负电的大分子，这在图1中通过线球结构表明，并且在后面图5中分别利用200、200′进行标记。带有负电的分子应该向测量电极20、30迁移并且在后面也被称为目标分子。在DNA分析的情况下目标分子是待检查的DNA。通过例如可以固定在水凝胶层35中的俘获分子，可以使目标DNA为了测量而聚集在电极20、30附近。
在水状溶剂15中还存在一种在水状溶剂中稳定且不如测量电极的金属那么贵重的材料。在通常情况下，该材料是金属/金属离子(Me/Me+)化合物，例如Cu/Cu2+。这意味着，根据预定的电位关系，要么在给出两个电子的条件下释放金属铜Cu0，要么在接收两个电子的条件下离析出铜(II)离子Cu2+，其中以下等式成立(2)在按照图5的装置中，在铜电极作为牺牲阳极40的条件下可以通过施加正电位而溶解为Cu2+。由此，在那里负的目标分子200向铜电极40移动并且在其附近以及因此也在测量电极20、30的区域中聚集。
只要在水状溶剂中存在Cu2+离子的条件下在图6的测量电极20、30上施加适当的负电位，则触发了这样的俘获分子/目标DNA条件，其由于不完全的互补性而具有减小的束缚强度。在此，在测量电极上的铜(II)离子(Cu2+)同时减小为金属铜(Cu0)。
借助图5a、5b和6a、6b以及图7表明了按照在图1中仅仅原理性示出的方案的方法过程。特别是，在图5a至6b中通过具有传感器表面21和31的测量电极20和30分别设置了水凝胶层35，在该水凝胶层锁定了用于位于水凝胶层35外部的目标分子200的俘获分子100。在此重要的是，俘获分子100俘获或者束缚目标分子200，并由此进行对传感器表面21以及31的分析。对于该方法例如参见本发明申请人以前的专利申请PCT/DE02/01982。
俘获分子100例如可以是专门的用硫醇修改的低聚核苷酸。应该由俘获分子100束缚的目标分子200是待分析的DNA。
一般地，在已知的测量装置中出现按照图5a的状态，其中目标DNA仅仅以较低的浓度出现在俘获DNA上。其中难以得到可靠的测量结果。反之，在按照图5b的装置中目标DNA以较高的浓度出现在俘获DNA上，这点通过DNA的聚积而得到。在该状态下可以得到良好的测量结果。
根据图6a，俘获DNA除了束缚互补的目标DNA 200之外，还束缚了不完全互补的DNA片段200′。通过紧缩处理可以通过为电极分别施加适当的电位而有选择性地清除非特定束缚的DNA。然后，非特定束缚的DNA由于其较弱的结合力而被分离。
由图1以及附图5a和5b可以看出，通过在辅助选择电极40上施加特殊电位实现了所希望的目标DNA的聚积。为此，具体地选择由非贵重金属(例如铜)制成的辅助选择电极40，并且在辅助选择电极40上施加正电压。只要整个装置位于水状溶剂中，则Cu2+离子进入溶剂。由此，形成了一种场梯度并吸引带有负电的DNA分子。
后者的过程基本上通过图7说明。这里，尤其可以看出对进入溶剂的铜离子进行了化合，为此使用了组氨酸分子70。
由图1以及附图6a和6b可以看出，通过在测量电极20、30和辅助选择电极40、45上施加特殊电位实现了所希望的DNA的选择。具体地说，将测量电极负极化，而将辅助选择电极正极化。只要整个装置位于包含铜(II)离子(Cu2+)的水状溶剂中，则这些离子在测量电极20、30上就减小为金属铜(Cu0)。由此，形成了场梯度并将带有负电的、不完全互补的DNA分子分离开来。
两种方案可以单独或者组合地进行。首先聚集目标分子，然后再进行选择。不过，也可以仅仅进行选择。
图2至4示出了传感器装置的不同实施方式。在图2中由金制成的测量电极20、30具有自由的金传感器面21、31，在该传感器面上束缚了俘获DNA 100。或者，在图3中设置了包含有俘获DNA 100的水凝胶35。特别是在图4中示出了一种装置，其中除了实际的测量电极20和30之外还具有由金制成的自由反应面50，在该自由反应面上按照密集的结构束缚了俘获DNA 100。这种装置具有俘获DNA密度高的优点。但是，在制造反应面50时必须首先用铜或类似物来覆盖测量电极20、30，以防止俘获DNA 100聚集在该电极上。为此，在图4中设置了铜层22以及32。在按照图2至4的所有装置中分别将牺牲电极40设置在测量电极20和30的附近，以便通过使铜进入溶剂而建立场梯度，并由此起到将目标DNA 200聚集到测量电极20和30附近的作用。由此，结果可以极大地改善测量精度。
在图8至10按照俯视图示出了按照图2至4的测量传感器的不同方案。特别是在图8中具有一个测量传感器80，其由两个带有相互咬合的电极针的梳形电极82和83组成，其中将唯一的牺牲电极84围绕该梳形电极地环形设置。
相应地由图9给出，其中利用水凝胶层85覆盖了梳形电极的区域。这种水凝胶层可以处在整个测量装置之上。特别是在图10中还额外地具有用于聚集俘获分子的反应面86。
由按照图8至10的各个传感器可以设计出具有n行和m列的阵列。在图11和12中示出了具有n·m阵列的多行测量传感器80，80’，…的完整装置。在此，原理上可以利用对应于图8至10之一的单个位置来构成该阵列，其中每个位置具有一个环形的牺牲电极84。在此，作为另一个环，将辅助选择电极185围绕着带有该单个位置的整个m·n装置来设置。
按照图11整个装置180位于一个容器中，例如流通的管道150中，其具有一个盖子120、一个流入口121和一个流出口122。
权利要求
1.一种特别是在利用两个测量电极之间的氧化还原循环过程运行DNA传感器时，在水状溶剂中迁移带电分子的方法，其特征在于下列措施-在测量电极的附近设置一种金属材料作为可以加载电压的电极，该金属材料在水状电解液中稳定且不如测量电极那么贵重，-通过在所述电极上施加正电位而使得金属材料作为正离子进入溶剂，-由此将带有负电的分子作为目标分子按照相反的方向迁移并且聚集在所述测量电极上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将进入到溶剂中的金属离子通过存在的化合物成分进行化合，由此保持其浓度很低并接近于常数。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，作为金属材料使用构成铜牺牲电极的铜。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，作为用于化合铜离子的化合物成分使用组氨酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，为了检测所述目标分子在电极表面使用俘获分子。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，作为俘获分子使用经过硫醇修改的俘获分子。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，作为俘获分子使用水凝胶束缚的俘获分子。
8.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，实施一种电泳方法。
9.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，对DNA片段进行DNA分析。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述DNA分析中将聚集的分子作为目标分子进行检测。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，通过极化用于电泳以及DNA分析的电极来提高过程的选择性。
12.一种特别是在利用两个测量电极之间的氧化还原循环过程运行DNA传感器时，在水状溶剂中特定于键分离带电分子的方法，其特征在于下列措施-在水状溶剂中存在金属离子，-通过在测量电极上施加负电位而在作为金属的测量电极上离析出金属离子，-由此将带有负电的、束缚在测量电极附近的分子作为带有足够低键能量的目标分子从测量电极迁移出去。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，作为所述金属离子使用铜，以及作为所述测量电极使用金。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述从测量电极迁移出去的分子是这样的目标分子，其在DNA分析中不应该被检测。
15.一种用于实施按照权利要求1或者按照权利要求2至10中任一项的方法、以及用于实施按照权利要求12或者按照权利要求13，14中任一项的方法的设备，其具有由用于在水状溶剂(15)中进行电化学测量的测量电极(20，30)构成的装置，其中，在该水状溶剂中存在由不如测量电极(20，30)那么贵重的材料制成的金属的金属离子以及金属群(40)，该材料在所述水状溶剂(15)中是稳定的。
16.根据权利要求15所述的设备，其特征在于，所述测量电极(20，30)由贵重金属、特别是金制成。
17.根据权利要求15所述的设备，其特征在于，所述金属是铜并构成牺牲电极(40)。
18.根据权利要求16所述的设备，其特征在于，所述由金构成的测量电极具有传感器表面(21，31)，在该传感器表面上束缚着用于目标DNA(200)的俘获分子。
19.根据权利要求15、16或18所述的设备，其特征在于，所述测量电极(20，30)构成一个由带有相互咬合的电极针的梳形电极(82，83)组成的交叉指型结构。
20.根据权利要求17所述的设备，其特征在于，所述牺牲电极(40)围绕所述梳形电极(82，83)环形地设置。
21.根据权利要求15所述的设备，其特征在于，在所述测量电极(20，30)上设置用于束缚俘获分子(100)的水凝胶层(35)。
22.根据权利要求15所述的设备，其特征在于，为所述测量电极(20，30)设置单独的反应面(50)，以便聚集俘获分子(100)。
23.根据权利要求19所述的设备，其特征在于，由带有牺牲电极(84)的单个交叉指型结构(80，80′，...)构成具有m行和n列的阵列。
24.根据权利要求23所述的设备，其特征在于，与所述单个牺牲电极(84)搭配的辅助选择电极(185)环形地围绕着所述m·n阵列(180)。
全文摘要
为了实现DNA传感器必须对带电的分子进行迁移。按照本发明实现了下列措施将不贵重的金属作为正离子加入到溶剂中，由此将带有负电的分子向相反的方向迁移并且聚集在测量电极上。通过由溶剂中的金属离子聚集在测量电极上而形成金属层，可以在预先给定适当电位的条件下实现带电分子特定于键的分离。由此，特别是可以将目标DNA置于测量电极的俘获分子的附近，并且也排除非特别束缚的DNA。在对应的设备中为测量电极装置(20，30)设置了一个由不如测量电极(20，30)的材料那么贵重的金属制成的牺牲电极(40)。测量电极(20，30)由贵重金属、优选为金组成，而牺牲电极(40)由铜构成。
文档编号C12Q1/68GK1720454SQ200380104842
公开日2006年1月11日 申请日期2003年11月28日 优先权日2002年12月2日
发明者海克·巴拉格, 沃尔特·冈布雷赫特, 曼弗雷德·斯坦泽尔 申请人:西门子公司