专利名称：细胞为基础的vegf释放的制作方法
技术领域：
本发明涉及刺激干细胞分化的方法，特别涉及利用细胞为基础的VEGF释放来刺激干细胞分化的方法。
背景技术：
治疗性血管再生提供了治疗缺血性心肌病和其它缺血性综合症的可能性。已经证明，在一些动物模型和不适合冠状血管再生的患者中的人体实验性试验中，治疗性血管再生对于缺血心脏病的治疗是有效的。在人体试验中检测的血管因子包括FGF-1、FGF-2和FGF-4以及一些VEGF的多种同型异构体。Freedman，S.B.& Isner，J.M.，Ann Intern Med 2002；136(1)54-71。理想的血管再生治疗的传输方法仍有待于确定。持续和无规律的血管内皮生长因子(VEGF)的产生在动物模型中产生不恰当的影响，因此，试图最小化系统作用的局部和瞬间表达是理想的。Lee et al.，Circulation 2000；102(8)898-901。
在临床人群中进行的用于传输血管因子的策略研究包括通过静脉内或动脉内注射的蛋白传输；腺病毒的冠状动脉内注射；或蛋白、裸DNA或用于编码血管生成基因产物的腺病毒的直接的心肌内注射。参见Udelson，J.E.，et al.，Circulation 2000；102(14)1605-1610.Simons，M.，etal.，Chronos NA.Circulation 2002；105(7)788-793.Grines，C.L.，et al.Circulation 2002；105(11)1291-1297.Laham，R.J.，et al.，Circulation 1999；100(18)1865-1871.Vale，P.R.，et al.，Circulation 2001；103(17)2138-2143.Rosengart T.K.，et al.Circulation 1999；100(5)468-474。
VEGF蛋白的冠状内传输策略被系统毒性限制，其包括对心肌再血管化所需高剂量的反应发展而来的高血压，参见Hariawala M.D.，et al.，J.Surg.Res.1996；63(1)77-82.Lopez，J.J.，et al.Am.J.Physiol.1997；273(3 Pt 2)H1317-H1323。由于循环核酸酶的快速降解作用，需要直接心肌注射裸DNA。
发明概述本发明的一个方面涉及缺血损伤组织中刺激干细胞分化的方法。所述的缺血损伤组织含有第一浓度的干细胞和第一浓度的VEGF。在此方法中，能够将所述的缺血损伤组织中的VEGF浓度从第一浓度增加到第二浓度。能够将所述的缺血损伤组织中的干细胞浓度从第一浓度增加到第二浓度。当所述的缺血损伤组织中的VEGF浓度增加时，所述的干细胞浓度能够同时增加。
根据本发明的另一方面，所述的干细胞的数量可以通过给予能够引起干细胞从骨髓动员到所述缺血损伤组织的外周血中的试剂或注射干细胞到所述外周血中来增加。在本发明优选的部分中，所述的引起干细胞从所述骨髓动员到所述外周血中的试剂选自细胞因子、趋化因子(chemokines)和化疗试剂。在更优先的部分中，所述的试剂包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
根据本发明的另一方面，增加VEGF浓度的步骤包括在所述的缺血损伤组织中作用细胞使其表达VEGF。利用基因治疗，所述的细胞能够被作用而表达VEGF。优选的基因治疗方法可包括利用表达载体转染所述的细胞。所述的表达载体可含有编码VEGF的核酸。
根据本发明的另一方面，所述的被作用使其表达VEGF的细胞包括经用于再回输的体外培养并被介入到所述的缺血损伤组织中的细胞。该培养细胞可包括自体同源细胞，其在培养前收集自欲进行治疗的个体。另一方面，所述的被作用使其表达VEGF的细胞包括所述缺血损伤组织中的天然细胞。
根据本发明的另一方面，所述的缺血损伤组织能够含有第一浓度的SDF-1，在增加所述缺血损伤组织中VEGF浓度的同时，所述缺血损伤组织中的SDF-1浓度能够从所述的第一浓度增加到第二浓度。通过作用所述的缺血损伤组织中的细胞使其表达SDF-1，能够增加所述的缺血损伤组织中SDF-1的浓度。
根据本发明的另一方面，通过向所述细胞中介入表达载体能够作用所述细胞使其表达SDF-1，所述的表达载体能够包括编码SDF-1的核酸。所述的被作用而表达SDF-1的细胞能够包括用于再回输的体外培养后并介入到所述缺血损伤组织中的细胞。所述的被作用而表达SDF-1的细胞能够进一步包括自体同源细胞，其在培养前收集自欲进行治疗的个体。可选择地，所述的被作用表达SDF-1的细胞能够包括缺血损伤组织中的天然细胞。
根据本发明的另一方面，所述的在所述缺血组织中被作用表达VEGF的细胞还可进一步在所述缺血组织中被作用表达SDF-1。通过介入表达载体到所述的细胞能够作用所述细胞使其表达SDF-1。所述表达载体可包括编码VEGF的核酸。
本发明的另一方面涉及在梗塞的心肌中刺激干细胞分化的方法。在此方法中，能够介导细胞进入所述的梗塞心肌中。所述的细胞被作用在所述的梗塞心肌中表达VEGF。能够给予引起所述干细胞从骨髓动员到所述梗塞心肌的外周血的试剂。当所述的VEGF在所述的梗塞心肌中表达时，所述的干细胞同时从所述骨髓被动员到所述外周血中。
在本发明的另一方面，所述的引起干细胞从所述骨髓动员到所述外周血的试剂选自细胞因子、趋化因子和化疗试剂。优选地，所述的试剂能够包括包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
根据本发明的另一方面，利用基因治疗，所述细胞能被作用使其在所述梗塞心肌中表达VEGF。所述的基因治疗能够包括利用表达载体作用所述细胞使其表达VEGF，所述的表达载体能够包括编码VEGF的核酸。
根据本发明的另一方面，在所述梗塞心肌中表达VEGF的所述细胞能够包括在介入所述梗塞心肌中之前用于再回输的体外培养的细胞。在另一方面，所述的被作用而表达VEGF的细胞能够包括自体同源细胞，其在培养前收集自欲进行治疗的个体。
根据本发明的另一方面，所述的梗塞心肌能够含有第一浓度的VEGF。所述的被作用使其表达VEGF的细胞能够在所述缺血损伤组织中将所述VEGF的浓度从第一浓度增加到第二浓度。
根据本发明的另一方面，所述的被作用在所述梗塞心肌中表达VEGF的细胞还可进一步被作用在所述梗塞心肌中表达SDF-1。通过介入表达载体到所述的细胞来作用所述细胞使其表达SDF-1。所述表达载体包括编码SDF-1的核酸。
本发明的另一方面涉及在梗塞的心肌中刺激干细胞分化来促进该梗塞心肌组织再生的方法。在此方法中，能够将骨骼肌成肌细胞(skeletalmyoblast)介入到所述梗塞心肌中，所述的骨骼肌成肌细胞能够被表达载体转染从而在所述梗塞心肌中表达VEGF。能够给予使干细胞从骨髓动员到所述梗塞心肌外周血的集落刺激因子。在所述的梗塞心肌中所述VEGF被表达的同时，所述的干细胞能够从所述骨髓中动员到所述外周血中。所述的从所述骨髓动员的干细胞可分化为心肌细胞。
附图简要说明通过阅读本发明以下的说明并参考相关的附图，本发明进一步的特征对于本发明相关领域所属的技术人员是显而易见的
图1(a和b)所示分别为给予盐水或G-CSF 4周后(LAD结扎后12周)梗塞区域中BrdU阳性细胞数量(a)和缩短分数(b)。
图2(a和b)所示为骨骼肌成肌细胞(SKMB)移植在细胞移植4周后(LAD结扎后12周)对梗塞区域中BrdU+细胞计数的作用。
图3(a和b)所示为BrdU给药5天后针对BrdU染色的骨髓(a)及未处理的心肌(b)的照片。
图3c所示为通过本发明治疗评价的梗塞区域中增加的BrdU+细胞。
图4所示为显示基质衍生因子-1(SDF-1)表达作为心肌梗塞后的时间函数的RT-PCR的照片。
图5(a和b)所示为经稳定转染或未转染SDF-1表达载体的心肌成纤维细胞在移植4周后、及在心肌成纤维细胞移植后进行或未进行5天的G-CSF给药，梗塞区域中BrdU+细胞数(a)和CD 117+细胞数(b)。
图5c所示为经SDF-1/G-CSF处理动物CD 117+染色的照片。
图6(a和b)所示为梗塞区域的免疫组织化学照片，其显示LAD结扎12周后，进行(a)SKMB或(b)VEGF-表达SKMB细胞移植后，用G-CSF进行干细胞动员之后的BrdU+细胞和心肌肌球蛋白表达细胞。
图6c所示为相对于没有VEGF过度表达的细胞治疗左心室功能的改善。
图7(a和b)所示为SKMB移植前后的血管密度(a)与左心室功能(b)的比较。
图8所示为在直接腺病毒注射和表达VEGF-165的细胞移植后血管密度的比较。
图9(a-f)所示分别为通过用AdLUC(a，d)、1×107pfu AdVEGF-165(b，e)转染的1百万SKMB，及AdVEGF-165(c，f)转染的1百万SKMB对所述梗塞区域周围进行5次等量分开注射4周后所述梗塞区域切片照片。
图10(a和b)所示为通过1×107pfu AdVEGF-165(a)和1百万用1×107pfu AdVEGF-165转染的SKMB(b)进行5次等量分开注射4周后所述梗塞区域周围炎症浸润的照片。
图11(a和b)所示为VEGF-165表达SKMB的移植对左心室(LV)功能的影响，(a)表示缩短分数(％)，(b)指相对于盐水对照。
实施方案的描述除非有其它定义，本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的含义。分子生物学术语的通常可理解的定义可参见例如Rieger et al.，Glossary of GeneticsClassical and Molecular，5thedition，Springer-VerlagNew York，1991；及Lewin，Genes V，OxfordUniversity PressNew York，1994。
本文描述了包括常规分子生物学技术的方法。此类技术是本领域所属技术人员一般通晓的并在方法学文献中有详细的描述，例如，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Vol.1-3，ed.Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；及CurrentProtocols in Molecular Biology，ed.Ausubel et al.，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1992(定期更新)。化学合成核酸的方法例如Beaucage and Carruthers，Tetra.Letts.221859-1862，1981，及Matteucci etal.，J.Am.Chem.Soc.1033185，1981中所述。核酸的化学合成可在例如商业销售的自动寡核苷酸合成仪中进行。免疫学方法(例如，抗原特异抗体的制备、免疫共沉淀及免疫印记)参见例如Current Protocols inImmunology，ed.Coligan et al.，John Wiley & Sons，New York，1991；及Methods of Immunological Analysis，ed.Masseyeff et al.，John Wiley & Sons，New York，1992所述。基因转移和基因治疗的常规方法也在本发明中采用，参见例如Gene TherapyPrinciples and Applications，ed.T.Blackenstein，Springer Verlag，1999；Gene Therapy Protocols(Methods in MolecularMedicine)，ed.P.D.Robbins，Humana Press，1997；及Retro-vectors forHuman Gene Therapy，ed.C.P.Hodgson，Springer Verlag，1996所述。
本发明涉及在缺血损伤组织中刺激干细胞分化的方法用来再生所述的缺血损伤组织。本发明的方法可用于所述缺血较长时间(即多周)后的缺血损伤组织的治疗。
所述的方法包括在哺乳动物个体中动员多潜能干细胞迁移到缺血损伤组织中。本发明所述的多潜能干细胞可以是任何能够被本发明所述的方法刺激从而分化为另一种细胞类型的细胞。多潜能干细胞的一个例子包括能够分化为心肌细胞的造血干细胞。
哺乳动物个体包括任何哺乳动物，例如人、大鼠、小鼠、猫、狗、绵羊、山羊、马、猴子、猿、兔子、牛等等。所述哺乳动物个体可处于任何发育阶段，包括成年、青年动物及新生儿。哺乳动物个体还可包括胚胎发育阶段的动物。
所述的缺血损伤组织包括由血液对所述组织供应不足引起损伤的任何组织。血液供应动脉的阻塞或狭窄或引流所述组织的静脉阻塞或狭窄能够引起血液供应的不足。
本发明的一个方面，所述缺血损伤组织包括梗塞的心肌。本发明所述的梗塞心肌指梗塞的心肌组织、所述的梗塞的心肌组织的周围组织(例如，周围血管组织情况下的骨骼肌组织)、及同时包括梗塞的心肌组织和所述的梗塞的心肌组织的周围组织。
在距缺血后较长时间的某一时间点上，第一数量的多潜能干细胞进入所述的缺血损伤组织。能够增加该第一数量的干细胞使得更多数量的干细胞进入到所述的缺血损伤组织中。通过增加进入所述的缺血损伤组织中的干细胞数量，由于在所述的缺血损伤组织中将会有更多数量的多潜能干细胞，其可分化为能够进行再定居(repopulate)(即植入)及部分或全部恢复缺血损伤组织正常功能的细胞，该缺血损伤组织能够再生。
根据本发明的另一方面，所述的方法包括将所述的缺血损伤组织的血管内皮生长因子(VEGF)从第一浓度增加到基本上高于第一浓度的第二浓度的步骤。所述的缺血损伤组织中的VEGF第一浓度为在缺血后较长的一个时间点(即多周)的缺血损伤组织中通常发现的VEGF浓度。通过将缺血损伤组织中的VEGF表达从缺血后较长的一个时间的缺血损伤组织中通常发现的VEGF量上调，能够增加缺血损伤组织中的VEGF的浓度。
与盐水对照比较，所述缺血损伤组织中血管内皮生长因子浓度的升高增加了缺血损伤组织中血管密度。所述在缺血损伤组织中表达的VEGF也能刺激干细胞分化和所述缺血损伤组织的再生。例如发现在梗塞心肌中表达的VEGF将动员的干细胞分化为心肌细胞。
本发明的方法进一步包括将干细胞动员到所述缺血损伤组织的步骤，其使所述缺血损伤组织外周血中多潜能干细胞的浓度(即数量)从第一浓度增加到基本上高于第一浓度的第二浓度的步骤。所述的干细胞的第一浓度可以为在缺血后较长的一个时间(即多周)的外周血中通常发现的干细胞浓度。只要所述的缺血损伤组织中的VEGF浓度增加的同时所述的外周血中的干细胞浓度也增加，所述的外周血中干细胞浓度就能在所述的缺血损伤组织中的VEGF浓度上调前或后增加。
根据本发明的另一个方面，所述的方法包括诱导多潜能干细胞归巢到缺血损伤组织中的步骤。通过将所述的缺血损伤组织中的SDF-1蛋白浓度从第一浓度增加到基本高于第一浓度的第二浓度来使多潜能干细胞归巢到所述的缺血损伤组织中。所述SDF-1蛋白的第一浓度可以为在缺血(如心肌梗塞)后较长的一个时间(即多周)的缺血损伤组织(如梗塞的心肌)中通常发现的SDF-1蛋白浓度。所述的SDF-1蛋白的第二浓度基本上高于所述的SDF-1蛋白的第一浓度。
通过将SDF-1蛋白的表达从距心肌梗塞后较长时间点的缺血损伤组织中通常表达的SDF-1蛋白量上调，能够增加SDF-1蛋白的浓度。所述的缺血损伤组织中的VEGF浓度、外周血中干细胞浓度增加的同时，所述缺血损伤组织中的SDF-1浓度也增加。
VEGF根据本发明的一个方面，表达在缺血损伤组织中的VEGF为血管内皮生长因子家族成员之一，其可诱导新的侧枝血管(collateral blood vessels)的生长。VEGF为特异性促血管生长因子，其具有血管通透性并几乎无例外地作用在内皮细胞上。
在缺血损伤组织中表达的VEGF可以是VEGF基因的表达产物。本发明使用的优选的VEGF包括VEGF-1(也称VEGF-A)及其它结构同源的VEGF类，例如VEGF-2(VEGF-C)、VEGF-3(VEGF-B)、VEGF-D、VEGF-E及胎盘生长因子。已知的VEGF-1异构体包括例如121、138、162、165、182、189及206个氨基酸。这些异构体分别确定为VEGF-121、VEGF-165、VEGF-162、VEGF-182、VEGF-189及VEGF-206。这些异构体的促有丝分裂和肝素结合活性是不同的。本发明使用的优选的VEGF-1异构体为VEGF-165。没有列出的VEGF-1的其它异构体和VEGF其它的同源物也可用于本发明。
本发明的VEGF可以与上述的VEGF之一具有氨基酸序列同一性。本发明的VEGF也可以是上述VEGF之一的变体，例如VEGF的片段、类似物和衍生物。这种变体包括例如，由天然VEGF基因(即编码自然发生的哺乳动物VEGF的自然发生的核酸)的自然发生的等位基因变体编码的多肽，天然VEGF基因的可选择拼接形式编码的多肽，天然VEGF基因的同源物编码的多肽，以及VEGF基因的非自然发生的变体编码的多肽。
VEGF变体具有一个或多个氨基酸不同于天然VEGF的肽序列。这种变体的所述肽序列具有天然VEGF的一个或多个氨基酸缺失、添加或取代的特征。氨基酸的插入优选为约1-4个连续的氨基酸的插入，而缺失优选为约1-10个连续氨基酸的缺失。根据本发明的变体VEGF基本上保持天然VEGF的功能活性。优选的VEGF蛋白变体可由表达本发明的具有沉默或保守变化特征的核酸分子来产生。
对应一个或多个特定基序和/或功能域或人工序列大小的VEGF片段也属于本发明的范围。可通过筛选编码此肽的核酸的对应片段重组产生的肽来获得VEGF的分离的肽基部分。此外，通过本领域公知的技术例如，常规Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学来化学合成片段。
VEGF的变体也可包括VEGF的重组形式。除VEGF外，本发明优选的重组多肽由与编码哺乳动物VEGF基因的核酸序列有至少85％序列同一性的核酸来编码。
VEGF变体可以包括组成性表达天然VEGF的功能活性的蛋白的激动剂形式。其它VEGF变体可包括由例如改变蛋白酶靶序列的突变而引起的抗蛋白裂解的变体。通过检测变体的VEGF功能活性可容易地检测肽的氨基酸序列改变是否能够产生具有VEGF的一个或多个功能活性的变体。
VEGF核酸本发明的另一个方面涉及编码VEGF的核酸分子及编码哺乳动物VEGF的非天然的核酸。这种核酸分子可以是RNA或DNA(例如，cDNA、基因组DNA及合成DNA)形式。所述DNA可以是双链或单链，及如果是单链可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。
本发明的其它核酸分子为天然VEGF基因的变体，例如编码天然VEGF的片段、类似物及衍生物的那些天然VEGF基因的变体。这些变体可以是例如，VEGF基因的自然发生的等位基因变体、天然VEGF基因同源物、或天然VEGF基因的非自然发生的变体。这些变体的核苷酸序列与天然VEGF基因的不同之处在于具有一个或多个不同的碱基。例如，这种变体的核酸序列具有天然VEGF基因的一个或多个核苷酸的缺失、添加或取代的特征。核酸的插入优选为约1-10个连续的核苷酸的插入，而缺失优选为约1-30个连续氨基酸的缺失。
在其它的应用中，表现结构本质变化的变体VEGF可由不引起所编码多肽的保守改变的核苷酸取代来产生。这种核苷酸取代的例子为引起(a)多肽骨架结构改变；(b)多肽电荷或疏水性改变；或(c)氨基酸侧链大小变化的取代。通常希望产生蛋白质特性最大变化的核苷酸取代为引起密码子非保守性改变的取代。可能引起蛋白质结构主要变化的密码子改变的例子为引起(a)亲水性残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)由(或被)疏水性残基(例如，亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸氨酸或丙氨酸)所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸由(或被)其它任意残基取代；(c)具有正电侧链的残基(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)由(或被)负电残基(例如，谷氨酸或天冬氨酸)所取代；或(d)具有侧链的残基(例如，苯丙氨酸)由(或被)没有侧链的残基(例如，丙氨酸)取代的密码子。
本发明的VEGF基因的自然发生的等位基因的变体为分离自哺乳动物组织的核酸，其与天然VEGF基因具有至少75％的序列同一性并编码与天然VEGF具有结构相似性的多肽。本发明中的天然VEGF同源物为分离自与天然基因具有至少75％的序列同一性的其它物种的核酸，其编码与天然VEGF具有结构相似性的多肽。可搜寻公共和/或专有的核酸数据库来确定与天然VEGF基因具有较高百分比序列同一性的其它核酸分子。
非自然发生的VEGF变体为自然界中没有出现的核酸(例如，由人工制造的)，其与天然VEGF基因具有至少75％的序列同一性，并编码与天然VEGF具有结构相似性的多肽。非自然发生的VEGF基因变体的例子为编码天然VEGF片段的那些变体、或在严格条件下与天然VEGF基因杂交或与天然VEGF基因互补的那些变体、与天然VEGF基因或天然VEGF基因互补序列共有至少65％序列同一性的那些变体、以及编码VEGF的那些变体。
本发明中的编码VEGF片段的核酸为编码天然VEGF残基的那些核酸。编码或与编码天然VEGF片段的核酸杂交的较短的寡核苷酸能够用作探针、引物或反义分子。编码或与编码天然VEGF片段的核酸杂交的较长的多聚核苷酸也能够用于本发明的多个方面。编码天然VEGF片段的核酸可通过对全长天然VEGF基因或其变体的酶切(例如，使用限制性内切酶)或化学降解来获得。
在严格条件下与上述核酸中的一种杂交的核酸也可用于本发明。例如，此核酸可以是在较低严格条件、中等严格条件、或较高的严格条件下与上述核酸中的一种杂交的核酸。
编码VEGF融合蛋白的核酸分子也可用于本发明。此种核酸可通过制备当其被介入到适合的靶细胞中时能表达VEGF融合蛋白的构建(例如，表达载体)来获得。例如，此种构建能够通过将融合在框架内的编码VEGF蛋白的第一多聚核苷酸与编码另一种蛋白的第二多聚核苷酸相连接，使得该构建在适合的表达系统中的表达产生一种融合蛋白来制备此构建。
本发明的寡核苷酸可以为单链或双链的DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰体。可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架对此寡核苷酸进行修饰，例如改进该分子的稳定性、杂交等等。本发明的寡核苷酸可另外含有其它的附加的基团，诸如肽(例如，用于在体靶向靶细胞受体)或促进跨细胞膜转运的试剂。为此，该寡核苷酸应连接到另外的分子上，例如肽、杂交促发交联剂、转运剂、杂交促发裂解剂等等。
VEGF表达根据本发明的另一方面，可通过向靶细胞介入增加VEGF表达的试剂来增加缺血损伤组织中VEGF的表达。所述靶细胞可包括缺血损伤组织中的细胞或用于再回输的体外处理(ex vivo)的细胞，其在所述试剂诱导后被移植到所述的缺血损伤组织中。
所述的用于再回输的体外处理细胞可以是与所述的细胞欲移植的组织生物匹配的任意细胞。这些细胞优选从欲治疗的个体中获得(即自体同源细胞)并在移植前进行培养。为增加用于移植的细胞的生物匹配性并最小化排斥的可能性，因此优选自体同源细胞。
当所述的缺血损伤组织包括梗塞的心肌时，所述的移植到所述梗塞心肌的细胞能够为例如，自体同源细胞、培养的骨骼肌成肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞及骨髓来源细胞。用于移植到梗塞心肌的优选细胞为骨骼肌成肌细胞。成肌细胞保持骨骼肌的再生潜能，在应激时能够增殖和分化为肌管，最终形成具有收缩能力的肌纤维。移植进入心肌的成肌细胞进行肌管的形成，从细胞周期中撤出，并保持活力。功能研究表明移植成肌细胞到所述的心肌后可改善区域的收缩性和顺应性。
在肌纤维的基膜下可容易获得骨骼肌成肌细胞，培养扩增该细胞系，并随后移植到梗塞的心肌中。例如，在鼠类个体中，可从该个体的后肢获得骨骼肌成肌细胞，培养并随后移植到该个体梗塞的心肌中。
所述的被介入到靶细胞来增加VEGF表达的试剂包括天然和合成的VEGF核酸，其被连接到能够介入并在所述细胞中复制的重组核酸构建(通常为DNA构建)中。此构建优选包括能够在给定的靶细胞中进行多肽编码序列的转录和翻译的复制系统和序列。
也可将其它试剂介入到靶细胞中来增加靶细胞中VEGF水平。例如，增加编码VEGF基因转录的试剂；增加编码VEGF的mRNA的翻译的试剂，和/或那些降低编码VEGF的mRNA的降解的试剂能够用于增加VEGF水平。通过在该编码VEGF基因的上游诱导外源性启动子可提高细胞中基因的转录率。也可使用促进异源性基因表达的增强子元件。
将所述的试剂介入到靶细胞的优选的方法包括基因治疗。基因治疗指用于体内或体外在细胞中表达治疗产物的基因转移。本发明的基因治疗可用于体内体外在靶细胞中表达VEGF。
基因治疗的一种方法使用含有编码VEGF的核苷酸载体。“载体”(有时指基因传输或基因转移“载体”)指包括体内或体外欲传输到靶细胞的多聚核苷酸的大分子或分子复合物。所述的欲传输的多聚核苷酸可以包括基因治疗中感兴趣的编码序列。载体包括，例如，能够介导多聚核苷酸释放到靶细胞的病毒载体(诸如腺病毒(Ad)、腺病毒相关病毒(AAV)及逆转录病毒)、脂质体及其它含有脂质的络合物、以及其它大分子络合物。
载体还可包括进一步调节基因释放和/或基因表达的其它成分或功能物，或另外对靶细胞提供有益特性的物质。这些其它的成分包括例如，影响对细胞结合或靶定的成分(包括介导细胞类型或组织特异结合的成分)；影响细胞对载体核酸摄取的成分；在摄取后影响细胞中多聚核苷酸定位的成分(例如介导核定位试剂)；及影响多聚核苷酸表达的成分。此成分还可包括标志，例如可检测和/或选择性标志，其可用于检测或选择已经摄取并表达由载体传输的核酸的细胞。此成分以载体的天然特征来提供(例如具有调节结合和摄取的成分和功能物的某种病毒载体的使用)，或能够修饰载体来提供此功能物。
选择性标志能够是阳性、阴性或双功能性的。阳性选择性标志能对携带此标志的细胞进行选择，而阴性选择性标志可对携带此标志的细胞进行选择性排除。已有多种此类标志基因，包括双功能(即阳性/阴性)标志的描述(参见例如，Lupton，S.，WO 92/08796，May 29，1992公布；及Lupton，S.，WO 94/28143，Dec.8，1994公布)。此标志基因可提供控制的附加方法，其在治疗方案中具有优越性。此载体的大多数是本领域所属技术人员公知的且是常规可获得的。
本发明使用的载体包括能够释放本发明的核酸到靶细胞中的病毒载体、脂质为基础的载体及其它载体。此载体可以是靶向载体，特别是优选结合到所述靶细胞(例如心肌细胞)的靶向载体。本发明使用的优选的病毒载体为对靶细胞低毒性并以组织或细胞特异性方式诱导治疗性作用量的VEGF的产生的载体。
目前优选的病毒载体衍生自腺病毒(Ad)或腺病毒相关病毒(AAV)。可使用人和非人病毒载体但优选的重组病毒载体在人中复制缺陷(replication-defective)。当载体为腺病毒时，优选包括多聚核酸，该多聚核酸具有可操作地连接到编码VEGF基因的启动子并在人类中复制缺陷。
本发明优选使用腺病毒载体，其原因是它们(1)在靶细胞中具有高效基因表达的能力，及(2)对较大量异源性(非病毒)DNA具有适应性。重组腺病毒的优选形式为“空壳(gutless)”、“高容量(high-capacity)”、或“辅助依赖性”(helper-dependent)腺病毒载体。此载体的特征为，例如，(1)所有或大部分病毒编码序列(编码病毒蛋白的序列)的缺失，(2)病毒DNA复制所必需的病毒反向(inverted)末端重复序列(ITRs)，(3)最多达28-32kb的“外源性”或“异源性”序列(例如，编码SDF-1蛋白的序列)，及(4)病毒DNA包装序列，其在病毒基因组进入感染性衣壳的包装中是必需的。对特异的心肌细胞，此重组腺病毒载体的优选变体含有可操作地连接到VEGF基因的组织特异性的(例如，心肌细胞)增强子和启动子。
AAV为基础的载体是有优势的，因其表现高度的靶细胞转导效率，并能够以位点特异性方式整合到靶基因组中。重组AAV载体的使用详见Tal，J.，J.Biomed.Sci.7279-291，2000；及Monahan and Samulski，GeneTherapy 724-30，2000所述。优选的AAV载体包含一对AAV反向末端重复序列，其侧翼连接至少一个盒(cassette)，该盒含有可操作地连接到VEGF核酸的组织(例如心肌)或细胞(例如心肌细胞)特异启动子。该AAV载体的DNA序列，包括所述ITRs、所述启动子及VEGF基因可整合到靶基因组中。
根据本发明可使用的其它病毒载体包括单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus，HSV)为基础的载体。缺失了一个或多个瞬时早期基因(IE)的HSV载体是有优势的，因其通常是非毒性的，在靶细胞中保持类似于潜伏期的状态，并提供有效的靶细胞转导。重组HSV载体可连接约30kb的异源核酸。优选HSV载体为一种(1)来自HSV I型的工程型(engineered)，(2)具有其IE基因缺失，及(3)含有可操作地连接到VEGF核酸的组织特异性(例如心肌)启动子。HSV扩增子载体也可用于本发明的不同方法中。通常，HSV扩增子载体约15kb长，具有病毒来源的复制和包装序列。
诸如C-型反转录病毒和慢病毒(lentiviruses)中的反转录病毒也可在本发明中使用。例如反转录病毒载体可以鼠白血病病毒(MLV)为基础。参见例如，Hu and Pathak，Pharmacol.Rev.52493-511，2000及Fong et al.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.171-60，2000。MLV-为基础的载体可含有取代病毒基因的最多达8kb的异源(治疗性)DNA。此异源性DNA可包含组织特异性启动子和SDF-1核酸。在向梗塞心肌传输的方法中，其也可编码心肌特异受体的配体。
其它的可使用的反转录病毒载体为复制缺陷慢病毒为基础的载体，包括人免疫缺陷病毒(HIV)为基础的载体。参见例如，Vigna and Naldini，J.Gene Med.5308-316，2000及Miyoshi et al.，J.Virol.728150-8157，1998。慢病毒载体的优势为，其对活动分化和非分化细胞均具有感染的能力。其对转导人上皮细胞也具有高效性。
用于本发明的慢病毒载体可以是人源和非人源性(包括SIV)慢病毒。优选的慢病毒载体包括载体繁殖所需的核酸序列以及可操作地连接到VEGF基因的组织特异性(例如，心肌)启动子。此前者可包括所述的病毒LTRs，引物结合位点，多聚鸟苷嘌呤系统(tract)，att位点，及衣壳包装(encapsidation)位点。
慢病毒载体可包装到任意适合的慢病毒衣壳中。一种颗粒蛋白被不同病毒的另一种颗粒蛋白的取代指“假型(pseudotyping)”。该载体衣壳可含有来自其它病毒的病毒外膜蛋白，包括小鼠白血病病毒(MLV)或水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)。VSV G-蛋白的使用可产生高载体滴度并导致载体病毒颗粒更高的稳定性。
甲病毒(Alphavirus)为基础的载体，例如产生自塞姆利基(semliki)森林病毒(SFV)和辛德毕斯(sindbis)病毒(SIN)的载体也可用于本发明中。甲病毒的使用如Lundstrom，K.，Intervirology 43247-257，2000及Perri et al.，Journal of Virology 749802-9807，2000所述。甲病毒载体通常以已知的复制子(replicon)的形式构建。复制子可包括(1)RNA复制必需的甲病毒遗传元件，及(2)诸如一种编码VEGF核酸的异源核酸。在甲病毒复制子中，所述的异源核酸可操作地连接到组织特异性(例如，心肌)启动子或增强子上。
重组、复制缺陷甲病毒载体是有优势的，因其具有高水平异源(治疗)基因表达能力，并可感染较广泛范围的靶细胞。甲病毒复制子可通过在其病毒体表面上展现功能异源配体或结合功能域(其可选择性地与表达同类结合伴侣的靶细胞结合)来被靶定在特异细胞类型(例如，心肌细胞)上。甲病毒复制子可具有潜伏期，并因此可在靶细胞中进行长期异源核酸的表达。该复制子还可在靶细胞中表现瞬时的异源核酸表达。优选的甲病毒载体或复制子为非细胞变性的。
在适用于本发明方法的多种病毒载体中可包括多于一种的启动子，该启动子允许载体表达多于一种的异源性基因。此外，该载体可含有编码信号肽的序列或促进VEGF基因产物从靶细胞中分泌的其它部分。
结合两种病毒载体系统的优越性，可使用杂交的病毒载体来向靶组织(例如，心肌)中传输VEGF核酸。构建此杂交载体的标准技术是本领域所属技术人员公知的。此技术，例如参见Sambrook，et al.，In MolecularCloningA laboratory manual.Cold Spring Harbor，N.Y.或任何论述重组DNA技术的实验室手册。腺病毒衣壳中的含有AVV和腺病毒ITRs组合的双链AAV基因组可用于转导细胞。在另一种变体中，可将AAV载体放入“空壳”、“辅助依赖性”或“高容量”腺病毒载体中。腺病毒/AAV杂交载体如Lieber et al.，J.Virol.739314-9324，1999所述。反转录病毒/腺病毒杂交载体如Zheng et al.，Nature Biotechnol.18176-186，2000所述。其中含有腺病毒的反转录病毒基因组可整合到靶细胞基因组内并对VEGF基因的稳定表达发挥作用。
也可考虑其它促进VEGF基因表达及载体的克隆的核酸序列元件。例如启动子上游增强子或编码区下游终止子的存在可例如促进表达。
本发明还考虑将组织特异的启动子用于细胞靶向。例如，当所述缺血损伤组织为梗塞心肌时，左心室肌球蛋白轻链-2(MLC2V)或肌球蛋白重链(MHC)的组织特异性转录控制序列可融合到转基因上，例如在腺病毒构建中的VEGF-165基因上。通过将此组织特异性启动子融合到转基因上，使转基因的表达限定在心室心肌细胞中。通过使用MLC2V或MHC启动子并在体传输转基因，相信单独心肌细胞(即不与所述心脏中的内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞伴随表达)能够提供充足的诸如促进血管生成的VEGF-165的促血管形成蛋白的表达。
对于充血性心肌衰竭的基因转移治疗作用，对心肌细胞的限制性表达也是有优势的。通过对所述心脏的限制性表达，可避免非心肌组织中血管形成的潜在有害作用。此外，对于心脏中的细胞，由于该细胞不进行快速周转，因此该肌细胞有可能提供最长的转基因表达，而不会如内皮细胞那样因细胞分裂和死亡而降低表达。内皮细胞特异启动子也已用于此目的。
除病毒载体为基础的方法外，也可使用非病毒方法将VEGF基因介入到靶细胞中。本发明使用的优选的非病毒基因传输方法是利用质粒DNA来介导VEGF核酸进入细胞。质粒为基础的基因传输方法是本领域所公知的。
合成基因的转移分子可设计为质粒DNA的多分子集合(multimolecular aggregates)(例如，锚定可操作地连接到心肌-特异启动子的VEGF编码序列)。这些集合可设计用于结合靶细胞(例如，心肌细胞)。
阳离子两性物(包括脂多胺类(lipopolyamines)和阳离子脂质)可用于提供受体依赖的VEGF核酸转移进入靶细胞中(例如，心肌细胞)。此外，使用的阳离子脂质体或阳离子脂质可与质粒DNA混合形成细胞转染复合物。有阳离子脂质制剂参与的方法参见Felgner et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.772126-139，1995和Lasic and Templeton，Adv.Drug Delivery Rev.20221-266，1996的综述。对于基因的传输，也可将DNA结合到两性阳离子肽上(Fominaya et al.，J.Gene Med.2455-464，2000)。
本发明也可使用同时包括病毒和非病毒为基础成分的方法。例如，用于治疗性基因传输的Epstein Barr病毒(EBV)为基础的质粒，如Cui et al.，Gene Therapy 81508-1513，2001所述。此外，包括将DNA/配体/多聚阳离子附加物耦合到腺病毒的方法如Curiel，D.T.，Nat.Immun.13141-164，1994所述。
编码VEGF表达的载体能够以注射制剂的形式传输到靶细胞中，如果需要，该制剂可含有诸如盐的药物可接受的载体。根据本发明也使用其它药物载体、制剂和剂型。
当靶细胞包括缺血损伤组织的细胞时，在荧光镜的指引下可使用结核菌素注射器并以足够表达VEGF水平(其能够有效刺激干细胞分化)的载体量直接进行注射来传输所述载体。通过将该载体直接注射到缺血损伤组织中，有可能更有效地靶向该基因并将该重组载体的丢失降低到最小。
这种形式的注射能够实现所希望数量的细胞，特别是梗塞心肌的心肌细胞中的局部转染，因此最大化基因转移的治疗效率并最小化病毒蛋白引起炎症反应的可能性。当所述缺血损伤组织包括梗塞心肌时，可使用心肌细胞特异性启动子，例如用来确保限于心肌细胞的表达的启动子。因此在这种情况下转基因的传输可导致靶定基因在例如左心室(LV)细胞中的表达。本领域其它公知的技术也可用于将所述载体移植到梗塞的心肌的靶细胞中。
当靶细胞为所培养的随后将被移植到缺血损伤组织的细胞时，所述的载体可通过直接注射到培养液中来传输。转染到细胞中的VEGF核酸能够可操作地连接到任何适合的调控序列，包括心肌特异启动子和增强子。通过本领域公知的移植技术，例如使用结核菌素注射器直接进行冠状动脉内注射，来随后将转染的靶细胞移植到缺血损伤组织中。
当所述缺血损伤组织包括梗塞心肌时，所述的靶细胞优选为收集自欲治疗个体并进行用于再回输的体外培养的自体同源细胞。通过首先体外转染所述靶细胞并随后移植所述的转染靶细胞到所述梗塞心肌中，与对梗塞的心肌进行载体的直接注射比较，可能最小化梗塞的心肌中炎症反应并且改善左心室功能。研究者认为，此没有炎症反应的改善结果通常与腺病毒注射有关。
在靶细胞中，本发明的VEGF可表达任意适合长度的时间，包括瞬时表达和稳定、长期表达。在优选的实施方案中，所述的VEGF核酸可以有效的剂量在适合并规定的时间长度内表达。
有效剂量为能够在所治疗的动物或人中产生医学上所希望的治疗效果的剂量。如医学领域所公知的，任何动物或人的剂量将依靠多种因素来决定，包括个体的大小、体表面积、年龄、欲给药的具体组合物、性别、给药时间和途径、一般健康情况及其它同时给予的药物。对本领域所属技术人员来讲，利用以下所述的实验方法可容易地确定蛋白、核酸或其它小分子的特定剂量。
无论所述的VEGF表达是瞬时的还是长期的，在所述缺血损伤组织中VEGF有限制的表达的浓度是需要的，来防止血管瘤或内皮细胞衍生血管内肿瘤的形成。
干细胞动员根据本发明的另一方面，能够通过给予诱导干细胞动员到外周血的试剂来增加个体的所述缺血损伤组织的外周血中干细胞的浓度。利用一些试剂可将个体干细胞动员到外周血中来增加个体外周血的干细胞浓度。例如，为了增加哺乳动物外周血中干细胞的数量，可对个体进行能够引起多潜能干细胞从骨髓动员到外周血的试剂的给药。一些这种试剂是公知的并包括细胞因子(诸如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-7、IL-3、IL-12、干细胞因子(SCF)及flt-3配体)，趋化因子(诸如IL-8、Mip-1α及Groβ)以及环磷酰胺(Cy)和紫杉醇(paclitaxel)的化疗试剂。这些试剂在实现干细胞动员、干细胞动员类型及效率的时间结构(time frame)上有所差异。
可将动员剂直接注射到所述的个体来进行动员剂的给药。优选地，所述的动员剂在缺血损伤组织中VEGF表达上调后给药。然而，所述的动员剂也可在VEGF表达上调之前给药。
优选的动员剂为集落刺激因子，例如G-CSF。在鼠类个体中G-CSF的常规剂量约为每天125μg/kg，给药约5-10天。可在VEGF表达上调后给予G-CSF试剂。
可选择地，如本领域公知的，可通过将特异化的干细胞(即MAPC′s)注射到外周血中来增加外周血中干细胞的浓度。
SDF-1蛋白根据本发明的一个方面，所述的在缺血损伤组织中表达的SDF-1蛋白(或SDF-1多肽)可以是SDF-1基因的表达产物。许多或不同哺乳动物SDF-1蛋白的氨基酸序列是已知的，包括如人、大鼠、小鼠及猫。该SDF-1蛋白可具有与上述天然的哺乳动物SDF-1蛋白中的一种相同的氨基酸序列。
本发明的SDF-1蛋白也可以是哺乳动物SDF-1蛋白的变体，例如哺乳动物SDF-1蛋白的片段、类似物和衍生物。此种变体包括例如，由天然的SDF-1基因(即编码自然发生的哺乳动物SDF-1蛋白的自然发生的核酸)的自然发生的等位基因变体编码的多肽，由天然SDF-1基因可选择的拼接形式编码的多肽，由天然SDF-1基因同源序列编码的多肽，及由天然SDF-1基因非自然发生的变体编码的多肽。
SDF-1蛋白变体与天然SDF-1蛋白比较其肽序列中有一个或多个不同的氨基酸。此变体的肽序列具有SDF-1蛋白的一个或多个氨基酸缺失、添加、或取代的特征。氨基酸插入优选为约1-4个连续(比邻)氨基酸，缺失优选为约1-10连续氨基酸。变体SDF-1蛋白基本上保持了天然SDF-1蛋白的功能活性。优选的SDF-1蛋白变体通过本发明中的以沉默或保守的改变为特征的核酸分子的表达来产生。
对应一个或更多基序的和/或功能域、或对应任意序列大小的SDF-1蛋白片段属于本发明的范围。可通过筛选编码此肽的核酸的对应片段重组产生的肽来获得SDF-1蛋白的分离的肽基部分。此外，可利用本领域所属技术人员公知的技术来化学合成片段，例如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学。例如，本发明的SDF-1蛋白可任意地分为没有片段重叠的所希望的长度，或优选分为所希望长度的重叠片段。可重组产生所述的片段并检测鉴定那些具有天然SDF-1蛋白激动剂功能的肽基片段。
SDF-1蛋白的变体还能包括SDF-1蛋白的重组形式。除SDF-1蛋白外，本发明优选的重组多肽由核酸编码，该核酸与编码哺乳动物SDF-1蛋白基因的核酸序列至少有85％序列同一性。
SDF-1蛋白变体可包括组成性表达天然SDF-1蛋白的功能活性的蛋白的激动剂形式。其它SDF-1蛋白变体可包括那些对蛋白降解分裂具有抗性的，例如，由于突变而改变蛋白酶作用的靶序列。肽的氨基酸序列改变是否可产生具有天然SDF-1蛋白的一个或多个功能活性的变体可通过检测变体的天然SDF-1蛋白功能活性来较容易地确定。
SDF-1核酸本发明的另一方面涉及编码SDF-1蛋白的核酸分子和编码SDF-1蛋白的非天然的核酸。这些核酸分子可以是RNA或DNA的形式(例如，cDNA、基因组DNA及合成的DNA)。DNA可以是双链或单链的，并且单链可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。该编码SDF-1蛋白的编码序列可以与GenBank登录号No.AF189724、GenBank登录号No.AF209976、GenBank登录号No.L120029及GenBank登录号No.NM022177的核酸序列相同。作为遗传密码的冗余和简并结果，其还可以是不同的编码序列，编码与该多聚核苷酸编码的相同的多肽。
本发明中编码SDF-1的其它的核酸分子为天然SDF-1的变体，例如，编码天然SDF-1蛋白的片段、类似物及衍生物的那些核酸。此变体可以是例如自然发生的天然SDF-1基因的等位基因变体，天然SDF-1基因的同源物、或天然SDF-1基因的非自然发生的变体。这些变体与天然SDF-1基因比较，其核苷酸序列具有一个或多个碱基差异。例如，此变体的核苷酸序列具有天然SDF-1基因的一个或多个核苷酸的缺失、添加、或取代的特征。核酸插入优选为约1-10个连续(比邻)核苷酸，缺失优选为约1-10个连续核苷酸的缺失。
在其它应用中，可通过核苷酸的取代(该取代不引起编码的多肽的保守改变)来产生表现为结构的实质性变化的变体SDF-1蛋白。此核苷酸取代的例子为引起(a)多肽骨架结构改变；(b)多肽电荷或疏水性改变；或(c)氨基酸侧链大小的改变的那些取代。通常希望能够产生蛋白特性的最大变化的核苷酸的取代是那些引起密码子非保守性改变的取代。可能引起蛋白结构较大变化的密码子改变的例子为引起(a)亲水残基(例如丝氨酸或苏氨酸)由(或被)疏水残基(例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸)所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸由(或被)任何其它残基所取代；(c)具有正电侧链的残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)由(或被)负电性残基(例如谷氨酸或天冬氨酸)所取代；或(d)具有侧链的残基(例如苯丙氨酸)由(或被)没有侧链的残基(例如甘氨酸)所取代的那些密码子。
本发明的天然SDF-1基因的自然发生的等位基因变体为分离自哺乳动物组织中的核酸，其与天然SDF-1基因具有至少75％序列同一性，并编码与天然SDF-1蛋白具有结构相似性的多肽。本发明的天然SDF-1基因的同源序列为分离自其它种群的核酸，其与所述的天然基因具有至少75％的序列同一性，并编码与天然SDF-1蛋白具有结构相似性的多肽。可搜寻公共和/或专有的核酸数据库来确定与天然SDF-1基因具有较高百分比(例如，70％或更多)序列同一性的其它核酸分子。
非自然发生的SDF-1基因变体为自然界中没有出现的核酸(例如，由人工制造)，与天然SDF-1基因具有至少75％的序列同一性，并编码与天然SDF-1蛋白具有结构相似性的多肽。非自然发生的SDF-1基因变体的例子为编码天然SDF-1蛋白片段的那些变体、或在严格条件下与天然SDF-1基因杂交或与天然SDF-1基因互补的那些变体、与天然SDF-1基因或天然SDF-1基因互补序列具有至少65％序列同一性的那些变体、以及编码SDF-1融合蛋白的那些变体。
本发明中的编码天然SDF-1蛋白片段的核酸为编码天然SDF-1蛋白残基的那些核酸。编码核酸(编码天然SDF-1蛋白片段)或与之杂交的较短的寡核苷酸能够用作探针、引物或反义分子。编码核酸(该核酸编码天然SDF-1蛋白片段)或与之杂交的较长的多聚核苷酸也能够用于本发明的多个方面。编码天然SDF-1片段的核酸可通过对全长天然SDF-1基因或其变体的酶切(例如，使用限制性内切酶)或化学降解来获得。
在严格条件下与上述核酸中的一种杂交的核酸也可用于本发明。例如，此核酸能够是在较低的严格条件、中等严格条件、或较高的严格条件下与上述核酸中的一种杂交的核酸，其也在本发明的范围内。
编码SDF-1融合蛋白的核酸分子也可用于本发明。此种核酸可通过制备当其介入适合的靶细胞中时表达SDF-1融合蛋白的构建(例如，表达载体)来获得。例如，此种构建能够通过将融合在框架内的编码的SDF-1蛋白的第一多聚核苷酸与编码另一种蛋白的第二多聚核苷酸连接来制备，使得该构建在适合的表达系统中的表达产生融合蛋白。
本发明的寡核苷酸可以为DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰体，其可为单链或双链的。能够对此寡核苷酸的碱基部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰，例如改进该分子的稳定性、杂交等等。本发明的寡核苷酸可另外含有其它的附加的基团，诸如肽(例如，用于在体靶定靶细胞受体)，或促进跨细胞膜转运、杂交-促发裂解(hybridization-triggeredcleavage)的试剂。为此，该寡核苷酸应连接到另外的分子上，例如肽、杂交促发交联剂、转运试剂、杂交促发裂解剂等等。
SDF-1表达根据本发明的另一方面，通过将所述细胞介入所述缺血损伤组织中来上调所述缺血损伤组织中SDF-1的表达。将细胞介入缺血损伤组织中来上调缺血损伤组织中SDF-1蛋白的表达。例如，将骨骼肌成肌细胞移植到鼠类个体的梗塞心肌中，从骨骼肌成肌细胞移植到该心肌后约1小时到移植后不多于约7天内，上调所述的梗塞心肌中SDF-1蛋白的表达。
能够移植到所述缺血损伤组织中的细胞类型包括与所述欲移植细胞的组织生物匹配的任何细胞。这些细胞优选从欲治疗的个体中获得(即自体同源细胞)并在移植前进行培养。为增加用于移植的细胞的生物匹配性并最小化排斥的可能性，因此优选自体同源细胞。
当所述的缺血损伤组织包括梗塞心肌时，用于移植到梗塞的心肌的细胞为例如，自体同源细胞、培养的骨骼肌成肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞及骨髓来源细胞。用于移植到所述梗塞心肌的优选细胞为骨骼肌成肌细胞。
介入到所述缺血损伤组织来上调所述SDF-1蛋白表达的细胞能够与介入到所述缺血损伤组织来上调所述VEGF表达的细胞相同或不同。当通过介入所述缺血损伤组织表达所述VEGF的细胞使所述VEGF的浓度增加时，表达VEGF的细胞优选与用于上调所述缺血损伤组织中SDF-1蛋白表达的细胞相同。例如，当表达VEGF的转染骨骼肌成肌细胞被移植到鼠类梗塞心肌时，其将引起所述梗塞心肌中SDF-1蛋白从所述骨骼肌成肌细胞移植入所述梗塞心肌后1小时至移植后少于约7天的瞬时表达。
在本发明的另一方面，通过向靶细胞中介入增加靶细胞中SDF-1蛋白表达的试剂可上调SDF-1蛋白的表达。所述的靶细胞包括缺血损伤组织中的细胞或用于再回输的体外培养的细胞，例如从该个体获得的并培养的自体同源细胞。例如，所述用于再回输的体外培养的细胞能够是介入所述缺血损伤组织来表达VEGF的细胞和/或介入所述缺血损伤组织来提供SDF-1的瞬时表达的细胞。
根据本发明和以上所述，所述的试剂包括被连接到重组核酸构建(典型的为DNA构建)中的天然和合成的核酸，其能够被介入并在细胞中复制。此构建优选包括能够在给定的靶细胞中进行多肽编码序列的转录和翻译的复制系统和序列。
也能够将其它试剂介入到靶细胞中来增加靶组织中SDF-1蛋白水平。例如，增加编码SDF-1蛋白基因转录的试剂，增加编码SDF-1蛋白的mRNA的翻译的试剂，和/或降低SDF-1蛋白的mRNA的降解的试剂能够用于增加SDF-1蛋白水平。通过在该编码SDF-1蛋白基因的上游诱导外源性启动子可实现增加细胞中基因的转录率。也可使用促进异源性基因表达的增强子元件。
将所述的试剂介入到靶细胞的优选的方法包括使用基因治疗。本发明的基因治疗可用于体内体外在靶细胞中表达SDF-1蛋白。优选的基因治疗方法包括使用含有编码SDF-1蛋白的核苷酸载体。可使用的载体的例子包括，能够介导多聚核苷酸释放到靶细胞的病毒载体(诸如腺病毒(Ad)、腺病毒相关病毒(AAV)及逆转录病毒)、脂质体和其它含有脂质的络合物、以及其它大分子络合物。
载体还包括进一步调节基因释放和/或基因表达的其它成分或功能物，或另外对靶细胞提供有益特性的物质。这些其它的成分如上所述。
用于表达SDF-1蛋白的载体包括能够释放本发明的核酸到靶细胞中的病毒载体、脂质为基础的载体及其它载体。此载体可以是靶向载体，特别是优选结合到特定细胞类型的靶向载体。本发明使用的优选的病毒载体为对靶细胞低毒性并以组织特异性方式诱导治疗性作用量的SDF-1蛋白的产生。
目前优选的病毒载体衍生自腺病毒(Ad)或腺病毒相关病毒(AAV)。可使用人和非人病毒载体但优选的重组病毒载体在人中复制缺陷。当载体为腺病毒时，优选包括多聚核酸，该多聚核酸具有可操作地连接到编码SDF-1蛋白基因的启动子并在人类中复制缺陷。能够使用的包括病毒和非病毒载体的其它载体是本领域所述技术人员公知的并如上所述。
在适用于本发明方法的多种病毒载体中可包括多于一种的启动子，该启动子允许载体表达多于一种的异源性基因。此外，该载体可含有编码信号肽的序列或促进SDF-1基因产物从靶细胞中分泌的其它部分。
结合两种病毒载体系统的优越性，可使用杂交的病毒载体来向靶组织(例如，心肌)中传输SDF-1核酸。构建此杂交载体的标准技术是本领域所属技术人员公知的。例如，启动子上游增强子或编码区下游终止子的存在可例如促进表达。
本发明的另一方面，组织特异性或药物调节性启动子可融合到SDF-1基因上。通过将此组织特异性启动子融合到腺病毒构建中，使转基因的表达限定在特异的细胞类型(例如心室心肌细胞)中或对特定的药物发生反应(例如四环素)。组织特异性启动子提供的基因表达的效率和特异性程度可使用本发明的重组腺病毒系统来测定。
在所述缺血损伤组织为梗塞心肌的情况下，当在体传输SDF-1基因时，单独针对心肌细胞(即不在所述心脏中的内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞中伴随表达)的组织特异性启动子的使用可提供治疗性处理的SDF-1蛋白的充分表达。对心肌的限定性表达也具有关于CHF治疗的基因转移应用的优点。此外，由于心肌细胞不进行快速的周转，因此心肌细胞似乎可提供最长的转基因表达；表达因而不会如内皮细胞那样因细胞分化和死亡而减少。
除病毒载体为基础的方法外，非病毒方法也可用于将SDF-1基因介入到靶细胞中。本发明的优选的非病毒基因传输方法是利用质粒DNA来介导SDF-1核酸进入细胞。质粒为基础的基因传输方法是本领域所公知的。
本发明也可使用同时包括病毒和非病毒为基础的成分的方法。例如，用于治疗性基因传输的Epstein Barr病毒(EBV)为基础的质粒，如Cui et al.，Gene Therapy 81508-1513，2001所述。此外，包括将DNA/配体/多阳离子附属物结合到腺病毒的方法，如Curiel，D.T.，Nat.Immun.13141-164，1994所述。
编码SDF-1表达的载体能够以注射制剂的形式传输到靶细胞中，如果需要该制剂可含有诸如盐的药物可接受的载体。根据本发明也可使用其它药物载体、制剂和剂型。
在荧光镜的指引下可使用结核菌素注射器并以使SDF-1蛋白的表达程度至能够产生较高疗效的载体量直接进行注射来传输所述载体。通过将该载体直接注射到缺血损伤组织，有可能更有效地靶向该基因并将该重组载体的丢失降低到最小。这种形式的注射还能够实现所希望数量的细胞的局部转染，因此最大化基因转移的治疗效率并最小化病毒蛋白引起炎症反应的可能性。
当缺血损伤组织包括梗塞的心肌细胞时，可使用心肌细胞特异性启动子，例如用来确保限于心肌细胞的表达的启动子。因此在这种情况下转基因的传输可导致靶定基因在例如左心室细胞中的表达。本领域其它公知的技术也可用于将所述载体移植到梗塞的心肌的靶细胞中。
当靶细胞为所培养的随后将被移植到缺血损伤组织的细胞时，所述的载体可通过直接注射到培养液中来传输。转染到细胞中的SDF-1核酸能够可操作地被连接到任何适合的调控序列，包括心肌特异启动子和增强子。
通过本领域公知的移植技术，例如使用结核菌素注射器直接进行注射，来随后将转染的靶细胞移植到缺血损伤组织中。与对缺血损伤组织进行载体的直接注射比较，通过首先进行离体的靶细胞转染，然后将转染的靶细胞移植到梗塞的心肌中，将最小化梗塞的心肌中炎症反应的可能性。
在靶细胞中，本发明的SDF-1核酸可表达任意长度的时间，包括瞬时表达和稳定、长期表达。在优选的实施方案中，所述的SDF-1核酸可以有效的剂量在适合并规定的时间长度内表达。对本领域所属技术人员来讲，利用以下所述的实验方法可容易地确定蛋白、核酸或其它小分子的特定剂量。
当没有用SDF-1蛋白编码载体转染的细胞被移植到所述梗塞的心肌中时，所述的SDF-1表达可以是瞬时的。可选择地，当利用SDF-1蛋白编码载体对梗塞的心肌进行转染或实施了SDF-1蛋白编码载体转染的细胞被移植到该梗塞的心肌时，SDF-1蛋白表达可以是长期的。
长期SDF-1表达是有优势的，因其能通过诸如G-CSF或一些其它因子的动员剂在手术或移植细胞步骤一段时间后来增加干细胞的浓度。当G-CSF为动员剂时，嗜中性粒细胞计数会显著增加，其可引起围手术期的副作用，而不在多天或多周后。另外，长期或慢性的SDF-1蛋白表达上调可使产生多企图的干细胞动员。此外，慢性SDF-1蛋白表达上调不需要干细胞的动员即可引起干细胞从外周血中长期归巢到缺血损伤组织中。
实施例通过以下的特定实施例对本发明作进一步说明。所给出的实施例仅是为了说明的目的而不是任何方式的对本发明范围或内容的限定。第一系列实施例MI8周后G-CSF对干细胞动员的作用为了利用建立的缺血性心肌病模型，确定由G-CSF诱导的干细胞动员是否能够引起大鼠心肌再生，将MI后8周的大鼠随机分为接受重组人G-CSF(125μg/kg/天，5天，腹腔注射)组或盐水组。开始G-CSF治疗5天后，获得血液样本来证明骨髓刺激，与盐水组(11.8±4.0细胞/μl)比较，G-CSF组表现三倍的白血病计数(37.3±5.3细胞/μl)。在G-CSF给药的最后一天开始给予5-溴-2′-脱氧尿苷BrdU，共14天，来标记心肌20中的增殖细胞。
如图1(a和b)所示，分别为梗塞区域的BrdU-阳性细胞数量(a)和缩短分数(b)给予盐水或G-CSF 4周后(LAD结扎后12周)。细胞以每mm2计数。数据用平均值±标准差表示，每组n＝6-8。
LAD结扎后2个月，给予G-CSF 2不导致梗塞区域中(图1a)BrdU阳性细胞的增加或有意义的心肌再生(由梗塞区域中血管形成或心肌肌球蛋白阳性细胞的缺乏来测定(数据未显示))。LAD结扎后12周，这些动物显示显著的心肌病，对照动物的缩短分数显著小于10％(正常＞60％)。与结扎8周后对G-CSF的反应缺少显著的心肌再生的组织学证据一致，对于G-CSF没有观察到有意义的收缩功能的恢复(图1b)。
干细胞动员前SKMB移植对缺血性心肌病的作用为了验证在心肌梗塞的一段较长时间后对干细胞动员反应的心肌再生是较理想的假说，在LAD结扎8周后进行骨骼肌成肌细胞的移植。在梗塞边界区域内，动物接受了5个200,000SKMB/注射的注射。由于最初的假说是移植的SKMB可用于表达负责干细胞归巢的基因产物，作为对照，用编码荧光素酶的腺病毒来转染SKMB。
如图2(a和b)所示为骨骼肌成肌细胞(SKMB)移植(LAD结扎后12周)在细胞移植4周后梗塞区域内对BrdU+细胞计数的作用。数据用平均值±标准差表示，每组n＝6-8。
在没有G-CSF存在下，将SKMB介入到梗塞心脏不能显著增加BrdU阳性细胞在梗塞区域中的掺入。然而，SKMB移植与G-CSF联合使用确实在4周后可显著增加梗塞区域中BrdU阳性细胞的数量(图2a)。此外，与单独接受G-CSF或SKMB移植的动物比较，接受联合治疗的动物相对于盐水对照组表现出显著的缩短分数的增加(图2b)。
为了确定梗塞区域中的BrdU阳性细胞是来源于骨髓还是来自分裂的心肌的内源性细胞，LAD结扎后8周，给予BrdU，共5天，在SKMB移植和G-CSF起始前6天开始。
如图3a所示，BrdU标记的骨髓(BM)显示培养自多种动物的几乎100％的骨髓细胞标记。图3b显示在未处理的心肌中，BrdU给药5天后，没有观察到显著的Brdu+细胞。数据用平均值±标准差表示，由独立的两个观察者，对每组动物进行一致的双盲阳性细胞计数。每组n＝6-8。比例条表示25μM。这导致在骨髓的细胞中有标记而心肌的细胞没有任何Brdu的显著标记(17.5±2.9阳性细胞/mm2)。
如图3c所示为本发明治疗产生的梗塞区域中增加的BrdU+细胞。
在这些实验中，只有接受SKMB和G-CSF的动物在梗塞区域内具有显著增加的BrdU阳性细胞数量。这些数据与BrdU-阳性细胞来自于骨髓并在联合治疗后归巢于梗塞区域的观点一致。该数据也支持了SKMB的移植重建了干细胞归巢到心肌所必需的信号。
负责干细胞归巢到梗塞组织的信号分子在SKMB移植产生的组织“刺激”下，循环细胞将会在MI后8周移入梗塞组织，此观察推动了干细胞归巢潜在介导剂的评价。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)为已知的介导造血干细胞行走和骨髓中干细胞归巢的因子；因此其作为干细胞移植到MI中以及响应SKMB移植的潜在的信号分子的作用可以实现。
如图4所示为以心肌梗塞后的时间为函数，显示基质细胞衍生因子(SDF-1)表达的RT-PCR照片。SDF-1表达在基线没有出现，在MI后1和24小时增加。在MI后24小时与7天之间SDF-1表达返回到未表达的状态并在MI后保持30天未表达。在MI后30天(30+)进行SKMB移植，SDF-1表达可在移植后72小时重新出现。
因此，通过RT-PCR，在1与24小时观测到SDF-1表达，但在0、7或30天、LAD结扎后没有观测到。SKMB诱导SDF-1表达，并在移植后72h可观察到，但在假手术动物中没有观察到(数据未显示)。相同样品中的GAPDH的PCR显示所有样品中的cDNA是完整的(数据未显示)。由SKMB移植引起的SDF-1表达增加可被实时PCR证实(数据未显示)。实时PCR显示在组间GAPDH水平是相似的。
为评估SDF-1是否调节BrdU阳性细胞移植进入梗塞区域，将对照心肌成纤维细胞或用SDF-1表达载体稳定转染的细胞移植进入LAD结扎后4周的心肌中。10天后，为下调内源性SDF-1表达，给予G-CSF共5天，相同的地，在G-CSF给药最后一天开始给予BrdU共5天。
如图5(a和b)所示为心肌成纤维细胞移植后4周梗塞区域中(a)BrdU+细胞数和(b)CD117+细胞数，该移植细胞稳定转染或未转染了SDF-1表达载体，在心肌成纤维细胞移植后给予或不给予G-CSF共5天。数据用平均值±标准差表示，由两个独立的观察者，对每组动物进行一致的双盲阳性细胞计数。每组n＝3-5。
如图5c所示为SDF-1/G-CSF处理的动物CD117+标记细胞。刻度条表示25μM。
与足够诱导干细胞归巢到损伤心肌的SDF-1一致，在对G-CSF的反应中，接受SDF-1表达的心肌成纤维细胞移植的心脏在整个梗塞区域表现出大于3倍的BrdU阳性细胞数量的增加。接受对照心肌成纤维细胞移植的动物的BrdU信号与对照组没有差异。
BrdU阳性细胞的鉴定我们通过免疫荧光来测定梗塞区域中BrdU细胞特性。抗体标记CD45表明，在分别对细胞移植和G-CSF给药的反应中＜5％的BrdU-阳性细胞为白细胞。在进行G-CSF处理、同时未进行或进行SKMB或心肌成纤维细胞移植的动物梗塞区域中没有观察到心肌肌球蛋白-BrdU阳性细胞。
在MI后期VEGF表达SKMB与G-CSF对新血管形成和LV功能的作用虽然在接受SKMB移植和用G-CSF刺激骨髓的联合处理动物中有BrdU阳性细胞数的增加，但没有观测到梗塞区域中有血管密度或心肌细胞数量的增加。因此，我们另外对VEGF过表达对SKMB移植和G-CSF给药的影响进行了研究。
如图6(a和b)所示，梗塞区域中的免疫组织化学显示LAD结扎12周后，用(a)SKMB细胞移植或(b)VEGF表达SKMB移植后用G-CSF进行干细胞动员时，BrdU+阳性细胞(开放箭头)和心肌肌球蛋白表达细胞(闭合箭头)。
如图6c所示为相对于没有处理对照组的LV功能的改善，数据用平均值±标准差表示，每组n＝6-8。刻度条表示10μM。
MI后8周进行VEGF-165表达SKMB细胞移植，与盐水对照比较可产生梗塞区域中血管密度的增加(44.1±5.2vs.17.7±2.8血管数/mm2；分别为VEGF-165vs.生理盐水)。此外，VEGF-165表达与利用G-CSF的干细胞动员联合处理可导致梗塞区域中心肌肌球蛋白表达细胞再生，这与心肌细胞再生一致(图6a)。如缩短分数检测所示，对SKMB加入VEGF-165表达也可显著增加LV功能(图6b)。在VEGF-165表达SKMB移植和SKMB移植联合G-CSF给药的治疗策略之间没有观察到缩短分数的显著差别(数据未显示)。
方法LAD结扎所有动物实验得到了动物研究委员会(Animal Research Committee)的批准，并将所有动物饲养在Cleveland临床基地的AAALAC动物设施中。用50mg/kg的戊巴比妥钠麻醉动物，插管，使用压力循环啮齿动物呼吸机(Kent Scientific Corp，RSP1002)以室内空气每分钟80次进行通气。在外科显微镜(Leica M500)下通过左前降支(LAD)的结扎在150-175g雄性Lewis大鼠中诱导产生前壁MI。
2D-超生心动图使用与Sequoia C256(Acuson)连接的15-MHz线性阵列传感器(lineararray transducer)，在LAD结扎后5-7天和8周，以及SKMB移植后4周，进行2D-超生心动图的检测。在每次超生心动图中用开他命(ketamine)(50mg/kg)对大鼠进行轻微的镇静。对于LV容积和壁厚度的定量，我们数字记录了从正位于乳头肌下方的mid-LV的短轴切面(short axisview)上观测的2D钳(clip)和m-模式图像，这能使在不同大鼠中得到相同解剖位置的一致的检测。检测由两个双盲的观察者使用ProSolve脱线(offline)进行。每只动物的每种检测进行6次，从对处理手段不知情的观察者记录的5个中随机选择3个m-模式钳。当分析LV功能时，从M-模式记录中计算缩短分数。缩短分数(％)＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD*100，其中LVEDD左心室舒张末期容积，LVESD左心室收缩末期容积。从恰好位于乳头肌水平下方的短轴切面测量前壁和后壁之间的距离来检测容积。此外，在舒张末期检测前壁厚度。
细胞的制备和传输从一些Lewis大鼠(Harlan Labs)的前肢中收集骨骼肌成肌细胞，放入175ml培养瓶(Falcon)中，并在含有10％胎牛血清、300mg/l ECGS以及抗生素青霉素、链霉素和吡啶羧酶(ofloxacin)的DMEM中培养。当细胞到达75％融合时进行传代以避免分化。在细胞移植前一天，在CMV启动子控制下，用108pfu/ml的表达VEGF-165的复制缺陷腺病毒或荧光素酶(对照)转染纯化的成肌细胞。在移植的当天，用胰蛋白酶收集成肌细胞，在PBS中进行充分的清洗来去除游离的病毒颗粒，并在移植前立即进行再生。随后麻醉动物，通气并进行外侧开胸术(lateral thoracotomy)来直接观察梗塞区域。在每只动物的5个区域中注射约1×106个细胞。
从一些成年大鼠心脏中收集心肌成纤维细胞并以与SKMB相同的方式培养。将来自总RNA的SDF-1克隆至PCDNA3.1表达载体(正向-NOT-1)-AATAAGAAATGCGGCCGCATGGACGCCAAGGTCGTCGCTGTGCTGGCC；反向-(Xba-1)-TCTAGACTTGTTTAAGGCTTTGTCCAGGTACTCTTGGA)，该总RNA回收自梗塞后24小时的心脏。利用新霉素选择稳定转染了SDF-1PCDNA3.1表达载体的心肌成纤维细胞。
干细胞动员在骨骼肌成纤维细胞移植当天，开始通过腹腔内注射(i.p.)给予重组人G-CSF(125μg/kg)，共5天。在移植后0、5、14、及21天获得全血细胞计数以及不同数据(Bayer，ADVIA)。为检测细胞增殖的累计程度，在第5天进行50mg/kg BrdU的i.p.注射，共14天，使BrdU标记由G-CSF诱导的任何增殖的干细胞。
组织学分析大鼠安乐死后，在移植4周后，进行HistoChoice(Amresco Inc.，Solon，OH)灌注固定后，收集其心脏，并垂直于LV长轴将其分割成3个等份。中间心室和顶端小片用石蜡包埋并分割成6μm厚的切片用于免疫组织化学分析。使用心肌肌球蛋白(Chemicon)、CD45(Chemicon)、因子VIII(Chemicon)、CD117(Santa Cruz Biotehnology)及BrdU(Vector labs)的单克隆抗体，并使用FITC-或生物素标记的第二抗体。对于定量分析，对梗塞区域中的5个切片进行阳性细胞和血管密度的分析。我们不能进行CD117和BrdU的双标记，由于我们的步骤中用于检测BrdU抗原的HCl处理可导致核抗原决定簇的表达，其可由三种不同的CD117抗体识别。
PCR分析作为SKMB移植后和LAD结扎后的时间函数，对分离自大鼠心脏中的总RNA进行RT-PCR分析。用异硫氰酸胍-氯化铯方法从组织中提取总RNA。使用大鼠SDF-1特异引物(正向TTGCCAGCACAAAGACACTCC；反向CTCCAAAGCAAACCGAA TACAG，设计表达产物243bp，40个循环)，GAPDH引物(正向CCCCTGGCCAAGGTCATCCA；反向CGGAAGGCCATGCCAGTGAG，设计表达产物238bp，20个循环)。随后通过实时PCR(Perkin-Elmer，ABI Prism 7700)，用SYBR-绿结合到上述PCR产物SDF-1(正向ATGCCCCTGCCGATTCTTTG；反向TGTTGTTGCTTTTCAGCCTTGC，设计产物116bp)和如上所述的GAPDH中，来验证梗塞和移植心脏中表达的增加。
腺病毒构建由Gen Vec，Inc(Gaithersburg，MD)慷慨惠赠编码VEGF-165的腺病毒构建。简而言之，从美国典型培养收集中心(American Type CultureCollection)获得293细胞(ATCC CRL.1573)并保持在含10％牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培养液(DMEM)中。通过在反向末端重复序列(ITR)的左侧末端相邻的唯一限制性位点将穿梭质粒载体线性化来产生E1-、E3-腺病毒载体AdVEGF-165，并与ClaI消化的H5d1324DNA共转染到293细胞中。两次连续斑点纯化后，将载体原料(stocks)在293细胞中繁殖，并通过氯化铯梯度上三个连续带(three sequential banding)来纯化。纯化的病毒用含10mM Tris，pH7.8，150mM NaCl，10mM MgCl2及3％蔗糖的缓冲液来透析，并储存在-80℃直到使用。由细胞肥大病毒即刻早期启动子来控制转基因的表达。
统计学分析数据用平均值±标准差表示。通过Student t-检验进行组间比较。
第二系列实施例骨骼肌成肌细胞移植对左心室功能的影响检测自体同源SKMB移植对血管密度和LV功能的影响来确定SKMB表达VEGF-165是否能够导致显著的所述梗塞区域的新血管再生并改善左心室的功能。
通过LAD结扎诱导心肌梗塞后8周，在所述梗塞区周围，用1百万SKMB(n＝6)或生理盐水(n＝7)以5次等量分开的注射进行注射。4周后，通过超声心动图对LV功能以缩短分数进行定量分析，并收集所述心脏。通过因子VIII的免疫组化来鉴定血管系统，并对全部梗塞区域的血管密度进行定量分析。
图7(a和b)所示为本研究的数据结果，数据以平均值±标准差表示，*P＜0.01。
该数据表明，由LAD结扎诱导的心肌梗塞8周后将SKMB移植到该梗塞区域周围没有引起所述梗塞区域的新血管再生(7a)。然而，通过在乳头肌水平上的缩短分数检测表明，SKMB移植确实能够产生少量(～20％)然而具有统计学意义地显著改善LV功能(6.8±1.0％ vs.8.1±1.1％，P＜0.01)(7b)。
对细胞为基础和直接腺病毒VEGF传输的新血管再生反应比较了直接病毒注射与病毒转染SKMB移植的血管再生反应。在每种情况下，LAD结扎诱导的心肌梗塞后8周，通过1×107pfu的AdVEGF-165(n＝4)，或1百万用AdLuc(n＝3)或AdVEGF-165(n＝6)转染的SKMB对所述梗塞区周围进行5次等量分开注射。利用因子VIII免疫组化鉴定血管，并通过计数正位于乳头肌水平下方的组织切片中因子VIII标记的血管来进行血管密度的定量分析。
图8显示了所述梗塞区域中，通过直接腺病毒注射与通过表达VEGF-165的细胞移植血管密度的比较。数据以平均值±标准差表示，*P＜0.05。
无论是在接受VEGF-165的腺病毒注射还是接受VEGF-165表达SKMB移植的动物中均观察到显著的血管密度增加。这两种治疗策略均没有血管瘤形成的数量和组织学证据。与直接病毒注射比较，还观察到采用细胞移植处理的动物血管密度明显增加。
图9(a-f)所示为分别为通过1百万用AdLUC(A，D)、1×107pfuAdVEGF-165(B，E)转染的SKMB或1百万用AdVEGF-165转染的SKMB(C，F)对所述梗塞区域周围进行5次等量分开注射4周后所述梗塞区域切片照片。(A-C)为H&E染色，(D-F)为因子VIII的免疫组化分析。
图9(a-f)的照片表明，SKMB移植后的所述梗塞区域相对无血管(图9(a和d))。通过任何形式的VEGF-165治疗后的新血管再生引起的血管密度的增加是以增加的毛细血管和小动脉数量为特征的(图9(b，c，e和f))。
图10(a和b)显示通过1×107pfu AdVEGF-165(a)或1百万用1×107pfuAdVEGF-165转染的SKMB(b)进行5次等量分开注射4周后所述梗塞区域周围的代表性H&E染色切片。
治疗后4周，所述动物的用腺病毒注射的梗塞区域周围一致性显示炎症浸润(图10a)，其未出现在用VEGF-165表达SKMB移植的任何动物中(图10b)。
细胞为基础的VEGF传输导致左心室功能的改善为测定直接病毒注射或细胞为基础的VEGF-165表达是否会改善LV功能，在心肌梗塞后8周，用生理盐水、1×107pfu AdVEGF-165(n＝4)、用AdLuc(n＝3)或AdVEGF-165(n＝6)转染的1百万SKMB对所述梗塞区域周围进行5次等量分开注射。4周后通过超声心动图定量分析LV功能。
图11(a和b)显示由缩短分数(％)(A)或相对与生理盐水对照(B)表示的LV功能。数据以平均值±标准差表示，*P＜0.01。
用于这些研究的所述LAD结扎模型可导致显著的缩短分数的降低。与接受编码VEGF-165的腺病毒的直接注射的心脏比较，采用表达VEGF-165的细胞移植的心脏的LV功能明显改善(图11a)。此外，采用表达VEGF-165的SKMB进行移植比单独用SKMB移植所观察到的LV功能改善明显提高(图11b)。虽然用VEGF-165编码腺病毒直接注射可产生血管密度的显著增加，但与单独的生理盐水注射比较，这种治疗策略不能改善LV功能(图11b)。
来自这些第二系列试验的数据表明，腺病毒和细胞为基础的VEGF-165传输均能诱导所述梗塞区域周新血管再生(与单独的SKMB比较，血管密度分别增加50±7％和145±29％)。以细胞为基础的而不是腺病毒的VEGF-165传输能导致心肌功能的显著增强(与生理盐水对照比较，缩短分数增加69.1±8.2％和1.5±5.8％)，甚至与单独的SKMB传输比较也增强(增加19.1±10.7％)。来自第二系列试验的数据进一步表明，细胞为基础的VEGF传输能够产生高于直接腺病毒注射的治疗效果，并提示当考虑SKMB移植时，已经发展的腺病毒载体可作为辅助治疗的潜在应用。
这些途径均可导致局部的VEGF的瞬时表达，并且本研究的所有动物最终以1×107pfu的编码腺病毒的VEGF处理。
两种VEGF传输策略均在整个的梗塞区域中观察到显著的新血管再生，并且采用单独的SKMB处理，在这些动物中观察到左心室功能的较少的增加。表达VEGF-165的SKMB的移植导致显著的血管密度的增加，并且以缩短分数定量，LV功能增强达70％。另一方面，虽然采用编码VEGF-165的腺病毒注射产生所述梗塞区域中血管密度的增加，但这种治疗不能改善LV功能。
利用SKMB与VEGF的共同作用得到的LV功能的协同改善的潜在机制可能与VEGF诱导造血干细胞(HSC)从骨髓中释放有关。已表明，在小鼠中，血管内皮生长因子(VEGF)给药动员CD34+造血干细胞，导致新细胞再生的增加。虽然两种传输策略有相似的HSC释放是可能的，但当不出现通常与腺病毒注射相关的炎症反应(且与VEGF-165表达SKMB的移植无关)时，所述进入心肌的HSC更容易分化为心肌细胞。
方法LAD结扎所有动物实验得到了动物研究委员会(Animal Research Committee)的批准，并将所有动物饲养在Cleveland临床基地的AAALAC动物设施中。用50mg/kg的戊巴比妥钠麻醉动物，插管，使用压力循环啮齿动物呼吸机(Kent Scientific Corp，RSP1002)以室内空气每分钟80次进行通气。在外科显微镜(Leica M500)下通过左前降支(LAD)的结扎在150-175g雄性Lewis大鼠中诱导产生前壁MI。
2D-超生心动图使用与Sequoia C256(Acuson)连接的15-MHz线性阵列传感器(lineararray transducer)，在LAD结扎后5-7天和8周，以及SKMB移植后4周，进行2D-超生心动图的检测。在每次超生心动图中用开他命(ketamine)(50mg/kg)对大鼠进行轻微的镇静。对于LV容积和壁厚度的定量，我们数字记录了从正位于乳头肌下方的mid-LV的短轴切面(short axisview)上观测的2D钳(clip)和m-模式图像，这能使在不同大鼠中得到相同解剖位置的一致的检测。检测由两个双盲的观察者使用ProSolve脱线(offline)进行。每只动物的每种检测进行6次，从对处理手段不知情的观察者记录的5个中随机选择3个m-模式钳。当分析LV功能时，从M-模式记录中计算缩短分数。缩短分数(％)＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD*100，其中LVEDD左心室舒张末期容积，LVESD左心室收缩末期容积。从恰好位于乳头肌水平下方的短轴切面测量前壁和后壁之间的距离来检测容积。此外，在舒张末期检测前壁厚度。
细胞的制备及细胞与病毒的传输从一些Lewis大鼠(Harlan Labs)的前肢中收集骨骼肌成肌细胞，放入175ml培养瓶(Falcon)中，并在含有10％胎牛血清、300mg/l ECGS以及抗生素青霉素、链霉素和吡啶羧酶(ofloxacin)的DMEM中培养。当细胞到达75％融合时进行传代以避免分化。
在细胞移植前一天，在CMV启动子控制下，用1×107pfu/ml的表达VEGF-165的E1、E3缺少的复制缺陷腺病毒或荧光素酶(对照)转染纯化的成肌细胞。在移植的当天，用胰蛋白酶收集成肌细胞，在PBS中进行充分的清洗来去除游离的病毒颗粒，并在移植前立即进行再生。随后麻醉动物，通气并进行外侧开胸术(lateral thoracotomy)来直接观察梗塞区域。在每只动物的5个区域中注射约1×106个细胞。类似地，通过每次0.2×107pfu共5次的注射来实现对梗塞周围的直接病毒注射。每次注射的体积为100μL。在所有的试验中，沿梗塞区域的周围边界的左侧和右侧分别进行两次注射，第五次注射位于所述梗塞区域周围的LV尖部。
腺病毒构建由Gen Vec，Inc(Gaithersburg，MD)慷慨惠赠编码VEGF-165的腺病毒构建。简而言之，从美国典型培养收集中心(American Type CultureCollection)获得293细胞(ATCC CRL.1573)并保持在含10％牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培养液(DMEM)中。通过在反向末端重复序列(ITR)的左侧末端相邻的唯一限制性位点将穿梭质粒载体线性化来产生引-、E3-缺失的腺病毒载体AdVEGF-165，并与ClaI消化的H5d1324DNA共转染到293细胞中。两次连续斑点纯化后，将载体原料(stocks)在293细胞中繁殖，并通过氯化铯梯度上三个连续带(three sequential banding)来纯化。纯化的病毒用含10mM Tris，pH7.8，150mM NaCl，10mM MgCl2及3％蔗糖的缓冲液来透析，并储存在-80℃直到使用。由细胞肥大病毒即刻早期启动子来控制转基因的表达。
组织学分析大鼠安乐死后，在移植4周后，进行HistoChoice(Amresco Inc.，Solon，OH)灌注固定后，收集其心脏，并垂直于LV长轴将其分割成3个等份。中间心室部分用石蜡包埋并在正位于乳头肌下方分割成6μm厚的切片用于免疫组织化学分析。使用苏木精和伊红染色切片用于组织学分析。为辅助血管鉴定，用因子VIII(Santa Cruz Biotehnology)的抗体和HRP标记的山羊抗小鼠第二抗体来标记切片。这些切片用苏木精对应标记。由不知晓每只动物特性的训练有素的观察者来计数每只动物整个梗塞区域的血管。
统计学分析数据用平均值±标准差表示。通过Student t-检验进行组间比较。
序列表<110>Penn，Marc<120>细胞为基础的VEGF传输<130>CCF-6374<140>US 10/426,769<141>2003-04-30<160>8<170>Patentln version 3.1<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>载体<400>1aataagaaat gcggccgcat ggacgccaag gtcgtcgctg tgctggcc 48<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCDNA3.1载体<400>2tctagacttg tttaaggctt tgtccaggta ctcttgga 38<210>3<211>21<212>DNA
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<223>寡核苷酸引物<400>3ttgccagcac aaagacactc c 21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>寡核苷酸引物<400>7atgcccctgc cgattctttg20<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>8tgttgttgct tttcagcctt gc 2权利要求
1.在缺血损伤组织中刺激干细胞分化的方法，所述的缺血损伤组织含有第一浓度的干细胞和第一浓度的VEGF，所述的方法包括如下步骤将所述的缺血损伤组织中的VEGF从第一浓度增加到第二浓度；及，将所述的缺血损伤组织的干细胞浓度从所述第一浓度增加到第二浓度，当所述的缺血损伤组织中的所述VEGF浓度增加时，所述的干细胞浓度同时增加。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的增加干细胞浓度的步骤包括给予能够引起干细胞从骨髓动员到缺血损伤组织的外周血的试剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的能够引起干细胞从骨髓动员到外周血的试剂选自细胞因子、趋化因子和化疗试剂。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述的试剂包括G-CSF。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述的增加干细胞数量的步骤包括注射干细胞到外周血中。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述的增加缺血损伤组织中的VEGF浓度的步骤包括作用细胞使其在所述的缺血损伤组织中表达VEGF。
7.如权利要求6所述的方法，其中使用基因治疗来作用所述的细胞使其表达VEGF。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述的被作用使其表达VEGF的细胞包括用于再回输的体外培养后并被介入到所述的缺血损伤组织中的细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述的被作用使其表达VEGF的细胞包括自体同源细胞，其在培养前收集自欲进行治疗的个体。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述的被作用使其表达VEGF的细胞包括所述缺血损伤组织中的细胞。
11.如权利要求6所述的方法，其中所述的缺血损伤组织含有第一浓度的SDF-1，并进一步包括在增加所述缺血损伤组织中VEGF浓度的同时将所述缺血损伤组织中的SDF-1浓度从所述的第一浓度增加到第二浓度的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其中通过作用所述缺血损伤组织中的细胞使其表达SDF-1来增加所述缺血损伤组织的SDF-1浓度。
13.如权利要求11所述的方法，其中通过向所述细胞中介入表达载体来作用所述细胞使其表达SDF-1，所述的表达载体包括编码SDF-1的核酸。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的被作用使其表达SDF-1的细胞包括用于再回输的体外培养后并介入到所述缺血损伤组织中的细胞。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述的被作用使其表达SDF-1的细胞包括自体同源细胞，其在培养前收集自欲进行治疗的个体。
16.如权利要求6所述的方法，其中所述的被作用使其表达SDF-1的细胞包括所述缺血损伤组织中的天然细胞。
17.在梗塞的心肌中刺激干细胞分化的方法，所述的方法包括如下步骤介导细胞进入所述的梗塞心肌中，所述的细胞被作用在所述的梗塞心肌中表达VEGF；及，给予引起所述干细胞从骨髓动员到所述梗塞心肌的外周血的试剂，当所述的VEGF在所述的梗塞心肌中表达时，所述的干细胞同时从所述骨髓被动员到所述外周血中。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述的引起干细胞从所述骨髓动员到所述外周血的试剂选自细胞因子、趋化因子和化疗试剂。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述的试剂包括G-CSF。
20.如权利要求17所述的方法，其中使用基因治疗来作用所述的细胞使其表达VEGF。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的被作用使其表达VEGF的细胞被表达载体转染，所述的表达载体包括编码VEGF的核酸。
22.如权利要求17所述的方法，进一步包括在作用所述细胞使其表达VEGF之前对细胞进行用于再回输的体外培养的步骤。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述的被作用使其表达VEGF的细胞包括在培养前收集自欲进行治疗的个体的自体同源细胞。
24.如权利要求17所述的方法，其中所述的梗塞心肌含有第一浓度的VEGF，所述的被作用使其表达VEGF的细胞在所述缺血损伤组织中将所述VEGF的浓度从第一浓度增加到第二浓度。
25.如权利要求17所述的方法，其中所述的被作用在所述梗塞心肌中表达VEGF的细胞还被作用在所述缺血组织中表达SDF-1。
26.如权利要求17所述的方法，其中通过介入表达载体到所述的用于再回输的体外培养细胞来作用所述细胞使其表达SDF-1，所述表达载体包括编码SDF-1的核酸。
27.在梗塞的心肌中刺激干细胞分化的方法，所述的方法包括如下步骤将骨骼肌成肌细胞介入到所述梗塞心肌中，所述的骨骼肌成肌细胞被在所述梗塞心肌中表达VEGF的表达载体转染；及给予使干细胞从骨髓动员到所述梗塞心肌外周血的集落刺激因子，在所述的梗塞心肌中所述VEGF被表达的同时，所述的干细胞从所述骨髓中动员到所述外周血中。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述的从所述骨髓动员的干细胞分化为心肌细胞。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述的干细胞分化促进所述梗塞心肌中组织再生。
全文摘要
本发明公开了一种在缺血损伤组织中刺激干细胞分化的方法，包括增加所述缺血损伤组织中的VEGF浓度、及当所述缺血损伤组织中的VEGF浓度增加时增加所述缺血损伤组织的干细胞浓度的步骤。
文档编号C12N5/06GK1725954SQ200380106167
公开日2006年1月25日 申请日期2003年10月29日 优先权日2002年11月6日
发明者马克·S·佩恩, 阿尔曼·T·阿斯卡里, 马修·凯德罗夫斯基 申请人:克里夫兰诊所基金会