专利名称：将基因转导入t细胞中的方法
技术领域：
本发明涉及将基因转导入T细胞中的方法。
背景技术：
造血细胞的基因修饰是一种用于治疗自身免疫性疾病、免疫缺陷以及由抗肿瘤免疫激活的肿瘤的引人注目的策略。在各种血细胞之中，自从早期的ADA-SCID(由腺苷脱氨酶缺陷引起的严重联合免疫缺陷疾病)基因治疗(Blaese，R.M.等，Science，1995，270475-480；Altenschmidt，U.等，J.Mol.Med.，1997，75259-266；Misaki，Y.等，Mol.Ther.，2001，324-27)以来，T淋巴细胞已经成为基因传递的对象。然而，T细胞对使用当前可用的载体例如逆转录病毒进行的基因传递是相对抗性的，这在当前已成为基因传递的障碍。
考虑到在治疗自身免疫性疾病、器官异体移植后的排斥、肿瘤或此类中的临床应用，活化的T淋巴细胞的亚群显然是理想的基因修饰对象(Altenschmidt，U.等，J.Mol.Med.，1997，75259-266；Hege，K.M.和Roberts，M.R.，Curr.Opin.Biotechnol.，1996，7629-634；Tuohy，V.K.等，J.Neuroimmunol.，2000，107226-232)。早期关于基因标记的临床报告证实，由肿瘤抗原活化的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)转移到在肿瘤耐受个体中的肿瘤，暗示TIL是用于将治疗基因传递到肿瘤中的理想的运载工具(Rosenberg，S.A.等，N.Engl.J.Med.，1990，323570-578)。在自身免疫和器官移植中也期待活化的T淋巴细胞有类似的特性。然而，大概因为通过当前可用的载体将基因传递到活化的T细胞中的效率很低，近10年来只进行了很少量的这类研究。
近来，一种新发现的用于将基因传递到T淋巴细胞中的工具，即基于人免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒载体，由于其定向CD4淋巴细胞的HIV向性，受到了相当多的关注。作为近几年来所付出的努力的结果，将HIV基因传递到活化的T细胞中的效率已经通过中心DNA瓣(central DNA flap)的构建被显著地改善了，中心DNA瓣能促进载体基因组输入到核中和促进其整合到染色体中，相对于通过使用常规的HIV载体达到的15％的效率，其效率可达到平均51％(Dardalhon，V.等，Gene Ther.，2001，8190-198)。然而，对基于致病病毒、特别包括HIV的慢病毒载体来说，潜在的安全性的担忧延迟了它们的临床应用(Buchschacher，G.L.Jr.和Wong-Staal，F.，Blood 2000，952499-2504)。毫无疑问开发更安全的能更有效将基因传递到T细胞中的替代物必需持续不断的努力。
发明内容
为了寻找能有效地将基因转导入T细胞中的载体，在各种条件下将载体转导到T细胞中并测量基因转导效率。结果，本发明人发现副粘病毒(Paramyxovirus)载体对于抗原活化的T细胞具有很高的基因转导效率。基因转导是对抗原活化的T细胞特异的，即载体对活化的T细胞的基因转导效率显著高于对原初(naive)T细胞的基因转导效率。副粘病毒载体可以优选用作将基因转导入抗原活化的T细胞的载体。
尽管T淋巴细胞定向的基因治疗显示了治疗各种免疫学疾病的可能性，不论进行复杂操作的必要性，基因转导的低效率已经成为迄今为止在T细胞基因治疗中的主要制约。本发明已经证明了副粘病毒载体可以使用很简单的步骤实现在活化的T细胞中特异性表达外源基因，从而已经克服了上述T细胞基因治疗的难题。本发明已使对活化的T细胞特异的基因传递成为可能。因此，期待将本发明用于在免疫疾病中利用T细胞定向的基因传递的免疫学修饰策略。
即，本发明涉及将基因转导入T细胞中的方法，更具体涉及(1)将基因转导入T细胞中的方法，其中所述方法包括使携带该基因的副粘病毒载体与活化的T细胞接触的步骤；(2)根据(1)的方法，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒(Sendai virus)载体；(3)转导了外源基因的T细胞的制备方法，其中所述方法包括使携带所述基因的副粘病毒载体与活化的T细胞接触的步骤；(4)根据(3)的方法，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒载体；(5)转导了外源基因的T细胞，其根据(3)或(4)的方法来制备；(6)用于将基因转导入活化的T细胞中的副粘病毒载体；和(7)根据(6)的载体，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒载体。
本发明提供利用副粘病毒载体将基因转导入T细胞中的方法，包括使携带待转导基因的副粘病毒载体与活化的T细胞接触的步骤。本发明人发现，这种副粘病毒载体能以极高的效率将基因转导入活化的T细胞中。对于原初T细胞，副粘病毒载体的基因转导低效率表明这种载体的基因转导是对抗原活化的T细胞特异的。因此，本发明的方法可优选用于将基因选择性转导入活化的T细胞中。T细胞作为在治疗癌症和其他疾病中用于控制免疫系统的对象非常重要，本发明的方法可适用在这些疾病的基因治疗中。基因转导可在任何期望的生理性水溶液中进行，例如培养基、生理盐水、血液和体液。
另外，本发明提供将期望的基因转导入T细胞中的方法，包括步骤(a)活化T细胞，和(b)用携带期望的基因的副粘病毒载体接触活化的T细胞。这种方法也被包括在本发明的将基因转导入T细胞的方法中。T细胞可以通过抗原刺激来活化。活化T细胞的步骤使得通过副粘病毒载体进行有效的基因转导成为可能。T细胞活化可以在存在副粘病毒载体时进行，或在使副粘病毒载体与这些T细胞接触之前进行。
通过副粘病毒载体进行的靶向T细胞的基因传递的一个重要优点是，其容许用简单的技术实现高效率的基因传递。如先前报道的，使用逆转录病毒和慢病毒将基因传递入T细胞中，为了优化基因传递需要通过离心来浓缩淋巴细胞，还需要使用有毒的药物例如polybrene(Bunnell，B.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，927739-7743；Chuck，A.S.，Hum.Gene Ther.，1996，7743-750；Chinnasamy，D.等，Blood 2000，961309-1316；Fehse，B.等，Br.J.Haematol.，1998，102566-574)。另一方面，仅需要简单加入副粘病毒溶液而不需任何特殊药物的帮助就可以实现很好的基因传递。另外，与用鼻粘膜(Yonemitsu，Y.等，Nat.Biotechnol.，2000，18970-973)、脉管系统(vasculature)(Masaki，I.等，FASEB J.，2001，151294-1296)、视网膜组织(Ikeda，Y.等，Exp.Eyp Res.，2002，7539-48)等观察到的典型结果类似，通过仙台病毒载体(SeV)向活化的T细胞最适宜地传递基因，可以通过暴露于T细胞相对短的时间(少于30分钟，数据未示出)来进行。从临床的观点来看，副粘病毒载体介导的基因传递的这些特征，能简化本发明中的T淋巴细胞的活体外基因修饰，并使该过程中细胞生存力的损失最小化。
本发明人发现，在体外人淋巴细胞的细胞密度越低，转导了基因的细胞的比例就越低，在鼠细胞中也观察到了相同的结果。因此，在本发明中用于基因转导的细胞密度优选相对较高。细胞密度在一近似的范围内，例如，1×106/ml到4×106/ml，优选4×106/ml到8×106/ml，更优选8×106/ml到1×107/ml，是适当的。
载体以一定的MOI(感染复数)给药，范围为优选1到500，更优选2到300，再进一步优选3到200。载体与T细胞短期接触，例如1分钟或更久，优选3分钟或更久，5分钟或更久，或10分钟或更久，是足够的。或者，接触时间可以是20分钟或更久，例如，大约1到60分钟，更特定为5到30分钟。无需说明，接触可以比这更久，例如几天或更久。
近来，利用一些精细的和有效的技术，包括完全人工的抗原呈递细胞(APC)系统，其能利用免疫突触(immunological synapses)用抗CD3和抗CD28以及4-1BB配体来刺激T细胞(Maus，M.V.等，Nat.Biotechnol.，2002，20143-148)，可以很容易地制备足够数量的T细胞克隆。通过组合这样的技术，衍生自SeV的载体系统在针对各种免疫学疾病的T细胞介导的基因治疗的临床应用方面将具有重大的治疗潜力。
本发明还提供选择性的将基因转导入活化的T细胞的方法，包括允许携带基因的副粘病毒载体与包含活化的和原初T细胞的细胞群共存的步骤。“选择性地将基因转导入活化的T细胞”是指与原初T细胞相比，活化的T细胞被有效转导了。例如，本发明提供一种方法，包括向包含活化的和原初T细胞的细胞群添加携带基因的副粘病毒载体的步骤。由于副粘病毒载体优先于原初T细胞将基因转导入活化的T细胞中，该方法使得选择性地将基因转导入活化的T细胞成为可能。或者，通过允许T细胞与载体共存然后通过处理活化这些T细胞，可以将载体选择性地转导入活化的T细胞中。这些方法也被包含在本发明的将基因转导入T细胞的方法之中。
T细胞，也称为T淋巴细胞，表达识别由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原肽复合物的T细胞受体。T细胞主要分化自骨髓干细胞，在胸腺中经历正选择(选择识别自身MHC的T细胞所有组分)和负选择(消灭识别自身抗原的T细胞所有组分)，在外周血和淋巴组织中作为成熟的原初T细胞出现。T细胞是主要的淋巴细胞，其能识别衍生自蛋白抗原、肿瘤抗原、异体抗原、病原体及其他的肽，在个体中产生抗原特异性免疫反应(适应性免疫)。T细胞在产生针对这些肽的抗体(体液免疫)方面起辅助作用，或通过自身成为防护的(armed)T细胞来诱导细胞免疫。
活化的T细胞是指受抗原、有丝分裂原等刺激而被诱导处于增殖/分化的状态的T淋巴细胞。简单地说，活化的T细胞是指作为通过T细胞受体结合或直接酶激活的细胞内酪氨酸激酶激活、之后是肌醇磷脂代谢的加速和细胞内钙浓度的增加、白细胞介素(IL)-2的产生和IL-2受体的表达、以及额外细胞信号的产生的结果，经历了DNA合成、细胞分裂和增殖/分化的T细胞。根据T细胞活化时的生物学环境，从各种类型的分化的T细胞中产生各种细胞因子。
另外，在本发明中活化的T细胞优选是由抗原活化的T细胞。通过仙台病毒载体的基因转导针对抗原活化的T细胞是选择性的。对于抗原非特异性T细胞而言转导效率很低，抗原非特异性T细胞是从在活体外对抗原应答的特异性T细胞旁侧活化的(bystander-activated)。因此，载体介导的基因转导效率可以通过用抗原活化T细胞、或通过进行相当的活化来显著地提高。
抗原活化的T细胞是指，具有对于上述抗原呈递细胞的MHC与肽或衍生自特定抗原的类似物的复合物而言有适当的亲合力的受体，并通过受体与复合物的结合传递活化信号的T细胞。抗原活化的T细胞优选是指由通过适当的共同受体例如CD28和4-1BB的信号传递来活化的T细胞。抗原活化的T细胞优选能增殖，能爆发形成(blast formation)，能产生各种细胞因子例如IL-2、IL-4和IFN-γ，能表达细胞毒分子例如Fas配体和穿孔素，能激活抗原(例如CD40配体)呈递细胞和/或B细胞，等等。抗原特异性T细胞在存在MHC和呈递肽的抗原呈递细胞时，激活抗原呈递细胞和/或B细胞并刺激淋巴结中及其他抗体的产生。在外周组织局部，抗原特异性T细胞具有从活体中排除非自身蛋白、非自身细胞和病原体的主要功能，该功能通过例如由于产生的细胞因子和细胞毒性分子而诱导细胞毒性和炎症来起作用。
可以通过分级分离法制备活化的T细胞。例如，可以根据人T细胞在活化时改变CD抗原的表达模式的特性，从原初T细胞中分离出活化的T细胞。具体方法包括通过负选择收集T细胞，通过使用磁珠分离法或流式细胞术用抗暴露在活化的T细胞上的CD45RO的抗体来分拣。CD45RA+和CD62L+双阳性T细胞是原初T细胞，其余的被认为不是活化的T细胞就是记忆T细胞。因此，同时抗CD45RA和CD62L的抗体可被优选用于通过使用磁珠分离法或流式细胞术来分拣和获得活化的T细胞或原初T细胞的级分。在分级分离法中使用的抗体可被用于所有使用已知的与T细胞活化有关的标记物组合的方法。另外，将活化的T细胞分级分离为具有特定功能的群、例如那些具有趋化因子受体或细胞因子受体的群的方法，也被包括在本发明中。分级分离法也包括已知的方法例如那些使用相对密度的方法。
也可以通过抗原刺激来活化原初T细胞从而制备活化的T细胞。例如，原初T细胞可以通过在固定了抗CD3抗体(10μg/ml)和抗CD28抗体(10μg/ml)的平板上以下述的浓度培养，优选与同时添加的分化自外周血单核细胞的成熟树状细胞培养来活化。另外，如在通过肿瘤抗原活化的部分所描述的，原初T细胞也可以在补充了树状细胞和肽或蛋白抗原的培养基中活化。
例如，当使用人的异体抗原时，抗原活化的T细胞可以如此制备从供体和受体收集外周血样本；利用外周血淋巴细胞分离液从每个样本中分离淋巴细胞；调整淋巴细胞悬浮液的浓度至1×107细胞/ml；将受者的细胞悬浮液和以30Gy照射过的来自供体的细胞悬浮液(各500μl)移液到24孔板的每个孔中；在存在人IL-2(5到100U/ml)时培养约7天。传代培养物可以每7天用照射过的供体淋巴细胞进行再刺激。抗原特异性T细胞系优选是经历了至少三次抗原刺激(包括第一次)的T细胞系。或者，使用例如固定了抗CD3和抗CD28抗体的珠或细胞进行第二次抗原刺激之后已被刺激来增殖的T细胞，也被包括在抗原活化的T细胞之中。
可以通过如下来获得用肿瘤抗原等等活化的T细胞快速冻融肿瘤细胞(4个循环或更多)，向分化自外周血的树状细胞添加细胞溶解物，在暴露于20到30Gy的辐射之后使用这些细胞作为抗原呈递细胞，将这些抗原呈递细胞与分离自外周血的T细胞共培养，在仅存在IL-2(5到100U/ml)或有额外的优化的细胞因子例如IL-7时培养7天，并每7天再刺激一次进行三次(Fields，R.C.等，Proc.Natl.Acad.Aci.USA，1998，959482-9487)。此处使用的树状细胞包括那些通过已知的方法获得的所有树状细胞，已知的方法使用细胞因子例如GM-CSF和IL-4来增殖和分化造血干细胞，例如外周血单核细胞、骨髓、脐带血和活动的外周血。
可以利用T细胞分离液来分离外周血T细胞。当已知一个抗原的有效的肽时，可以利用通过与I类和II类四聚体形成的肽复合物分离抗原特异T细胞的方法来获得T细胞。
除上述方法之外，当特异的抗原是已知的时，也可以通过利用该抗原、或衍生自该抗原的肽或蛋白的活化方法来制备活化的T细胞。已知的活化T细胞的方法例如利用凝集素等的非特异性活化方法也可用来制备活化的T细胞。本发明中抗原活化的T细胞也包括这样获得的这些T细胞。
这些活化的T细胞可以通过与适当的生长因子、细胞因子和抗原、和抗原呈递细胞(包括饲养细胞、分化的树状细胞或人工的APC)、或与不呈递任何抗原的抗原呈递细胞等共培养来进行传代。也可以采用其他适合于被治疗的疾病的传代方法。例如，对感染免疫等的转移免疫疗法而言，在抗原活化期间T细胞产生各种细胞因子，因此，在T细胞进入活体内时很可能发生例如发烧的副作用。另外，用于转移免疫的T细胞必须仅在感染时表现它们的功能。因此，现有一种制备静止的活化T细胞(所谓的记忆T细胞)的方法，它通过使用副粘病毒载体将基因转导入抗原活化的T细胞中、然后在不存在抗原时与APC共培养。
在本发明中，副粘病毒载体是具有感染性的基于副粘病毒的病毒颗粒，是用于将基因转导入细胞中的工具。此处“感染性”是指副粘病毒载体维持细胞附着能力的能力和将载体携带的基因转导到该载体所附着的细胞内部的能力。优选实施方案中，本发明的副粘病毒载体具有掺入到其基因组RNA中用于表达的外源基因。本发明的副粘病毒载体可具有复制能力或是没有复制能力的缺陷型载体。“具有复制能力”是指当病毒载体感染宿主细胞时，病毒在细胞中复制以产生有感染性的病毒颗粒。
“重组病毒”是指通过重组多核苷酸生产的病毒。“重组多核苷酸”是指其中的核苷酸不象在自然情况中那样在一端或两端连接的多核苷酸。具体地，重组多核苷酸是其中多核苷酸链的键被人工修饰(切割和/或连接)了的多核苷酸。重组多核苷酸可以通过本领域已知的基因重组方法结合多核苷酸合成、核酸酶处理、连接酶处理等的组合的方式来产生。重组病毒可以通过表达通过基因操作构建的编码病毒基因组的多核苷酸和重构病毒来产生。例如，重组副粘病毒可以通过从cDNA重构来产生(Y.Nagai，A.Kato，Microbiol.Immunol.，43，613-624(1999))。
在本发明中，“基因”是指遗传物质，编码转录单位的核酸。基因可以是RNA或DNA。在本发明中，编码蛋白质的核酸被称为该蛋白质的基因。另外，基因可以不编码蛋白质。例如，基因可以编码功能性的RNA，例如核酶或反义RNA。基因可以是天然出现的或人工设计的序列。另外，在本发明中，“DNA”既包括单链DNA也包括双链DNA。此外，“编码蛋白质”是指多核苷酸在正义和反义链中包含编码蛋白质的氨基酸序列的ORF，从而在适当条件可以表达蛋白质。
在本发明中，“副粘病毒”是指属于副粘病毒科的，或属于其衍生物的病毒。副粘病毒是一组以无节段的负链RNA作为其基因组的病毒，包括副粘病毒科(包括呼吸道病毒(Respirovirus)，也称作副粘病毒)、Rubulavirus、和Morbillivirus)和肺病毒科(Pneumovirinae)病毒(包括Pneumoviurs和Metapneumovirus)。应用于本发明的副粘病毒的具体例子是仙台病毒、纽卡斯尔病病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(RS病毒)、牛瘟病毒、犬瘟病毒、猿副流感病毒(SV5)、和人副流感病毒1、2和3。更具体的是，这样的例子包括仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹型犬瘟病毒(phocine distempervirus，PDV)、犬型犬瘟病毒(canine distemper virus，CDV)、海豚麻疹病毒(dolphin molbillirirus，DMV)、peste-des-petits-ruminants病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、Hendra病毒(Hendra)、Nipah病毒(Nipah)、人副流感病毒-2(HPIV-2)、猿副流感病毒5(SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒-4b(HPIV-4b)、腮腺炎病毒(Mumps)、和纽卡斯尔病病毒(NDV)。更优选的例子是选自由仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹型犬瘟病毒(PDV)、犬型犬瘟病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、peste-des-petits-ruminants病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、Hendra病毒(Hendra)、和Nipah病毒(Nipah)构成的组的病毒。本发明的病毒优选是那些属于副粘病毒科(包括呼吸道病毒、Rubulavirus、和Morbillivirus)或其衍生物的病毒，更优选是那些属于呼吸道病毒属(也称作副粘病毒)或其衍生物的病毒。应用于本发明的呼吸道病毒属的病毒的例子是人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、牛副流感病毒3(BPIV-3)、仙台病毒(也称作鼠副流感病毒-1)、和猿副流感病毒-10(SPIV-10)。在本发明中最优选的副粘病毒是仙台病毒。这些病毒可以衍生自自然株、野生株、突变株、实验室传代株、人工构建株等等。
使副粘病毒载体上携带的基因处于基因组RNA中的反义方向。基因组RNA是指具有与副粘病毒的病毒蛋白质形成核糖核蛋白(RNP)的功能的RNA。包含在基因组中的基因由RNP表达，基因组RNA被复制，并形成子代RNP。通常，副粘病毒的基因组这样构成，从而使病毒基因以反义方向处于3’前导区和5’尾随区之间。在单个基因的ORF之间存在转录终止序列(E序列)-间插序列(I序列)-转录起始序列(S序列)，从而允许编码每个ORF的RNA被转录为单独的顺反子。
编码副粘病毒的病毒蛋白的基因包括NP、P、M、F、HN和L基因。“NP、P、M、F、HN和L基因”分别是指编码核壳-、磷酸-、基质-、融合-、血凝素-神经氨酸酶-和巨大-蛋白的基因。属于副粘病毒科的每个病毒中的基因一般如下列。通常，NP基因也被列作“N基因”。
呼吸道病毒...NP...P/C/V...M...F...HN...-...LRubulavirus...NP...P/V...M...F...HN..(SH)...LMorbillivirus...NP...P/C/V...M...F...H...-...L例如，每个仙台病毒基因的核苷酸序列的数据库登记号为对于NP基因M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218；对于P基因M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008；对于M基因D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584和X53056；对于F基因D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131；对于HN基因D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808和X56131；对于L基因D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587和X58886。其他病毒编码的病毒基因的例子是对于N基因，CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV，AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；SeV，X00087；SV5，M81442；和Tupaia，AF079780；对于P基因，CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV，M20302；PDV，X75960；RPV，X68311；SeV，M30202；SV5，AF052755；和Tupaia，AF079780；对于C基因，CDV，AF014953；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，D00047；MV，ABO16162；RPV，X68311；SeV，AB005796；和Tupaia，AF079780；对于M基因，CDV，M12669；DMV，Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z47977；PDV，X75717；RPV，M34018；SeV，U31956；和SV5，M32248；对于F基因，CDV，M21849；DMV，AJ224704；HPN-1，M22347；HPIV-2，M60182；HPIV-3，X05303；HPIV-4a，D49821；HPIV-4b，D49822；Mumps，D86169；MV，AB003178；NDV，AF048763；PDPR，Z37017；PDV，AJ224706；RPV，M21514；SeV，D17334；和SV5，AB021962；和对于HN(H或G)基因，CDV，AF112189；DMV，AJ224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2，D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB006954；Mumps，X99040；MV，K01711；NDV，AF204872；PDPR，Z81358；PDV，Z36979；RPV，AF 132934；SeV，U06433；和SV-5，S76876。然而，对于每种病毒都已知大量的株系，由于株系的不同，存在着包含与上述序列不相同的序列的基因。
通过上述E-I-S序列，将编码这些病毒蛋白质的OFR和外源基因的ORF以反义方向安置在基因组RNA中。最靠近基因组RNA 3’端的ORF仅需要位于3’前导区和ORF之间的S序列，而不需要E或I序列。另外，最靠近基因组RNA 5’端的ORF仅需要位于5’尾随区和ORF之间的E序列，而不需要I或S序列。此外，例如，通过利用内部核糖体进入位点(IRES)序列，两个ORF可以被转录为一个单独的顺反子。在这种情况下，在这两个ORF之间不需要E-I-S序列。在野生型副粘病毒中，典型的RNA基因组包括3’前导区，以反义方向按此顺序排列的编码N、P、M、F、HN和L蛋白的六个ORF，和在另一末端的5’尾随区。在本发明的基因组RNA中的病毒基因方向没有限制，但类似于野生型病毒，编码N、P、M、F、HN和L蛋白的ORF优选按这个顺序排列，位于3’前导区之后和5’尾随区之前。某些类型的副粘病毒具有不同的病毒基因，但即使在这种情况下，优选按如上述的野生型的方式排列每个基因。通常，保持了N、P和L基因的载体可以自动地从细胞中的RNA基因组表达基因，复制基因组RNA。此外，通过编码包膜蛋白的F和HN基因以及M基因的作用，形成感染性的病毒颗粒并释放到细胞外。因而，这种载体成为具有复制能力的病毒载体。待转导入T细胞的外源基因可如下述被插入到该基因组中的蛋白非编码区中，。
另外，本发明的副粘病毒载体可以是在野生型副粘病毒的任何基因上有缺陷的。例如，不包含M、F或HN基因、或它们的任意组合的副粘病毒载体，可以优选用作本发明的副粘病毒载体。这样的病毒载体可以通过，例如外部提供缺陷基因的产物来重构。如此制备的病毒载体类似于野生型病毒粘附到宿主细胞上并导致细胞融合，但是它们不形成包含与原始载体一样的传染性的子代病毒颗粒，因为导入到细胞中的病毒基因组在病毒基因上有缺陷。因此，这样的载体作为只导入一次基因的安全的病毒载体是有用的。基因组可具有缺陷的基因的例子是F基因和/或HN基因。例如，通过用表达在F基因有缺陷的重组副粘病毒载体基因组的质粒，与F蛋白表达载体和NP、P和L蛋白的表达载体一同转染宿主细胞，来重构病毒载体(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。病毒也可以通过，例如使用已经将F基因掺入到它们的染色体中的宿主细胞来产生。在这些蛋白质中，它们的氨基酸序列不必与病毒的序列相同，来自其他病毒的突变的或同源的基因可以作为替代物使用，只要在核酸导入中它们的活性与自然型的活性相同或更高就可以。
另外，可以制备包含与载体基因组所来源的病毒的包膜蛋白不同的包膜蛋白的载体作为本发明的病毒载体。例如，当重构病毒时，可以通过表达与基础病毒基因组编码的包膜蛋白不同的包膜蛋白来产生包含期望的包膜蛋白的病毒载体。这样的蛋白不受特别的限制，包括其他病毒的包膜蛋白，例如，水泡性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。本发明的病毒载体包括假型病毒载体，其包含来源于与基因组所来源的病毒不同的病毒的包膜蛋白，例如VSV-G。如果病毒载体被设计为在RNA基因组中不编码这些包膜蛋白，那么在病毒颗粒感染细胞后将绝不会表达此蛋白。
此外，本发明的病毒载体可以是，例如，在其包膜表面包含蛋白例如能粘附到特定细胞的粘着因子、配体、受体、抗体或片段的载体，或是在细胞内区域中包含和这些蛋白的嵌合蛋白并在细胞外区域中包含衍生自病毒包膜的多肽的载体。因而，能控制载体的T细胞特异性。这些蛋白质可以在病毒基因组中编码，或通过在病毒载体重构时表达不在病毒基因组中的基因(例如，其他表达载体携带的基因，或在宿主染色体中的基因)来提供。
另外，在本发明的载体中，例如载体中包含的任何病毒基因可以从野生型基因修饰得到，来降低病毒蛋白导致的免疫原性，或增强RNA转录或复制效率。具体地，例如，在副粘病毒载体中，修饰复制因子N、P和L基因中至少一个，被认为增强转录或复制功能。此外，尽管包膜蛋白HN蛋白包含血凝素活性和神经氨酸酶活性，有可能例如，如果削弱前者的活性会增加在血液中病毒的稳定性，如果改变后者的活性则可控制传染性。另外，也可能通过修饰F蛋白来控制膜融合能力。例如，可以分析F蛋白或HN蛋白的表位，其可以是细胞表面抗原分子，利用这个可以制备对于这些蛋白具有降低的抗原性的病毒载体。
此外，本发明的载体可以是在辅助基因中有缺陷的。例如，通过敲除SeV辅助基因之一的V基因，在没有阻碍培养的细胞中基因的表达和复制时，SeV对宿主例如小鼠的致病性显著地降低(Kato，A.等，J.Virol.717266-7272；Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587；Curran，J.等，WO01/04272，EP1067179)。这种减毒载体作为用于体内或活体外基因转移的无毒病毒载体是特别有用的。
副粘病毒是优良的基因转移载体。它们不具有DNA期，仅在宿主细胞质中进行转录和复制，从而不发生染色体整合(Lamb，R.A.和Kolakofsky，D.，ParamyxoviridaeThe viruses and their replication.InFields BN，Knipe DM，Howley PM，(eds).Fields of Virology.Vol.2.Lippincott-Raven PublishersPhiladelphia，1996，pp.1177-1204)。因此，不会发生安全方面的问题例如由于染色体畸变造成的转化(transformation)和永生。当作为载体使用时这种副粘病毒特征对安全性起了很大的作用。例如，外源基因表达的结果显示即使在SeV的多次连续传代之后，也几乎观察不到核苷酸突变。这表明病毒基因组是高度稳定的以及插入的外源基因长时期被稳定表达(Yu，D.等，Genes Cells2，457466(1997))。另外，存在与不具有衣壳结构蛋白质的SeV有关的性质上的优点，例如包装灵活性和插入基因大小，表明副粘病毒载体可成为用于人基因治疗的新一类高效载体。具有复制能力的SeV载体能导入大小高达至少4kb的外源基因，并能通过添加转录单位来同时表达两种或更多种基因。
另外，已知SeV在啮齿动物致病导致肺炎，但对人是不致病的。这一点也得到先前的报道的支持，对非人灵长类动物鼻部给药野生型SeV不会出现严重的不良影响(Hurwitz，J.L.等，Vaccine15533-540，1997)。这些SeV特征表明SeV载体可以被治疗性地应用于人，证明SeV载体是靶向人T细胞的基因治疗的一种有前途的选择。
本发明的病毒载体能在它们的基因组RNA中编码外源基因。通过将外源基因插入到上述的副粘病毒载体基因组中得到携带外源基因的重组副粘病毒载体。外源基因可以是需要在靶T细胞中表达的任何期望的基因，可以是编码天然出现的蛋白、或通过氨基酸残基的缺失、替换或插入从天然出现的蛋白修饰得到的蛋白的基因。例如，外源基因可以被插入到病毒基因组的蛋白非编码区的任何期望的位置。上述核酸可以被插入到基因组DNA中的，例如，3’前导区和最靠近3’端的病毒蛋白质ORF之间；每个病毒蛋白质ORF之间；和/或最靠近5’端的病毒蛋白质ORF和5’尾随区之间。另外，在F或HN基因等缺陷的基因组中，编码外源基因的核酸可以被插入到那些缺陷区中。当将外源基因导入副粘病毒中时，最好这样插入基因从而插入到基因组中的多核苷酸的链长是六的倍数(Journal of Virology，Vol.67，No.8，4822-4830，1993)。E-I-S序列应当被安排在插入的外源基因和病毒ORF之间。可以通过E-I-S序列串联插入两个或更多的基因。
在载体中携带的外源基因的表达水平可以利用添加到基因的上游(负链的3’侧)的转录起始序列的种类来控制(WO01/18223)。表达水平还可以通过在基因组中插入外源基因的位置来控制插入位置越靠近负链的3’端，表达水平越高；而插入位置越靠近5’端，表达水平越低。因而，为获得期望的基因表达水平，可以适当地控制外源基因的插入位置，从而在外源基因前和后的编码病毒蛋白质的基因的组合是最适合的。一般，由于高的外源基因表达水平被认为是有利的，优选将外源基因连接到高效转录起始序列上，并在接近负链基因组的3’端插入。具体地，将外源基因插入到3’前导区和最靠近3’端的病毒蛋白质ORF之间。或者，外源基因可被插入到最靠近3’端的病毒基因的ORF和第二个最靠近的病毒基因之间。在野生型副粘病毒中，最靠近基因组3’端的病毒蛋白质基因是N基因，第二个最靠近的基因是P基因。或者，当不希望导入的基因高水平表达时，例如，通过将外源基因插入到载体中尽可能靠近负链5’侧的位点，或通过选择低效(inefficient)的转录起始序列，可以抑制从病毒载体的基因表达水平以获得适合的效果。
为制备本发明的载体，在存在对副粘病毒成分RNP的重构必不可少的病毒蛋白质(即，N、P、和L蛋白)时，在哺乳动物细胞中转录编码副粘病毒基因组RNA的cDNA。可以通过产生负链基因组(也就是说，与病毒基因组相同的反义链)或正链(编码病毒蛋白质的有义链)来重构病毒RNP。产生正链对于载体重构效率增加是优选的。RNA末端优选尽可能精确地反映3’前导序列和5’尾随序列的末端，如在天然的病毒基因组中那样。为了精确地调节转录产物的5’端，例如，可以利用T7RNA聚合酶的识别序列作为转录起始位点在细胞内部表达RNA聚合酶。为了调节转录产物的3’端，例如，可以在转录产物的3’端编码一自我切割的核酶，容许用该核酶精确地切割3’端(Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587；和Yu，D.等，1997，Genes Cells 2457-466)。
例如，携带外源基因的重组仙台病毒载体可以根据下列描述如下构建Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587；Yu，D.等，1997，Genes Cells 2457 466；等等。
首先，制备包含目标外源基因的cDNA序列的DNA样品。DNA样品优选可以通过电泳在25ng/μl或更高的浓度时被证实为是单个质粒的。以下参考实施例说明利用Not I位点将外源基因插入到编码病毒基因组RNA的DNA中的例子。当Not I识别位点被包括在目标cDNA核苷酸序列中时，利用定点诱变等改变该碱基序列，而使其编码的氨基酸序列不改变，优选预先切除Not I位点。通过PCR从该样品扩增目的基因片段，然后回收。通过将Not I位点添加到引物对的5’区，扩增的片段的两端都变成Not I位点。E-I-S序列被设计成包括在引物中，从而在外源基因被插入到病毒基因组中之后，每一个E-I-S序列被放置在外源基因的ORF和两侧的病毒基因的ORF之间。
例如，为了保证用Not I的切割，正向侧合成的DNA序列具有一种形式，其中在5’侧选择任何不少于两个核苷酸的期望序列(优选不包含来源于Not I识别位点的序列的四个核苷酸，例如GCG和GCC，更优选ACTT)，并且将Not I识别位点‘gcggccgc’添加到它的3’侧。向该3’侧再添加九个任意的核苷酸、或九个加上六的倍数个核苷酸作为间隔区序列。再向这个3’侧添加相当于期望的cDNA的ORF的大约25个核苷酸的序列，包括并从起始密码子ATG开始数起。正向侧合成的寡DNA的3’端优选大约25个核苷酸，选自期望的cDNA从而最末的核苷酸成为G或C。
对于反向侧合成的DNA序列，从5’侧选择不少于两个的任意核苷酸(优选不包含来源于Not I识别位点的序列的四个核苷酸，例如GCG和GCC，更优选ACTT)，将Not I识别位点‘gcggccgc’添加到它的3’侧，并向该3’侧再添加寡DNA插入片段来调整长度。设计该寡DNA的长度从而使最终的PCR扩增产物的Not I片段的链长成为六的倍数个核苷酸(所谓的“六个法则(rule of six)”)；Kolakofski，D.，等，J.Virol.72891-899，1998；Calain，P.和Roux，L.，J.Viroi.674822-4830，1993；Calain，P.和Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993)。当将E-I-S序列添加到该引物时，向寡DNA插入片段的3’侧添加仙台病毒S、I、和E序列的互补链序列，优选分别为5’-CTTTCACCCT-3’(SEQID NO1)，5’-AAG-3’，和5’-TTTTTCTTACTACGG-3’(SEQ ID NO2)；并进一步向该3’侧添加与从期望的cDNA序列的终止密码子起倒数大约25个核苷酸相应的互补链序列，其长度已经被选定从而使链的最末尾的核苷酸成为G或C，来产生反向侧合成的DNA的3’端。
可以利用Taq聚合酶或其它DNA聚合酶用常用的方法来进行PCR。目标扩增片段用Not I消化，然后插入到例如pBluescript质粒载体的Not I位点。如此获得的PCR产物的核苷酸序列用测序仪证实，并且选择包含正确序列的质粒。利用Not I从这些质粒中切除插入片段，克隆到包含基因组cDNA的质粒的Not I位点中。重组仙台病毒cDNA还可以通过不使用质粒载体而直接将该片段插入到基因组cDNA的Not I位点来获得。
例如，可以根据在文献中描述的方法来构建重组仙台病毒基因组cDNA(Yu，D.等，Genes Cells 2457-466，1997；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997)。例如，将包含Not I限制位点的18bp间隔区序列(5’-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3’)(SEQ ID NO3)插入到前导序列和克隆的仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))的N蛋白的ORF之间，获得质粒pSeV18+b(+)，其包含来源于delta肝炎病毒反基因组链的自我切割核酶位点(Hasan，M.K.等，1997，J.General Virology 782813-2820)。可以通过将外源基因片段插入到pSeV18+b(+)的Not I位点中来获得包含期望的外源基因的重组仙台病毒cDNA。
可以通过在细胞中存在上述病毒蛋白质(L、P和N)时转录编码如此制备的重组副粘病毒的基因组RNA的DNA来重构本发明的载体。本发明提供编码本发明载体的病毒基因组RNA的DNA来制造本发明的载体。本发明还涉及编码载体的基因组RNA的DNA在制造本发明的载体方面的用途。可以通过本领域已知的方法来重构重组病毒(WO97/16539；WO97/16538；Durbin，A.P.等，1997，Virology 235323-332；Whelan，S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392；Schnell.M.J.等，1994，EMBO J.134195-4203；Radecke，F.等，1995，EMBO J.145773-5784；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.等，1995，EMBO J.146087-6094；Kato，A.等，1996，Genes Cells 1569-579；Baron，M.D.和Barrett，T.，1997，J.Virol.711265-1271；Bridgen，A.和Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404)。用这些方法，可以从DNA重构负链RNA病毒包括副流感病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙台病毒。依据这些方法可以重构本发明的载体。当病毒载体DNA被制成F基因、HN基因和/或M基因有缺陷的时，这种DNA不形成原本的感染性的病毒颗粒。然而，可以通过将这些缺陷的基因和/或编码其他病毒的包膜蛋白的基因分别地导入宿主细胞中，然后在其中表达这些基因来形成感染性的病毒颗粒。
具体地，制备病毒可以通过如下步骤(a)在表达N、P和L蛋白的细胞中转录编码副粘病毒基因组RNA(负链RNA)或其互补链(正链)的cDN A；和(b)收获包含产生的副粘病毒的培养物上清液。为了转录，将编码基因组RNA的DNA连接到适当启动子的下游。如此转录的基因组RNA在存在N、L和P蛋白时复制以形成RNP复合物。然后，在存在M、HN和F蛋白时，形成包含在包膜中的病毒颗粒。例如，可以将编码基因组RNA的DNA连接到T7启动子的下游，通过T7RNA聚合酶转录为RNA。除那些包含T7聚合酶识别顺序的启动子之外，还可以使用任何期望的启动子作为启动子。或者，可将体外转录的RNA转染到细胞中。
对从DNA到基因组RNA的起始转录所必不可少的酶，例如T7RNA聚合酶，可以通过转导表达它们的质粒或病毒载体，或，例如，通过将RNA聚合酶基因掺入到细胞的染色体中以便允许诱导其表达，然后在病毒重建时诱导表达来提供。另外，对载体重构必不可少的基因组RNA和病毒蛋白质通过，例如，转导表达它们的质粒来提供。在提供这些病毒蛋白质时，使用辅助病毒例如野生型或某种突变的副粘病毒。
用于将表达基因组RNA的DNA转导到细胞中的方法包括，例如，(i)产生用于靶细胞内在化的DNA沉淀的方法；(ii)产生包含适合于被靶细胞内在化、并具有低细胞毒及正电荷特性的DNA的复合物的方法；和(iii)利用电脉冲来瞬间产生靶细胞膜上的、大小足够使DNA分子通过的孔道的方法。
对于(ii)，可以使用多种转染试剂。例如，可以用DOTMA(Roche)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)等等。对(i)，例如，可以用利用磷酸钙的转染方法，尽管用这种方法转移到细胞中的DNA通过吞噬泡被内在化，已知仍有足够量的DNA进入到核中(Graham，F.L.和Van Der Eb，J.，1973，Virology 52456；Wigler，M.和Silverstein，S.，1977，Cell 11223)。Chen和Okayama研究了转移技术的优化，报道说(1)细胞和共沉淀的孵育条件是2到4％CO2、35℃和15到24小时，(2)环状DNA的活性比线性DNA高，和(3)当沉淀混合物中DNA浓度是20到30μg/ml时获得最佳的沉淀(Chen，C.和Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.72745)。(ii)的方法适合于瞬时转染。通过以期望的DNA浓度比来制备DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885M.W.5×105)混合物用于进行转染的方法是早已知道的。由于大多数复合物在内体中分解，也可添加氯喹来增强效果(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。(iii)的方法称为电穿孔法，由于它们没有细胞选择性通常比方法(i)或(ii)使用得更多。在电流脉冲持续时间、脉冲的形状、电场的效力(电极、电压间的缺口)、缓冲液的传导率、DNA浓度和细胞密度的最理想的条件时，这些方法的效率可以很好。
在上述三类中，(ii)的方法操作简便、并且便于利用大量细胞进行许多样品的检验、使转染试剂适合于将DNA转导入细胞中用于载体重构。优选使用Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，Cat No.301305)、或DOSPERLiposomal Transfection Reagent(Roche，Cat No.1811169)，但是转染试剂不局限于这些。
具体地，从cDNA的病毒重建可以，例如，如下进行在大约6到24孔的塑料板中，或在100-mm培养皿等中，利用包含10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100单位/ml青霉素G和100μg/毫升链霉素)的极限必需培养基(MEM)培养来源于猴肾的LLC-MK2细胞直到约100％汇合。然后用，例如，两个噬斑形成单位(PFU)/细胞的重组痘苗病毒vTF7-3，其表达T7 RNA聚合酶并已经通过20分钟的紫外线照射在存在1μg/ml补骨脂素时灭活了(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838122-8126，1986；Kato，A.等，Genes Cells 1569-579，1996)，来感染上述细胞。添加的补骨脂素的数量和紫外线照射时间可以适当地调整。在感染之后一个小时，2到60μg，更优选3到20μg的编码重组仙台病毒的基因组RNA的DNA与表达病毒RNP产生所必不可少的转移动作(trans-acting)病毒蛋白的质粒(0.5到24μg的pGEM-N、0.25到12μg的pGEM-P、和0.5到24μg的pGEM-L)(Kato A.等，Genes Cells 1569-579，1996)一起，利用脂质转染法或用Superfect的方法进行转染。例如，编码N、P和L蛋白的表达载体的数量比值优选为2∶1∶2，质粒数量适当地在1到4μg pGEM-N、0.5到2μg pGEM-P、和1到4μg pGEM-L的范围内调整。
培养转染的细胞，如所期望的，在包含100μg/ml的利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)、更优选在仅包含40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)的无血清MEM中。设置最优的药物浓度以使痘苗病毒导致的细胞毒性最小化，并使病毒回收率最大化(Kato，A.等，1996，Genes Cells 1569-579)。在转染后培养约48到72小时之后，收获细胞，然后通过重复冻融三次使细胞破碎。用包含RNP的破碎的物质重感染LLC-MK2细胞，进行培养。或者，回收培养物上清液，添加到LLC-MK2细胞的培养液中以感染它们，然后培养细胞。转染可以通过，例如，用lipofectamine、聚阳离子脂质体等形成复合物，并将复合物转导入细胞中来实施。具体地，可以使用各种转染试剂。例如，可以用DOTMA(Roche)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、和DOSPER(Roche#1811169)。为了避免在内涵体中分解，也可添加氯喹(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。在用RNP转导的细胞中，病毒基因从RNP表达并且进行RNP复制，扩增载体。通过稀释如此获得的病毒溶液(例如，106倍)，然后重复扩增，痘苗病毒vTF7-3可以被完全地去除。重复扩增，例如，三次或更多次。如此获得的载体可以保存在-80℃。为了重构没有复制能力和缺乏编码包膜蛋白的基因的病毒载体，表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞可以被用于转染，或表达包膜蛋白的质粒可以被共转染。或者，缺陷型病毒载体可以通过培养用表达包膜蛋白的LLK-MK2细胞覆盖的(overlaid)被转染的细胞来扩增(见WO00/70055和WO00/70070)。
如此回收的病毒的滴定度可以通过，例如，测量CIU(细胞感染单位)或血细胞凝集活性(HA)来确定(WO00/70070；Kato，A.等，1996，Genes Cells 1569-579；Yonemitsu，Y.&Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306 1999)。携带GFP(绿色荧光蛋白)标记基因等的载体的滴定度可以通过利用标记物作为指示(例如，GFP-CIU)直接计数受感染细胞来定量。如此测量的滴度可以如CIU一样处理(WO00/70070)。
只要病毒载体能被重构，在重构中使用的宿主细胞没有特别的限制。例如，在仙台病毒载体等的重构中，可用来培养的细胞例如来源于猴肾的LLC-MK2细胞和CV-1细胞，来源于仓鼠肾的BHK细胞，和来源于人的细胞。通过在这些细胞中表达适合的包膜蛋白，也可以获得包含包膜的感染性病毒颗粒。另外，为获得大量仙台病毒载体，可用从上述宿主中获得的病毒载体感染含胚的鸡蛋来扩增载体。已经发展出了利用鸡蛋制造病毒载体的方法(Nakanishi，等，ed.(1993)，“State-of-the-Art Technology Protocol inNeuroscience Research III，Molecular Neuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp.153-172)。具体地，例如，将受精卵放置于孵卵器中，在37到38℃培养9到12天以使胚胎生长。在病毒载体接种到尿囊腔中之后，将鸡蛋培养几天(例如，三天)以增殖病毒载体。可以根据使用的重组仙台病毒来变化条件例如培养时间。然后，回收包含载体的尿囊液。可以根据常用方法从尿囊液中进行仙台病毒载体的分离和纯化(Tashiro，M.，“Virus ExperimentProtocol，”Nagai，Ishihama，ed.，Medical View Co.，Ltd.，pp.68-73，(1995))。
例如，F基因缺陷的仙台病毒载体的构建和制备可以如下所述进行(见WO00/70055和WO00/70070)。
<1>构建F基因缺陷的仙台病毒的基因组cDNA，和表达F基因的质粒仙台病毒(SeV)的全长基因组cDNA，pSeV 18+b(+)的cDNA(Hasan，M.K.等，1997，J.General Virology 782813-2820)(“pSeV18+b(+)”也被称为“pSeV18+”)用SphI/KpnI消化以回收片段(14673bp)，将其克隆到pUC18中制备质粒pUC18/KS。F基因缺陷位点的构建在这个pUC18/KS上进行。F基因缺陷通过PCR连接法的组合来构建，结果是除去了F基因的ORF(ATG-TGA＝1698bp)。然后，例如，连接atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO4)以构建F基因缺陷型SeV基因组cDNA(pSeV18+/ΔF)。将通过利用引物对[正向5’-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO5，反向5’-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO6]在PCR中形成的PCR产物连接到F的上游，和将利用引物对[正向5’-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO7，反向5’-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO8]在PCR中形成的PCR产物连接到在EcoT22I的F基因的下游。如此获得的质粒用SacI和SalI消化以回收包含F基因缺陷位点的区域的4931bp片段，将其克隆到pUC18中形成pUC18/dFSS。该pUC18/dFSS用DraIII消化，回收片段，用包含pSeV18+的F基因的区域的DraIII片段替换，并连接以获得质粒pSeV18+/ΔF。
将外源基因插入到，例如，pUC18/dFSS的F基因缺陷位点中的Nsi I和Ngo MIV限制酶位点中。对此，外源基因片段可以是，例如，利用尾部为Nsi I的引物和尾部为Ngo MIV的引物扩增的。
<2>诱导SeV-F蛋白表达的辅助细胞的制备为构建表达仙台病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP诱导型的表达质粒，通过PCR扩增SeV-F基因，插入到质粒pCALNdlw(Arai，T.等，J.Virology 72，1998，p1115-1121)的独特的Swa I位点中，其设计是为允许通过Cre DNA重组酶进行基因产物的可诱导表达，从而构建质粒pCALNdLw/F。
为从F基因缺陷的基因组回收感染性的病毒颗粒，建立表达SeV-F蛋白的辅助细胞系。例如，通常被用于SeV增殖的来源于猴肾的LLC-MK2细胞系能用作所述细胞。将LLC-MK2细胞在37℃、5％CO2在补充有10％热处理灭活的胎牛血清(FBS)、青霉素G钠(50单位/ml)和链霉素(50μg/ml)的MEM中培养。因为SeV-F基因产物是细胞毒的，上述被设计为允许用CreDNA重组酶进行F基因产物的可诱导表达的质粒pCALNdLw/F，根据本领域公知的技术通过磷酸钙法(利用哺乳动物转染试剂盒(Stratagene)转染LLC-MK2细胞用于基因转导。
将质粒pCALNdLw/F(10μg)转导到利用10cm平板生长到40％汇合的LLC-MK2细胞中，然后将细胞培养在包含10％FBS的MEM中，于5％CO2的温育器在37℃培养24小时。在24小时之后，细胞脱落并悬浮在培养基(10ml)中。然后接种悬浮液到五个10cm平皿中，5ml到一个平皿中、各2ml到两个平皿中、和各0.2ml到两个平皿中，在包含G418(GIBCO-BRL)(1200μg/ml)和10％FBS的MEM(10ml)中培养。培养细胞14天，每隔一天更换培养基，以选择用基因稳定转导的细胞系。利用克隆环回收从上述培养基生长出的显示G418抗性的细胞。如此回收的每个克隆的培养物继续在10cm平板上直到汇合。
在细胞在6cm平皿上生长到汇合后，根据Saito等的方法通过用腺病毒AxCANCre以，例如，MOI＝3感染细胞来诱导F蛋白表达(Saito等，Nucl.AcidsRes.233816-3821(1995)；Arai，T.等，J.Virol 72，1115-1121(1998))。
<3>F基因缺陷的仙台病毒(SeV)的重构和扩增将已经插入了外源基因的上述质粒pSeV18+/ΔF如下转染到LLC-MK2细胞LLC-MK2细胞以5×106细胞/平皿接种到100mm平皿。当利用T7·RNA聚合酶进行基因组RNA转录时，培养细胞24小时，然后用表达T7·RNA聚合酶的重组痘苗病毒以MOI约为2在室温下感染一小时，其中的重组痘苗病毒已经用补骨脂素和长波紫外线(365nm)处理20分钟(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))。至于痘苗病毒的紫外线照射，例如，可以使用装备了五个15瓦灯泡的UV Stratalinker2400(目录No.400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，USA)。用无血清MEM洗涤细胞，然后使用适当的脂质转染试剂用表达基因组RNA的质粒转染细胞，表达质粒分别表达副粘病毒的N、P、L、F以及HN蛋白。这些质粒的数量的比值优选按该顺序设为6∶2∶1∶2∶2∶2，但不局限于此。例如，基因组RNA的表达质粒以及表达N、P、L和F加HN蛋白的表达质粒(pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，和pGEM/F-HN；WO00/70070，Kato，A.等，Genes Cells1，569 579(1996))以数量比每平皿12μg∶12μg∶4μg∶2μg∶4μg∶4μg分别地进行转染。在培养几小时之后，用无血清MEM洗涤细胞两次，在包含40μg/ml的胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraCSigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培养。回收这些细胞，并在Opti-MEM(107细胞/ml)中悬浮颗粒状物。冻融悬浮液三次，与脂质转染试剂DOSPERBoehringer Mannheim)(106细胞/25μl DOSPER)混合，在室温放置15分钟，转染上述克隆的表达F的辅助细胞(在12孔平板中106细胞/孔)，在无血清MEM(包含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中培养以回收上清液。缺乏除F以外的基因，例如，缺乏HN或M基因的病毒也可以通过与此类似的方法制备。
例如，当制备基因缺陷的病毒载体时，包含缺乏不同病毒基因的基因组的两种或多种载体可以被导入到相同细胞中，一个载体中缺乏的病毒蛋白可以通过其它载体的表达来提供。这些载体相互补足并形成感染性病毒颗粒，从而启动了病毒载体扩增的复制循环。也就是说，本发明的两种或多种载体可以互补病毒蛋白的组合注入到细胞中，来大规模并低成本地生产缺乏各自的病毒基因的病毒载体的混合物。与那些不缺乏病毒基因的病毒相比，这些病毒由于它们的病毒基因缺陷而使基因组大小减小，从而能携带大型的外源基因。这些病毒基因缺陷的病毒不具有增殖能力并在细胞外被稀释。这造成维持共感染困难，导致不育，从管理这些病毒的环境释放的观点来看是有利的。
要通过本发明副粘病毒转导的外源基因没有特别的限制，天然出现的蛋白的例子有激素、细胞因子、生长因素、受体、胞内的信号传导分子、酶、肽等等。蛋白可以是分泌型蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白等等。人工蛋白质的例子有融合蛋白例如嵌合的毒素、显性失活的(negative)蛋白(包括可溶性受体分子和膜结合型受体)、缺失体细胞粘着分子、细胞表面分子等等。人工蛋白质可以是具有添加的分泌信号、膜定位信号、核定位信号等的蛋白。通过表达转基因例如反义RNA分子、RNA剪切核酶之类，可以抑制在T细胞中表达的特定基因的功能。将用疾病的治疗基因制备的病毒载体作为外源基因给药可以进行基因治疗。可通过直接或间接(活体外)给药本发明的病毒载体，用基因表达方法表达，例如，治疗效果有希望的外源基因或在病人体内供应不足的内源基因，来将载体用于基因治疗。另外，本发明的方法也可以用于再生型药物中的基因治疗载体。
当向个体或细胞给药复制型副粘病毒载体之后，由于治疗的完成等原因必须抑制病毒载体的增殖，也有可能通过给药RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂来特异性抑制病毒载体的增殖而不对宿主造成损害。
根据在此描述的产生病毒的方法，本发明的病毒载体可以例如，1×105CIU/ml或更高、优选1×106CIU/毫升或更高、更优选5×106CIU/ml或更高、更优选1×107CIU/ml或更高、更优选5×107CIU/ml或更高、更优选1×108CIU/ml或更高，并更优选5×108CIU/ml或更高的滴度释放到产生病毒的细胞的培养基中。病毒滴度可以用本说明书描述的方法或其他的方法(Kiyotani，K.等，Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)来测量。
回收的副粘病毒载体可以纯化为基本上纯的。纯化可以通过本领域已知的纯化和分离方法，包括过滤、离心分离和柱纯化，或其任意组合来进行。“基本上纯的”指病毒载体占样品的主要比例，在该样品中病毒载体作为组分存在。典型地，基本上纯的病毒载体可以通过证实来源于病毒载体的蛋白在样品中所有蛋白中的比例为10％或以上、优选20％或以上、更优选50％或以上、优选70％或以上、更优选80％或以上、和更进一步优选90％或以上(然而，排除作为载体或稳定剂添加的蛋白)来鉴定。纯化副粘病毒的具体方法的例子有使用硫酸纤维素酯或交联多糖硫酸酯的方法(审查公开的日本专利申请特公昭62-30752号公報，特公昭62-33879号公報，和特公昭62-30753号公報)，和那些涉及吸附到包含岩藻糖硫酸盐和/或其降解产物的多糖上的方法(WO97/32010)。
在包含载体的组合物制备中，如果必要载体可以与选择的药学上可接受的载体或赋形剂组合。“药学上可接受的载体或赋形剂”指可以与载体一起给药、不会明显地抑制基因由载体转导的物质。例如，载体可以用生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、或培养基适当地稀释以形成组合物。当载体在鸡蛋等上生长时，该“药学上可接受的载体或赋形剂”可包含尿囊液。另外，包含载体的组合物可包括载体或赋形剂例如去离子水和5％右旋糖水溶液。此外，除上述之外，组合物可包含植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、抗生物剂等等。组合物也可以包含防腐剂或其它添加剂。包含本发明载体的组合物作为试剂和药物是有用的。
期望利用本发明载体将基因转导入T细胞用于多种病症的基因治疗。可以进行这样的基因治疗来，例如，纠正由于基因缺陷导致的基因异常细胞表达、通过导入外源基因来给予细胞新的功能、或通过导入对特定基因有抑制作用的基因来抑制细胞中不需要的功能。
本发明的方法在，例如，自身免疫疾病等中抑制排异反应方面是有用的。例如，可期望通过在体内抑制T细胞的异体反应或诱导抑制性树状细胞来控制排异反应。这包括利用建立的活化T细胞系，它识别导致自身免疫病的异体抗原或主要抗原，并在根据本发明方法建立的T细胞系中主动地(actively)表达抑制型细胞因子例如IL-10。另外，还期待利用通过本发明方法的T细胞基因转导来治疗癌症。例如，当携带血管增殖抑制基因的载体被转导入识别肿瘤特异抗原的T细胞中时，期望会出现对局部肿瘤生长的抑制效果。或者，就脱髓鞘疾病例如多发性硬化来说，通过利用被目标抗原活化的T细胞来转导基因，例如PDFG基因(血小板衍生的生长因子A)，它能从干细胞中区别少突胶质细胞，从而诱导少突胶质细胞的再生(Vincent，K.T.等，Journalof Neuroimmunology，2000，107226-232)，期望可控制疾病的进展。另外，有可能将本发明方法应用于所有的疾病和损伤，其中期望利用抗原活化的T细胞或抗原非特异性活化的T细胞(利用抗体或促分裂原活化的T细胞)的基因转导会产生治疗效果。
宿主衍生的因子例如干扰素(IFN)影响副粘病毒转导的基因的转录(Kato，A.等，J.Virol.，2001，753802-3810)。由于异体抗原刺激的T细胞系产生大量的IFN，IFN例如IFN-γ可能影响在副粘病毒载体上携带的基因的转录(Biron，C.A.和Sen，G.C.，Interferons and other cytokine.InFields BN，Knipe DM，Howley PM，(eds).Fields of virology.Vol.2.Lippincott-Raven PublishersPhiladelphia，1996.321-351)。实际上，本发明人发现来自IFN-γ受体缺陷的小鼠的异体活化的T细胞系维持较高的EGFP表达水平超过3周。因此，在需要高水平表达目标基因的定向T细胞的基因治疗中，抑制IFN-γ信号转导可能是有效的。
载体剂量可根据病症、体重、年龄、性别和病人症状，以及给药目的、给药组合物的形式、给药方法、需转导的基因等变化；然而，本领域的技术人员能适当确定剂量。可以适当选择给药途径。也可以进行局部或全身给药。载体的剂量优选在药学上可接受的载体中给药，范围为优选约105CIU/ml到约1011CIU/ml、更优选约107CIU/ml到约109CIU/ml，最优选约1×108CIU/ml到约5×108CIU/ml。在人体中，单次剂量优选在2×105CIU到2×1011CIU的范围内，只要副作用在临床上可接受的范围内，可以给药一次或多次。对每天给药次数也一样。对于非人动物，例如，上述剂量可以根据受试动物和人之间的给药目标部位的体重比或体积比(例如平均值)进行转换，转换过的剂量可以给药给动物。就活体外给药来说，使载体在体外与T细胞接触(例如，在试管或培养皿中)。优选以MOI范围1到500、更优选2到300，进一步优选3到200将载体给药给T细胞。包含本发明载体的组合物所给药的受试者包括所有哺乳动物，例如人、猴、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛和犬。
附图简述
图1是显示SeV到鼠T细胞(活化的或原初T细胞)的基因转导效率的一系列点图。在存在或不存在SeV-EGFP(2.5×107PFU)(MOI＝62.5)时培养鼠淋巴细胞两天，回收细胞并用APC结合的抗CD3和PE结合的抗CD4(上块(panel))或CD8抗体(下块)染色。点图显示了在存活的CD3+CD4+或CD3+CD8+淋巴细胞之中CD4或CD8和GFP的表达。在各自象限的右上角，基因转导效率以EGFP阳性细胞的百分比表示。左块细胞培养在无Ab包被的孔中。中块细胞培养在包被了活化抗体(抗CD3和抗CD28抗体)的孔中。右块细胞培养在包被了活化抗体(抗CD3和抗CD28抗体)不含SeV-EGFP的孔中。类似的数据得自与表达萤光素酶的SeV-luci培养的细胞(阴性对照)。重现性的数据得自超过四个独立实验。
图2是显示对T细胞系进行SeV介导的基因转导的效率的一系列点图。在存在或不存在SeV-EGFP(2.5×107PFU)(MOI＝62.5)时培养T细胞系两天，回收的细胞用APC结合的抗CD3和PE结合的抗CD4(上块)或CD8(下块)抗体染色。最左侧块的点图说明了CD3和CD4或CD8在门控的(gated)(分类的)存活淋巴细胞中的表达，在各自的四个象限中显示淋巴细胞的百分比。在其它块中的点图说明在门控的CD3阳性存活淋巴细胞之中的CD4或CD8T细胞的EGFP表达。左数第二个块中，细胞与照射过的B6刺激物(刺激细胞)培养。左数第三个块中，细胞与照射过的Balb/c刺激物(刺激细胞)培养。在最后的块中，细胞与无SeV-EGFP的照射过的Balb/c刺激物(刺激细胞)培养。重现性的数据得自超过四个独立实验。
图3是显示在原初T细胞和T细胞系的异体抗原特异性活化下基因转导效率的一系列点图。原初2C淋巴细胞(上块标有字母“1×”)或2C T细胞系(下块标有字母“3×”)在存在或不存在SeV EGFP(2.5×107PFU)时培养两天。回收细胞并用APC结合的抗CD8和生物素化的抗克隆型T细胞受体mAb(1B2)然后是PE链霉抗生物素蛋白染色。最左边块表明在门控的存活淋巴细胞之中CD8+1B2+T细胞的百分比。在其它块中的点图表明存活的克隆型T细胞的EGFP表达。左数第二个块中，细胞与照射过的B6刺激物(刺激细胞)培养。左数第三个块中，细胞与照射过的Balb/c刺激物(刺激细胞)培养。在最后的块中，细胞与无SeV-EGFP的照射过的Balb/c刺激物(刺激细胞)培养。重现性的数据得自两个独立实验。
图4是显示旁侧活化对SeV介导的基因转导效果的柱状图。在存在(通过在X轴下的加号标示)或不存在(通过在X轴下的减号标示)SeV-EGFP(2.5×107PFU)时，用照射过的Balb/c(黑色柱)、B6(灰色柱)、或C3H(格子柱)淋巴细胞(1×107/ml)、或无淋巴细胞(白色柱)各100μl刺激50μl的2C原初淋巴细胞(1×107/ml)和50μl的B6原初淋巴细胞(1×107/ml)两天。得到在门控的存活CD8+1B2+T细胞之中EGFP阳性细胞的百分比。Y轴显示了EGFP阳性克隆型细胞的百分比。每个数据显示为一式三个孔(n＝3)的平均百分比±SEM(平均标准误差)，类似的结果在两个独立实验中观察到。在用C3H刺激的2C T细胞和那些用Balb/c刺激的2C T细胞之间存在统计学显著性差异(p＜0.01)，但在用C3H刺激的2C T细胞和那些用B6刺激的2C T细胞之间不存在统计学显著性差异。用单向方差分析和Fisher’s PLSD检验确定统计显著性。
图5是显示用SeV-EGFP转导的T细胞中GFP表达维持的一系列点图。在存在SeV-EGFP的情况下，用照射过的B6(左列)或Balb/c(右列)淋巴细胞刺激来自2C-tg小鼠的T细胞系六天。用新鲜的培养基洗涤转导的T细胞，然后用照射过的B6或Balb/c刺激物在缺乏SeV的情况下再刺激六或七天。点图显示了存活的克隆型T细胞的EGFP表达。各自的象限的右上角的数字表明EGFP阳性或阴性的克隆型T细胞在13天(顶块)或20天(中间块)时的百分比。显示了来自刺激了20天的未感染的2C T细胞系(阴性对照)的数据(底块)。这些数据是两个独立实验的代表。
图6是显示在人T细胞的SeV介导的基因转导效率的一系列点图，其显示了活化的或原初T细胞的基因转导效率。200μl的人淋巴细胞(4×106/ml)在存在或不存在SeV-EGFP(2.5×107PFU)时培养(MOI＝31)两天。回收细胞并用APC结合的抗CD3和PE结合的抗CD4(顶块)或CD8(底块)抗体染色。点图说明了在存活的CD3+CD4+或CD3+CD8+T淋巴细胞之中CD4或CD8和GFP的表达。基因转导效率用在T细胞之中EGFP阳性细胞的相对比来表示，在标绘图中示出。左块细胞培养在无Ab包被的孔中。中块细胞培养在包被了活化抗体(抗CD3和抗CD28抗体)的孔中。右块细胞培养在包被了活化抗体(抗CD3和抗CD28抗体)无SeV-EGFP的孔中。类似的数据得自与SeV-luci培养的细胞(阴性对照)。在各自象限的右角中的数字表示了单独的群的百分比。重现性的数据得自超过四个独立实验。
图7是显示对人原初或记忆/活化的T细胞的基因转导效率的一系列点图。新分离的T细胞与SeV-EGFP在无Ab包被的孔中培养两天。回收细胞并用APC结合的抗CD62L、PE结合的抗CD3、和生物素化的抗CD45RA抗体、然后用链霉抗生物素蛋白PerCP染色。在左块中，点图表示了在门控的(分类的)存活CD3阳性T细胞中CD62L和CD45RA的表达。在右块中，点图表示了CD62L高和CD45RA高T细胞中或者是原初T细胞(顶块)或者是记忆/活化的其他T细胞(底块)的CD3和EGFP的表达。重现性的数据得自利用来自健康供体的样本的三个实验。
图8是显示对人T细胞系进行基因转导的效率的一系列点图。如在图6中描述，人T细胞系在存在或不存在SeV-EGFP时培养两天，并按图6中描述进行分析。显示了CD4(顶块)和CD8(底块)T细胞中EGFP表达的百分比。左块细胞培养在无Ab包被的孔中。中块细胞培养在包被了活化抗体(人抗CD3和抗CD28抗体)的孔中。右块细胞培养在包被了活化抗体(人抗CD3和抗CD28抗体)无SeV-EGFP的孔中。
图9是评估SeV进入原初或活化的T细胞内的图。在存在(白或灰色柱)或不存在(黑色柱)UV灭活的SeV-luci时在37℃温育B6淋巴细胞(4×106/ml)30分钟之后，洗涤细胞并与SeV-EGFP(MOI＝62.5)在37℃温育30分钟。在洗涤细胞三次后，将200μl的细胞悬浮液(2×106/ml)在包被了鼠抗CD3和抗CD28抗体的活化的孔中、在不存在病毒的情况下培养两天。作为阳性对照，制备的细胞与SeV-EGFP(2.5×107PFU)一起在活化的孔中培养两天(白色柱)。回收细胞并用APC结合的抗CD3和PE结合的抗CD8抗体染色。得到在门控的(分类的)存活CD3+CD4+或CD3+CD8+T细胞之中EGFP阳性细胞的百分比。Y轴显示EGFP阳性CD4(左边三柱)或CD8(右边三柱)T细胞的百分比。各自的数据用一式三个孔(n＝3)的平均百分比±SEM来表示。在单独的群之间存在统计上显著的差异(p＜0.01)。用单向方差分析和Fisher’sPLSD检验确定统计显著性。
图10是评价SeV进入原初或活化的T细胞内的图。在不存在(沿X轴最左边的数值)或存在(X轴上其他数值)SeV-EGFP(MOI＝100)时在4℃温育B6淋巴细胞30分钟之后，洗涤该B6淋巴细胞并在37℃无SeV时温育0、15、30、45或90分钟。在洗涤细胞三次后，将温育了指定时期的细胞在包被了小鼠抗CD3和抗CD28抗体的活化的孔中培养两天。回收细胞并如图9所述染色(CD4T细胞用黑圈表示，CD8T细胞用黑方块表示)。作为阳性对照，制备的细胞与SeV-EGFP(2.5×107PFU)一起培养(MOI＝62.5)(CD4T细胞用白圈表示，CD8T细胞用白方块表示)。数值用一式三个孔(n＝3)的平均百分比±SEM来表示。在CD4T细胞和CD8T细胞中，在37℃温育0分钟和温育15分钟之间均存在统计学显著性差异(p＜0.01)。另外，在37℃温育0分钟和温育90分钟之间也存在统计学显著性差异(p＜0.01)。用单向方差分析和Fisher’s PLSD检验确定统计学显著性。
发明的最佳实施方式以下，将参考实施例更详细解释本发明，但不能将其理解为局限于此。将本说明书中引用的所有参考合并到说明书中作为说明书的部分。通过单向方差分析和Fisher’s PLSD检验用p＜0.05的统计学显著性确定统计显著性。
动物近亲繁殖的雌性C57BL/6(H-2b)(缩写为B6)小鼠，C3H(H-2k)小鼠，和Charles River级小鼠Balb/c(H-2d)小鼠购自KBT Oriental(Tosu，Japan)。2C转基因小鼠(2c-tg，H-2b)是I类MHC抗原Ld反应性T细胞受体(TCR)的转基因小鼠，见Sha，W.C.等，Nature，1988，335271-274中描述。小鼠全部人道地处理，维持在无特定病原体的设备中，用标准的啮齿动物食物和自来水喂养。使用7到9周龄的小鼠。动物试验由九州大学(Kyushu University)动物试验伦理委员会(Committee of Ethics on Animal Experiments)和重组DNA实验伦理委员会(Committee of Recombinant DNA Experiments)检查，根据美国国家卫生部(National Institute of Health)的“动物实验准则”进行。还遵循“实验动物照料原则(Principles ofLaboratory Animal Care)”和“实验动物的照料与使用指导(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)”。
重组SeV的构建携带EGFP(水母增强绿色荧光蛋白)基因的SeV(SeV-EGFP)或携带萤火虫萤光素酶基因的SeV(SeV-luci)按照Kato等(Kato，A.等，Genes Cells，1996，1569-579；Sakai，Y.等，FEBS Lett.，1999，456221-226)的描述来构建。具体地，将具有Not I限制酶位点的18bp间隔区序列5’-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3’(SEQ ID NO3)插入到携带编码SeV基因组的cDNA的载体上5’非转录区和核壳(N)基因的起始密码子之间。此克隆的包含SeV基因组cDNA的载体还包含来源于delta肝炎病毒的反基因组链的自我切割核酶位点。编码(SeV-EGFP的)EGFP或(SeV-luci的)萤光素酶的完整cDNA，利用包含Not I位点和来自新SeV用于外源基因表达的E和S信号序列标签组的引物，通过PCR扩增，并插入到上述克隆的基因组的Not I位点中。包含外源基因的模板SeV基因组的全长，根据所谓的“六个法则”(Kolakofsky，D.等，J.Virol.，1998，72891-899)被安排为包含六的倍数个核苷酸。携带外源基因的模板SeV基因组和编码N、磷酸(P)和巨大(L)蛋白的质粒(依次为pGEM-N、pGEM-P和pGEM-L)用商业上可获得的阳离子脂质复合，并与痘苗病毒vT7-3共转染到CV-1或LLCMK细胞中(Fuerst，T.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.US A，1986，838122-8126)。四十小时后，冻融三个循环破裂细胞，注入到十天龄的含胚鸡蛋的绒毛膜尿囊腔中。然后回收病毒并通过在鸡蛋中第二次增殖除去痘苗病毒。通过利用鸡红细胞进行血细胞凝集分析来确定病毒滴度(Yonemitsu，Y.&Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306，1999)，将病毒保存在-80℃待用。
单克隆抗体(mAb)生物素化的人CD45RA(HI100)mAb、别藻蓝蛋白(APC)结合的抗鼠CD3(145-2C11)、APC结合的抗小鼠CD8(53-6.7)、和APC结合的抗人CD62L(DREG-56)mAbs、藻红蛋白(PE)结合的抗人CD3(UCHT1)、PE-结合的抗人CD4(RPA-T4)、PE结合的抗小鼠CD4(GK1.5)、和PE结合的抗小鼠CD8(53.67)mAbs、PE结合的链霉抗生物素蛋白以及多甲藻黄素叶绿素α蛋白(perCP)结合的链霉抗生物素蛋白购自PharMingen(San Diego，CA，USA)。
APC-结合的抗人CD3(UCHT1)mAb购自DAKO(Kyoto，Japan)。PE结合的抗人CD8(NU-Ts/c)mAb购自Nichirei(Tokyo，Japan)。抗2C克隆型TCR决定簇的mAb由本发明人从杂交瘤培养物上清液(1B2)(Sha，W.C.等，Nature，1988，335271-274)中利用HiTrap蛋白G柱(Amersham Pharmacia BioscienceInc.，Buckinghamshire UK)纯化，并利用EZ-LinkTMNHS-LC Biotin(PIERCEBiotechnology Inc.，Rockfold，IL，U.S.A.)生物素化。
为了活化T细胞，使用了购自PharMingen(San Diego，CA，USA)的纯化的抗小鼠CD3(145-2C11)、抗小鼠CD28(37.51)、抗人CD3(HIT3a)的和抗人CD28(CD28.2)的mAbs。
细胞的制备使用补充了20mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、0.2％碳酸氢钠、50μM 2-巯基乙醇(2-ME)、10μg/ml庆大霉素钠和热灭活的10％胎牛血清(FBS)(ICN Biomedicals，Inc.，Arora，OH，U.S.A.)的RPMI 1640培养基(SIGMA，St.Louis，MO，U.S.A.)作为完全培养基。
为制备小鼠淋巴细胞，收集脾和淋巴结并置于冰上的完全培养基中。通过在两个载玻片之间挤压这些组织来在培养基中破碎脾和淋巴结。如此制备的细胞悬浮液从不锈钢的网孔中滤过，用培养基洗涤两次。利用氯化铵碳酸钾裂解缓冲液裂解红细胞。利用Ficoll PaqueTMPLUS(Pharmacia Biotech Inc.，Wikstroms，Sweden)从健康供体提供的血液中分离人外周血淋巴细胞(PBL)。利用标准台盼蓝(染色)排除分析系统来计数存活的有核细胞。
小鼠和人T细胞系的建立为制备异体反应性T细胞系，B6或2C-tg小鼠淋巴细胞(5×107)与30Gy照射过的(137Cs；Gammacell 40，Atomic Energy of Canada Limited，Ottawa，Canada)Balb/c淋巴细胞(5×107)在RPMI 1640完全培养基(总体积10ml)在50ml烧瓶(35-3014；FALCON，Beckton Dickinson Bioscience，Inc.，FranklinLake，NJ，U.S.A.)中共培养六天。添加人IL-2(10ng/ml)(Immuno-BiologicalLaboratories Co.，Ltd，Fujioka，Japan)后，每周用照射过的Balb/c淋巴细胞刺激活化的异体反应性T细胞一次。因为利用这个方法从B6获得的T细胞系主要由CD8T细胞组成，为了获得CD4T细胞系，用照射过的淋巴细胞刺激排除了CD8的B6淋巴细胞。为制备排除了CD8的淋巴细胞，新分离的淋巴细胞与抗小鼠CD8mAb(Lyt-2.2Meiji，Tokyo，Japan)在4℃温育30分钟，然后与Low-ToxTM-M Rabbit completent(Cedarlane，Ontario，Canada)在37℃温育50分钟。刺激了三次或更多次的B6或2C-tg异体抗原活化的T细胞被用作鼠T细胞系。
为制备人T细胞系，健康供体提供的外周血淋巴细胞(5×106)与来自不同的健康供体的30Gy照射过的外周血淋巴细胞(5×106)，在存在人IL-2(10ng/ml)时在RPMI-1640感染培养基(1ml)中共培养七天。在那之后，所述淋巴细胞用照射过的淋巴细胞再刺激至少每周两次，并用作T细胞系。
流式细胞术分析离心收集的鼠细胞，在4℃与生产抗小鼠CD16/32mAb的杂交瘤(2.4G2；American type culture collection，Manassas，VA，U.S.A)的培养物上清液(50μl)温育30分钟。对于人淋巴细胞省略此步骤。将细胞在完全培养基中洗涤，在4℃与多种mAbs的组合温育30分钟，再用完全培养基洗涤两次。生物素化的mAb用PE链霉抗生物素蛋白或PerCP链霉抗生物素蛋白检测。标记的细胞利用FACS Caliber用CellQuest程序(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)和FLOWJO程序(TREE STAR，Inc.，San Carlos，CA，USA)进行分析。为了检测并除去死细胞，在使用细胞计数器之前向细胞悬浮液(250μl)添加125ng碘化丙锭(PI)。从人的活化/记忆T细胞中分离原初T细胞省略此步骤。用荧光1检测EGFP。在鼠和人的研究中，CD3+CD4+PI-细胞群表示存活的CD4T细胞，CD3+CD8+PI-细胞群表示存活的CD8T细胞。转基因克隆型T细胞，CD8+1B2+PI-细胞，表示存活的2c T细胞。原初人T细胞被确定为是那些门控(分类)为CD62L+CD45RA+CD3+的细胞，活化的/记忆人T细胞为从CD3+细胞中排除的那些(Picker，L.J.等，J.Immunol.，1993，1501105-1121；Ostrowski，M.A.等，J.Virol.，1999，736430-6435)。
通过SeV将基因传递到鼠或人T细胞中为评价对活化的或原初T细胞的基因转导效率，200μl的鼠淋巴细胞悬浮液(2×106/ml)与SeV-EGFP(2.5×107噬斑形成单位(PFU))，在无包被的或包被了抗小鼠CD3mAb(15μg/ml)和抗小鼠CD28mAb(20μg/ml)的96孔平底平板(3860-096；IWAKI，Tokyo，Japan)中培养两天。对于人淋巴细胞，200μl人外周血淋巴细胞(PBL)悬浮液(4×106/ml)或人T细胞系(4×106/毫升)与SeV-EGFP(2.5×107PFU)，在无包被的或包被了抗人CD3mAb(10μg/ml)和抗人CD28mAb(10μg/ml)的96孔平底平板中培养两天。异体活化的T细胞系的基因转导效率的评价通过使100μl的B6或2C-tg小鼠T细胞系(2×106/ml)与100μl 30Gy照射过的B6或Balb/c鼠淋巴细胞(1×107/ml)在存在SeV-EGFP(2.5×107PFU)时共培养两天来进行。或者，可以通过使200μl B6或2C-tg小鼠T细胞系(2×106/ml)与SeV-EGFP(2.5×107PFU)在包被了抗体(抗CD3抗体和抗CD28抗体)的96孔平底平板上共培养两天来实现。为评价被异体抗原特异性活化的原初T细胞的基因转导效率，使用从2C-tg小鼠分离的新鲜淋巴细胞。在替换性实验中，2.5ml的来自2C-tg小鼠的T细胞系(2×106/ml)用来自B6或Balb/c鼠的2.5ml 30Gy照射过的淋巴细胞(1×107/ml)在存在SeV-EGFP(6×108PFU)时刺激六天(每三或四天将一半培养基替换为新鲜培养基)。用新鲜的培养基洗涤转导的T细胞，然后用照射过的B6或Balb/c淋巴细胞在缺乏SeV时再刺激六或七天(每六或七天进行再刺激)。为评价旁侧活化的效果，50μl 2C原初淋巴细胞(1×107/ml)和50μl B6原初淋巴细胞(1×107/ml)的混合悬浮液用100μl照射过的Balb/c、B6或C3H淋巴细胞(1×107/ml)在存在SeV-EGFP(2.5×107PFU)时刺激两天。
每个样品一式三份在37℃在包含5％CO2的湿润空气中培养。EGFP表达水平在SeV感染之后48h达到最大值。活化mAb的适当浓度或SeV的最适剂量通过滴定实验确定。用于转导最大量EGFP进入T细胞的最低SeV剂量是感染复数(MOI)12.5，超过500的SeV MOI对T细胞有细胞病变效应。
SeV进入原初或活化T细胞中的评价在存在或不存在用2000mj UV(UV crosslinker；Pharmacia Biotech Inc.，San Francisco，CA，USA)灭活的SeV-luci(5×108PFU/ml)时，以1∶1比例在37℃温育B6淋巴细胞(4×106/ml)30分钟。该细胞用完全培养基洗涤，并与SeV-EGFP(2.5×108PFU/ml)以1∶1比例在37℃温育30分钟。洗涤三次之后，将200μl细胞悬浮液(2×106/ml)在包被了抗小鼠CD3mAb(15μg/ml)和抗小鼠CD28mAb(20μg/ml)的96孔平底平板中培养两天。存在于最后的洗涤培养基中的污染物SeV几乎没有能力将EGFP转导入没有在活化孔中预处理过的T细胞中，因此该洗涤步骤被证实为是充分的。为作阳性对照，将制备的原初细胞与SeV-EGFP(2.5×107PFU)在活化的孔中培养两天。为检查附着的SeV从原初T细胞上的释放，将10ml B6淋巴细胞(2×106/ml)在存在或不存在SeV-EGFP(2×109PFU)时在4℃温育30分钟，用完全培养基洗涤，然后在没有SeV时在37℃温育0、15、30、45或90分钟。洗涤三次之后，细胞在活化孔中在37℃培养两天。为作阳性对照，将制备的原初细胞与SeV-EGFP(2.5×107PFU)培养。
重组SeV以高效率将EGFP转导入活化的T细胞检查仙台病毒载体是否能将EGFP基因转导入T细胞。首先，鼠淋巴细胞与SeV-EGFP(MOI＝62.5)培养48h。当在未刺激的鼠CD3+CD4+或CD3+CD8+T细胞(也称为CD4T细胞或CD8T细胞)中EGFP阳性细胞的比例小(分别为0.5到1.5％和0.8到2.0％)的时候，被固定的抗CD3抗体和抗CD28抗体非特异性活化的CD3+CD4+或CD3+CD8+T细胞高水平地表达EGFP，EGFP阳性T细胞的比例显著地升高(分别为65到85％和0到92％)(图1)。对于CD4和CD8T细胞的情况，EGFP阳性细胞的比例以SeV剂量依赖性方式增加，几乎达到MOI 12.5的稳定水平。
然后，为检查是否有可能将基因转导入抗原活化的T细胞系，使用异体抗原作为T细胞刺激抗原，原初淋巴细胞可以对其应答并在无体内免疫的情况下在原始培养物中增殖。通过共培养来自C57BL/6的未修饰过的淋巴细胞和来自Balb/c的照射过的淋巴细胞而产生的T细胞系主要由CD8T细胞组成。然后通过将排除了CD8T细胞的淋巴细胞与照射过的刺激型淋巴细胞共培养来获得CD4T细胞系。或者，使用来自2C-tg小鼠的T细胞(2C T细胞)，其具有表达Ld-特异性TCR的大量原初T细胞克隆，从而允许在原始T细胞的抗原特异性反应中观察基因转导。正如所料，用异体抗原刺激的T细胞在存在照射过的异源淋巴细胞的情况下通过SeV被EGFP有效转导(图2)。另外，即使在不存在刺激型异源淋巴细胞的情况下，活化的T细胞也被基因有效转导。尽管在CD4和CD8T细胞中的效果是共同的，但EGFP表达水平和EGFP阳性细胞比例倾向于在CD4T细胞系中比CD8T细胞系中稍低。这些发现表明SeV能将目标基因转导入处于活化状态的T细胞。
使用来自2C-tg小鼠的T细胞来证实在抗原特异性T细胞反应中的发现。这些2C-tg鼠T细胞特异性地应答Ld，并甚至在处于它们的原初状态时从大量淋巴细胞中以CD8+1B2+群被分离出来。EGFP在仅存在异源的Balb/c刺激细胞时在原初2C T细胞中高度表达，但在存在同源的B6刺激细胞时很少表达。然而，在存在B6或Balb/c刺激细胞的情况下SeV有效地将EGFP转导入已经用Balb/c刺激细胞刺激了三次或更多次的活化的2C T细胞(图3)。此外，在37℃简单地用SeV温育T细胞系仅30分钟就足以最大化表达EGFP(数据未显示)。
另外，由于非抗原特异性的T细胞可以通过强的异体反应的旁侧效应在体外被活化，进行以下实验来证明这种强力的SeV基因转导是否限于抗原特异性活化的T细胞。原初2C T细胞被用作能应答Balb/c刺激物但不应答C3H刺激物的抗原特异性T细胞。包含C57BL/6和原初2C T细胞的混合物的应答器(应答细胞)在有或没有Balb/c、C57BL/6或C3H刺激细胞的情况下进行共培养，随后将SeV-EGFP(2.5×107PFU)添加到培养孔中。利用这个培养系统，可以检查当来自C57BL/6小鼠的T细胞在混合的淋巴细胞培养物中强烈地应答C3H刺激物时，EGFP基因是否通过SeV-EGFP被转导入2C T细胞。当使用C3H刺激细胞时，即使C57BL/6T细胞应答C3H刺激物，EGFP也没有转导入2C T细胞。当未使用刺激细胞时、和使用C57BL/6刺激细胞时观察到同样的结果(图4)。与此相反，当使用Balb/c刺激物时，2C T细胞高水平表达EGFP(图4)。因此，通过SeV的基因转导限于用特异性的抗原活化的T细胞。
在活化的T细胞中通过SeV表达转基因的持续时间然后，检查所转导基因的体外维持。活化的2C T细胞与仙台病毒共培养，在体外用Balb/c刺激物或C57BL/6刺激物维持转导的T细胞。EGFP表达水平在感染后48h的峰值表达之后快速降低，但至少维持20天(图5，数据未显示)。即使用Balb/c刺激物进行抗原再刺激，EGFP表达水平也没有增加。这些发现也在异体特异性活化的T细胞系中观察到(数据未显示)。
传递基因到活化的人T细胞和T细胞系中来自健康供体的新分离的人PBL与2.5×107PFU的SeV-EGFP表达载体(MOI＝30)培养48h。与鼠的T细胞相比，尽管未刺激的人CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞中EGFP表达强度相对低，但获得了比较高的EGFP阳性比例(分别是在15到45％的范围内平均比值＝23.1％，和在18到50％的范围内平均比值＝34.0％)(图6)。
本发明人猜测活化的/记忆T细胞群在人PBL中比在已经维持在无特定病原体条件下的鼠淋巴组织中更高。从活化的/记忆T细胞分离原初T细胞(CD45RA+CD62L+)，并分析每个T细胞群的EGFP表达。正如所料，EGFP阳性活化的/记忆T细胞与原初T细胞相比具有特别高的EGFP阳性细胞比例，原初T细胞具有低于4％的比例(图7)。对小鼠的研究显示即使在没有抗原刺激的情况下，EGFP也被有效转导入用抗原预先活化的T细胞中。因而认为在活化的/记忆表型的T细胞之中活化的T细胞在表达EGFP。相比之下，已经用固定的抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激的CD3+CD4+或CD3+CD8+T细胞剧烈表达EGFP并具有高比例的EGFP阳性细胞(分别在30到69％和50到70％的范围内)(图6)。
在人的异体抗原刺激的T细胞系中，在存在固定的抗体的情况下，CD4和CD8T细胞都显示了特别有效的基因转导，分别为97％和98％(图8)。对于这个T细胞系，在37℃简单温育仅30分钟就足以最大化EGFP表达。
发生在活化的T细胞中而在原初T细胞中不发生的SeV载体的附着后进入检查通过SeV介导的活化T细胞的特异性基因转导的可能机制。以下因素可能影响基因转导效率(i)SeV特异性受体(Markwell，M.A.和Paulson，J.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.US A，1980，775693-5697)，(ii)融合所需的公认的共同受体(Kumar，M.等，J.Virol.，1997，716398-6406；Eguchi，A.等，J.Biol.Chem.，2000，27517549-17555)，和(iii)通过T细胞活化诱导的信号转导，其可以影响进入后SeV的转录(Collins，P.L.等，Parainfluenza viruses.InFieldsBN，Knipe DM，Howley PM，(eds).Fields of virology.Vol.2.Lippincott-RavenPublishersPhiladelphia，19961205-1241)。在这些因素的研究中使用鼠T细胞。SeV介导的基因转导在活化的鼠T淋巴细胞中是有效率的，但是用新分离的鼠T淋巴细胞时几乎看不到。因此，在利用鼠T细胞的实验中，省略从活化的/记忆T细胞分离原初T细胞的步骤。
为了干预T细胞特异性受体和利用SeV的HN神经氨酸酶活性释放唾液酸残基，新分离的淋巴细胞首先在存在(预处理的原初T细胞)或缺乏(未经预处理的原初T细胞)UV灭活的SeV-luci时在37℃温育60分钟。然后这些T细胞与SeV-EGFP(MOI＝62.5)在37℃温育30分钟，再用固定的抗CD3和抗CD28抗体刺激。两天后，检查EGFP表达水平。在SeV-EGFP预处理过的原初T细胞中，被连续活化的CD4和CD28T细胞中EGFP阳性细胞的比例分别为35％和50％(图9)。然而，在用UV灭活的SeV-luci温育原初T细胞时，抑制了EGFP基因转导到活化T细胞中。即使已经用灭活的SeV-luci预温育，大部分在活化培养期间已经用SeV-EGFP温育的T细胞都表达EGFP，因此，在预处理的T细胞中缺乏EGFP表达不是由降低的T细胞活力导致的(图9)。反而，这被认为是由在随后的温育期间SeV特异性受体的恢复引起的。另外，由于最终的洗涤培养基将少量的EGFP转导入未修改的活化的T细胞(数据未显示)，排除了洗涤过程不充分的可能性。这些发现表明SeV利用T细胞上的特异性受体进行基因转导。
在确定用SeV-EGFP温育T细胞时间的初步实验中，观察到EGFP阳性T细胞的比例随温育时间的延长而减少。根据该观察结果，本发明人猜测SeV附着到原初T细胞但不与原初T细胞融合大概是因为共同受体缺陷，该缺陷使SeV由于在温育温度37℃时的自身HN神经氨酸酶活性而从原初T细胞上分离，37℃是最适于该酶活性的。然后，用SeV-EGFP(MOI＝100)在4℃温育新分离的淋巴细胞，此时神经氨酸酶几乎无功能但SeV仍能附着于唾液酸残基上，之后在37℃在新鲜培养基中温育指定的时间(图10)。然后洗涤这些T细胞三次并用固定的抗CD3和抗CD28抗体刺激它们，两天后检查它们的GFP表达水平。在这个实验中，所有T细胞都被同样活化从而数据不受与SeV基因表达有关的因素如细胞激酶活性的影响，而仅受与SeV进入有关的因素影响。当在4℃温育T细胞一次然后活化时，EGFP阳性CD4和CD28T细胞的比例分别是50％和70％。与此相反，在4℃温育随后在37℃温育，EGFP阳性细胞的比例随时间而下降(图10)。在37℃温育90分钟之后EGFP阳性细胞的比例到达它们的最小值，相当于在活化孔中最终洗涤之后未用混合在培养基中的SeV预处理的共培养的T细胞。用SeV-EGFP温育的阳性对照T细胞在活化培养期间全部被基因有效转导。此外，当使用活化的T细胞时，EGFP阳性T细胞的比例在37℃温育仅30分钟之后就与阳性对照的比例一样高(数据未显示)。由于一旦进入了原初T细胞的SeV就不可能再从中释放，这些现象可用SeV进入活化的T细胞、并附着于原初T细胞但不与它们融合的能力来解释。非常有可能的是载体颗粒导致对活化的T淋巴细胞而不是原初T淋巴细胞特异的内在化。
工业实用性本发明使向T细胞有效率的转导基因成为可能。由于将基因转导入T细胞中对于治疗各种与免疫系统相关的疾病很重要，期待将本发明用于在免疫疾病中利用T细胞定向的基因传递的免疫学修饰策略。
序列表<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>将基因转导入T细胞中的方法<130>D3-A0205P<140>
<141>
<150>JP 2002-310053<151>2002-10-24<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工合成的序列<400>1ctttcaccct 10<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工合成的序列<400>2tttttcttac tacgg 15<210>3<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工合成的序列<400>3cggccgcaga tcttcacg18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工合成的序列<400>4atgcatgccg gcagatga18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工合成的序列<400>5gttgagtact gcaagagc18<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工合成的序列<400>6tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42
<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工合成的序列<400>7atgcatgccg gcagatga18<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工合成的序列<400>8tgggtgaatg agagaatcag c2权利要求
1.一种将基因转导入T细胞的方法，其中所述方法包括使携带该基因的副粘病毒载体与活化的T细胞接触的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒载体。
3.一种转导了外源基因的T细胞的制备方法，其中所述方法包括使携带所述基因的副粘病毒载体与活化的T细胞接触的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒载体。
5.转导了外源基因的T细胞，其通过权利要求3或4的方法来制备。
6.副粘病毒载体，其用于将基因转导入活化的T细胞。
7.根据权利要求6所述的载体，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒载体。
全文摘要
本发明提供将基因转导入活化的T细胞的方法，包括使副粘病毒载体与活化的T细胞接触的步骤。本发明还提供转导了外源基因的T细胞的制备方法，包括使副粘病毒载体与活化的T细胞接触的步骤。本发明还提供通过这种方法制备的转导了外源基因的T细胞。本发明使对活化的T细胞特异的有效的基因转导成为可能，并期望被用于利用定向T细胞的基因传递的免疫学修饰策略。
文档编号C12N5/10GK1732267SQ20038010750
公开日2006年2月8日 申请日期2003年10月22日 优先权日2002年10月24日
发明者冈野慎士, 米满吉和, 居石克夫, 长谷川护 申请人:株式会社载体研究所