专利名称：多价淋巴毒素β受体激动剂及其治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学和癌症诊断与治疗领域。更特别地，它涉及多价淋巴毒素β受体(LT-β-R)激动剂抗体构建体的制备以及在治疗方法中与化疗剂相组合的用途。
背景淋巴毒素β受体(LT-β-R)是肿瘤坏死因子家族的成员，它在免疫系统的发展以及免疫系统内很多细胞(包括滤泡树突细胞和很多基质细胞类型)的功能性维持中都具有公认的作用(Matsumoto等，1996Immunol.Rev.156137)。LT-β-R的已知配体包括LTα1/β2和被称作LIGHT的第二配体(Mauri等，1998 Immunity 821)。已经发现可溶配体或激动性抗受体单克隆抗体对LT-β-R的活化会诱导某些癌的死亡(Browning，J.L.等(1996)J.Exp.Med.183867-878和美国专利6,312,691)。
本发明提供了多价LT-β-R激动剂及其治疗用途。
发明概述在一个方面，本发明提供了作为人淋巴毒素β受体(LT-β-R)激动剂的多价抗体构建体。在一个实施方案中，多价抗体构建体包含LT-β-R表位特异性的至少一个抗原识别位点。在某些实施方案中，至少一个抗原识别位点位于scFv结构域，而在其它实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域。
本发明提供了包含淋巴毒素β受体(LT-β-R)表位特异性的至少一个抗原识别位点的多价抗体。在一个实施方案中，至少一个抗原识别位点位于scFv结构域内。在另一个实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域内。在又一个实施方案中，该抗体构建体是单特异性的，包括例如CBE11结合的表位。在又一个实施方案中，本发明的多价抗体是四价的。仍在另一个实施方案中，该抗体构建体是BHA10表位特异性的。仍在另一个实施方案中，该抗体构建体是双特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体具有两个CBE11特异性抗原识别位点和两个BHA10特异性识别位点。
抗体构建体可以是二价的、三价的、四价的或五价的。在某些实施方案中，该抗体构建体是单特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体是CBE11结合的表位特异性的，并且在一些实施方案中，它是四价的。在另一个实施方案中，该抗体构建体是BHA10结合的表位特异性的，并且在一些实施方案中，它是四价的。在某些实施方案中，至少一个抗原识别位点位于scFv结构域内。在某些实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域内。其它抗体构建体可以是人LT-β受体上不同表位多特异性的。在某些实施方案中，该抗体构建体是双特异性的。在其它实施方案中，该抗体构建体对BKA11、CDH10、BCG6、AGH1、BDA8、CBE11和BHA10组成的淋巴毒素β受体(LT-β-R)表位组中的至少两个成员是特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体是CBE11和BHA10结合的表位特异性的，并且在某些实施方案中，它是四价的。在一个实施方案中，该抗体构建体具有两个CBE11特异性抗原识别位点和两个BHA10特异性识别位点。在任何多特异性抗体构建体中，至少一个抗原识别位点可以位于scFv结构域，并且在某些实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域。
本发明进一步提供了包含SEQ ID NOs1-10的抗体构建体，以及编码它们的核酸和载体，包含该核酸和载体的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了包含该主题抗体构建体和药物可接受载体的药物组合物。在某些实施方案中，该药物组合物可以进一步包含有效量的化疗剂，其中所述组合物给受试者的施用导致肿瘤的超累加抑制。在另一个方面，本发明提供了含有或能够装载有效量的主题多价抗体构建体和药物可接受载体的药物递送装置。在某些实施方案中，该药物递送装置进一步含有或能够装载有效量的化疗剂，其中用所述装置施用该构建体和该试剂会导致肿瘤的超累加抑制。
在另一个方面，本发明提供了治疗受试者癌症的方法，包括给该受试者施用有效量的主题抗体构建体。在某些实施方案中，该受试者是人。本发明还提供了抑制受试者的肿瘤体积的方法，包括给该受试者施用有效量的主题抗体构建体的步骤。在某些实施方案中，抑制肿瘤体积的方法包括给该受试者施用有效量的主题抗体构建体和化疗剂，其中所述构建体和所述试剂的施用会导致肿瘤的超累加抑制。
本发明进一步提供了包括主题药物组合物或药物递送装置，和任选它们的使用说明书的试剂盒。这种试剂盒的用途包括例如治疗应用。在某些实施方案中，任何试剂盒中含有的主题组合物已经被冻干并且使用前需要再水化。
在一个实施方案中，包含本发明多价抗体的药物组合物进一步包含有效量的化疗剂，其中所述组合物的施用导致肿瘤的超累加抑制。本发明还描述了包含有效量的本发明多价抗体构建体和药物可接受载体的药物组合物。在一个实施方案中，该药物组合物进一步包含有效量的化疗剂，其中所述组合物的施用导致肿瘤的超累加抑制。
本发明包括含有或能够装载有效量的本发明多价抗体构建体以及药物可接受载体的药物递送装置。在一个实施方案中，该药物递送装置进一步含有或能够装载有效量的化疗剂，其中用所述装置施用所述构建体和所述试剂会导致肿瘤的超累加抑制。
本发明还包括治疗受试者癌症的试剂盒，其中含有包含本发明多价抗体的组合物。在一个实施方案中，该试剂盒还包括说明书。在另一个实施方案中，该试剂盒包含化疗剂。
本发明还描述了抑制受试者的肿瘤体积的方法，包括给所述受试者施用有效量的本发明多价抗体构建体的步骤。
由下列详细说明书和权利要求，本发明的其它特征和优点将很明显。
附图简述
图1A和1B分别显示了huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的成熟重链的多核苷酸(SEQ ID NO1)和推导的多肽序列(SEQ IDNO2)。
图2显示了huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的成熟轻链的多核苷酸(SEQ ID NO3)和推导的多肽序列(SEQ ID NO4)。
图3A和3B分别显示了成熟huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体构建体的多核苷酸(SEQ ID NO5)和推导的多肽序列(SEQ ID NO6)。
图4A和4B分别显示了huCBE11单特异性-1抗体构建体的成熟重链的多核苷酸(SEQ ID NO7)和推导的多肽序列(SEQ ID NO8)。
图5A和5B分别显示了成熟huCBE11单特异性-2抗体构建体的多核苷酸(SEQ ID NO9)和推导的多肽序列(SEQ ID NO10)。
图6A和6B显示了双特异性抗体构建体的三级结构示意图，可变区用适当阴影区表示。图6A显示了双特异性-1和双特异性-2抗体的结构，其包含CBE11和BHA10抗原识别位点。图6B显示了包含CBE11抗原识别位点的单特异性-1和单特异性-2四价抗体的结构。
图7描绘了可以使用本发明方法制备的其它抗体构建体的三级结构示意图。
图8描绘了图，该图显示了HT29细胞的增殖作用对八种激动剂抗LT-β-R抗体的抗体浓度的函数，所述抗体包括huCBE11/huBHA10双特异性-1和双特异性-2抗体构建体(分别为实心圆形和实心正方形)、单特异性-1和单特异性-2抗体构建体(分别为实心三角形和实心菱形)、人源化抗体huCBE11(开放三角形)、人源化抗体huBHA10(开放正方形)、联合施用的人源化抗体huCBE11和huBHA10(开放菱形)和五聚化chuCBE11抗体(开放圆形)。
图9描绘了图，该图显示了WiDr人结肠腺癌肿瘤对双特异性-1的反应，通过测定在双特异性-1(三角形、开放正方形、开放和闭合的圆形)、载体(PBS对照、十字形)和紫杉酚(闭合正方形)以所示剂量植入后不同天数观察的肿瘤重量进行评估。箭头示出了每种剂量的第一次和最后一次给药。
图10用来自多个肿瘤抑制实验的数据描述了huCBE11和双特异性-1活性的回顾性比较。数据是基于肿瘤生长的抑制百分比而计算的，该百分比是在每一实验的第34或35天，使用下式(100-(100x(测试组平均数/安慰剂对照组平均数)))计算的。图上的每一数据点代表来自研究的一个实验测试组。
图11A和11B显示了包含五聚形式CBE11抗体的序列。图11A描述了成熟五聚嵌合CBE11重链的多核苷酸(SEQ ID NO17)和推导的多肽序列(SEQ ID NO18)。图11B描述了成熟嵌合CBE11轻链的多核苷酸(SEQ ID NO19)和推导的多肽序列(SEQ ID NO20)。
发明详述1.定义为了方便，在进一步描述本发明之前，在这里定义说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语。
单数形式包括所指项目的复数形式，上下文清楚地指出者除外。
术语“施用”包括将本发明化合物，包括但不限于药物组合物或治疗剂递送给受试者的系统或者受试者内或受试者上的特定部位的任何方法。这里使用的短语“全身施用”、“外周施用”意思是化合物、药物或其它物质不是直接施用到中枢神经系统，这样使得它进入患者的系统，从而经受新陈代谢及其它类似过程，例如皮下施用。“肠胃外施用”是指除了肠内和局部施用的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网腹下、脊柱内和胸骨内注射和输注。
这里使用的术语“抗体”意思是指完全的、完整的抗体，和Fab、Fab’、F(ab)2、Fv及其其它片段。完全的、完整的抗体包括例如单克隆抗体，如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、抗个体基因型抗体、抗抗个体基因型抗体、和人源化抗体，以及其多价形式。术语“免疫球蛋白”或“抗体”(这里可互换使用)是指具有由两条重链和两条轻链组成的四条多肽链基础结构的抗原结合蛋白，所述链例如通过链间二硫键稳定，该抗原结合蛋白具有特异性结合抗原的能力。重链和轻链都折叠成结构域。术语“结构域”是指包含例如通过β-折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(如包含3至4个肽环)的重链或轻链多肽的球形区。基于在“恒定区”结构域的情况下各种类型成员结构域内相对缺少序列变异，或在“可变区”结构域的情况下各种类型成员结构域内的显著变异，结构域这里进一步称作“恒定区”或“可变区”。轻链上的“恒定区”结构域可互换地称作“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”，“CL”区或“CL”结构域。重链上的“可变区”结构域可互换地称作“重链恒定区”、“重链恒定结构域”，“CH”区或“CH”结构域。轻链上的“可变区”结构域可互换地称作“轻链可变区”、“轻链可变结构域”，“VL”区或“VL”结构域。重链上的“可变区”结构域可互换地称作“重链恒定区”、“重链恒定结构域”，“CH”区或“CH”结构域。
术语“区”是指抗体链的一部分，包括如这里定义的恒定或可变区，以及所述结构域的更离散部分。例如，轻链可变结构域或区包括散布于“构架区”或“FRs”之间的“互补决定区”或“CDRs”，如这里定义。
免疫球蛋白或抗体可以以单体或多聚形式存在。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段结合抗原或与完整抗体(即与它们所来源的完整抗体)竞争抗原结合(即特异性结合)。术语“构象”是指蛋白或多肽(如抗体、抗体链、或其结构域或区)的三级结构。例如，短语“轻(或重)链构象”是指轻(或重)链可变区的三级结构，短语“抗体构象”或“抗体片段构象”是指抗体或其片段的三级结构。
结合片段通过重组DNA技术，或通过酶促或化学切割完整免疫球蛋白而产生。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv、单链，和单链抗体。不同于“双特异性”或“双功能”免疫球蛋白或抗体，免疫球蛋白或抗体被理解为它们的每个结合位点是相同的。“双特异性”或“双功能抗体”是具有两条不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。可以用各种方法制备双特异性抗体，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见如Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)；Kostelny等J.Immunol.148，1547-1553(1992)。
术语“抗体构建体”是指一种重组分子，其中包含来自抗体的重链和轻链可变结构域的两个或更多抗原结合片段，并可以包含来自五类Ig(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)中任何一种抗体的恒定区的全部或部分。例如，抗体构建体可以由重链C末端包含单链可变片段的抗体制成。在另一个实例中，抗体构建体可以由抗体两条重链的恒定区的全部或部分组成，该重链的羧基和氨基末端包含单链可变片段。图6用示意图描述了这些构建体中每一个的实例。在又一个实例中，抗体构建体可以包含具有两个或更多可变区的两条重链和具有一个或多个可变区的两条轻链，其中两条重链通过二硫键或其它共价键连接。在另一个实例中，抗体构建体可以包含含有两个或更多可变区的两条重链，其中两条重链通过二硫键或其它共价键连接。图7用示意图描述了这些构建体中每一个的实例。本发明的详细说明书和实施例中描述了本发明抗体构建体的其它实例。
这里使用的术语“抗原”意思是与特异性抗体有反应性的分子。
术语“抗原结合位点”或“抗原识别位点”是指特异性结合抗原上表位的抗体区域。
术语“癌症”或“瘤”通常是指任何恶性瘤或者自发的细胞生长或增生。本文中该术语包括充分发育的恶性瘤，以及恶变前损害。具有“癌症”的受试者例如可以具有肿瘤或白细胞增生如白血病。在某些实施方案中，具有癌症的受试者是具有肿瘤如实体瘤的受试者。癌症包括实体瘤，包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)、睾丸癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌(CRC)、乳腺癌，以及前列腺、胃、皮肤、胃、食管和膀胱癌。
术语“化疗剂”是指用于治疗由外来细胞或恶性细胞(如肿瘤细胞)引起的疾病的任何小分子或组合物。化疗剂的非限制性实例包括破坏DNA合成的药剂、作为拓扑异构酶I抑制剂的药剂、烷化剂或植物碱。术语“破坏DNA合成的药剂”是指能够减少或抑制DNA合成过程的任何分子或化合物。破坏DNA合成的药剂实例包括但不限于核苷类似物如嘧啶或嘌呤类似物，包括例如但不限于吉西他滨或蒽环霉素化合物，包括例如但不限于阿霉素、daunombicin、羟基柔红霉素和idambicin和表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷。术语“拓扑异构酶I抑制剂”是指抑制或降低拓扑异构酶I的生物活性的分子或化合物。包括例如但不限于camptosar。术语“烷化剂”是指能够与(例如胺、醇类、酚、有机和无机酸类)的亲核基团反应并由此给另一分子如蛋白或核酸添加烷基(例如乙基或甲基)的任何分子或化合物。用作化疗剂的烷化剂实例包括白消安(bisulfan)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥、苯丙氨酸氮芥、噻替派、各种亚硝基脲化合物和铂化合物如顺铂和卡铂。术语“植物碱”是指属于生物学上有活性和细胞毒性的、来源于植物的碱性含氮分子家族的化合物。植物碱的实例包括但不限于紫杉烷类(taxanes)如紫杉酚、多西他赛(docetaxel)和紫杉醇以及长春药类如长春碱、长春新碱和长春瑞宾。
术语“嵌合抗体”是指这样一种抗体，其轻链和重链基因典型地通过遗传工程由属于不同种类的免疫球蛋白基因片段构建而成。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变(V)区片段可以与人恒定(C)区片段连接，如IgG1和IgG4。优选人同种型IgG1。因此典型的嵌合抗体是由来自小鼠抗体的V或抗原结合结构域和来自人抗体的C或效应结构域组成的杂合蛋白。
术语“有效量”是指足以引起期望结果(包括但不限于例如在体外或体内减小肿瘤体积)的化合物、物质或包含本发明化合物的组合物的量。本发明药物组合物的有效量是足以引起期望临床结果(包括但不限于改善、稳定、预防或延迟患者的癌症发展)的药物组合物的量。在两种情况下，本发明化合物的有效量都可以以一次或多次给药而施用。这些上述指标的检测和测定是本领域技术人员已知的，包括但不限于例如肿瘤负荷的减少、肿瘤大小的抑制、继发性肿瘤增生减少、基因在肿瘤组织中表达、生物标记的存在、淋巴结的参与、组织学分级和核分级。
术语“表位”是指抗体或抗体构建体优先和特异性结合的抗原区域。单克隆抗体优先结合分子中的单一特异性表位，所述表位可以在分子学上确定。在本发明中，多特异性抗体可以识别多个表位。
术语“肿瘤体积的抑制”是指肿瘤体积的任何减小或降低。
术语“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗体”是指包括至少一条人源化免疫球蛋白或抗体链(即至少一条人源化轻或重链)的免疫球蛋白或抗体。术语“人源化免疫球蛋白链”或“人源化抗体链”(即“人源化免疫球蛋白轻链”或“人源化免疫球蛋白重链”)是指具有可变区的免疫球蛋白或抗体链(即分别指轻或重链)，其中包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变构架区和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDRs)(如至少一个CDR，优选两个CDRs，更优选三个CDRs)，并进一步包括恒定区(例如在轻链的情况下，包括至少一个恒定区或其部分，在重链的情况下，优选包括三个恒定区)。术语“人源化可变区”(如“人源化轻链可变区”或“人源化重链可变区”)是指包括基本上来自人免疫球蛋白抗体的可变构架区和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDRs)的可变区。
术语“淋巴毒素β受体(LT-β-R)激动剂”是指可以加强配体与LT-β-R结合、细胞表面LT-β-R聚集和/或LT-β-R信号传导的任何试剂。
短语“多价抗体”或“多价抗体构建体”是指包含一个以上抗原识别位点的抗体或抗体构建体。例如，“二价”抗体构建体具有两个抗原识别位点，“四价”抗体构建体具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等是指本发明的多价抗体构建体中存在的不同抗原识别位点特异性的数目(与抗原识别位点数不同)。例如，“单特异性”抗体构建体的抗原识别位点全部结合同一表位。“双特异性”抗体构建体具有至少一个结合第一表位的抗原识别位点和至少一个结合不同于第一表位的第二表位的抗原识别位点。“多价单特异性”抗体构建体具有全部结合同一表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体构建体具有多个抗原识别位点，其中一些结合第一表位，另一些结合不同于第一表位的第二表位。术语“双特异性-1”(也称为“BS-1”)、″双特异性-2″(也称为“BS-2”)、“单特异性-1”(也称为“MS-1”)和“单特异性-2”(也称为“MS-2”)是指这里进一步描述的特定抗体构建体。在本发明的一个实施方案中，抗体是单特异性四价抗体，其中该抗体包含四个CBE11抗原识别位点，如图6B所示。
“患者”或“受试者”或“宿主”是指人或非人动物。
术语“药物递送装置”是指可以用来给受试者施用治疗剂或试剂的任何装置。药物递送装置的非限制性实例包括皮下注射器、多室注射器、支架、导管、经皮贴片、显微针、微型研磨器和可植入型控释装置。在一个实施方案中，术语“药物递送装置”是指能够在注射前混合两种化合物的双室注射器。
这里使用短语“药物可接受的”指在合理医学判断范围内适合用于接触人和动物组织，而无过多毒性、刺激、变态反应或者其它问题或并发症，与合理的益处/风险比率相称的那些化合物、物质、组合物，和/或剂型。
这里使用的短语“药物可接受载体”意思是参与将主题化合物从一个器官或身体部分运载或输送至另一个器官或身体部分的药物可接受的物质、组合物或载体，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。每种载体在与该制剂的其它成分相容和对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可以用作药物可接受载体的物质的一些实例包括(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉化黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可油和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和(22)药物制剂中使用的其它无毒相容物质。
“药物可接受盐”是指化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。
术语“Fv片段”是指包含重链和轻链可变结构域的抗体片段。术语“Fc片段”是指包含重链恒定结构域的抗体片段。
术语“单链可变片段或scFv”是指重链结构域和轻链结构域相连接的Fv片段。一个或多个scFv片段可以与其它抗体片段(如重链或轻链的恒定结构域)连接形成具有一个或多个抗原识别位点的抗体构建体。
术语“肿瘤的超累加抑制”是指肿瘤体积总的减小大于由于每一单独试剂造成的试剂组合的作用总和。在一个实施方案中，超累加抑制包括施用LT-β-R激动剂和不是LT-β-R激动剂的化疗剂组合所产生的平均肿瘤抑制，该抑制在统计学上显著高于单独施用LT-β-R激动剂或单独施用化疗剂产生的肿瘤抑制的总和。可以用如本发明详述部分所述的各种统计方法确定LT-β-R激动剂和化疗剂组合施用产生的肿瘤抑制是否“在统计学上显著高于”各化合物预期的累加值。
术语“协同的”是指比任何两个或更多单一试剂的累加效应更有效的组合。在本发明的一个实施方案中，术语“协同的”包括超累加抑制的组合类型，其中LT-β-R激动剂和化疗剂二者单独都具有抑制肿瘤体积的能力。术语“增强”是指两种或更多试剂的同时作用大于各试剂单独作用的总和的情况。在某一实施方案中，增强是指超累加抑制类型，其中LT-β-R激动剂或化疗剂中仅有一种单独具有抑制肿瘤体积的能力。
“治疗”受试者的癌症或“治疗”具有癌症的受试者是指使受试者接受药物治疗，如施用药物，从而降低或预防癌症程度。治疗包括(但不限于)施用组合物，如药物组合物，且可以预防性或在病理事件开始之后实施。
术语“肿瘤体积”是指肿瘤总的大小，它包括肿瘤本身加上所波及的淋巴结(如果适用时)。可以用本领域已知的各种方法测定肿瘤体积，例如通过使用测径器、记算机断层(CT)或磁共振成象(MRI)扫描测量肿瘤尺寸，并使用基于例如Z轴直径或者基于标准形状如球体、椭圆球体或立方体的方程式计算体积。
2.多价LT-β-R激动剂抗体构建体和制备它的方法在一个实施方案中，本发明的多价抗体构建体是淋巴毒素β受体激动剂，并包含至少两个能够结合该受体和诱导LT-β-R信号传导的结构域。这些构建体可以包括含有两个或更多可变区的重链，所述可变区包含结合LT-β受体特异性的抗原识别位点，并且可以包括含有一个或多个可变区的轻链，或可以构建为仅包含含有两个或更多可变区的重链或轻链，该可变区包含结合LT-β受体特异性的CDRs。
在一个方面，本发明提供了作为人淋巴毒素β受体(LT-β-R)激动剂的多价抗体构建体。在一个实施方案中，多价抗体构建体包含LT-β-R表位特异性的至少一个抗原识别位点。在某些实施方案中，抗原识别位点中的至少一个位于scFv结构域内，而在其它实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域内。
抗体构建体可以是二价的、三价的、四价的或五价的。在某些实施方案中，该抗体构建体是单特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体是CBE11结合的表位特异性的。在其它实施方案中，本发明的抗体是包含四个CBE11抗原识别位点的单特异性四价LT-β-R激动剂抗体。在另一个实施方案中，该抗体构建体是BHA10表位特异性的，在一些实施方案中，它是四价的。在这些实施方案中的任何一个中，至少一个抗原识别位点可以位于scFv结构域上，在这些实施方案中的某些中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域上。抗体可以是多特异性的，其中本发明的抗体结合人LT-β受体上的不同表位。
在某些实施方案中，该抗体构建体是双特异性的。在其它实施方案中，该抗体构建体对下列抗体BKA11、CDH10、BCG6、AGH1、BDA8、CBE11和BHA10之一结合的表位组成的淋巴毒素β受体(LT-β-R)表位组中的至少两个成员是特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体是CBE11和BHA10抗体所结合的表位特异性的，在某些实施方案中，它是四价的。在一个实施方案中，该抗体构建体具有两个CBE11特异性抗原识别位点和两个BHA10特异性识别位点，其中该抗体是双特异性四价LT-β-R激动剂抗体。在任何多特异性抗体构建体中，至少一个抗原识别位点可以位于scFv结构域上，在某些实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域上。
在另一些实施方案中，本发明的抗体构建体包含下列多核苷酸序列及其所编码的多肽序列
实施例1-9提供了获得上表列出的双特异性、单特异性和五聚LT-β-R激动剂抗体构建体的详细说明。图6A和6B描绘了这些构建体中某些构建体的示意图。然而可以使用本领域已知方法构建本发明的其它LT-β-R激动剂抗体构建体，如下简略描述。图7描绘了这些构建体的几个实例。
抗原识别位点或完整可变区可以来源于一个或多个亲本抗体。亲本抗体可以包括天然存在的抗体或抗体片段、由天然存在的抗体改变而来的抗体或抗体片段、使用已知特异于LT-β受体的抗体或抗体片段的序列从头构建的抗体。可以来源于亲本抗体的序列包括重和/或轻链可变区和/或CDRs、构架区或其其它部分。
多价、多特异性抗体可以含有包含两个或更多可变区的重链和/或包含一个或多个可变区的轻链，其中至少两个可变区识别LT-β受体上的不同表位。
可以使用来源于亲本抗LT-β-R抗体的各种不同序列以各种不同方法构建多价抗LT-β-R抗体，包括小鼠或人源化BHA10(Browning等J.Immunol.15433(1995)；Browning等J.Exp.Med.183867(1996))和/或小鼠或人源化CBE11(美国专利6,312,691)。
下列产生单克隆抗LT-β-R抗体的杂交瘤细胞系可以用来制备从中得到抗体构建体序列的抗LT-β-R抗体，所述杂交瘤细胞系以前已经根据布达佩斯条约规定保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其ATCC保藏号如下
然而，本领域技术人员使用常规重组DNA技术可以开发各种其它多价抗体构建体，例如如PCT国际申请PCT/US86/02269；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT国际
发明者E·加伯, V·贝利, J·L·布朗宁 申请人:拜奥根Idec马萨诸塞公司