专利名称：周期浸没气升式的植物细胞培养方法及其培养装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中使用生物反应器进行植物细胞的规模化培养，特别涉及一种周期浸没气升式的植物细胞培养方法及其培养装置。
背景技术：
植物细胞、组织、器官大规模培养技术是生产有用次生代谢产物的一条有效途径，近年来已取得了很大的发展。用于植物细胞、组织、器官培养的生物反应器是从培养微生物细胞的反应器改进、发展而来的，但具有适应植物细胞生长的独特的特点，主要分为机械搅拌生物反应器、非机械搅拌生物反应器、鼓泡塔及气升式生物反应器、填充床生物反应器、流化床生物反应器，膜生物反应器等。由于植物细胞的固有性质，如细胞容易聚集、易分化，细胞的脆弱性、代谢途径和代谢产物形成与细胞生长的复杂性等，选择合适的反应器构型及操作方法极大地关系到植物细胞的代谢产物合成。如日本的三井石油化学公司采用750L搅拌式反应器二步法培养紫草细胞，实现紫草宁的工业化生产(Noguchi et al.，Plant tissue culture and itsbiotechnological application，1977，pp.85.)。德国建立了75L、750L、7500L、15000L和75000L系列搅拌式生物反应器组成的植物细胞培养工厂，并利用这些反应器培养紫松果菊(Echinaceapurpurea)细胞，生产免疫活性多糖(Mavituna F，Recent advancesin biotechnology，1992，pp.209-226)。
对于植物组织和器官的大规模培养，如丛生芽、毛状根、体胚及幼苗等，由于这些器官和组织体积大、形态特殊、在培养过程中流动性差、易堆积、对剪切力更为敏感以及长期浸泡更易产生玻璃化和变异等，国内外科研人员根据培养对象的不同采用了多种不同类型的生物反应器进行植物组织和器官的培养，如Rodrigueg-Mendiola等报道了一种9立升的植物毛状根培养反应器(M.A.Rodrigueg-Mendiol et al.，Bioreactors for growth of plant roots，Enzyme Microb.Technol.1991，Vol.13，pp.697-702)，此反应器部分解决了毛状根的接种及堆积问题，但未根本解决接种的均匀性，从而影响了混合特性和传质、传热过程，而且该反应器为全浸没式，易造成培养物的玻璃化和变异。针对植物细胞、组织和器官生长代谢特性，本申请人的一种气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养反应器(1999年11月13日授权，专利号为98205797.0)，该反应器主要由反应器主体、筛板隔板、接种管、气体分布器、光源、储液槽、电磁阀、气液循环管和气液分配管组成，是一种适于大规模培养的生物反应器，可以实现植物组织和器官培养的均匀接种、克服植物组织器官长期浸没产生的玻璃化和变异现象，反应器内培养物供养充分，还可以实现气液交替半浸没周期、光照周期的调节和控制，具有良好的混合、传质、传热特性，但是，这种生物反应器更适于植物的组织和器官的培养，如不易流动的丛生芽、毛状根、苗等，对于某些需要控制细胞聚集体大小以及需要固定化和悬浮培养相结合的植物细胞，则有不能同时实现固定和总体循环流动的缺点。
发明内容
本发明的目的是克服现有的植物细胞组织器官培养反应器仅适于植物的组织和器官的培养，不能控制细胞聚集体的大小、存在的次生代谢产物产量低的缺点，以及现有反应器过于复杂的问题，从而提供一种周期浸没气升式的植物细胞培养方法及其反应器，以适于大规模地培养植物细胞。
本发明的技术方案如下本发明提供的植物细胞的周期浸没气升式培养方法，其步骤如下1)将植物细胞置入灭菌后的透明反应器主体中的多层可转动筛板上；2)对植物细胞周期性交替地进行培养液全浸没的循环悬浮培养和培养液非浸没的固态培养，直至培养完成；所述的培养液全浸没的循环悬浮培养为在植物细胞处于培养液全浸没的状态下，转动可转动筛板使其与水平面呈45°-75°角，此时，筛板上的植物细胞悬浮在培养液中，在来自反应器主体底部气体分布器气体的吹动下进行培养液全浸没的循环悬浮培养1-8小时；所述的培养液非浸没的固态培养为将筛板转动并固定至水平位置的同时，将培养液从反应器主体的底部放入位于其下方的储液罐中，此时，植物细胞下落到呈水平态的可转动筛板上进行培养液非浸没的固态培养10-60分钟；所述周期性交替进行的培养液全浸没的循环悬浮和培养液非浸没的固态培养在位于培养器主体外围的外置光源的光照下进行，其光照强度为1000-4000Lux，光照时间为每天8-24小时。
本发明提供的植物细胞的周期浸没气升式培养装置，包括一透明材料制造的反应器主体，其上的补液口通过一阀门与一补液罐相连通，反应器主体内底部安装一与气源相通的气体分布器，反应器主体的下方设置一与反应器主体底部相通的储液罐，该储液罐与气源相通，其特征在于，还包括安装在反应器主体内的可在与水平面呈45°-75°角范围内进行转动的筛板；反应器主体内还可安装一筛板支撑架，所述的筛板通过支撑轴固定在筛板支撑架上，筛板绕支撑轴在与水平面呈45°-75°角范围内转动；一端部穿出反应器主体顶盖的拉杆与所述筛板的外边缘固定，伸出反应器主体外的拉杆端部与使拉杆做上下运动的手柄相连；所述伸出反应器主体外的拉杆端部与使拉杆做上下运动的电磁拉杆装置相连，所述电磁拉杆装置由线圈内放置一电磁拉杆后密封而成，所述拉杆的端部与电磁拉杆固定在一起，所述线圈与一时间控制仪相连，经时间控制仪控制即可实现多层筛板的周期性自动转动。电磁拉杆装置的顶部设置有排气管，以利于电磁拉杆主体的散热及断电后瞬时磁场的快速消除，保证筛板的快速回落；所述储液罐与气源之间的连通管道上安装一与时间控制仪电连接的电磁阀，储液罐进气口和反应器主体空气出口的连通管道上安装一与时间控制仪电连接的电磁阀，两电磁阀的开/闭状态相反，以实现培养液的全浸没液体培养与非浸没固态培养交替进行；还可在所述反应器主体的周围均匀分布有外置光源，其光照强度为1000-4000Lux；在所述储液罐的四周套装一恒温水夹套，用以调控培养液的温度；在所述的储液罐上设置取样口，可随时测定培养液的pH、各种营养物质的含量，对反应器主体内的培养情况进行监控。
本发明的优点在于本发明的周期浸没气升式的植物细胞培养方法及其反应器，可实现多植物细胞进行周期性浸没、通气、周期性光照，更适于植物细胞生长的特点和生物节律，各层筛板周期性的自动转动使细胞周期循环，保证浸没培养期的细胞均匀悬浮于整个反应器内，细胞获得充分的营养，而且，循环时适宜的剪切力作用，可以抑制细胞聚集体过度增大；非浸没培养期的细胞则可均匀附着于各层筛板上，有利于细胞聚集体长大。本发明实现了细胞固定化和悬浮循环培养的交替进行，对细胞聚集体可以进行有效调控，使聚集体大小控制在一定范围内，这有利于细胞间的生物信息传递和营养物质包括氧和二氧化碳的传递，该反应器有利于细胞的生长与代谢，具有优良的混合、传质、传热特性。
图1为本发明的培养装置的结构示意图；图2为使用本发明的培养装置和培养方法对植物细胞进行培养时，植物细胞处于培养液全浸没循环悬浮培养期时的细胞聚集体流动示意图；图3为电磁拉杆装置结构示意图；其中反应器主体1筛板架2气体分布器3接种口4通气口5拉杆6排气管7补液罐8空气出口9第一电磁阀10 储液罐11 输液管12储液罐进气口13 恒温水夹套14 膜式空气过滤器15a膜式空气过滤器15b 第二电磁阀16 气体流量计17a气体流量计17b 进气分流管18 空气过滤柱19储气罐20 取样口21 外置光源22时间控制仪23 蒸汽进口24 硅胶片25线圈26 电磁拉杆27 电磁拉杆装置28具体实施方式
实施例1本实施例的2L体积的植物细胞的周期浸没气升式培养装置，结构如图1，由图1可知，培养装置包括一透明材料制造的反应器主体1，其上的补液口通过一阀门与一补液罐8相连通，反应器主体1内底部安装一与气源20相通的气体分布器3，反应器主体1的下方设置一与反应器主体底部相通的储液罐11，该储液罐11与气源20相通，在反应器主体1内的可在与水平面呈60°范围内进行转动的2层筛板；所述的筛板可通过支撑轴固定在筛板支撑架2上，再将筛板支撑架2用硅胶片25安装在反应器主体1内，筛板也可以其它方式转动固定；一端部穿出反应器主体1顶盖的拉杆6与所述筛板的外边缘固定，伸出反应器主体1外的拉杆6的端部与使拉杆6做上下运动的电磁拉杆装置28相连，其结构为伸出反应器主体1外的拉杆端部与固定在一置于线圈26内的电磁拉杆27上，该线圈26连接一时间控制仪23，在电磁拉杆装置28主体的顶部还设有排气管7；所述储液罐11与气源20之间的连通管道上安装一与时间控制仪23电连接的第二电磁阀16，储液罐进气口13和反应器主体空气出口9的连通管道上安装一与时间控制仪电连接的第一电磁阀10，两电磁阀的开/闭状态相反；所述反应器主体1的周围均匀分布有外置光源22(管状荧光灯)，其光照强度为1000Lux。所述储液罐11的四周套装一恒温水夹套14；气体分布器3与外部的空气压缩机相连，其连接管道上安装有膜式空气过滤器15a、气体流量计17a、进气分流管18、空气过滤柱19和储气罐20；在反应器主体1的下方放置储液罐11，并用一输液管12连通储液罐11和反应器主体1的底部，储液罐11顶部的进气口13通过一根进气管连接到膜式空气过滤器15b上后，通过第二电磁阀16和气体流量计17b与进气系统相连，在进气口13管路上接出的另一根通气管通过第一电磁阀10与反应器主体法兰盖上的通气口9相连，两个电磁阀及线圈26与时间控制仪23相连，以实现培养液的浸没与非浸没交替循环以及多层筛板的周期自动转动。
实施例2用实施例1的培养装置和本发明的培养方法对植物细胞(水母雪莲)进行培养在无菌环境下将植物细胞(水母雪莲)加入反应器主体1中的各层筛板上，并交替进行培养液的全浸没循环培养和非浸没固态培养，其具体操作步骤如下首先，将线圈26取下，再将整个反应器系统放到蒸汽消毒锅中用高温蒸汽灭菌，灭菌后，待培养液温度降至室温后，将反应器系统取出，在培养室内安装好，并装上线圈26；然后，电磁阀10与电磁阀11同时断电，上液时，电磁阀10为关闭状态，电磁阀11为打开状态，打开气体流量计17b，将培养液由储液罐压入反应器主体1中，打开接种口4封帽，在无菌环境下将植物细胞(水母雪莲)加入反应器主体1中的各层筛板上，盖好封帽，植物细胞浸没在液体培养基中；同时，线圈26通电数分钟，拉动拉杆，使各层筛板与水平方向成一定角度，再打开气体流量计17a通入无菌空气，植物细胞在反应器主体1内进行培养液的全浸没循环悬浮培养，其培养时间见表1；此时，植物细胞在反应器主体1内进行培养液的全浸没循环悬浮培养期的细胞聚集体流动状态如图2所示。
全浸没循环培养之后，将线圈26断电，各层筛板落下成水平态；第一电磁阀10与第二电磁阀16同时通电，此时第一电磁阀10为打开状态，第二电磁阀16为关闭状态，培养液从反应器主体1回落到储液罐11中，植物细胞下落到各层筛板上，进行培养液的非浸没固态培养，其培养时间见表1；将上述的培养液的全浸没循环悬浮培养和培养液的非浸没固态培养交替进行若干次，直至培养完成；第一电磁阀10与第二电磁阀16同时通电、断电，实现培养液在反应器主体与储液罐之间的周期循环，简化了原有的采用4个电磁阀的反应器装置。电磁拉杆装置28、第一电磁阀10和第二电磁阀16的开关均可以由时间控制仪23自动控制。
本实施例还可将一个恒温水夹14环绕在储液罐上，培养过程中由恒温水夹套14控制培养液温度，间隔一定时间从储液罐取样口21处取少量的培养液，测定培养液的pH、残糖浓度、碳源、氮源消耗、各种营养盐离子浓度，以对反应器主体1内的培养情况进行监控。
本实施例中，各层筛板均由10目的不锈钢网固定在不锈钢圈制作的筛板支撑架上后转动固定在筛板架上的转动轴上，各层筛板间及筛板与反应器顶部与底部间均有一定间距，10目的不锈钢网可保证培养液内气泡的自由通过，培养装置具有良好的混合传质特性。使筛板绕轴转动的转动装置不仅仅限于本发明涉及的拉杆转动装置，还会有许多使筛板转动一定角度的装置，这属于本专业技术人员应知应会。
表1为本实施例所采用培养参数
上述实验结果表明，在全浸没循环培养时间为8小时，非浸没固态培养时间为15分钟时，细胞聚集体大小合适，细胞生物量高达10.4克/每升(干重)，细胞的黄酮含量可达4.8％，黄酮产量可达0.5克/每升。
实施例3制备一50L的多层自动转动筛板的周期浸没气升式植物细胞培养反应器，如图1所示，将具有5层不锈钢筛板的筛板架沿轴向同轴固定在反应器主体1中心，储液罐11侧壁底部增设一蒸汽进口24，其它与实施例1的2L反应器结构相同。
用实施例2所述的50L多层自动转动筛板的周期浸没气升式植物细胞培养反应器培养植物细胞时，其培养方法与实施例1基本相同。不过在反应器系统灭菌过程中，使蒸汽发生器产生的121℃蒸汽从增设的储液罐蒸汽进口24进入，从反应器主体1的通气口5排出进行原位灭菌。培养液灭菌后即打开气体流量计17b，将培养液由储液罐11压入反应器主体1，经气体流量计17a通入少量无菌空气进行保护，待培养液温度降至室温后打开接种口4封帽，在无菌环境下将培养物种子加入，盖好封帽，通入无菌空气进行培养。培养过程中间隔一定时间从储液罐取样口21处取少量的培养液，测定培养液的各种理化参数，对反应器主体内的培养情况进行监控。
其步骤如下原位灭菌后，把储液罐中的培养液压入反应器主体中，拉动拉杆带动固定在拉杆上的筛板使得筛板和水平方向成75°角，筛板上的植物细胞培养物浸没在培养液中，在气体分布器3通入的无菌空气的作用下循环流动，浸没培养1或8小时；再拉动拉杆使得筛板回复到水平位置，再将反应器中的培养液下到储液罐中，植物细胞培养物落到筛板上后，非浸没培养10或60分钟；重复浸没培养和非浸没培养，直到培养工作完成。
本实施例中，如图3所示，电磁拉杆27置于一线圈26内，通电后，线圈26控制电磁拉杆27做上下运动，带动与之相连的拉杆6控制筛板转动；线圈26还连接到时间控制仪23上，通过时间控制仪23控制筛板的自动转动，线圈26带电，在电磁场的作用下，电磁拉杆27向上运动一段距离，通过反应器主体1内的拉杆6带动筛板转动；时间控制仪断电时，线圈26断电，磁场消失，电磁拉杆27下落回复到自然状态，反应器主体1内的筛板也随之回落到水平位置。在电磁拉杆装置顶部设置一排气管，以有利于电磁拉杆主体的散热及断电后瞬时磁场的快速消除，保证筛板的可快速回落到水平位置。
作为本发明植物细胞培养方法的另一种改进，通过一外置光源对培养物植物细胞进行光照，光照时间为8-24小时，光照强度为1000-4000Lux；还可将外置光源22连接到一时间控制仪23上，通过时间控制仪23控制光照时间。
表2为本实施例所采用培养参数
比较实施例2的结果可知，随着反应器体积的增大，筛板转动时对细胞的不利影响减小，培养的效果还会进一步提高。
总之，本发明的周期浸没气升式的植物细胞培养方法及其反应器，可实现植物细胞进行周期性浸没、通气、周期性光照，特别是对于某些需要控制细胞聚集体大小以及需要固定化和悬浮培养相结合培养的植物细胞，采用本发明所提供的方法和装置，更加有利于细胞间的生物信息传递和营养物质包括氧和二氧化碳的传递，有利于细胞的生长与代谢，具有优良的混合、传质、传热特性。
权利要求
1.一种植物细胞的周期浸没气升式培养方法，其步骤如下1)将植物细胞置入灭菌后的透明反应器主体中的多层可转动筛板上；2)对植物细胞周期性交替地进行培养液全浸没的循环悬浮培养和培养液非浸没的固态培养，直至培养完成；所述的培养液全浸没的循环悬浮培养为在植物细胞处于培养液全浸没的状态下，转动可转动筛板使其与水平面呈45°-75°角，此时，筛板上的植物细胞悬浮在培养液中，在来自反应器主体底部气体分布器气体的吹动下进行培养液全浸没的循环悬浮培养1-8小时；所述的培养液非浸没的固态培养为将筛板转动并固定至水平位置的同时，将培养液从反应器主体的底部放入位于其下方的储液罐中，此时，植物细胞下落到呈水平态的可转动筛板上进行培养液非浸没的固态培养10-60分钟。
2.按权利要求1所述的植物细胞的周期浸没气升式培养方法，其特征在于，所述周期性交替进行的培养液全浸没的循环悬浮和培养液非浸没的固态培养在位于培养器主体外围的外置光源的光照下进行，其光照强度为1000-4000Lux，光照时间为每天8-24小时。
3.一种植物细胞的周期浸没气升式培养装置，包括一透明材料制造的反应器主体，其上的补液口通过一阀门与一补液罐相连通，反应器主体内底部安装一与气源相通的气体分布器，反应器主体的下方设置一与反应器主体底部相通的储液罐，该储液罐与气源相通，其特征在于，还包括安装在反应器主体内的可在与水平面呈45°-75°角范围内进行转动的筛板。
4.按权利要求3所述的植物细胞的周期浸没气升式培养装置，其特征在于，反应器主体内安装一筛板支撑架，所述的筛板通过支撑轴固定在筛板支撑架上，筛板绕支撑轴在与水平面呈45°-75°角范围内转动。
5.按权利要求4所述的植物细胞的周期浸没气升式培养装置，其特征在于，一端部穿出反应器主体顶盖的拉杆与所述筛板的外边缘固定，伸出反应器主体外的拉杆端部与使拉杆做上下运动的手柄相连。
6.按权利要求4所述的植物细胞的周期浸没气升式培养装置，其特征在于，一端部穿出反应器主体顶盖的拉杆与所述筛板的外边缘固定，伸出反应器主体外的拉杆端部与使拉杆做上下运动的电磁拉杆装置相连，所述电磁拉杆装置由线圈内放置一电磁拉杆后密封而成，所述拉杆的端部与电磁拉杆固定在一起，所述线圈与一时间控制仪相连。
7.按权利要求6所述的周期浸没气升式植物细胞培养反应器，其特征在于，所述电磁拉杆装置的顶部设置有排气管。
8.按权利要求3所述的周期浸没气升式植物细胞培养反应器，其特征在于，所述储液罐与气源之间的连通管道上安装一与时间控制仪电连接的电磁阀，储液罐进气口和反应器主体空气出口的连通管道上安装一与时间控制仪电连接的电磁阀，两电磁阀的开/闭状态相反。
9.按权利要求3所述的周期浸没气升式植物细胞培养反应器，其特征在于，所述反应器主体的周围均匀分布有外置光源，其光照强度为1000-4000Lux。
10.按权利要求3所述的周期浸没气升式植物细胞培养反应器，其特征在于，所述储液罐的四周套装一恒温水夹套。
全文摘要
本发明的周期浸没气升式的植物细胞培养方法及装置，将植物细胞置于反应器中的多层可转动筛板上，筛板转动一角度时，细胞处于培养液全浸没的循环悬浮培养期；筛板回落成水平态时放掉培养液，细胞处于培养液非浸没的固态培养期，两种培养期周期交替进行直至完成培养。通过拉杆将各筛板串联固定在电磁拉杆装置的电磁拉杆上，时间控制仪控制筛板的周期性转动和回落；电磁阀控制培养液对细胞的浸没与非浸没的交替和通气及光照的自动控制；其优点在于实现了细胞固定化和悬浮循环培养的交替进行，有效调控细胞聚集体，使聚集体大小得以控制，有利于细胞间的生物信息传递和营养物质的传递，适宜细胞的生长与代谢，具有优良的混合、传质、传热特性。
文档编号C12N5/04GK1648240SQ20041000079
公开日2005年8月3日 申请日期2004年1月20日 优先权日2004年1月20日
发明者王玉春, 袁晓凡, 赵兵, 王晓东 申请人:中国科学院过程工程研究所