专利名称：组织型纤溶酶原激活剂突变体的复性分离纯化方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术重组蛋白分离纯化技术领域。
二.
背景技术：
瑞替普酶是一种用基因定点突变技术，在大肠杆菌中表达生产的基因重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体。属于单链无糖基化多肽，含355个氨基酸，具有天然人组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，t-PA)的1～3，176～527号氨基酸编码序列。只携带野生型t-PA的kringle2结构域和蛋白酶结构域的瑞替普酶，以其16～20分钟较长的半衰期，更快更彻底的溶栓作用和较少颅内出血危险等优点成为较为理想的溶血栓药物。
由于瑞替普酶含有10对二硫键，在大肠杆菌中表达时形成包涵体形式，溶解变性后用常规方法复性很难正确折叠和复性成活性状态。这是由于组成十对二硫键的20个半胱氨酸在复性时错误配对造成的。而用还原型和氧化型谷胱甘肽与其它复性试剂按一定比例复性瑞替普酶虽能获得成功，但成本却十分昂贵。
三.
发明内容
为了提高变性瑞替普酶的复性率，降低瑞替普酶的生产成本，我们发明了设计含有(His)6和factor Xa切割位点的上游引物以扩增瑞替普酶，六个组氨酸为纯化标签与瑞替普酶融合表达，两段之间加有factor Xa以除去纯化标签获得正确的目的蛋白。然后把瑞替普酶插入合适的表达载体中进行融合表达。如此融合表达的瑞替普酶在适当的条件下在Ni2+-HiTrap柱上，可以复性、分离纯化一步完成。所用试剂都是普通级别的，而且步骤简单。本发明不但简化了复性分离纯化的程序，还能提高复性率，最终提高瑞替普酶的产率，大大降低生产成本，并能应用于工业化生产。
本发明需要解决的问题是用低廉的普通的一些试剂在适当的条件下，促进瑞替普酶形成正确配对的二硫键，完成分子结构重排，形成正确活性形式，达到复性目的。同时设计了(His)6纯化标签以简化后续的分离纯化，(His)6纯化标签与瑞替普酶之间的factor Xa切割位点，用factor Xa在瑞替普酶复性后去掉(His)6纯化标签，获得正确的目的蛋白。这样就简化了瑞替普酶的下游工艺，节约生产成本。
技术方案本发明用尿素变性包涵体的溶解液中加入一定量的咪唑和2-巯基乙醇，以促进瑞替普酶的复性。
设计含有(His)6和factor Xa切割位点的上游引物扩增瑞替普酶→大肠杆菌表达瑞替普酶→收集菌体，超声破碎→分离包涵体→尿素变性溶解，变性液中有低浓度咪唑和2-巯基乙醇→在Ni2+-HiTrap柱上复性与分离纯化一步完成。经上述步骤，即可制备得到纯度大于96％，有活性的瑞替普酶。
本发明的优点本发明提供了一种快速而低廉的促进瑞替普酶复性的新型工艺方法，它与现有的瑞替普酶生产工艺相比具有以下优点；(1)变性的瑞替普酶复性率高。(2)复性体系中的瑞替普酶蛋白浓度提高，复性体积减少，节约时间。(3)所用试剂均为常用、低廉的普通级别，大大节省复性成本。(4)复性、分离纯化都在柱上一步完成，极大限度的减少瑞替普酶的损失，提高瑞替普酶产率。这些优势使本发明具有十分明显的技术性和工艺先进性。而成本的降低，使瑞替普酶更适合于工业化生产，为瑞替普酶后续的普及应用奠定坚实的基础。
四.
图1.瑞替普酶柱上复性纯化后的活性测定。
五.
具体实施例方式
瑞替普酶制备方法如下将表达后的瑞替普酶工程菌菌体收集，悬浮于20mM Tris-HclPH8.0，超声破碎并在4℃ 12000rpm，离心15分钟，收集包涵体。包涵体用溶液I，其组分为6～8M尿素、10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～5mM 2-巯基乙醇PH8.0，室温搅动，充分溶解后，4℃ 12000rpm，离心15分钟，取上清，用0.22um或0.45um的滤膜过滤，就可以获得变性的瑞替普酶溶液。
变性的瑞替普酶通过过柱前已用溶液I平衡的Ni2+-HiTrap柱，上样后，先用两倍柱体积的溶液I和溶液II，溶液II的组分为6～8M尿素、10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、20～500mM咪唑、0～100mM 2-巯基乙醇PH7～10，各洗涤一次，再以六倍柱体积的不含尿素的溶液III，溶液III的组分为10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～100mM2-巯基乙醇PH7～10洗涤。这一步骤之后，可加两倍到四倍柱体积的溶液IV，其组分为10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、50mM～1M咪唑、0～5mM 2-巯基乙醇PH7～10，洗脱已折叠有活性的瑞替普酶。或在洗涤完后加入factor Xa，使之在柱上切割(His)6。最后用适当浓度的NaCl洗脱有活性的瑞替普酶，得到正确的有活性的目的蛋白。
权利要求
1.一种组织型纤溶酶原激活剂重组突变体39KD瑞替普酶的复性方法，其特征在于用尿素变性包涵体的溶解液中加入一定量的咪唑和2-巯基乙醇，以促进瑞替普酶的复性。
2.根据权利要求1所述，组织型纤溶酶原激活剂重组突变体39KD的瑞替普酶的复性分离纯化方法，其特征在于设计含有(His)6和factor Xa切割位点的上游引物扩增瑞替普酶→大肠杆菌诱导融合表达瑞替普酶→收集菌体，超声破碎→分离包涵体→尿素变性溶解(有低浓度咪唑和2-巯基乙醇)→在Ni2+-HiTrap柱上分离纯化与复性一步完成。
3.根据权利要求2所述，组织型纤溶酶原激活剂重组突变体39KD瑞替普酶的变性，其特征是以尿素为变性剂，变性溶液中含6～8M尿素，10～50mMTris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～100mM 2-巯基乙醇PH7～10。
4.根据权利要求2所述，组织型纤溶酶原激活剂重组突变体39KD瑞替普酶的复性，其特征在于复性的过程是咪唑和尿素量的变化过程。咪唑的浓度逐渐加大，而尿素的量逐渐减少，直至没有。上样后复性是分三步洗涤，溶液的先后顺序为两倍柱体积的溶液I，溶液组分为6～8M尿素、10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～5mM 2-巯基乙醇PH7～10→两倍柱体积的溶液II，溶液组分为6～8M尿素、10～100mMTris-Hcl、0.5M NaCl、20～500mM咪唑、0～100mM 2-巯基乙醇PH7～10→六倍体积的溶液III，溶液组分为10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～100mM 2-巯基乙醇PH7～10。
5.根据权利要求4所述溶液I、II、III洗涤完毕后，用两到四倍柱体积的溶液IV，其溶液组分为10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、50mM～1M咪唑、0～100mM 2-巯基乙醇PH7～10，洗脱折叠复性的组织型纤溶酶原激活剂重组突变体39KD的瑞替普酶。
6.根据权利要求4所述溶液I、II、III洗涤完毕后，加入factor Xa，使之在柱上切割(His)6。最后用适当浓度的NaCl洗脱有活性的瑞替普酶。
全文摘要
本发明属于医药生物技术重组蛋白分离纯化技术领域，公开了一种用低廉、普通级别的常用试剂咪唑和尿素，以它们的浓度梯度在合适的条件下，使在大肠杆菌中与(His)
文档编号C12N9/00GK1556206SQ200410013849
公开日2004年12月22日 申请日期2004年1月8日 优先权日2004年1月8日
发明者沈子龙, 廖建民, 孙石静, 张新元 申请人:中国药科大学