专利名称：轮枝菌纤溶酶及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从络石内生真菌轮枝菌发酵液中制备能降解纤维蛋白的可用于治疗血栓栓塞性疾病的溶血栓纤溶酶————轮枝菌纤溶酶。
背景技术：
血栓栓塞性疾病是当前危害人类健康，致残率与致死率最高的疾病之一。目前临床上治疗多采用尿激酶、链激酶等溶栓药物来进行治疗。但链激酶的抗原性强，尿激酶虽然抗原性较小，但在体内的半衰期短，长期大量用药则有全身性出血的倾向。我国临床应用的还有蝮蛇抗栓酶、口服蚓激酶和水蛭素等，但应用效果都不是很好，伴有发热、头痛和过敏性休克等不良免疫反应。国际上，日本开发出的重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(γt-PA)以及美国生物遗传科学公司开发出的单克隆抗体MH-1具有良好血栓溶解作用，但是其给药方式均为静脉注射，对制剂的要求特别高，价格昂贵。因此寻找各种新来源的溶栓药物是非常必要的。此外，一般而言蛋白质药物分子量越大越容易引起免疫反应，所以应筛选分子量小的。
目前，从微生物中分离纤溶酶已有一些报道，其中包括枯草杆菌(Bacillussp.)、链霉菌(Streptomyces)、豆豉杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)以及侧耳(Plerotus ostreatus)和冬菇(Flammulina velutipes)等，然而，利用轮枝菌特别是植物内生菌来分离纤溶酶，至今没有任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原材料丰富、操作简便易行，便于工业化生产的价格低廉、安全无毒的溶栓药物，以弥补尿激酶等药物在生产和治疗方面的不足。
植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植物一般不表现出外在病症。我们首次从络石内生真菌轮枝菌(Verticillium sp.)中获得纤溶酶，命名为轮枝菌纤溶酶。
本发明的技术方案如下一种轮枝菌纤溶酶，它是从络石(Trachelospermum jasminoides)内生真菌轮枝菌(Verticillium sp.)发酵所得的发酵液经盐析得沉淀，沉淀经透析脱盐后，以DEAE-纤维素层析，收集活性峰，透析后冷冻干燥，得粗酶，粗酶进行制备电泳，洗脱后得到的分子量约为33kD，等电点约为8.5的纯轮枝菌纤溶酶。
一种上述的轮枝菌纤溶酶的制法，它包括下列步骤步骤一、将从络石(Trachelospermum jasminoides)内生真菌轮枝菌(Verticillium sp.)菌株在马铃薯-葡萄糖(PDA)培养基上25-29℃培养3-5天，之后接种于查氏培养基(蔗糖1-3％，NaNO30.1-0.3％，KCl 0.01-0.05％，MgSO40.01-0.05％，FeSO40.0005-0.001％，K2HPO40.01-0.03％，酵母膏0.1-0.5％)培养3-5天，再转种于同一培养基，25-29℃培养6-9天，将培养物离心或过滤得发酵液，步骤二、在步骤一所得的发酵液中，加入(NH4)2SO4至90％饱和度，静置后离心收获沉淀，步骤三、将步骤二所得的沉淀溶解后以Sephadex G-25柱层析或透析法脱盐，步骤四、以DEAE-纤维素层析，用Tris-HCl缓冲液洗脱，280nm紫外检测，收集活性峰的洗脱液，洗脱液经透析后冷冻干燥，得到轮枝菌纤溶酶的粗酶，步骤五、将步骤四所得的轮枝菌纤溶酶的粗酶以8-10％聚丙烯酰胺凝胶进行制备电泳，洗脱后即得纯的轮枝菌纤溶酶。
上述的轮枝菌纤溶酶的制法，步骤一中所述的，查氏培养基为含蔗糖1-3％、NaNO30.1-0.3％、KCl 0.01-0.05％、MgSO40.01-0.05％、FeSO40.0005-0.001％、K2HPO40.01-0.03％和酵母膏0.1-0.5％的水溶液。
上述的轮枝菌纤溶酶的制法，步骤四中，洗脱液冷冻干燥可以用超滤脱盐浓缩替代。
上述的轮枝菌纤溶酶的制法，步骤五中，粗酶也可以经疏水层析和FPLC凝胶过滤色谱纯化，得到纯的轮枝菌纤溶酶，或者粗酶经CM-纤维素离子交换层析和FPLC凝胶过滤色谱纯化，得到纯的轮枝菌纤溶酶。
本发明人研究发现，轮枝菌纤溶酶有直接降解纤维蛋白的纤溶活性，有良好的血栓溶解作用，因此轮枝菌纤溶酶可以用于制备抗血栓的药物。
本发明的轮枝菌纤溶酶具有直接降解纤维蛋白的作用，纤溶活性好。轮枝菌纤溶酶的分子量约33KD，等电点约为8.5，具有广泛的pH稳定性。其纤溶活性可被PMSF抑制，而不受EDTA影响。通过液体发酵，使得原材料丰富、操作简便易行，便于工业化生产，因此有可能开发成为临床较理想的新型抗血栓药物。
四
图1轮枝菌纤溶酶的SDS-PAGE，1蛋白质标准，2轮枝菌纤溶酶样品。
图2温度对轮枝菌纤溶酶活性的影响。
图3pH对轮枝菌纤溶酶活性的影响。
图4不同PH对轮枝菌纤溶酶稳定性的影响。
五具体实施例方式
实施例1.轮枝菌纤溶酶的制备(1)发酵将从络石(Trachelospermum jasminoides)内生真菌轮枝菌(Verticillium sp.)菌株在马铃薯-葡萄糖(PDA)培养基上25-29℃培养3天左右，之后接种于查氏培养基(蔗糖1-3％，NaNO30.1-0.3％，KCl 0.01-0.05％，MgSO40.01-0.05％，FeSO40.0005-0.001％，K2HPO40.01-0.03％，酵母膏0.1-0.5％)培养4天，再转种于同一培养基，25-29℃培养7天，将培养物离心或过滤得发酵液。
(2)盐析在1000mL发酵液中加入600g(NH4)2SO4搅拌溶解至90％饱和度。4℃冰箱中过夜，然后7500rpm，4℃离心15min，收集沉淀。
(3)脱盐将步骤(2)所得沉淀溶解后，10000rpm，4℃离心15min，取上清，用Tris-HCl缓冲液透析过夜。
(4)离子交换柱层析取10mL上述样品，以DEAE-纤维素层析，用Tris-HCl缓冲液洗脱，280nm紫外检测，收集活性峰。将层析所得含活性部分的洗脱液超滤脱盐、浓缩(浓缩至原体积的1/10)，得轮枝菌纤溶酶粗酶。
(5)疏水层析柱分离将上述粗酶溶液10mL用含1M(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液透析，然后用疏水层析柱(Octyl Sepharose 4FF，1.6×10cm)进行分离，以含1---0M(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，280nm紫外检测，收集活性峰。
(6)将步骤(5)所得含活性部分的洗脱液超滤浓缩后，以FPLC(Superdex75)凝胶过滤色谱纯化，得轮枝菌纤溶酶纯品。
实施例2.轮枝菌纤溶酶的制备除步骤(5)不同于实施例1外，其它步骤同实施例1。步骤(5)改用如下方法将粗酶溶液10mL用磷酸缓冲液透析，然后以CM-纤维素离子交换层析，以含0-0.6M NaCl的磷酸缓冲液进行梯度洗脱，280nm紫外检测，收集活性峰。
实施例3.轮枝菌纤溶酶的制备步骤(1)和(2)同实施例1。
(3)将步骤(2)所得沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解后，10000rpm，4℃离心15min，取上清，以SephadexG-100柱(2.6×100cm)层析进行初步分离，用紫外分光光度计测280nm吸光值，收集活性峰，超滤浓缩。
(4)将步骤(3)所得含活性部分的洗脱液，以DEAE-纤维素层析，用Tris-HCl缓冲液洗脱，280nm紫外检测，收集活性峰。
(5)将步骤(4)所得含活性部分的洗脱液超滤、浓缩(浓缩至原体积的1/10)，得轮枝菌纤溶酶粗酶。
(6)将粗酶溶液10mL用磷酸缓冲液透析，然后以CM-纤维素离子交换层析，以含0-0.6M NaCl的磷酸缓冲液进行梯度洗脱，280nm紫外检测，收集活性峰，即得轮枝菌纤溶酶纯品。
实施例4.轮枝菌纤溶酶的制备除步骤(3)外，其它步骤同实施例1。步骤(3)改用如下方法(3)将步骤(2)所得沉淀溶解后，10000rpm，4℃离心15min，取上清，以Sephadex G-25柱(2.6×75cm)层析脱盐，加样量为20mL，洗脱液为0.02MTris-HCl缓冲液。
实施例5.轮枝菌纤溶酶的制备除步骤(6)外，其它步骤同实施例1。步骤(6)改用如下方法(6)将粗酶用10％聚丙烯酰胺凝胶进行制备电泳，得轮枝菌纤溶酶纯品。
实施例6.轮枝菌纤溶酶的性质研究(1)轮枝菌纤溶酶的分子量和等电点根据轮枝菌纤溶酶在SDS-PAGE蛋白质电泳中的迁移率，其分子量约为33kD(见附图1轮枝菌纤溶酶的SDS-PAGE)；在等电聚焦电泳中显示其等电点约为8.5。所以该酶属于碱性蛋白，而且分子量较小(小于尿激酶54kD)。
(2)轮枝菌纤溶酶活性的测定采用酶标仪法及平板法，具体做法如下方法一、酶标仪法在96孔细胞培养板上每孔先后加入含1.2mg/mL纤维蛋白原的50mM Tris缓冲液(pH8.0)238.5μL和105U/mL凝血酶溶液1.5μL制成小血栓，待血栓形成后在每个孔中分别加15μL样品液，用酶标仪同时测定多个样品在630nm的光吸收值的变化。在反应初期，血栓吸光度的降低同时间呈线性关系，其回归方程的斜率k的相反数与酶活性成正比。该法耗时短，且可同时作多个样品，在纤溶酶纯化过程中洗脱峰的纤溶酶活性检测主要用此法。
方法二、纤维蛋白平板法试剂纤维蛋白原(牛血)溶液用含10mM pH8.0磷酸缓冲液的生理盐水配成3.2mg/mL凝血酶(牛血)溶液用含10mM pH8.0磷酸缓冲液的生理盐水配成105U/mL0.6％琼脂糖溶液用含10mM pH8.0磷酸缓冲液的生理盐水配成轮枝菌纤溶酶样品，用磷酸盐缓冲液配成一定浓度。
操作在直径为9cm平皿里，先加入3mL纤维蛋白原溶液，再加入含100μL凝血酶溶液的0.6％琼脂糖溶液12mL，快速摇匀，静置1小时。用微量进样器点样5μL，盖上玻盖，于37℃恒温箱中保温16h后取出，用卡尺测出溶圈垂直两直径，相乘得一积。以溶圈直径乘积作纵坐标，尿激酶标准品的浓度为横坐标作图，即可在图上查出样品的活力单位。在轮枝菌纤溶酶活性特征研究中主要采用此法。
(3)直接降解纤维蛋白活性特征的测定采用平板法，分别以两种平板一种加有纤溶酶原和一种不加纤溶酶原且80℃加热灭活市售纤维蛋白原可能混有的纤溶酶原，测定轮枝菌纤溶酶的纤溶活性，结果发现，两种平板上的溶圈面积无明显差异，由此说明轮枝菌纤溶酶的纤溶活性是直接降解纤维蛋白。
(4)温度对酶活性的影响分别在不同温度下测定轮枝菌纤溶酶的活性，结果表明其最适反应温度在50-60℃之间。(见附图2温度对轮枝菌纤溶酶活性的影响)。
(5)pH对酶活性的影响将轮枝菌纤溶酶分别用不同pH的缓冲液溶解，然后在不同pH下用平板法测定酶的活力，结果发现其最适pH在10左右。(见附图3pH对轮枝菌纤溶酶活性的影响)。
又将酶溶于不同pH的缓冲液中，室温放置6小时后调pH至8.0，测定剩余活力，结果表明轮枝菌纤溶酶在pH4.0-10.0稳定性都较好。(见附图4不同pH对轮枝菌纤溶酶稳定性的影响)。
(6)不同抑制剂对酶活性的影响将轮枝菌纤溶酶分别溶于不同抑制剂0.5mM PMSF，5mM EDTA，5mMDTT和0.1％SDS，37℃下放置10min，测定剩余活力，结果表明轮枝菌纤溶酶活性可被PMSF抑制，而不受EDTA影响(见表1不同抑制剂对轮枝菌纤溶酶活性的影响)，由此说明轮枝菌纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，而不是金属蛋白酶。
表1不同抑制剂对轮枝菌纤溶酶活性的影响抑制剂 浓度 相对活性(％)None100PMSF 0.5mM1.23EDTA 5mM 97.5SDS0.1％62.6DTT5mM 69.4实施例7.轮枝菌纤溶酶的药理作用(1)急性毒性小将轮枝菌纤溶酶小鼠静脉注射8000U/kg无死亡。
(2)溶栓活性强体外自然血凝块的溶解抽取一定量的大鼠血，倒入平皿中，凝血后，用pH7.5，10mM PBS洗涤(加入PBS后摇几下8000rpm 5min，重复2次)后，分别称取500mg，放入离心管中，然后分别加入不同样品①4mL生理盐水，②含75μg轮枝菌纤溶酶的4mL同样溶液，③含100U/mL尿激酶的4mL同样溶液，37℃保温并不时振荡，每隔一定时间称重一次，记录血块重量。结果如表2。由此可见，轮枝菌纤溶酶急性毒性小，溶栓活性强，可用于生产治疗脑血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的药物。
表2轮枝菌纤溶酶体外溶解血块的作用
权利要求
1.一种轮枝菌纤溶酶，其特征是它是从络石内生真菌轮枝菌发酵所得的发酵液经盐析得沉淀，沉淀经透析脱盐后，以DEAE-纤维素层析，收集活性峰，透析后冷冻干燥，得粗酶，粗酶进行制备电泳，洗脱后得到的分子量约为33kD，等电点约为8.5的纯轮枝菌纤溶酶。
2.一种上述的轮枝菌纤溶酶的制法，其特征是它包括下列步骤步骤一、将从络石内生真菌轮枝菌菌株在马铃薯-葡萄糖培养基上25-29℃培养3-5天，之后接种于查氏培养基培养3-5天，再转种于同一培养基，25-29℃培养6-9天，将培养物离心或过滤得发酵液，步骤二、在步骤一所得的发酵液中，加入(NH4)2SO4至90％饱和度，静置后离心收集沉淀，步骤三、将步骤二所得的沉淀溶解后以Sephadex G-25柱层析或透析法脱盐，步骤四、以DEAE-纤维素层析，用Tris-HCl缓冲液洗脱，280nm紫外检测，收集活性峰的洗脱液，洗脱液经透析后冷冻干燥，得到轮枝菌纤溶酶的粗酶，步骤五、将步骤四所得的轮枝菌纤溶酶的粗酶以7.5％聚丙烯酰胺凝胶进行制备电泳，洗脱后即得纯的轮枝菌纤溶酶。
3.根据权利要求2所述的轮枝菌纤溶酶的制法，其特征是步骤一中所述的查氏培养基为含蔗糖1-3％、NaNO30.1-0.3％、KCl 0.01-0.05％、MgSO40.01-0.05％、FeSO40.0005-0.001％、K2HPO40.01-0.03％和酵母膏0.1-0.5％的水溶液。
4.根据权利要求2所述的轮枝菌纤溶酶的制法，其特征是步骤四中，洗脱液冷冻干燥用超滤脱盐、浓缩替代。
5.根据权利要求2所述的轮枝菌纤溶酶的制法，其特征是步骤五中，粗酶经疏水层析和FPLC凝胶过滤色谱纯化，得到纯的轮枝菌纤溶酶，
6.根据权利要求2所述的轮枝菌纤溶酶的制法，其特征是步骤五中，粗酶经CM-纤维素离子交换层析和FPLC凝胶过滤色谱纯化，得到纯的轮枝菌纤溶酶。
7.轮枝菌纤溶酶在制备抗血栓药物中的应用。
全文摘要
一种轮枝菌纤溶酶，它是从络石内生真菌轮枝菌发酵所得的发酵液经盐析得沉淀，沉淀经透析脱盐后，以DEAE－纤维素层析，收集活性峰，透析后冷冻干燥，得粗酶，粗酶进行制备电泳，洗脱后得到的分子量约为33kD，等电点约为8.5的纯轮枝菌纤溶酶。轮枝菌纤溶酶有直接降解纤维蛋白的纤溶活性，有良好的血栓溶解作用，因此轮枝菌纤溶酶可以用于制备抗血栓的药物。本发明公开了轮枝菌纤溶酶的制备方法。
文档编号C12N9/68GK1563370SQ200410014430
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月25日 优先权日2004年3月25日
发明者谭仁祥, 李英, 双惊雷, 黄午阳, 袁伟伟 申请人:南京大学