可变盐单胞菌高抗草苷膦的epsp合酶及其编码序列的制作方法

专利名称：可变盐单胞菌高抗草苷膦的epsp合酶及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物学领域，具体地说，本发明涉及从一株分离自草甘膦极端污染环境土壤的可变盐单胞菌(Halomonas variabilis)中克隆5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及获得其蛋白产物。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。本发明的多肽是一种具有抗草甘膦抗性的酶。
背景技术：
草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，其作用机制是通过抑制植物体内5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，干扰植物体内芳香族氨基酸的生物合成，导致植物死亡。
应用化学诱变细菌产生的aroA突变体，抗药性机理研究确证了aroA基因是草甘膦作用靶标EPSP合酶的编码基因。近年来包括美国和中国在内的国家草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦品种的选育和大面积的推广有直接的关系。美国Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的编码基因aroA及其抗草甘膦转基因植物等方面已申请了100余份专利，获得转基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品种，其中大豆等多种转基因作物已进入商品化生产。
我国在转基因抗草甘膦作物方面的研究已取得一定进展，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。同时，由于没有配套出口转基因抗除草剂种子的优势和抗草甘膦基因专利，与国外大公司在市场销售竞争中处于极为不利的地位。
因此，本领域迫切需要开发新的抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。

发明内容
本发明的目的是提供一种新的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(简称为“EPSP合酶”)以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在提高植物抗草甘膦抗性方面的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的EPSP合酶多肽，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码上述EPSP合酶多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-1347位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1350位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。在本发明的第五方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。
在本发明的第六方面，提供了一种改变植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合酶DNA编码序列，所述的EPSP合酶选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使EPSP合酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入EPSP合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次从草甘膦极端污染环境土壤样品分离鉴定的可变盐单胞菌中克隆获得了新的EPSP合酶，并且通过实验证实了它具有高抗草甘膦抗性，并且转入植物后，可导致植物抗草甘膦抗性的提高。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“EPSP合酶”、“EPSP多肽”或“5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶”可互换使用，都指具有5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的EPSP合酶或多肽”是指EPSP多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EPSP合酶。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括EPSP合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然EPSP合酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“EPSP多肽”指具有EPSP合酶活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与EPSP合酶相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与EPSPS DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了EPSP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有EPSP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供EPSP合酶或多肽的类似物。这些类似物与天然EPSP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。
在本发明中，“EPSP合酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EPSP合酶的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的EPSPS核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、PCR扩增法、或重组法的方法获得。例如首先根据SEQ ID NO1的序列进行全序列合成。
对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用人工合成的EPSPS核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或EPSP合酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的EPSP多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码EPSP多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，EPSP合酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含EPSP合酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗草甘膦抗性提高的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
另一方面，本发明还包括对EPSP合酶DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与EPSP合酶基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制EPSP合酶的分子，也包括那些并不影响EPSP合酶功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的EPSP合酶基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的EPSP合酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达EPSP合酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用EPSP合酶基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与EPSP合酶基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗EPSP合酶的抗体可用于检测样品中的EPSP合酶。
多克隆抗体的生产可用EPSP合酶或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明还涉及定量和定位检测EPSP合酶水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。
一种检测检测样品中是否存在EPSP合酶的方法是利用EPSP合酶的特异性抗体进行检测，它包括将样品与EPSP合酶特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EPSP合酶。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因的表达分析。用EPSP合酶特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测EPSP合酶的转录产物。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是根据测序结果人工全合成的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1350个碱基，其开放读框位于1-1347位，编码全长为449个氨基酸的EPSP合酶(SEQ ID NO2)。
本发明的EPSP合酶具有如下特性A)草苷膦抗性功能明确，且显示了高于以前报道5-10倍的抗草苷膦能力；B)结构新，在核酸水平上与已见报道的EPSP合酶编码基因无任何同源性，在氨基酸水平上与Monsanto公司专利报道的根瘤农杆菌CP4的同源性为44％，且不含有专利保护序列和突变位点。
EPSP合酶为改变植物的抗草甘膦抗性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以通过将EPSP合酶的编码基因导入，改变现有优良农作物品种的抗草甘膦抗性，可获得抗草甘膦的小麦、水稻或其它农作物品种，解决农业生产中存在的实际问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1高抗草苷膦的DNA片段克隆1、草苷膦极端污染环境中土壤样品的采集自然环境中特别是在长期使用草甘膦等除草剂地区的土壤中，存在种类繁多的能耐受草甘膦或其它除草剂的细菌菌株。从被50％左右草苷膦污染达十年以上的土壤中(河北奇峰化工有限公司草甘膦生产工厂开放式分装点)采集样品。
2、从草苷膦极端污染土壤样品中分离鉴定可变盐单胞菌样品接种在草苷膦终浓度(100mmol/L，200mmol/L，300mmol/L，350mmol/L，400mmol/L，450mmol/L，500mmol/L，550mmol/L，600mmol/L，650mmol/L，700mmol/L，800mmol/L，900mmol/L，1000mmol/L)的MOPs液体培养基中，30℃，200r/min摇瓶振荡培养2d，稀释菌液，然后在草苷膦浓度为200mmol/L的MOPs固体培养基上涂板，挑取单菌落反复划线纯化后接种在LB固体培养基上。对筛选出的单一菌株进行细菌形态、生理生化综合特征表型鉴定。
提取细菌总DNA，以DNA为模板，用引物F275′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(SEQ ID NO3)，引物R1492 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO4)，PCR扩增出16SrDNA。产物经纯化，用pGEM-Teasy连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。16SrDNA测序由上海基康公司完成。将测序结果用BLAST软件与Genebank中16SrDNA序列进行同源性比较，并用DNAMAN V4软件的Multiple Sequence Alignment进行同源性分析。
菌株为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状，无芽孢。将菌株的16SrDNA序列在Genebank中进行同源性检索，结果发现，在最相近的100个序列中，有48个为可变盐单胞菌属细菌，同源性为95-99％，所筛选的菌株与Halomonas variabilis的16SrDNA的同源性达99％，初步鉴定为Halomonas variabilis。
3、可变盐单胞菌总DNA粘粒文库的构建粘粒文库的构建按Stratagene公司说明书进行；DNA片段用Clontech公司的Gel-extract Kit纯化。菌株染色体DNA用Sau3AI部分酶切，回收30-40kb的片段，去磷酸化；与经Xba I酶切，去磷酸化，再用Bam I酶切的Super Cosl Cosmid载体(Stratagene公司)相连，噬菌体蛋白Gigapack packing包装转染大肠杆菌JM109，将转染后的细胞涂板在Amp 100μg/ml LB平板上。
4、筛选草甘膦抗性转化子从Amp 100μg/ml LB平板上挑单菌落，划板在草苷膦浓度20mmol/L的MOPs培养基固体平板上，筛选得到阳性克隆。克隆片段用EcoRI消化，与经EcoRI酶切pACYC184载体(ATCC 37033)相连，转化JM109后，在Tc 50μg/ml和草苷膦20mmol/L双重抗性的MOPs固体培养基上筛选得到8kb亚克隆片段，该片段用HindIII酶切后，与经HindIII酶切的pGEM-3zf(-)载体(Promega)相连，转化JM109后，在Amp 100μg/ml和草苷膦20mmol/L双重抗性的MOPs固体培养基上筛选得到包括3.5kb亚克隆片段的草甘膦抗性转化子。
5.高抗草苷膦的DNA片段的亚克隆及抗性验证为确定草苷膦抗性基因的编码区，以3.5kb片段为模板，以引物I(5′-ctg gaa ttcatg caa cca cag gg-3′，SEQ ID NO5，含Eco RI位点))和引物II(5′-gtc cga att cgg cacgtc aaa cgt cat-3，SEQ ID NO6，含Eco RI位点))进行PCR扩增得到1.35kb EPSPs基因(SEQ ID NO1中1-1347bp)。PCR循环为94℃，5min→94℃，30sec→57℃，1min 20sec→72℃，30sec；30个循环。
将PCR产物经Eco RI酶切与经相同酶切去磷酸化的pACYC184相连，连接产物转化JM109。在四环素50μg/ml和草苷膦10mmol/L双重抗性的MOPs固体培养基上筛选得到阳性克隆。重组质粒命名为1.35-pACYC184。
1.35-pACYC184转化JM109后在不同草苷膦浓度(0至160mmol/L)的MOPs液体培养基中观察发现它能在草苷膦浓度为80mmol/L的MOPs液体培养基中很好的生长。
实施例2高抗草苷膦的DNA片段的序列分析及其EPSP合酶功能验证1、高抗草苷膦的DNA片段的序列分析对实施例1中所亚克隆的高抗草苷膦DNA片段进行全核苷酸序列测定。分析结果表明，它有一个完整的阅读框架，编码EPSP合酶其序列如SEQ ID NO1所示，编码包括终止密码子在内的449个氨基酸的EPSP合酶(SEQ ID NO2)。
将所亚克隆的高抗草苷膦编码序列与已报道的EPSP合酶编码基因(aroA)比较，在核苷酸水平几乎没有任何同源性。
氨基酸序列同源性分析结果表明，与已知的Class I EPSP合酶(来源于大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等)氨基酸同源性同源性并不高，与大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌来源的EPSP合酶氨基酸同源性分别为26.15％和24.84％。与Achromobacter sp.strain LBAA的EPSP合酶同源性为42.42％，与Agrobacteriumtumefaciens sp.strain CP4的EPSP合酶同源性为44.54％，与Psedomonas sp.StrainPG2982的EPSP合酶同源性为42.42％，且没有美国专利(专利号为6,225,114和6,248,876)所保护的位点。
2、高抗草苷膦的DNA片段的EPSP合酶功能验证序列分析结果显示抗性克隆中含有EPSP合酶，为了证实其具有EPSP合酶活性，本实验以大肠杆菌EPSP合酶缺陷型菌株为受体菌株，采用CaCl2法将1.35-pACYC184转化大肠杆菌EPSPs缺陷型菌株ER2799(购自New EnglandBiolabs，Inc)，涂板在Tc 50μg/mlLB固体平板上，用牙签点取所有的转化子到草苷膦20mmol/L MOPs固体培养基上，受体菌株ER2799、含有载体质粒(pACYC184、pGEM-3zf)的ER2799为阴性对照，如抗草甘膦亚克隆含有可表达的EPSP合酶基因，互补了受体菌的缺陷，则能够利用限制性培养基的无机物合成氨基酸并生长，否则就不能生长。
试验结果表明，发现其在功能上与EPSP合酶缺陷型菌株互补，能在限制性培养基MOPs固体平板上生长，而空白质粒pACYC184及缺陷菌株都不能在MOPs固体平板上生长。说明该基因具有完整的EPSP合酶的功能。
利用pET-28a(+)(Novagen)构建含His-Tag，T7-Tag和EPSP合酶的融合蛋白，对转入的大肠杆菌BL21裂解物进行电泳，发现在约51KD处有一条带，与预测的融合蛋白分子量相符。
实施例3高抗草苷膦的EPSP合酶基因的人工合成根据测定的含1350bp编码区的核苷酸序列，首先分8个区段分别根据正链和副链序列，分别合成出长度150-200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链各一一对应的8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火，形成8个带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段，经T4 DNA连接酶催化组装成一个完整的EPSP合酶基因。经测序验证，该合成的DNA片段含有SEQ ID NO1中1-1347位的核苷酸序列，并且合成基因的两端含XbaI和SacI位点。
将上述人工合成的5’和3’端酶切位点为XbaI和SacI位点EPSP基因，用于下面高抗草苷膦的EPSP合酶基因植物表达载体的构建。
实施例4高抗草苷膦的EPSP合酶基因植物表达载体的构建高抗草苷膦的EPSP合酶基因植物表达载体构建的具体方法如下A.pBI121(ClonTech公司)和pCAMBIA2301(ClonTech公司)用HindIII和EcoRI双酶切，将pBI121带有p35S-GUS-Nos-ter的片段连入pCAMBIA2301，形成中间载体p35S-2301-GUS；B.用XbaI和SacI双切p35S-2301-GUS和上述人工合成的EPSP基因，用EPSP置换p35S-2301-GUS相应酶切位点的GUS，从而获得高抗草苷膦的EPSP合酶基因植物表达载体。再将其转入农杆菌中，用于转化模式植物烟草。
实施例5利用叶盘法转化构建抗草苷膦的转基因烟草(1)用无菌牙签挑取YPE选择平板上的实施例5中制备的阳性克隆，接种于2ML YPE液体(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；(2)室温下4,000g离心10分钟；(3)弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌体的OD600在0.5左右；(4)取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1cm2见方的小叶片；(5)将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5分钟，在无菌滤纸上吸干菌液；把经浸染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；(6)将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/l+NAA 0.1mg/l+Kan50mg/l+羧苄青霉素250mg/l)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；(7)约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/l+Kan 25mg/l)上进行生根培养，2-7天左右生根；(8)待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着着的固体培养基，移入土壤中，刚开始几天用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，转移至在含10mM的草苷膦的固体培养基中筛选草苷膦抗性的植株。
(9)抗性植株经Southern、Northern杂交以及Westhern blot验证为转基因的抗性植株。
(10)用浓度为1.6％草甘膦盐水剂喷非转基因烟草苗，发现非转基因烟草苗萎焉，而在同样浓度下，转EPSP基因的烟草苗却能正常生长。为了进一步检测转基因烟草的抗性，采用几个梯度的草甘膦铵盐水剂0.25％，1％，1.6％，2.5％，5％，10％，发现非转基因烟草苗在0.25％草甘膦铵盐水剂下就不能生长，而转基因烟草在5％草甘膦铵盐水剂下能正常生长，而在10％草甘膦铵盐水剂下能正常生长两周，然后，茎部开始腐烂最后死亡。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>可变盐单胞菌高抗草苷膦的EPSP合酶及其编码序列<130>035622<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1350<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1347)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1350)<223>EPSP合酶<400>1atg caa cca cag ggt aaa gtt acc tat cgg gtg agt ccc ggt ggc cag48Met Gln Pro Gln Gly Lys Val Thr Tyr Arg Val Ser Pro Gly Gly Gln1 5 10 15gcg caa ggt cgc ttg cgc gtt ccg ggc gat aaa tgc atg tct cac cgt96Ala Gln Gly Arg Leu Arg Val Pro Gly Asp Lys Cys Met Ser His Arg20 25 30tcc att atg ctg ggt gct ttg gca gag ggt gtg acc gag gta aaa ggg144Ser Ile Met Leu Gly Ala Leu Ala Glu Gly Val Thr Glu Val Lys Gly35 40 45ttt ctt gaa ggt gaa gat agc ctg gca aca ctg caa gca ttc cgc gag192Phe Leu Glu Gly Glu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Gln Ala Phe Arg Glu50 55 60atg ggc gtc gct att gaa ggt cct cac cag ggg cga gtg aca atc cat240Met Gly Val Ala Ile Glu Gly Pro His Gln Gly Arg Val Thr Ile His65 70 75 80ggt gtg gga atg cat ggg ctc aaa gcg cca gct ggt cca ctt tac gtg288Gly Val Gly Met His Gly Leu Lys Ala Pro Ala Gly Pro Leu Tyr Val85 90 95
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<221>misc_feature<222>(1)..(1350)<223>EPSP合酶
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<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>引物<400>4tacggttacc ttgttacgac tt 22<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>引物<400>5ctggaattca tgcaaccaca ggg 23<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>引物<400>6gtccgaattc ggcacgtcaa acgtcat 2权利要求
1.一种分离的EPSP合酶多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-1347位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1350位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种具有EPSP合酶活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有EPSP合酶活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的EPSP合酶特异性结合的抗体。
10.一种改变植物抗草甘膦抗性的方法，其特征在于，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合酶DNA编码序列，所述的EPSP合酶选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使EPSP合酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入EPSP合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
全文摘要
本发明提供了一种新的5－烯醇丙酮酸莽草酸－3－磷酸合酶(简称为“EPSP合酶”)，编码EPSP合酶的多核苷酸和经重组技术产生这种EPSP合酶的方法。本发明还公开了编码这种EPSP合酶的多核苷酸的用途。
文档编号C12N5/04GK1664095SQ20041001663
公开日2005年9月7日 申请日期2004年3月1日 优先权日2004年3月1日
发明者林敏 , 刘柱 申请人:中国农业科学院生物技术研究所