专利名称：微生物转化法生产美雄酮的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白同化激素类药物的生产方法，特别是一种微生物转化法生产美雄酮的制备工艺。
背景技术：
美雄酮(Methandienone)即去氢17α-甲基睾丸素(Dehydro-17α-methyltestosterone)，化学名17β-羟基-17α-甲基雄甾-1，4-二烯-3-酮(17β-hydroxy-17α-methylandrosta-1，4-dien-3-one)，俗称大力补(Dianabol)，是一种蛋白质同化激素，能明显地促进蛋白质合成(同化作用)，减少氨基酸分解(异化作用)，使肌肉增长，体重增加，降低氮质血症，同时能够促进骨髓造血功能，主要用于蛋白质同化或吸收不足，以及蛋白质分解亢进或损失过多等情况，如严重烧伤、手术后慢性消耗性疾病、老年骨质疏松和肿瘤恶液汁等病人。有报道称对治疗再生障碍性贫血有较好的疗效。美雄酮与甲基睾丸素相比较，其具有同化作用强，但雄性激素样作用弱的优点。
美雄酮是由甲基睾丸素经C1，2脱氢生成，其反应过程如下所示 自20世纪50年代人们已经开始对其进行研究，已有不少专利文献进行报道。主要分为化学脱氢和生物脱氢两种方法，化学脱氢研究比较成熟，以SeO2脱氢法为代表早已在国内外用于生产。随着新型试剂的出现和有机合成技术的提高，许多化学脱氢的新方法也随之出现。罗马尼亚大学ITorrini I等利用Ti(NO3)3对△1-3-氧-甾族化合物或△4-3-氧-甾族化合物在室温下进行脱氢反应制备△1，4-3-氧-甾族化合物；浙江大学姚爱平等采用DDQ(2，3-二氯-5，6-双睛苯醌)将甲基睾丸素脱氢制备成去氢甲基睾丸素。国内工业生产也普遍采用化学脱氢法在17α-甲基睾丸素A环C1，2引入双键生成去氢17α-甲基睾丸素，即SeO2脱氢法，为使产品去氢17α-甲基睾丸素符合有关标准的规定，在后处理上通常采用复杂的层系统进行分离纯化，从而加大生产成本。用微生物法在17α-甲基睾丸素A环C1，2引入双键生成去氢17α-甲基睾丸素国内外也有相关报道，Buki等比较了一株诺卡氏菌(Nocardia)和一株分支杆菌(Mycobacterium)对各种17α-甲基-17β-羟基-雄甾烷类甾体的转化作用；Protiva等的实验结果表明不同的微生物按不同的代谢途径转化17α-甲基-17β-羟基-雄甾烷-3-酮；Ghiocel Radu R等用简单节杆菌在两种液相系统中转化甲基睾丸素制备去氢甲基睾丸素，利用离子交换柱对产物进行分离纯化，最终收率45-50％。SCHERING AG(DG)公司就采用简单节杆菌发酵3-氧-△4-甾类化合物生成3-氧-△1，4-甾类化合物申请专利(EP 0054810)，其中甲基睾丸素脱氢生成去氢甲基睾丸素，投料浓度0.0375％，收率82.7％。法幼华等比较了诺卡氏菌和节杆菌两属共62株菌对17α-甲基表雄醇和17α-甲基睾丸素的脱氢，发现节杆菌9-2能从17α-甲基表雄醇一步生成去氢17α-甲基睾丸素，转化率85％；中科院上海有机化学所张丽青等人采用简单节杆菌和诺卡氏菌混合菌株转化17α-甲基-17β-羟基-雄甾-3-酮一步反应同时在C1和C4引入两个双键生成17α-甲基-17β-羟基-△1，4雄甾二烯-3-酮即去氢甲基睾丸素，产率50％。尽管利用微生物转化法制备去氢甲基睾丸素在国内外已有相关研究，甚至有的报道收率能达到80％以上，但是这些研究仅是在实验室阶段的研究，规模小、操作复杂，而且投料浓度很低，一般不超过千分之一。
综上所述，不难看出，影响生物发酵法生产美雄酮推广应用的关键问题是投料浓度、生产规模、生产成本以及操作的难易程度。为此，研究和开发一种工艺简单、经济实用的美雄酮制备、分离提取方法是当务之急。
发明内容
为了解决上述技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种制备不含对人体有害物质、操作简单、生产环境达到环保要求，同时投料浓度高、转化率高、收率高、成本低的微生物转化法生产美雄酮的制备工艺。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种微生物转化法生产美雄酮的制备工艺，该工艺包括以下步骤一、制备用于转化17α-甲基睾丸素的发酵液1、菌种悬液的制备生产菌种为天津科技大学应用微生物教研室保存的简单节杆菌，编号BY31250，将该生产菌株在琼脂斜面上30℃恒温培养1-2天，菌体在斜面上已完全长好，从外观上看呈淡乳黄色，丰满而有光泽；在光学显微镜下，菌体形状多数呈杆状，有部分呈折角状。生产菌株琼脂斜面4℃保藏待用，保藏时间以在20d内为宜。其中，制作菌体种子悬液采用的液体为无菌水或新鲜种子培养基，灭菌条件为121℃，灭菌时间20～25min。这是因为斜面低温保藏法是一种简便、短期、过渡性的保藏方法，而斜面保藏时间对菌种质量及甾体转化能力均有一定的影响。实验分别用新鲜斜面及4℃冰箱保存5天、10天、15天、20天、25天、30天的菌种进行甲基睾丸素的脱氢实验，结果如附图1所示。
由附图1可知，斜面在4℃冰箱保存20d之内，美雄酮的转化率仅下降了6.45％。而在4℃冰箱保存30d，美雄酮的转化率下降了30.6％，菌种性能衰退较大。因此，菌种保藏时间以在20d之内为宜。
2、一级种子培养种子培养基由碳源、氮源和无机磷组成，即葡萄糖 8～12g/L玉米浆 10～15g/L酵母膏 3～7g/LKH2PO41.5～2.8g/LpH 6.4～7.0将制备好的种子悬液加入到上述种子培养基中，灭菌条件为120～125℃，15～25min；在摇床转速160r/min下，30～33℃培养18～22h，即可得到适合接种的种子培养物。
3、二级发酵培养发酵培养基组成葡萄糖 12～15g/L玉米浆 15～20g/L酵母膏 3～7g/LKH2PO41.5～2.8g/LpH 7.0～7.2将生长良好的种子培养液按2％～5％(v/v)的接种量接入到上述发酵培养基中；在发酵过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平在10％～30％，通过流加20％(w/v)的NaOH来控制pH值在7.0～7.2，培养22～24h，即可得到适宜于投料的菌体培养液。
4、底物17α-甲基睾丸素的转化将底物17α-甲基睾丸素粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，并加入相对于发酵液体积4％～7％的工业乙醇，投料量为12～20g/L发酵液体积。在转化过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平在20％～40％，通过流加20％(w/v)的NaOH来控制pH值在7.0～7.4，转化36～48h；在转化阶段后期，通过薄层层析或高效液相来控制发酵终点。
二、从发酵液中提取、分离美雄酮该过程包括发酵液过滤、滤饼在甲醇中回流、去除菌体、成腙反应、过滤得粗品及水解后底物回收(见附图2)。具体步骤包括如下1、发酵液除去菌体转化结束后，将发酵液减压过滤，滤饼烤干。将滤饼加入到反应罐中，并加入为滤饼重量10～15倍量的甲醇，回流溶解至澄清，回流时间1～2h，过滤除去菌体。
2、产物的分离与精制在滤液中加入一定量的Girard试剂和冰醋酸，所用Girard(吉拉得)试剂是上海试剂一厂生产的。回流4～6小时，减压浓缩，加入8～10倍体积的水，室温搅拌，过滤即得美雄酮粗品，用乙醇或甲醇精制即得质量符合BP80版标准的美雄酮成品。
3、底物的回收在滤液中加入浓硫酸调节pH值在1.5～3的范围，室温下静置6～8小时，未转化的底物即可结晶析出，过滤、水洗、干燥即得回收底物，回收底物可以被所用菌种再次转化为符合质量标准的美雄酮。
本发明的制备方法包括美雄酮的微生物转化和美雄酮的提取、分离两方面技术，其有益效果是利用微生物转化法生产美雄酮所采用的工艺与化学脱氢法制备相比较，所得产品美雄酮同样都达到BP80版标准的情况下，原料成本降低了40％以上，成品收率提高了30％以上。同时，微生物转化法生产工艺对周围环境污染非常轻微，几乎没有污染，生产中为常压工作，操作工序简单，无其它危险。应用本工艺方法生产美雄酮周期短、收率高，可带来较高的经济效益。而且有利于开拓更为广阔的市场，满足社会的需求。
图1为本发明的菌种保藏时间对转化率的影响图表；图2为本发明的发酵液的提取、分离过程流程图。
具体实施例方式
结合附图及实施例对本发明的微生物转化法生产美雄酮的制备工艺加以说明。
实施例1生产菌种为天津科技大学应用微生物教研室保存的简单节杆菌，编号BY31250，将该生产菌株在琼脂斜面上30℃恒温培养2天，4℃保藏5d使用。其中，制作菌体种子悬液采用的液体为无菌水或新鲜种子培养基，灭菌条件为121℃ 20～25min。
种子培养基由碳源、氮源和无机磷组成，即葡萄糖 8g/L玉米浆 10g/L酵母膏 3g/LKH2PO41.5g/LpH 6.4将制备好的种子悬液加入到上述种子培养基中，灭菌条件为121℃25min；在摇床转速60r/min下，30℃培养22h，即得适合接种的种子培养物。
发酵培养基组成葡萄糖 15g/L玉米浆 20g/L酵母膏 7g/L
KH2PO42.8g/LpH 7.2将生长良好的种子培养液按5％(v/v)的接种量接入到上述发酵培养基中；在发酵过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平在10％～30％，通过流加20％(w/v)的NaOH来控制pH值在7.0～7.2，培养24h，即得适宜于投料的菌体培养液。
将底物17α-甲基睾丸素(17α-methyltestosterone)粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，并加入相对于发酵液体积4％的工业乙醇，投料量为1.2g/L发酵液体积，在转化过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平在30％左右，通过流加20％(w/v)的NaOH来控制pH值在7.2，转化36h；在转化阶段后期，通过薄层层析或高效液相来控制发酵终点。
转化结束后，将发酵液减压过滤，滤饼烤干。将滤饼加入烧瓶中，并加入滤饼重量的10～15倍量的甲醇，回流溶解至澄清，回流时间1～2h，过滤除去菌体。在滤液中加入一定量的Girard试剂和冰醋酸，回流4～6小时，减压浓缩，加入8～10倍体积的水，室温搅拌，过滤即得美雄酮粗品，用乙醇精制即得符合BP80版质量标准的美雄酮成品。在滤液中加入浓硫酸调节pH值在1.5～3的范围，室温下静置6～8小时，未转化的底物即可结晶析出，将结晶过滤、水洗、干燥即得回收底物，回收底物可以被所用菌种再次转化为符合质量标准的美雄酮。最终结果如下转化率＝72％、粗品率＝94.7％、分离率＝64％、精制率＝97.2％实施例2用新鲜的种子斜面，即生产菌株在琼脂斜面上30℃恒温培养2天后直接使用，用无菌水制成菌悬液。一级种子培养、二级发酵培养实例1中所述。将底物17α-甲基睾丸素(17α-methyltestosterone)粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，投料量为1.2g/L发酵液体积，并加入相对于发酵液体积3％的工业乙醇，转化条件同实例1中所述。转化9h后，再加入相对于发酵液体积4％的工业乙醇；转化48h后，取样用TLC和HPLC法控制终点。
转化结束后，发酵液的提取、分离同实例1中所述，转化结果为转化率＝70％、粗品率＝95.7％、分离率＝60％、精制率＝96.8％实施例3用新鲜的种子斜面，即生产菌株在琼脂斜面上30℃恒温培养2天后直接使用，用无菌水制成菌悬液。一级种子培养、二级发酵培养实例1中所述。
将回收底物粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，投料量为2.0g/L发酵液体积，并加入相对于发酵液体积3％的工业乙醇，转化条件同实例1中所述。转化8h后，再加入相对于发酵液体积4％的工业乙醇；转化24h后，取样用TLC和HPLC法控制终点。
转化结束后，发酵液的提取、分离同实例1中所述，转化结果为转化率＝88％、粗品率＝94.5％、分离率＝78％、精制率＝94.8％实施例4用新鲜的种子斜面，即生产菌株在琼脂斜面上30℃恒温培养2天后直接使用，用无菌水制成菌悬液。一级种子培养、二级发酵培养实例1中所述。
将粉碎后粒度14～16μ的正品底物和回收底物按1∶1(w/w)混合，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，投料量为1.5g/L发酵液体积，并加入相对于发酵液体积3％的工业乙醇，转化条件同实例1中所述。转化8h后，再加入相对于发酵液体积4％的工业乙醇；转化36h后，取样用TLC和HPLC法控制终点。
转化结束后，发酵液的提取、分离同实例1中所述，转化结果为转化率＝75％、粗品率＝93％、分离率＝66％、精制率＝94％实施例5用新鲜的种子斜面，即生产菌株在琼脂斜面上30℃恒温培养2天后直接使用，用无菌水制成菌悬液。一级种子培养、二级发酵培养实例1中所述。
将粉碎后粒度14～16μ的正品底物和回收底物按7∶3(w/w)混合，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，投料量为1.5g/L发酵液体积，并加入相对于发酵液体积3％的工业乙醇，同时加入聚醚类物质(泡敌)0.3g/L，转化条件同实例1中所述。转化8h后，再加入相对于发酵液体积4％的工业乙醇；转化36h后，取样用TLC和HPLC法控制终点。
转化结束后，发酵液的提取、分离同实例1中所述，转化结果为转化率＝70％、粗品率＝95％、分离率＝62％、精制率＝96％传统的化学脱氢是采用SeO2脱氢，虽然脱氢工艺也不复杂，收率也不低，但因最终产品中不可避免的含有少量对人体有害的Se，而采用本发明的微生物转化法生产美雄酮的制备工艺的最终产品—美雄酮成分中不含Se。
权利要求
1.一种微生物转化法生产美雄酮的制备方法，其特征是该方法采用简单节杆菌经菌种悬液的制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化和产物的分离提取；通过控制培养期和转化期的相关工艺，并采用Girard试剂特异性的分离产物美雄酮和底物17α-甲基睾丸素，获得符合BP80版标准的产物美雄酮、回收的底物甲基睾丸素可以被该菌株重新转化的具体步骤包括如下(一)、制备用于转化甲基睾丸素的发酵液(1)、菌种悬液的制备生产菌种为天津科技大学应用微生物教研室保存的简单节杆菌，编号BY31250，将该生产菌株在琼脂斜面上生长1-2天后，4℃保藏待用；其中，制作菌体种子悬液采用的液体为无菌水或新鲜种子培养基，灭菌条件为121℃，灭菌时间20～25min；(2)、一级种子培养将上述制好的种子悬液加入到含碳源、氮源和无机磷组成的种子培养基中，灭菌条件为120～125℃，灭菌15～25min；在摇床上160r/min转速下，30～33℃培养18～22h，即得适合接种的种子培养物；(3)、二级发酵培养将生长良好的种子按2％～5％v/v的接种量接入到含有玉米浆、酵母膏、葡萄糖、磷酸二氢钾的发酵培养基中；在发酵过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平保持在10％～30％，通过流加20％(w/v)的NaOH来控制pH值在6.7～7.2，培养22～24h，即得适宜于投料的菌体培养液；(4)、底物17α-甲基睾丸素的转化将底物粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，并加入相对于发酵液体积4％～7％的工业乙醇，投料量为12～20g/L发酵液体积；在转化过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平在20％～40％，通过流加20％w/v的NaOH来控制pH值在7.0～7.4，转化36～48h；在转化阶段后期，通过薄层层析或高效液相来控制发酵终点；(二)、从发酵液中提取、分离美雄酮该过程包括发酵液过滤、滤饼在甲醇中回流、去除菌体、成腙反应、过滤得粗品以及水解后回收底物的具体步骤包括如下(1)、发酵液除去菌体转化结束后，将发酵液减压过滤，滤饼烤干，加入为滤饼重量的10～15倍量的甲醇，回流溶解至澄清，回流时间1～2h，过滤除去菌体；(2)、产物的分离与精制在滤液中加入一定量的Girard试剂和冰醋酸，回流4～6小时，减压浓缩，加入8～10倍体积的水，室温搅拌，过滤即得美雄酮粗品，用乙醇或甲醇精制即得质量符合BP80版标准的美雄酮成品；(3)、底物17α-甲基睾丸素的回收在滤液中加入浓硫酸调节pH值在1.5～3.0的范围，室温下静置6～8小时，未转化的底物即可结晶析出，过滤、水洗、干燥即得回收底物，回收底物可以被所用菌种再次转化为符合质量标准的美雄酮。
2.根据权利要求1所述的美雄酮的制备方法，其特征是在菌种悬液制备时，琼脂斜面菌种30℃恒温培养1-2天，菌体在斜面上已完全长好，从外观上看呈淡乳黄色，丰满而有光泽；在光学显微镜下菌体形状多数呈杆状，有部分呈折角状；在4℃保藏时间以在20d之内为宜。
3.根据权利要求1所述的美雄酮的制备方法，其特征是在发酵培养基中采用玉米浆和酵母膏构成复合氮源。
4.根据权利要求1所述的美雄酮的制备方法，其特征是在投入底物的过程中将底物17α-甲基睾丸素粉碎的粒度为14～16μ，在无菌条件下迅速投入发酵液中，加入4％～7％的工业乙醇，并加入相对于发酵液体积万分之一至万分之三的聚醚类消泡剂。
5.根据权利要求1所述的美雄酮的制备方法，其特征是所述工业乙醇的加入分两次加入，第一次随底物一起加入，转化7～9h后再次加入总体积一半左右的工业乙醇。
6.根据权利要求1所述的美雄酮的制备方法，其特征是获得符合BP80版标准的美雄酮正品的底物投料浓度为12～15g/L，转化率65％～75％，收率55％～64％；回收底物投料浓度为15～20g/L，转化率85％～90％，收率75％～80％。
7.根据权利要求1所述的美雄酮的制备方法，其特征是回收底物可以被所用菌种再次转化为符合所述质量标准的美雄酮。
8.根据权利要求1所述的美雄酮的制备方法，其特征是提取分离过程为采用Girard试剂分离。
9.根据权利要求1所述的美雄酮的制备方法，其特征是所得的美雄酮成分中不含Se。
全文摘要
本发明提供一种微生物转化法生产美雄酮的制备工艺，主要包括采用简单节杆菌经菌种悬液的制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化和产物的分离提取；通过控制培养期和转化期的相关工艺，并采用Girard试剂特异性的分离产物美雄酮和底物，获得符合BP80版标准的产物美雄酮、回收的底物甲基睾丸素可以被该菌株重新转化等步骤。其有益效果是利用微生物转化法生产美雄酮所采用的工艺与化学脱氢法制备相比较，所得产品美雄酮同样都达到BP80版标准的情况下，原料成本降低了40％以上，成品收率提高了30％以上。同时，该生产工艺对周围环境污染非常轻微，几乎没有污染，生产中为常压工作，操作工序简单，无其它危险。生产美雄酮周期短、收率高，可带来较高的经济效益。
文档编号C12P33/02GK1563409SQ20041001880
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月29日 优先权日2004年3月29日
发明者杜连祥, 王致萍, 卢继坤, 王树立, 别松涛 申请人:天津市福兴达精细有机化工有限公司