专利名称：利用可转化大片段基因组文库发掘野生稻有利基因的方法
技术领域：
本发明属于水稻品种改良及育种技术领域。涉及大规模发掘和利用野生稻有利基因资源的分子生物学技术及基因工程技术领域。
背景技术：
野生稻中蕴含丰富的有利基因。野生稻基因资源的成功挖掘、利用曾带来了世界的第一次和第二次绿色革命。从野生稻中转育矮秆基因到栽培稻带来了第一次绿色革命；杂交水稻被誉为我国的第五大发明，三十多年前，袁隆平院士最先从野生稻中发现野败不育基因才成功培育了杂交水稻，开创了第二次绿色革命。野生稻由于长期处于野生状况，经受各种灾害和不良环境的选择，具有对各种病虫害的抗性和各种逆境的适应性，如抗病、抗虫、耐寒、耐旱、耐盐碱、耐淹、耐荫以及高产、优质、雄性不育、磷钾高效利用等性状都是水稻遗传改良的重要基因资源。
野生稻有利基因可为栽培稻所利用。稻属(Oryza)有20～25个分化很好的种，稻属各种染色体组型划分为AA、BB、CC、BBCC、CCDD、EE、FF、GG、和HHJJ，只有两个种即普通栽培稻(Oryza sativa)和光身稻(O.glaberrina)属于栽培稻，其它的称野生稻。对于AA染色体组型野生稻可以直接用常规杂交方法进行利用，即结合选择、回交即可成功。早在上世纪二十年代，我国水稻专家丁颖利用栽培稻与普通野生稻杂交，选育出了“中山1号”及系列衍生品种“抱胎矮”、“包选2号”等。野败不育系、长柱头不育系、红莲不育系的培育成功使杂交水稻大面积推广并产生巨大效益；一些抗性基因，例如抗草丛矮缩病、抗白叶枯病等，也同过常规杂交方法实现了转育，但这些仅限于对AA基因组野生稻进行杂交转育。非AA组型野生稻与栽培稻杂交较为困难，目前主要通过胚抢救、组培、原生质体融合等技术，将非AA染色体组型野生稻的一些有利基因转入栽培稻，包括抗病性(白叶枯病，稻瘟病等)、抗虫性(褐飞虱，三化螟，白背飞虱等)以及抗逆性等方面的有利基因，培育了一系列的渗入系。
同时，野生稻有利基因的现有利用技术也存在着诸多局限性。如野生稻与栽培稻的杂交转育后代长期疯狂分离，稳定慢，育种周期长；胚抢救、组织培养、原生质体融合等方法主要针对非AA染色体组型野生稻，这些方法对某些基因型的野生稻存在难度，同时也不能避免后代的疯狂分离；野生稻有利基因难以简便、快速在多个栽培稻品种中导入、重现；控制转移性状的基因难以跟踪，易造成后代目标性状的不稳定性，或者造成控制目标性状的部分基因的导入。
因此，发掘野生稻基因宝库期待新的技术策略，迫切需要寻求一种简便、有效的高通量技术与方法来发掘有重要经济价值及具有广阔的应用前景的野生稻有利基因。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种利用可转化大片段基因组文库快速、有效发掘野生稻有利基因资源的方法，以克服现有技术中存在的缺陷，提供性状得到改良的转基因突变体植株。
为实现上述的目的，本发明方法包括如下步骤a.供体野生稻可转化大片断基因组文库的建立；b.通过转基因技术将可转化大片断基因组文库导入受体栽培稻，获得全基因组突变体库；c.对突变体库进行筛选，获得农艺性状改良的突变体植株及控制优良性状的野生稻有利基因。
上述步骤a中，供体野生稻可转化大片断基因组文库的建立是按琼脂包埋法制备Megebase级的大片段水稻DNA，再利用可转化人工染色体载体(TAC)或者双元细菌人工染色体载体(BAC)构建大片段基因组文库。步骤b中的转基因技术为农杆菌介导、基因枪、花粉管通道、穗颈注射中的任一种，或者建库时直接以农杆菌为宿主菌，将全基因组克隆和/或候选克隆导入栽培稻品种，待转化水稻材料为纯度好的常规稻和杂交稻亲本，构建全基因组基因敲入突变体库。步骤c中，对所产生的突变体库进行筛选，其过程是转基因水稻种子浸种时用抗生素筛选，PCR复测，按常规田间管理方法种植阳性转基因植株，将阳性转基因植株移至大田考察农艺性状，筛选有育种价值的变异单株。应用Southern blot等分子生物学技术检测、鉴定突变体，确定插入片段的大小和拷贝数，并对对应的大片段DNA进行克隆。筛选纯合(最好是单拷贝)突变植株，继续进行品种比较试验；同时对杂交稻则进行亲本测配。最后获得显著改良的转基因突变体水稻新材料，并发现可能在栽培稻中已经丢失的野生稻的有利基因。
本发明的优点1.本发明利用可转化大片段克隆载体技术进行一种新的基因敲入，通过异源近源种TAC文库的遗传转化，创造突变体，继而选择简单遗传的克隆突变性状基因，这种基因克隆技术具有操作简单、周期短的特点。并在克隆基因的同时，还可获得遗传修饰的转基因植物。
2.本发明构建的突变体库可提供基因组文库中大片段克隆控制的性状和遗传模式及改良的水稻新品种。
3.本发明筛选并获得的性状改良基因可用于其它水稻品种的改良，使现有水稻品种得到整体升级4.本发明率先大规模利用野生稻基因资源发掘水稻产量、抗性、品质等性状显著改良的有利基因，将拓宽栽培稻的遗传基础。
图1为BIBAC2酶切图。植物筛选标记为潮霉素，细菌筛选标记为卡那霉素，文库构建所用单克隆位点为BamH I。
图2为转基因植株叶片的GUS检测，上为阳性转基因水稻植株，下为对照。阳性对照植株叶片染成了蓝色，而对照植株叶片没有被染色。
图3为大片段克隆转基因水稻植株的PCR分析。1大片段克隆质粒；2水稻DNA(对照)；3-10大片段克隆转基因水稻植株；111Kb Ladder。质粒和转基因水稻都扩增出了约620bp的DNA片断，对照没有。
图4大片段克隆转基因水稻植株的农艺性状变异。右为转基因植株，左为对照植株。变异株整体性状优良，略为迟熟，株高较对照约高5cm，穗部性状有明显改善。
具体实施例方式
实施例1利用药用野生稻可转化大片段基因组文库转育栽培稻9311、R207、金23B(1)以药用野生稻为供体植物，首先按琼脂包埋法制备Megebase级的大片段水稻DNA。即利用可转化人工染色体载体(TAC，Transformedartificial chromosome)或者双元细菌人工染色体载体(BIBAC，binarybacterial artificial chromosome)，按100Kb左右进行克隆，构建药用野生稻大片段基因组文库。构建过程如下a.大分子量核DNA的制备.取水稻黄化苗20g，液氮研磨，加入200mL 1×HB溶液(0.01mol/L Tris-HCl，0.08mol/L KCl，0.01mol/L EDTA，1mmol/L精氨，1mmol/L亚精氨，0.5mol/L蔗糖，0.15％β-巯基乙醇，pH＝9.4～9.5)，搅拌均匀，2层纱布、1层Mirocloth过滤，1800×g离心20min，沉淀用1×HB溶液悬浮，与等体积的1％低熔点琼脂糖于45℃混匀，加入可制成胶块的模具中，4℃凝固1h，取出胶块，置于5倍体积的裂解液(0.5mol/L EDTA pH＝9.0～9.3，1％ sodium lauryl sarcosine，1mg/mL蛋白酶K)中50℃裂解24～48h，然后把胶块用0.5mol/L EDTA(pH＝9.0～9.3)溶液洗1遍，再置于4℃的0.05mol/L EDTA(pH＝8.0)溶液中1h，最后进行脉冲电泳，用1％的低熔点琼脂糖回收2Mb以上的DNA片段，保存于0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)溶液中。
b.BIBAC载体制备。用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化大量提取的质粒DNA，获得的闭环DNA用BAM I进行消化，消化完全的BIBAC DNA用HK磷酸酶(Epicenter，USA)按操作说明书进行脱磷。
c.BAC文库的构建。将已纯化的大分子量DNA凝胶块置于40倍体积含1mmol/L PMSF的TE中，50℃温育1h，重复1次；然后于40倍体积的TE中漂洗2次，再置于10倍体积的消化液中(1×EcoR I缓冲液+4mmol/L亚精胺)4℃温育30min，然后每块凝胶加200μL消化液、1UBAM I，冰上温育2h；最后，37℃消化10min，消化后用冰冷的TE洗涤2次以终止反应.通过脉冲电泳(CHEF，BIO-RAD琼脂糖1％，缓冲液0.5×TBE，脉冲时间60～90s，脉冲电压4.5V/cm，脉冲角度120°，电泳时间18h，温度11℃)检查酶切效果，切下200～600kb处的低熔点琼脂糖凝胶块，通过控制适当的脉冲电泳条件(CHEF，BIO-RAD琼脂糖1％，缓冲液0.5×TBE，脉冲时间5s，脉冲电压4.5V/cm，脉冲角度120°，电泳时间15h，温度11℃)使大于200kb的DNA片段压缩成1条带，切下此处的低熔点琼脂糖凝胶块置于4℃TE溶液中平衡2h.凝胶块经琼脂糖酶(Epicentre，USA)消化为液体后与脱磷载体按一定比例进行混合，用T4DNA连接酶(Boehringer，Germany)进行连接，用Cell-Porator(Gibco，BRL)电激转化仪进行转化，挑取转化子直接接种到含有80μL培养液(LB，6mmol/L K2HPO4，13.2mmol/L KH2PO4，1.7mmol/L citrate sodium，12.5μg/mL氯霉素，0.4mmol/L MgSO4，6.8mmol/L(NH4)2SO4，4.4％glyceryl)的384孔培养平板上(Nunc，384 Well Plate)，37℃摇动过夜后，贮存于-70℃冰箱中。
(2)以三类栽培稻品种9311、R207、金23B为受体植物，采用农杆菌介导的转基因技术将药用野生稻可转化大片段基因组文库即全基因组克隆分别导入三类栽培稻(9311、R207、金23B)，然后通过GUS(β-glucuronidase)组织化学检测获取各个大片段克隆的转基因阳性植株(图2)，GUS检测方法按如下步骤进行将待测定的叶片浸入适量X-Gluc溶液，于37℃保温过夜后，在体视显微镜下观察，拍照记录。若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空，染色效果将更好。如材料存在色素干扰问题，染色后用酒精脱色，使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存。X-Gluc染色液0.2mol/L NaPO4缓冲液，pH7.0(0.2mol/L Na2HPO4，62ml；0.2mol/L NaH2PO4，38ml)；0.1mol/L K3[Fe(CN)6]；0.1Mol/LK4[Fe(CN)6].3H2O；1.0Mol/L Na2EPTA；0.1％ X-Gluc。
(3)随后对转基因水稻种子浸种时用抗生素筛选，PCR复测进行阳性转基因植株的鉴定(图3)。
抗生素筛选方法为种子用75％酒精灭菌2-3分钟，滤纸吸干后置于培养皿的滤纸上，添加50mg/L的潮霉素进行筛选，正常发芽者为阳性转基因植株。
PCR复测方法为扩增潮霉素抗性基因的引物序列为Forword5’-GCTGTT ATG CGG CCA TTA TC；Revise5’-GAC GTC TGT CGA GAA GTTTC，PCR产物为620bp。PCR反应体系DNA 30-90ng，10×Buffer 2.0ul，1mM dNTP 1.8ul，25mM MgCl21.5ul，10uM primer两种各0.5ul，Tag酶1.5U，然后加dd h2O至20ul反应体积。PCR循环条件94℃，变性3分钟；94℃，1分钟，55℃(检测PSAG12〕或68℃(检测NPTII)，1.5分钟，72℃，1.5分钟，40个循环；72℃，延伸5分钟。电泳检测用1.4％琼脂糖凝胶电泳，照相记录电泳结果。
(4)按常规田间管理方法种植阳性转基因植株，考察农艺性状，筛选有育种价值的变异单株。继续筛选纯合(最好是单拷贝)突变植株，进行品种比较试验；同时对杂交稻则进行亲本测配。在田间性状考察中，发现部分转基因植株有性状变异，其中1株变异株整体性状优良，略为迟熟，株高较对照约高5cm，穗部性状有明显改善(图4，表1)。这表明可以通过这一途径将野生稻有利基因转入栽培稻中，创制育种材料，培育新品种，并将有助于克隆控制突变性状的基因。
表1大片段克隆转基因水稻的农艺性状考察材料 株高(cm) 穗长(cm) 有效穗数 穗粒数 实粒数 结实率(％) 千粒重(g) 单株粒重(g)变异株 74.9 13.65 9.1 112.67 95.60 84.85 24.12 20.89金23B对照株 65.3 12.41 8.9 102.22 87.98 86.07 23.89 18.7权利要求
1.利用可转化大片段基因组文库发掘野生稻有利基因的方法，其特征在于，包括如下步骤a.供体野生稻可转化大片断基因组文库的建立；b.通过转基因技术将可转化大片断基因组文库导入受体栽培稻，获得全基因组突变体库；c.对突变体库进行筛选，获得农艺性状改良的突变体植株及控制优良性状的野生稻有利基因。
2.根据权利要求1所述的利用可转化大片段基因组文库发掘野生稻有利基因的方法，其特征在于，供体植物可转化大片断基因组文库为双元细菌人工染色体库或可转化人工染色体库。
3.根据权利要求1所述的利用可转化大片段基因组文库发掘野生稻有利基因的方法，其特征在于，供体野生稻可转化大片断基因组文库的构建是按琼脂包埋法制备Megebase级的大片段水稻DNA，再利用可转化人工染色体载体或者双元细菌人工染色体载体构建大片段基因组文库。
4.根据权利要求1所述的利用可转化大片段基因组文库发掘野生稻有利基因的方法，其特征在于，所述的转基因技术为农杆菌介导、基因枪、花粉管通道、穗颈注射中的一种。
5.根据权利要求1所述的利用可转化大片段基因组文库发掘野生稻有利基因的方法，其特征在于，供体植物为野生稻，受体植物为栽培稻。
全文摘要
本发明公开了一种利用可转化大片段基因组文库发掘野生稻有利基因的方法，它包括构建野生稻可转化大片段基因组文库，通过转基因技术将大片段克隆导入到栽培稻中，建立全基因组基因敲入突变体库。通过对突变体中大片段克隆控制的性状和遗传模式的田间筛选，获得产量、抗性、品质等性状得到显著改良的转基因突变体水稻新材料。同时，含有有利基因的大片段克隆一经鉴定，即可快速用于其它栽培稻品种，使现有水稻品种得到整体改良。这一技术也适用于发掘其他植物基因资源。
文档编号C12N15/29GK1594564SQ200410023348
公开日2005年3月16日 申请日期2004年6月25日 优先权日2004年6月25日
发明者曹孟良 申请人:湖南西城杂交水稻基因科技有限公司