专利名称：用Vibrio metschnikovii DL 33-51菌株生产碱性蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产生碱性蛋白酶的微生物Vibrio metschnikovii DL 33-51菌株。
背景技术：
据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，产生碱性蛋白酶的菌种主要来源于芽孢杆菌及一些真菌。Bacillus，Streptomyces，Aspergillus，Pseudomonas中的某些菌株均可以产生碱性蛋白酶。根据伯杰氏细菌鉴定手册第九版，本发明菌株的形态和生理生化特征大部分与弧菌属的梅氏弧菌(Vibrio metschnikovii)相符。
碱性蛋白酶在工业上主要作为洗涤添加剂使用，要求其在广泛的pH和温度范围内保持高的酶活力和稳定性，还必须与含有多种氧化剂和表面活性剂的洗衣粉相融合。目前微生物来源的碱性蛋白酶反应最适pH一般为9.0-10.0，各种氧化剂与表面活性剂均可导致不同程度的酶活下降。本发明中Vibrio metschnikoviiDL 33-51来源的碱性蛋白酶最适pH为12.0，氧化剂与表面活性剂的存在不会引起酶活丧失，反而可促使酶活力上升。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于碱湖的菌株Vibrio metschnikovii DL 33-51并利用该菌株生产碱性蛋白酶的方法，以及相关的酶学性质。
本发明分离纯化出一株来源于碱湖的菌株Vibrio metschnikovii DL 33-51，其具有产生碱性蛋白酶的特性，保藏单位简称CCTCC，保藏号为M204008。本发明的特点是首次分离出产碱性蛋白酶的Vibrio metschnikovii DL 33-51菌株。该菌株为弯杆状，革兰氏阴性，0.4-0.7μm×1.3-1.5μm，端生单鞭毛(图1)。该菌种来源于碱湖环境，为发酵型糖代谢，在无盐和10％NaCl胨水中不生长，3％和7％NaCl胨水中生长良好，且对O-129敏感试验呈阳性，根据伯杰氏手册第九版确定其为弧菌属(该菌株与弧菌属梅氏弧菌Vibrio metschnikovii的特征对比见表1)。此菌株在酪蛋白培养基上24℃培养24h形成单菌落，菌落乳白色，圆形，边缘整齐。
该菌种具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。特别是利用本发明中营养贫瘠的半合成培养基发酵该菌株可得到高的产酶量。在发酵培养基中培养40h，其发酵液中碱性蛋白酶的活力即达到3268U/mL(30℃下测定)。用本发明的菌株作为碱性蛋白酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。
通过分离纯化，SDS-PAGE确定该菌株产生的碱性蛋白酶的分子量为29.5kDa(图2)。其分子量不同于已报导的碱性蛋白酶。(表2)。
对该碱性蛋白酶的性质研究表明，最适酶反应pH12.0，最适反应温度55-60℃，此温度下所测酶活力为11173U/mL。该酶具有良好的抗表面活性剂与氧化剂特性。与吐温-80与Trixon-X100于30℃下保温1小时后，酶活可提高20％(图3)。H2O2与NaClO均对酶活有促进作用(图4)。用本发明的菌株生产的碱性蛋白酶具有常温下活力高，热稳定性好，广泛的pH耐受性，可抗表面活性剂与氧化剂，有望作为一种新型的酶制剂应用于常温加酶洗涤剂的生产中。
图1，菌株V.metschnikovii DL 33-51的扫描电镜照片。
图2，纯化的碱性蛋白酶SDS-PAGE电泳结果。左边为纯酶单带，右边为标准蛋白分子量。
图3，表面活性剂对碱性蛋白酶活力的影响。30℃下，该酶与不同浓度Triton-X100和吐温-80溶液保温一个小时，残余活力与对照酶活的百分比。
图4，氧化剂对碱性蛋白酶活力的影响。30℃下，该酶与不同浓度NaClO和H2O2溶液保温一个小时，残余活力与对照酶活的百分比。
具体实施例方式
从碱湖采集水样，选取在酪蛋白平板上产生透明圈大的菌落，通过测定其发酵液酶活力进行复筛，得到具有高产碱性蛋白酶活力的一株细菌。该菌株通过形态观察和生理生化鉴定为弧菌属中的梅氏弧菌。酪蛋白培养基的组成为酪蛋白1.0g，豆粉1.0g，NaCl14.0g，KH2PO41.0g，CaCl20.1g，琼脂15.0g，H2O1000mL，pH10.0。
菌种用酪蛋白培养基活化后，以5％的接种量接入到装有100mL发酵培养基(酪蛋白1.0g，豆粉1.0g，NaCl14.0g，KH2PO41.0g，CaCl20.1g，H2O1000mL，pH10.4)的250mL三角瓶中，26℃摇瓶培养40h，培养液4℃下3000rpm离心10分钟去除菌体，获得发酵酶液。酶活力测定的条件100μl酶液加入到5mL0.5％酪蛋白底物中，一定温度下保温5min，加入10％三氯乙酸终止反应，过滤，滤液在275nm下比色。定义测定温度下每分钟催化产生1μg酪氨酸的酶量为一个活力单位(U)。
该菌种产生碱性蛋白酶的分子量测定采用丙酮沉淀得到的酶蛋白在50mmol glycine-NaOH pH10.0的缓冲液中透析、干燥后，经Q-sepharose阴离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶柱层析分离纯化。SDS-PAGE得到一条单带，分子量为29.5kDa。
表1 Vibrio sp.DL 33-51菌株与V.metschnikovii的鉴定对比Vibrio sp.DL 33-51V.metschnikovii3-12根鞭毛 - -固体培养基上有侧毛 - -游动- -直杆状 - dPHB积累-色素- -精氨酸双水解+ -氧化酶 - -还原硝酸盐 - -发光- -从D葡萄糖产气 - -V-P产生 + +生长需要Na离子 - d生长需要有机因子- d生长在4℃ - -30℃+ +35℃+ +40℃- +淀粉酶 + +明胶酶 + +脂酶+ +溶藻酶 -几丁质酶 +利用乙酸盐+ +乌头酸盐 dL-精氨酸- +乙醇 -D-葡萄糖酸盐+ +L-谷氨酸盐 +D-葡萄糖醛酸盐 -DL-甘油酸盐-甘氨酸 - -DL-乳酸盐 +乳糖- dL-亮氨酸 -D-甘露醇+ +D-甘露糖+ d蜜二糖 -L-脯氨酸+ +水杨苷 -L-丝氨酸+ +D-山梨醇 d蔗糖+ +海藻糖 + +L-酪氨酸 -D-木糖 - -麦芽糖 +发荧光 -
表2 Vibrio metschnikovii DL 33-51菌株产酶与其他菌株产酶的比较菌种 酶系 分子量 kDaScedosporium apiospermum 33Vibrio parahaemolyticus 43Bacillus mojavensis 30Vibrio pacini X4B-7 27Bacillus subtilis44Shewanella sp.PA-43 76Kurthia spiroforme sp.nov. 8Tritirachium album 33Pseudomonas sp.7-11 30Vibrio metschnikovii DL 33-5129.权利要求
1.对碱性蛋白酶生产菌种Vibrio metschnikovii DL 33-51实施专利保护。
2.对利用Vibrio metschnikovii DL 33-51产生碱性蛋白酶实施专利保护。
全文摘要
本发明涉及一种能产生碱性蛋白酶的微生物Vibrio metschnikovii DL 33－51，该酶的分子量为29.5kDa。本发明的目的是提供一种来源于自然界的菌种Vibrio metschnikovii DL 33－51以及利用该菌株生产碱性蛋白酶的方法。本发明从碱湖分离纯化出一株菌Vibrio metschnikovii DL 33－51，其具有产生碱性蛋白酶的特性。根据伯杰氏手册第九版，该菌种的形态和生理生化特征基本与弧菌属的梅氏弧菌相符。该菌种具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点，产生的碱性蛋白酶具有高活性。用本发明的菌株作为碱性蛋白酶的生产菌株，具有产品的活性高、pH及热稳定性好、可抗表面活性剂和氧化剂、生产周期短、成本低等特点，能够开发成一种新型的应用于常温洗涤剂的酶制剂，实现工业化的生产。
文档编号C12P1/04GK1560232SQ200410023670
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月10日 优先权日2004年3月10日
发明者江晓路, 梅承芳 申请人:中国海洋大学