专利名称：家蚕作为“生物工厂”生产重组人bFGF的方法
技术领域：
本发明涉及基因重组技术、杆状病毒基因表达系统、蛋白质的纯化与活性分析，尤其涉及一种家蚕作为“生物工厂”生产重组人bFGF的方法。
背景技术：
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，简称FGF)是一类结构类似、生物功能相近的肝素Heparin结合蛋白。最近有报道认为FGF家族有18个成员，其中，从牛脑组织分离到的酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)是该家族中最早发现的两个成员。人bFGF由146个氨基酸组成，分子量为16.4kDa，pI为9.6。人bFGF对包括血管内皮细胞在内的多种中胚层细胞和神经外胚层细胞均具有强烈的体外促分裂作用，因此，被认为在调节生长发育、伤口愈合和肿瘤生长过程中的血管发生和再生方面具有重要作用。因此，临床试验中广泛研究了bFGF在伤口愈合、组织移植和治疗局部缺血上实际效果，显示出很好的应用前景。但是目前市场上bFGF蛋白的价格昂贵，虽然用基因工程的方法在大肠杆菌中可以生产，但在大肠杆菌中bFGF以包含体的形式表达，需要对其重新折叠恢复其生物活性。额外的处理使得该过程效率很低且不经济。为了克服这个问题，其他人曾试着用酵母和腺病毒感染的哺乳动物细胞进行表达生产。然而，酵母的质粒转化体不稳定，哺乳动物培养细胞生产的成本又太高。因此有必要建立一种高效经济的生产bFGF的方法。
杆状病毒表达系统是当今最有效的真核基因表达系统之一，目前该系统主要包括欧美国家正在广泛应用的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus，简称AcNPV)和以中国、日本为代表的家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，简称BmNPV)表达系统两大类，两者各有优点，但病毒寄主范围不同。AcNPV寄主范围较广，而“家蚕-重组杆状病毒表达系统”由于可以利用我国饲养量最大的特色经济昆虫一家蚕作表达载体，家蚕具有个体大、易饲养等特点，因此具有生产成本低、可规模化生产等优点，适合于生物制药产业化水平的要求。申请人构建了介于BmNPV和AcNPV之间的杂交杆状病毒HyNPV(专利申请已授权，专利号ZL01125605.2)，它具有扩大的寄主域的突出优点。这样，可以在AcNPV的寄主细胞Sf21中构建重组病毒，然后在家蚕幼虫中低成本、高效地生产重组蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕作为“生物工厂”生产重组人bFGF的方法。利用HyNPV构建含有人bFGF基因的重组病毒，并利用家蚕作为宿主，表达生产具有生物活性的重组人bFGF。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下(1)bFGF基因的克隆以人脑cDNA为模板，PCR基因扩增技术获得人bFGF基因，引物设计如下正向引物5′-ACGTAGATCTCCCGCCTTGCCCGAG-3′含有BglII酶切位点；反向引物5′-ACGTAGATCTTCAGCTCTTAGCAGA-3′，含有BglII酶切位点。PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94℃模板变性50秒；30个循环，55℃退火30秒，70℃延伸1分钟；最后1个循环，70℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆入3.9kb载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆bFGF基因顺序正确性；(2)含有人bFGF基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BglII消化pCR2.1-bFGF得到bFGF基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pAcGP67b获得重组体pAcGP67b-bFGF；通过共转染在昆虫细胞内与杂交杆状病毒HyNPVDNA同源重组产生重组病毒，共转染的方法为1μg pAcGP67b-bFGF DNA和15μg HyNPV DNA混合，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf 21培养细胞。先用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒原液，用来筛选重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml，申请人将此重组病毒命名为HyNPV-bFGF；(3)家蚕体内表达和重组bFGF纯化使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前将幼虫浸在冰水浴中进行短时间麻醉，然后采用皮下注射的方法注射重组病毒悬浮液，浓度为106pfu/ml，每条家蚕注射20μl，注射1小时后喂桑，并在23-25℃下饲养；感染后72-96小时内收集家蚕幼虫，解剖感染家蚕的脂肪体，并用此作为纯化重组人bFGF的起始材料；将脂肪体匀浆后溶解在预冷的pH 7.6，20mM Tris-HCl缓冲液中，经高速离心后将上清液直接上肝素Heparin亲和层析柱，由于bFGF与肝素具有强烈的亲和性而使bFGF结合到层析柱上，然后用含有0.4M NaCl的上述同样缓冲液洗脱去掉杂蛋白，最后用2.0M NaCl的缓冲液一步洗脱出结合的bFGF。通过SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白，结果显示获得的重组bFGF纯度很高；(4)重组bFGF活性分析鉴定用人脐静脉内皮细胞HUVEC分析重组人bFGF的生物活性；细胞在培养基199中37℃培养，补充5％的CO2，培养基中另外添加100units/ml青霉素，100units/ml链霉素，4.0mg/ml两性霉素B，20％热灭活补加牛血清，5units/ml肝素和50mg/ml内皮细胞生长补充物质ECGS；细胞用胰蛋白酶消化后接种于24孔组织培养板，细胞密度大约为1.0×104cells/well，每孔加1ml同样的培养基。24小时后，将培养基更换为含有10％SCS和5units/ml肝素，但是不含有ECGS的新鲜培养基199；纯化的重组bFGF经梯度稀释后用0.22μm灭菌过滤器过滤灭菌，加入到培养板孔中，每孔体积不超过10μl。72小时后，用PBS洗两次，用胰蛋白酶消化后离心收集细胞，重悬于200μl PBS中；0.4％台酚蓝染色后，用血球计计算细胞个数。结果表明，重组bFGF能够刺激HUVEC细胞的分裂、增殖，表明家蚕幼虫中表达的重组人bFGF具有生物学活性。
本发明与背景技术相比，具有的有益效果是本发明较好地解决了bFGF在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点，家蚕幼虫表达重组人bFGF具有成本低、产量高、生物活性强的优点。本专利建立的方法可以大量生产重组人bFGF，在未来的医学和临床治疗领域具有广阔的应用前景。
具体实施例方式
1、研究材料基因工程操作工具酶和PCR扩增试剂盒购于我国上海生工生物工程技术服务公司。人脑cDNA购自Clotech公司，TA克隆试剂盒、杆状病毒转移载体pAcGP67b、脂质体lipofectin均为Invitrogen公司产品。肝素Heparin亲和层析用产品购自日本和光化学公司。DNA测序试剂盒购于PEApplied Biosystems。胎牛血清FCS、昆虫细胞系Sf21的培养基TC-100和用于培养人脐静脉内皮细胞HUVEC的培养基199均为GibcoBRL的产品。秋粘虫细胞系Tn-5的培养基ESF921购于Expression systems。人脐静脉内皮细胞HUVEC、SCS和ECGS均为Technoclone GmbH的产品。草地贪夜蛾细胞Sf21用添加10％(v/v)FCS和0.26％细菌用胰蛋白胨的TC-100培养基在27℃培养。Tn-5利用无血清的ESF921培养基于27℃瓶中培养。本试验使用家蚕杂交种，家蚕幼虫桑叶饲养，温度为23～25℃。
2、工作流程利用家蚕作为“生物工厂”生产重组人bFGF的方法(1)bFGF基因的克隆以人脑cDNA为模板，PCR基因扩增技术获得人bFGF基因，引物设计如下正向引物5′-ACGTAGATCTCCCGCCTTGCCCGAG-3′含有BglII酶切位点；反向引物5′-ACGTAGATCTTCAGCTCTTAGCAGA-3′，含有BglII酶切位点。PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94℃模板变性50秒；30个循环，55℃退火30秒，70℃延伸1分钟；最后1个循环，70℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆入3.9kb载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆bFGF基因顺序正确性；(2)含有人bFGF基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BglII消化pCR2.1-bFGF得到bFGF基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pAcGP67b获得重组体pAcGP67b-bFGF；通过共转染在昆虫细胞内与杂交杆状病毒HyNPVDNA同源重组产生重组病毒，共转染的方法为1μg pAcGP67b-bFGF DNA和15μg HyNPV DNA混合，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf 21培养细胞。先用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒原液，用来筛选重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml，申请人将此重组病毒命名为HyNPV-bFGF；(3)家蚕体内表达和重组bFGF纯化使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前将幼虫浸在冰水浴中进行短时间麻醉，然后采用皮下注射的方法注射重组病毒悬浮液，浓度为106pfu/ml，每条家蚕注射20μl，注射1小时后喂桑，并在23-25℃下饲养；感染后72-96小时内收集家蚕幼虫，解剖感染家蚕的脂肪体，并用此作为纯化重组人bFGF的起始材料；将脂肪体匀浆后溶解在预冷的pH 7.6，20mM Tris-HCl缓冲液中，经高速离心后将上清液直接上肝素Heparin亲和层析柱，由于bFGF与肝素具有强烈的亲和性而使bFGF结合到层析柱上，然后用含有0.4M NaCl的上述同样缓冲液洗脱去掉杂蛋白，最后用2.0M NaCl的缓冲液一步洗脱出结合的bFGF。通过SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白，结果显示获得的重组bFGF纯度很高；(4)重组bFGF活性分析鉴定用人脐静脉内皮细胞HUVEC分析重组人bFGF的生物活性；细胞在培养基199中37℃培养，补充5％的CO2，培养基中另外添加100units/ml青霉素，100units/ml链霉素，4.0mg/ml两性霉素B，20％热灭活补加牛血清，5units/ml肝素和50mg/ml内皮细胞生长补充物质ECGS；细胞用胰蛋白酶消化后接种于24孔组织培养板，细胞密度大约为1.0×104cells/well，每孔加1ml同样的培养基。24小时后，将培养基更换为含有10％ SCS和5units/ml肝素，但是不含有ECGS的新鲜培养基199；纯化的重组bFGF经梯度稀释后用0.22μm灭菌过滤器过滤灭菌，加入到培养板孔中，每孔体积不超过10μl。72小时后，用PBS洗两次，用胰蛋白酶消化后离心收集细胞，重悬于200μl PBS中；0.4％台酚蓝染色后，用血球计计算细胞个数。结果表明，重组bFGF能够刺激HUVEC细胞的分裂、增殖，表明家蚕幼虫中表达的重组人bFGF具有生物学活性。
权利要求
1.一种家蚕作为“生物工厂”生产重组人bFGF的方法，其特征在于(1)bFGF基因的克隆以人脑cDNA为模板，PCR基因扩增技术获得人bFGF基因，引物设计如下正向引物5′-ACGTAGATCTCCCGCCTTGCCCGAG-3′含有BglII酶切位点；反向引物5′-ACGTAGATCTTCAGCTCTTAGCAGA-3′，含有BglII酶切位点。PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94℃模板变性50秒；30个循环，55℃退火30秒，70℃延伸1分钟；最后1个循环，70℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆入3.9kb载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆bFGF基因顺序正确性；(2)含有人bFGF基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BglII消化pCR2.1-bFGF得到bFGF基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pAcGP67b获得重组体pAcGP67b-bFGF；通过共转染在昆虫细胞内与杂交杆状病毒HyNPVDNA同源重组产生重组病毒，共转染的方法为1μg pAcGP67b-bFGF DNA和15μg HyNPV DNA混合，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf 21培养细胞。先用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒原液，用来筛选重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml，申请人将此重组病毒命名为HyNPV-bFGF；(3)家蚕体内表达和重组bFGF纯化使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前将幼虫浸在冰水浴中进行短时间麻醉，然后采用皮下注射的方法注射重组病毒悬浮液，浓度为106pfu/ml，每条家蚕注射20μl，注射1小时后喂桑，并在23-25℃下饲养；感染后72-96小时内收集家蚕幼虫，解剖感染家蚕的脂肪体，并用此作为纯化重组人bFGF的起始材料；将脂肪体匀浆后溶解在预冷的pH7.6，20mM Tris-HCl缓冲液中，经高速离心后将上清液直接上肝素Heparin亲和层析柱，由于bFGF与肝素具有强烈的亲和性而使bFGF结合到层析柱上，然后用含有0.4M NaCl的上述同样缓冲液洗脱去掉杂蛋白，最后用2.0M NaCl的缓冲液一步洗脱出结合的bFGF。通过SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白，结果显示获得的重组bFGF纯度很高；(4)重组bFGF活性分析鉴定用人脐静脉内皮细胞HUVEC分析重组人bFGF的生物活性；细胞在培养基199中37℃培养，补充5％的CO2，培养基中另外添加100units/ml青霉素，100units/ml链霉素，4.0mg/ml两性霉素B，20％热灭活补加牛血清，5units/ml肝素和50mg/ml内皮细胞生长补充物质ECGS；细胞用胰蛋白酶消化后接种于24孔组织培养板，细胞密度大约为1.0×104cells/well，每孔加1ml同样的培养基。24小时后，将培养基更换为含有10％SCS和5units/ml肝素，但是不含有ECGS的新鲜培养基199；纯化的重组bFGF经梯度稀释后用0.22μm灭菌过滤器过滤灭菌，加入到培养板孔中，每孔体积不超过10μl。72小时后，用PBS洗两次，用胰蛋白酶消化后离心收集细胞，重悬于200μl PBS中；0.4％台酚蓝染色后，用血球计计算细胞个数。结果表明，重组bFGF能够刺激HUVEC细胞的分裂、增殖，表明家蚕幼虫中表达的重组人bFGF具有生物学活性。
全文摘要
本发明公开了一种家蚕作为“生物工厂”生产重组人碱性成纤维细胞生长因子bFGF的方法。利用构建的AcNPV和BmNPV的杂交杆状病毒HyNPV作为载体，构建了重组含有人bFGF基因的重组病毒。利用家蚕作为重组病毒的宿主，表达了具有生物活性的重组人bFGF。解决了bFGF在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点，家蚕幼虫表达的重组人bFGF大部分留在家蚕脂肪体内，利用亲和层析从脂肪体中纯化bFGF，每头家蚕的产量高达600－700μg。活性分析表明，重组bFGF具有促进细胞分裂增殖的生物活性。利用家蚕作为“生物工厂”可以大量生产重组bFGF，在医学和治疗领域上的应用开辟了广阔的前景。
文档编号C12N15/866GK1594565SQ20041002540
公开日2005年3月16日 申请日期2004年6月17日 优先权日2004年6月17日
发明者吴小锋, 曹翠平, 姚慧鹏 申请人:浙江大学